CN101184769A

CN101184769A - 诊断剂和治疗剂

Info

Publication number: CN101184769A
Application number: CNA2006800184776A
Authority: CN
Inventors: 阿基·科伊维斯托伊宁; 马蒂亚斯·贝里曼; 汉努·埃洛
Original assignee: Carle Young -Ctt Ltd
Current assignee: Carle Young -Ctt Ltd
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2008-05-21
Also published as: FI20050437A0

Abstract

本发明涉及诊断剂和治疗剂，并且涉及包含肽序列X－R－Y－P－Z_n的肿瘤靶向单元或者其可药用或生理上可接受的盐。本发明进一步涉及肿瘤靶向剂，所述肿瘤靶向剂含有至少一个本发明的靶向单元，该靶向单元直接或者间接与至少一个效应器单元结合。本发明进一步涉及包含本发明的至少一种靶向单元或至少一种靶向剂的诊断或药用组合物，以及涉及本发明的靶向单元或靶向剂在制备用于治疗癌症或者癌症相关疾病，特别是治疗非小细胞肺癌或其转移的药物中的用途。

Description

诊断剂和治疗剂

技术领域

本发明涉及靶向剂，尤其是肿瘤靶向剂，诸如肺部肿瘤，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)靶向剂，所述靶向剂包括至少一个靶向单元和至少一个效应器单元，以及涉及肿瘤靶向单元和基序，诸如肺部肿瘤和NSCLC靶向单元和基序。此外，本发明涉及含有所述靶向剂或靶向单元的药用和诊断组合物，以及所述靶向剂和靶向单元作为药用或诊断工具的用途。本发明进一步涉及所述靶向剂和靶向单元在制备药用或诊断组合物中的用途。此外，本发明涉及用于诊断或治疗癌症，诸如肺癌尤其是非小细胞肺癌的试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤是人及动物最严重的健康问题之一，是导致死亡最常见的原因之一，在年轻个体中也是如此。尽管进行了数十年的深入研究，但可供用于治疗癌症的方法仍然非常有限。虽然有时候有疗效的治疗，通常为与化学疗法和/或放射疗法相结合的手术治疗是可行的，但恶性肿瘤每年依然导致大量的死亡。实际上，如果疾病未能得以早期诊断，几乎难以进行有疗效的治疗。此外，某些癌症类型是难得治愈的。

有诸多原因导致了该令人沮丧的情况，其中最重要的一点在于除手术之外的大多数治疗方案缺乏足够的选择性。通常使用的化学治疗剂并非只对肿瘤的恶性细胞起作用，并且对其他细胞也是高度毒性的，尤其是对快速分裂细胞类型，诸如造血细胞和上皮细胞，结果导致非常难以接受的副作用。放射疗法与之类似。

此外，两个主要问题困扰着所述恶性实体瘤的非手术治疗。肿瘤内的生理屏障阻止了治疗剂以有效浓度输送至所有癌症细胞，由遗传和外成机理形成的获得性耐药性也降低了可供使用的药物的有效性。

在癌症及转移的诊断中，包括对患者的追踪调查和对肿瘤及转移的治疗效果的研究，可靠、灵敏和更具选择性的方法和试剂将是非常有利的。目前采用的所有方法，例如核磁共振成像、X-射线法、组织染色法仍缺乏这样的试剂，所述试剂能靶定用于特异性或选择性检测肿瘤组织、转移或肿瘤细胞和/或肿瘤内皮的实体。

在男性和女性中，肺癌是与癌症相关的死亡率的主要原因。非小细胞肺癌占所有肺癌的约80％，小细胞癌症占20％。据估计，仅有10％的确诊的肺癌患者存活5年以上。通常，在癌症确诊的时候，癌症已经扩散，使得手术治疗这一唯一有效的治疗手段已经不可能再进行。此外，其所患癌症处于可手术治疗期的患者通常还患有一些其他疾病使之不能接受外科手术。早期诊断对于成功治疗非小细胞肺癌(NSCLC)是至关重要的。迄今为止，早期诊断依然难以实现，并且仅有螺旋计算机断层摄影(螺旋CT)具有令人满意的结果。然而，作为手段，螺旋CT价格昂贵，且作为筛选测试是不可行的。

进行传统疗法(手术、化学疗法和放射疗法)的患者的长期存活是罕见的。当前在晚期NSCLC治疗中，与含铂药物组合使用的治疗剂诸如有丝分裂抑制剂(紫杉烷类，如紫杉醇和紫杉萜)、抗代谢物(吉西他滨，gemsitabine)、长春花碱类(长春瑞滨)和拓扑异构酶抑制剂(伊立替康(irinotecane))已达到治疗有效性的阈值。

对肺部肿瘤细胞具有特异性的单克隆抗体作为用于治疗肺部癌症的靶向剂已显示出临床应用的希望。然而，基于以下两点事实，抗体靶定疗法具有一些主要局限：抗体分子的大尺寸以及肝和网状内皮组织系统对抗体分子的非特异性吸收。所述大尺寸导致抗体药物非常差的肿瘤透过性并常常引起免疫应答，而肝和网状内皮组织系统的非特异性吸收导致对肝和骨髓的剂量限制毒性。

靶向肽是用于人类癌症靶定治疗的非常好的另外一种选择，并且由于其相对较小的尺寸使之能克服抗体靶向所具有的问题。肽的优点在于：更高的稳定性-肽能在室温下保存数周；更低的制造成本(合成制造相对于重组制造(recombinant production))；更快的药物代谢动力学；能被修改的排泄途径；以及每份最终靶向剂质量具有更高的活性。

已有大量公报披露了导向(homing)不同细胞和组织类型的肽。其中一些据称可用作癌症靶向肽。其中最早确定的所述导向肽是由Ruoslahti等在例如美国专利第6,180,084号中描述的整联蛋白和NGR-受体靶向肽。

国际专利公报WO 00/12738披露了用于输送异源基因的靶定腺病毒载体。所披露的载体被描述为含有能靶向尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物受体(UPAR)的肽序列，如NQNSRRPSRA。

国际专利公报WO 02/020822披露了用于鉴别选择性结合肽的生物淘选法(biopanning method)，所述肽可举出CSRRPEVVC，其为经宣称能靶向间充质干细胞的环肽。

尚未有公报披露已经鉴定出了特异性靶向NSCLC细胞的肽。因此，需要能用于诊断和治疗NSCLC的靶向剂。

发明内容

本发明涉及靶向肺癌，更具体为靶向小细胞肺部肿瘤的肿瘤靶向单元，所述肿瘤靶向单元包括肽序列X-R-Y-P-Z_n或其可药用或生理上可接受的盐或衍生物，其中X是丙氨酸、丝氨酸或高丝氨酸，或其结构性或功能性类似物；R是精氨酸或高精氨酸，或其结构性或功能性类似物；Y是精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸或脯氨酸；P是脯氨酸或其结构性或功能性类似物；Z是任何氨基酸残基，并且各个Z_n可以是不同、相似或相同；以及n是0～7的整数。本发明的靶向单元可以是线性的，或者是环状的或者形成部分环状结构。本发明进一步涉及含有与至少一个效应器单元直接或间接相连的至少一个本发明的靶向单元的肿瘤靶向剂。优选为，所述效应器单元是可直接或间接检测的试剂或是治疗剂。

本发明进一步涉及含有至少一种本发明的靶向单元或至少一种本发明的靶向剂的诊断或药用组合物，以及涉及本发明的靶向单元或靶向剂在制备用于癌症或癌症相关疾病治疗，尤其用于非小细胞肺癌或其转移治疗的药物中的应用。

本发明进一步涉及用于治疗癌症或癌症相关疾病的方法，所述方法通过向有需要的患者提供治疗有效量的本发明的药物组合物以治疗非小细胞肺癌或其转移。

附图说明

以下参考附图通过优选实施方式对本发明进行更详细的描述，其中

图1显示了NSCLC细胞系对靶向剂的选择性结合；

图2显示了本发明的肽在体外是非毒性的；以及

图3显示了本发明的肽是非免疫原性的。

具体实施方式

本发明的一个目的是提供新型肿瘤靶向剂，所述靶向剂包括至少一个靶向单元，以及可选的至少一个效应器单元。在一重要的实施方式中，本发明提供了含有至少一段能靶向肺部实体瘤的基序的靶向单元。作为具体的实施方式，本发明提供能特异性靶向非小细胞肺癌细胞的肿瘤靶向基序和单元。

可选地与至少一个效应器单元结合的本发明的靶向单元是可用治疗的和可用于诊断的，特别用于癌症包括转移的治疗和诊断，优选为肺部肿瘤及转移的治疗和诊断。此外，本发明的靶向剂可用于细胞切除、选择、分类和富集。

本发明的第二目的是提供药用和诊断组合物，所述药用和诊断组合物含有至少一种本发明的靶向剂或至少一种本发明的含有至少一种基序的靶向单元。所述组合物可用于破坏肿瘤或阻止其生长，或者用于癌症诊断。

由于转移的早期诊断对于成功治疗癌症是至关重要的，本发明的靶向单元和靶向剂的重要用途在于肿瘤转移的早期诊断。

本发明的第三目的是提供用于癌症，优选为肺部癌症包括转移的诊断和/或治疗的新型诊断和治疗的方法和试剂盒。

本发明的靶向单元可如此使用或者与至少一个效应器单元结合。

为了本发明的目的，术语“癌症”以其最广泛的含有在此使用，并包括涉及转化的或恶性的细胞的任何疾病或不适。在本领域中，癌症根据其组织来源(组织学类型)主要分为五类：为实体瘤类型癌症的癌、肉瘤、骨髓瘤、和淋巴瘤；和为“液体癌”的白血病。在本发明中使用的术语癌症旨在主要包括以实体瘤为特征的所有类型的疾病，包括没有可检测到的实体瘤的疾病状态或者恶性或转化细胞(癌细胞)表现为在健康组织中扩散渗透或零星出现的疾病状态。

术语“氨基酸”和“氨基醇”在此处可解释为也包括二氨基、三氨基、寡氨基和多氨基的酸和醇；二羧基、三羧基、寡羧基和多羧基氨基酸；二羟基、三羟基、寡羟基、和多羟基氨基醇；以及含有超过一个羧基或羟基和一个以上氨基的类似化合物。

根据已确定的术语学，术语“肽”是指通过肽键相连从而形成氨基酸链的氨基酸(肽单元)的链。肽可以是如下所述的线形或环形。为了本发明的目的，含有一个以上D-氨基酸、β-氨基酸和/或其他非天然氨基酸(例如具有非天然侧链的氨基酸)的化合物也包括在术语“肽”中。为了本发明的目的，术语“肽”旨在包括含有经修饰的氨基酸的肽类似物。所述修饰可例如包括引入或存在取代基；引入或存在“额外”的官能团如氨基、肼基、羧基、甲酸基(醛基)或酮基，或其他部分；以及官能团或其他部分缺失或除去。所述术语也包括在氨基端和/或羧基端进行修饰的类似物如肽酰胺化合物和N-取代酰胺、肽酰肼、N-取代酰肼、肽酯及其相似物，还包括不具有氨基端-NH₂基团或者含有取代了氨基端氨基的例如经修饰的氨基端氨基或亚氨基或肼基的肽，还包括不具有羧基端羧基或含有取代它的经修饰基团的肽等。

能用于修饰肽形成“肽类似物”的可能的反应类型的一些例子是例如缩合和亲核加成反应，以及酯化、成酰胺化、形成具有取代基的酰胺、N-烷基化、成酰肼化、成盐化。成盐化可以为形成任何类型的盐，诸如碱金属或其他金属盐、铵盐、与有机碱的盐、酸加成盐等。肽类似物可以或者由相应的肽合成或者直接合成(通过其他途径)。

本发明的肽的“结构性或功能性类似物”的表述是用于涵盖不由氨基酸或者不是单独由氨基酸构成的，或者其结构单元的一部分或者全部是经修饰的氨基酸的化合物。不同类型的结构单元可用于该目的，正如本领域技术人员所能理解那样。这些化合物在生物体系中的功能与肽的功能基本相似。这些化合物与原型肽的相似之处是基于结构上或功能上的相似性。该化合物可称为肽模拟类似物，这是因为它们模拟原型肽的功能、构象和/或结构，为了本发明的目的，它们包含在术语“肽”中。

本发明的肽的功能性类似物的特征在于与肿瘤、肿瘤组织、肿瘤细胞或肿瘤内皮结合相关的结合能力，这与其所类似的肽的结合能力基本相似。

例如，可以使用基于原型肽的主要序列的含有类似物的化合物如苯并内酰胺或哌嗪(Adams等，1999；Nakanishi和Kahn，1996；Houghten等，1999；Nargund等，1998)。多种类型的肽模拟物质已在科学和专利文献中报道并为本领域技术人员所熟知。肽模拟物质(类似物)可包含例如一种或多种以下结构部分：还原的酰胺、羟基乙烯和/或羟乙胺等排体、N-甲基氨基酸、尿素衍生物、硫脲衍生物、环状尿素和/或硫脲衍生物、聚(酯酰亚胺)、聚酯、酯、胍衍生物、环状胍、咪唑酰基化合物、咪唑啉化合物、咪唑烷基化合物、内酰胺、内酯、芳香环、双环体系、乙内酰脲和/或硫乙内酰脲以及各种其他结构。许多类型的用于合成肽模拟物质的化合物可由许多商业来源获得(例如Peptide and Peptidomimetic Synthesis，Reagents for Drug Discovery，Fluka ChemieGmbH，Buchs，Switzerland，2000和Novabiochem 2000 Catalog，Calbiochem-Novabiochem AG，

Switzerland，2000)。肽模拟化合物和原型肽之间的相似性基于结构上和/或功能上的相似性。因此，所述肽模拟化合物模拟原型的性质以及，为了本发明的目的，它们的结合能力与其所类似的肽相似。肽模拟化合物可由例如并不出现在原型肽中的非天然氨基酸(诸如D-氨基酸或含有非天然侧链的氨基酸，或b-氨基酸等)构成，或者它们可认为由其他化合物或者结构单元构成或者能由其他化合物或者结构单元制成。合成肽模拟化合物的例子包括N-烷基氨基环状尿素、硫脲、聚酯、聚(酯酰亚胺)、双环胍、乙内酰脲、硫乙内酰脲和咪唑-吡啶-吲哚(imidazol-pyridino-inole)(Houghten等1999和Nargund等，1998)。这些肽模拟化合物可表征为是本发明的肽的“结构性或功能性类似物”。

为了本发明的目的，术语“靶向单元”表示一种化合物、肽或其结构性或功能性类似物，能选择性地靶向或选择性地结合肿瘤组织、肿瘤，以及优选的肿瘤基质、肿瘤实质和/或肿瘤的细胞外基质(ECM)。更具体而言，所述靶向单元可结合细胞表面、在细胞表面或细胞内部的特异性分子或结构，或者它们可以与存在于细胞之间的细胞外基质向结合。所述靶向单元也可与肿瘤脉管系统的内皮细胞或细胞外基质结合。所述靶向单元也可与转移的肿瘤块、肿瘤细胞和细胞外基质相结合。

通常，术语“靶向”或“结合”指本发明的靶向单元粘附、附着、亲和或结合于肿瘤、肿瘤细胞和/或肿瘤组织至所述结合能客观地例如通过对体外肿瘤活组织切片的体内或离体(ex vivo)的肽竞争实验，或者通过原位免疫染色，或者通过本领域技术人员已知的其他方法进行测量和测定的程度。肿瘤靶向是指所述靶向单元在施用于人或动物身体时能特异性地结合肿瘤。在本领域中用于该特异性结合的术语是“导向”。当结合足够牢固以经受正常样本处理如用生理盐水或其他生理上可接受的盐或缓冲溶液在生理pH下清洗和冲洗时，或者当与体内肿瘤目标的结合足够长使得所述效应器单元能对所述目标表现其功能时，可认为本发明的靶向单元和靶向剂与所述肿瘤目标在体外“结合”。

本发明的靶向剂或靶向单元与肿瘤的结合是“选择性的”，意指它们不与正常细胞和器官结合，或者与肿瘤相比与正常细胞和器官的结合程度明显更低。

本发明的靶向单元和物质的可药用、生理上可接受或诊断上可接受的盐和衍生物包括其盐、酯、酰胺、酰肼、N-取代酰胺、N-取代酰肼、异羟肟酸衍生物、脱羧基化和N-取代衍生物。其他合适的可药用衍生物可很容易地被本领域技术人员所确认。

本发明基于以下发现，即具有特定氨基酸序列或基序的一组线形或环形肽能选择性地在体内靶向肿瘤，尤其是NSCLC肿瘤，和选择性地在体外靶向肿瘤细胞。因此，本发明的肽在施用于人或动物受试对象时能选择性地与肿瘤结合，而不与体内的正常组织结合。

本发明的肿瘤靶向单元经由噬菌体展示库的生物淘选而鉴别。噬菌体展示是这样一种方法，通过该方法随机肽的库能通过将其编码DNA序列插入噬菌体基因组的基因III从而在噬菌体表面作为噬菌体衣壳蛋白pIII的一部分而进行表达。所述pIII库在每个噬菌体颗粒上展示每个单独肽的3～5份拷贝(Smith和Scott，1993)。

噬菌体展示肽库由生物淘选进行筛选以选择能与非小细胞肺癌特异性结合的肽。生物淘选的原理包括1)将均质化的组织样品暴露于噬菌体库，2)洗掉未结合的噬菌体，和3)回收(rescuing)与目标组织结合的噬菌体。重复步骤1～3可获得与初始噬菌体库的其他肽相比，具有与所述目标组织的高结合亲和性的高度富集的肽的精选集合。在本发明中，噬菌体展示肽库针对获取自非小细胞肺癌患者的原发性肿瘤组织样品进行淘选，在实施例部分进行详细描述。

本发明的靶向基序

令人惊讶的发现四氨基酸基序

X-R-Y-P

能靶向和表现出对肿瘤和肿瘤细胞，尤其是对NSCLC肿瘤的选择性结合，其中X是丙氨酸、丝氨酸或高丝氨酸，或其结构性或功能性类似物；R是精氨酸或高精氨酸，或其结构性或功能性类似物；Y是精氨酸、高精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、缬氨酸或脯氨酸，或其结构性或功能性类似物；P是脯氨酸或其结构性或功能性类似物。

尤其优选的本发明的基序是其中X是丙氨酸和Y是精氨酸的基序，即A-R-R-P。

优选为X是丙氨酸，或其结构性或功能性类似物，或者不具有侧链或者在其侧链中包含最多四个、更优选为最多三个、更再优选为最多两个非氢原子。丙氨酸的结构性或功能性类似物例如包括如下化合物的任何光学异构体，如：3-氯丙氨酸、3-氟-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氟-2-氨基丁酸、4-氯-2-氨基丁酸、3-氰基丙氨酸、3-环丙基丙氨酸、2-氨基-3-丁酸和2-氨基-3-丁酸。

在本发明的另一个优选实施方式中，X是丝氨酸或高丝氨酸或其结构性或功能性类似物，含有至少一个羟基或其他能形成氢键的含氧基团，优选为羟基。

丝氨酸或高丝氨酸的结构性或功能性类似物可例如是其同系物；或氨基酸、氨基醇、二氨基醇、三氨基醇、寡氨基醇或多氨基醇，或氨基酸类似物或衍生物，其含有至少一个羟基、酯化羟基、甲氧基、其他醚化羟(醚)基、酮肟基、醛肟基、异羟肟酸基、或酮羰基或醛羰基。

丝氨酸或高丝氨酸的结构性或功能性类似物的例子可以是以下物质的任何光学异构体：异丝氨酸、别苏氨酸、苯基异丝氨酸、2-氨基-3-(3，4-二羟基苯基)-3-羟基丙酸、S-(2-羟基乙基)-半胱氨酸、2-氨基-4-羟基戊二酸、O-磷-丝氨酸、O-硫-丝氨酸、抑胃酶氨酸(statine)、β-(2-噻吩基)丝氨酸、O-磷苏氨酸、2-氨基-3-甲氧基丙酸，以及甲状腺原氨酸、4-甲氧基-苯基丙氨酸、2-氨基-酪氨酸、3-氨基酪氨酸、3-碘酪氨酸、3，5-二溴酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、任何其他单卤代-或二卤代或三卤代或四卤代酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3，5-二硝基酪氨酸、O-磷酪氨酸、O-硫酪氨酸，以及化合物诸如2-氨基丙二酸、2-氨基丙二酸单乙酯和2-氨基-3-氧丁酸及其单酯。

根据本发明，R包括精氨酸、高精氨酸和刀豆氨酸的任何光学异构体；以及其结构性或功能性类似物，优选含有至少一个鸟嘌呤基(guanyl)、脒基(amidino)或者具有或通过质子化获得离域正电荷的相关基团。

精氨酸或高精氨酸的结构性或功能性类似物的例子包括：刀豆氨酸、2-氨基-8-胍基-辛酸、2-氨基-7-胍基-辛酸、2-氨基-6-胍基-辛酸、2-氨基-5-胍基-辛酸、2-氨基-7-胍基-庚酸、2-氨基-6-胍基-庚酸、2-氨基-5-胍基-庚酸、2-氨基-4-胍基-庚酸、2-氨基-5-胍基-己酸、2-氨基-4-胍基-己酸、2-氨基-3-胍基-己酸、2-氨基-4-胍基-戊酸和2-氨基-3-胍基-戊酸以及这些化合物的N-甲基化和二甲基化衍生物。

根据本发明，Y可选自由精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸或脯氨酸，或其结构性或功能性类似物组成的组。

精氨酸、丙氨酸和丝氨酸的结构性或功能性类似物的例子描述如上。

亮氨酸和缬氨酸的结构性或功能性类似物的例子包括：

(a)将至少一条支化、非支化或脂环结构作为其侧链或多条侧链，或者其侧链或多条侧链上包含至少一条支化、非支化或脂环结构的氨基酸和氨基酸类似物和衍生物(诸如氨基醇和多氨基酸)，所述支化链、非支化链或脂环族结构含有至少一个，优选至少两个相似或不同的选自由与至少一个碳、醚氧和硫醚硫相连的碳原子、硅原子、卤素原子组成的组的原子；或者

(b)支化、非支化或环状非芳香、亲脂或疏水氨基酸或氨基酸类似物或其衍生物或结构性或功能性类似物，或者具有一个或多个亲脂碳硼烷类型或其他亲脂性含硼侧链或其相当物或其他亲脂笼型结构的氨基酸或羧酸或氨基酸类似物或衍生物或羧酸类似物或衍生物。

Y因此例如可以是以下物质的任何光学或几何异构体：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基-2-甲基丙酸、2-氨基-4，4-二甲基-戊酸、4，5-脱氢亮氨酸、2-氨基-6-异丙基氨基-己酸、4-氨基-6-甲基庚酸、3-氨基-6-甲基庚酸、2-氨基-6-甲基庚酸、叔亮氨酸、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸、4-氨基-5-环己基-戊酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-3-环己基丙酸、2-氨基-4-环己基丁酸、2-氨基-3-环戊基丙酸、2-氨基-4-环戊基丁酸、2-氨基-3-环丁基丙酸、2-氨基-4-环丁基丁酸、2-氨基-3-环丙基丙酸、2-氨基-4-环丙基丁酸、2-氨基-3-(1-环戊基)-丙酸、2-氨基-4-(1-环戊基)-丁酸、2-氨基-3-乙硫基丙酸、2-氨基-3-甲硫基丙酸、3-氟丙氨酸、3-氯丙氨酸、3，3-二环己基丙氨酸、2-氨基-3-丙烯酸、2-氨基-4，4-二甲基戊酸或抑胃酶氨酸，或上述任何一种的N-甲基类似物、上述任何一种的N-乙基类似物、上述任何一种的其他N-烷基类似物、上述任何一种的α-甲基类似物(2-甲基类似物)、上述任何一种的α-乙基类似物(2-乙基类似物)、上述任何一种的α-烷基类似物(2-烷基类似物)；或2-氨基丁酸、2-氨基-2-甲基丙酸、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸、4-氨基-5-环己基戊酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-3-环己基丙酸、2-氨基-4-环己基-丁酸、2-氨基-3-乙硫基丙酸、2-氨基-3-甲硫基丙酸、2-氨基-4，4-二甲基戊酸、别异亮氨酸、4，5-脱氢亮氨酸、2-氨基-6-异丙基氨基-己酸、正亮氨酸、正缬氨酸、抑胃酶氨酸、4-氨基-6-甲基庚酸、3-氨基-6-甲基庚酸、2-氨基-6-甲基庚酸或上述任一种的N-甲基类似物、或上述任一种的N-乙基类似物、其他N-烷基类似物、α-甲基类似物(2-甲基-类似物)、α-乙基类似物(2-乙基类似物)或其他α-烷基类似物(2-烷基类似物)。

根据本发明，R和Y还可以共同构成一个单元，所述单元含有精氨酸或高精氨酸的任意光学异构体，或其类似物，其含有至少一个鸟嘌呤基或脒基或带有或者可通过质子化获得离域正电荷的相关基团。

根据本发明，P包括脯氨酸的任何光学或几何异构体；以及其结构性或功能性类似物，含有杂环或碳环结构，或含有双键的结构；其中所述类似物优选具有与脯氨酸相近或相似的空间或成缺口性质。

本发明的基序X-R-Y-P可成为更大结构诸如肽或一些其他结构的一部分。被讨论的化合物或结构还可包含多于一个的基序X-R-Y-P，并且所述基序的取向和方向可变。

本发明的靶向单元

已发现此处定义的含有本发明的肿瘤靶向基序的肽，包括其结构性或功能性类似物可靶向肿瘤，尤其是肺部肿瘤和非小细胞肺癌细胞肿瘤并显示出与所述肿瘤的选择性结合。含有本发明的肿瘤靶向基序的肽，以及至多七个附加氨基酸残基或其类似物，同样表现出如此的靶向和选择性结合，并且是本发明的特别优选实施方式。

该肽用作本发明的靶向单元是极其有利的，例如这是因为其尺寸小和其合成简单可靠廉价。由于本发明的肽的尺寸小，纯化、分析和质量控制简单易行并且是商业可行的。

优选的本发明的肿瘤靶向单元包括如上定义的肿瘤靶向基序X-R-Y-P，并且附加的残基选自由天然氨基酸；非天然氨基酸；至多含有30个非氢原子和数目不受限制的氢原子的氨基酸类似物；以及分子量和/或结构式量最大为270的其他结构单元和残基所组成的组，其中所述附加残基的数目为0～7，优选为0～6，优选为0～5，优选为0～4并最优选为0～3。

本发明的靶向单元优选为线形的。本发明的线形肽可快速、简单、廉价地制备，这是由于它们在合成后不需要任何进一步的处理(环化等)，以及不需要环化所需的复杂正交基团和其他保护基团以及额外的官能性基团。此外，向线形肽连接另外的单元更加容易，例如这是因为没有必要“保留”用于环化的官能团，或使用昂贵复杂的正交保护等。在本发明的一些优选实施方式中，在例如其中期望快速清除的诊断应用中，与使用降解更加缓慢的物质相比，线形肽在人体内有效率的降解是有利的。

在本发明的另一实施方式中，环状肽可以是优选的。因此，本发明的靶向单元也可以是环状的。在体内和许多其他生物体系中环状肽通常比其非环状对应物更稳定，这在本领域内是公知的。为某些目的，例如在某些治疗应用中，高度优选更稳定的本发明的肽。

本发明的优选靶向单元可含有序列

X-R-Y-P-Z_n

其中，X-R-Y-P是如上定义的肿瘤靶向基序，Z是氨基酸残基或其结构性或功能性类似物，而n是0～7的整数，优选为0～6，0～5，0～4并最优选0～3。

特别优选的靶向单元是其中Z为除组氨酸或色氨酸之外的任何氨基酸残基的靶向单元。特别优选的是其中Z_n含有以下至少一种：赖氨酸、亮氨酸或天冬氨酸或其结构性或功能性类似物的靶向单元。

赖氨酸的结构性或功能性类似物的例子包括赖氨酸、鸟氨酸的任意光学异构体，及其结构性和/或功能性类似物，优选含有至少一个带有正电荷或能通过质子化带上正电荷的氨基或具有取代基的氨基或其他含氮基团。

天冬氨酸的结构性或功能性类似物的例子包括谷氨酸或天冬氨酸的任意光学异构体，及其结构性或功能性类似物，其含有至少一个能形成氢键的氧原子，并优选为含有至少一个羧基、酯化羧基、异羟肟酸官能团、酯化异羟肟酸官能团、醇羟基或酚羟基、酯化醇羟基或酚羟基、酮基或醛基，并更优选为含有至少一个羧基、酯化羧基、异羟肟酸官能团、酯化异羟肟酸官能团、醇或酚羟基、酯化醇或酚羟基，再更优选为含有至少一个羧基、酯化羧基、异羟肟酸官能团、醇羟基、酯化醇羟基，最优选为含有至少一个羧基或酯化羧基；或含有一个或一个以上的其他氧酸性官能团，优选为选自以下的组：-SO₃ ^-，-OSO₃ ^-，任何无机磷基团或其酯。

优选的本发明的靶向单元包括选自由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.73所确定的肽所组成的组的靶向单元。高度优选的本发明的靶向单元包括ARRPKLD(SEQ ID NO.1)、SRRPKLD(SEQ ID NO.65)、ARRP(SEQ IDNO.66)、SRAP(SEQ ID NO.67)、ARAP(SEQ ID NO.68)、SRVP(SEQ IDNO.69)、SRLP(SEQ ID NO.70)、ARLP(SEQ ID NO.71)、ARPP(SEQ ID72)、SRRP(SEQ ID NO.73)。

本发明的靶向剂

还已发现含有至少一个本发明的肿瘤靶向单元，和至少一个效应器单元的靶向剂能靶向癌症细胞和癌症组织并显示出与之的选择性结合。

本发明的肿瘤靶向剂可选地包括诸如连接子、溶解性调节子、稳定子、电荷调节子、间隔子、胞溶或反应或反应性调节子、内在化(internalizing)单元或内在化增强剂或膜相互作用单元或其他局部路径、附着、结合和分布影响单元。本发明的肿瘤靶向剂的该附加单元可为所述目的通过任何合适的方法相互连接。

所讨论的类型以及相关类型的结构、分子和基团相互连接的多种可能对于本领域技术人员而言是公知的。各种单元可相互直接连接或者在一个或多个相同的、相似的和/或不同的连接单元的辅助下连接。本发明的肿瘤靶向剂可具有诸如任何以下示例性显示的非限制性类型的不同结构：

其中EU指“效应器单元”，TU指“靶向单元”，而n、m和k独立地为除0之外的整数。

在本发明的靶向剂中，如在许多其他药物和其他物质中那样，含有间隔子或连接子如氨基酸及其类似物(如长链ω-氨基酸)将是明智的，从而防止所述靶向单元被空间或电子“扰乱”，或者另外被效应器单元或所述靶向剂的其他单元所阻碍或“掩藏”。

在本发明的靶向剂中，为提高活性而例如利用枝形或者环状结构从而提供在每个靶向单元中引入多个效应器单元或附加单元的可能性将是有用的。

本发明的优选靶向剂包括结构EU-TU-OU、TU-EU-OU或TU-OU-EU，其中TU是如上确定的本发明的靶向单元；而EU和OU是效应器或选自由如下组成的组的可选单元：

效应器单元、连接子单元、溶解性调节子单元、稳定子单元、电荷调节子单元、间隔子单元、胞溶和/或反应和/或反应性调节子单元、内在化和/或内在化增强子和/或膜相互作用单元和/或其他局部途径和/或局部附着/局部结合和/或分布影响单元、吸附增强子单元和其他相关单元；以及

包含至少一个该单元的肽序列和其他结构；以及

包含不超过20个，优选为不超过12个，更优选为不超过6个天然和/或非天然氨基酸的肽序列；以及

包含不超过25个非氢原子和无数目限制的氢原子的天然和非天然氨基酸；

以及其盐、酯、衍生物和类似物。

效应器单元

为了本发明的目的，术语“效应器单元”(EU)指分子或自由基或其他化学实体或大颗粒如胶状颗粒等；脂质体、纳米颗粒或微粒。合适的效应器单元还可包括纳米装置或纳米芯片等；或者任意上述物质的组合，以及可选地包括用于所述效应器单元的组成部分相互连接或与所述靶向剂的其他部分相连接的化学结构。效应器单元也可包含能调节所述效应器单元的稳定性或溶解性的部分。

优选的由本发明的效应器单元所提供的效应是对靶定肿瘤的治疗性(生物、化学或物理)效应；为治疗目的使肿瘤或肿瘤细胞能被检测或成像的性质；或者与所述靶向剂在不同应用中的用途相关的结合能力。

优选的本发明的效应器单元的(生物)活性是治疗效应。例如，所述治疗活性的例子为例如细胞毒性、细胞抑制性效应、导致细胞分化或提高其分化程度或导致表型变化或新陈代谢变化的能力、趋化性活性、免疫调整活性、疼痛缓解活性、放射活性、影响细胞周期的能力、导致细胞凋亡的能力、荷尔蒙活性、酶活性、转染细胞的能力、基因转移活性、介导一个或多个基因的“敲除”的能力、导致基因置换或”嵌入“的能力、降低、抑制或阻断基因或蛋白表达的能力、抗血管形成活性、从外界辐射或电场或磁场收集热或其他能量的能力、影响细胞基因信息或外部相关信息的转录、翻译或复制的能力，以及影响转录后或翻译后事件等等。

由本发明的效应器单元赋予的其他优选治疗性途径可基于热(慢)中子的使用(通过中子俘获造成合适的核辐射)，或施用能水解例如酯键或其他键的酶，或施用本发明的靶定酶。

适于检测的本发明的效应器单元的优选功能的例子是放射性、顺磁性、铁磁性、铁氧体磁性或任何类型的磁性，或能被NMR谱检测的能力，或能被EPR(ESR)谱检测的能力，或PET和/或SPECT成像的适用性，或免疫原结构的存在，或抗体或抗体片段或抗体型结构的存在，或金颗粒的存在，或生物素或抗生物素蛋白或其他蛋白的存在，和/或发光和/或荧光和/或磷光活性或能增强肿瘤、肿瘤细胞、内皮细胞及转移在电子显微镜、光学显微镜(UV和/或可见光)、红外显微镜、原子力显微镜或隧道显微镜下被检测到的能力，等等。

本发明的效应器单元的优选结合能力包括，例如：

a)例如通过螯合与金属离子相结合的能力，

b)与细胞毒性、细胞凋亡或新陈代谢影响物质或能原位转变为该物质的物质相结合的能力，

c)与诸如组氨酸标签或其他标签等物质或结构相结合的能力，

d)与酶或改性酶相结合的能力，

e)与生物素或其类似物相结合的能力，

f)与抗生物素蛋白或其类似物相结合的能力，

g)与在细胞粘着、迁移或细胞内信号传递中涉及的整联蛋白或其他物质相结合的能力，

h)与噬菌体相结合的能力，

i)与淋巴细胞或其他血细胞相结合的能力，

j)由于通过生物淘选或其他方法选择的抗体或结构的存在而与任何预选材料相结合的能力，

k)与用于信号产生或放大的材料相结合的能力，

l)与治疗性物质相结合的能力。

该结合可以是例如螯合、形成共价键、抗体抗原型亲和、形成离子对或离子缔合，抗生物素蛋白-生物素型的特殊相互作用等的结果，或者是任何类型或模式的结合或亲和的结果。

一个以上的效应器单元或其部分也可以是靶向单元本身的一部分。因此，所述效应器单元可例如是所述靶向单元的一个或多个原子或核，诸如放射性原子或能被使得产生放射性的原子，或顺磁性原子或易被MRI或NMR谱检测到的原子(诸如碳-13)。更多的例子是例如含硼结构如碳硼烷型亲脂性侧链。

所述效应器单元可通过任何类型的键或结构或其任意组合与所述靶向单元相连接，所述任何类型的键或结构或其任意组合足够强使得大部分，或者优选为全部或基本全部的所述靶向剂的效应器单元能与所述靶向单元在基本(必需)靶向过程中能保持相连，例如在处于研究或治疗之中的人类或动物受试对象内或者生物样品中。

所述效应器单元或其某些部分可保持与所述靶向单元相连，或者通过自发化学反应或平衡，或者通过自发酶过程或其他生物过程，或者作为目的性操作或步骤例如施用水解性酶或其他化学物质的结果，效应器单元能从所述靶向单元上部分或者完全水解，或者以其它方式分离。也可通过施用靶定的物质如根据本发明的酶引起或增强所述酶过程或其他反应。

一种可能是所述效应器单元或其某些部分通过一种以上的各种在肿瘤中(例如在细胞内、在细胞膜中或在细胞外基质中)或在其周边位置存在的各种水解酶的作用从所述靶向剂水解或水解为更小的单元。

考虑到本发明的所述定靶可以是非常快速的，在体内随处可发生的非特异性水解可被有目的的接受和用于具有目的性地水解一个以上的效应器单元，由于所述水解可处于合适的情况之中(例如空间位阻，或者甚至没有任何该位阻效应)，如此之慢使得尽管存在躯体的水解酶，所述靶向剂仍能安全地靶向，如本领域技术人员所能很好地理解的那样。在水解后形成不溶性产物或被快速吸收入细胞或与其表面结合的产物对于所述靶向效应器单元或其片段等保持在所述肿瘤或其最近的位置是有利的。

在本发明的一个优选实施方式中，所述效应器单元可包括使之可能直接或间接导致“放大”治疗效果或其他效果、信号检测、与预先确定的物质包括生物材料、分子、离子、微生物或细胞结合的结构、特征、片段或分子等。

该“放大”可例如基于一种以上的以下非限制性类型：

-通过所述效应器单元，与能再结合其他物质(例如抗体、荧光抗体、其他“标记“物质、诸如抗生物素蛋白等物质)的其他材料的结合，优选使得所述其他材料的多个分子或“单元”能与每个效应器单元相结合；

-所述效应器单元含有超过一个能结合例如蛋白的实体，因此可直接放大；

-在多于一步的步骤中放大。

优选的本发明的效应器单元可选自以下的组：

-细胞抑制剂或细胞毒剂

-致细胞凋亡剂或细胞凋亡增强剂

-酶或酶抑制剂

-抗代谢物

-能扰乱膜功能的试剂

-放射性或顺磁性物质

-含有一种以上的金属离子的物质

-含有硼、钆、锂的物质

-适用于中子俘获疗法的物质，例如硼或碳硼烷

-标记物质

-插层剂(intercalator)以及包含插层剂的物质

-氧化剂或还原剂

-核苷酸及其类似物

-金属螯合物或螯合剂。

在非常优选的本发明的实施方式中，所述效应器单元包括α辐射体。

在另一本发明的优选实施方式中，所述效应器单元可包括铜螯合剂如反式-二(水杨基醛肟)铜(II)及其类似物，或者铂化合物如顺铂和卡铂。

更具体而言，为与铂化合物组合治疗晚期NSCLC，可使用以下试剂或其结构性或功能性类似物：有丝分裂抑制剂/紫杉烷类如紫杉醇或紫杉萜、或抗代谢物如吉西他滨(gemsitabine)或甲氨蝶呤(metotrexate)、或长春花碱如长春瑞滨或长春新碱，或烷化剂如异磷酰胺或环磷酰胺，或抗生素如博来霉素或丝裂霉素、或拓扑异构酶抑制剂如伊立替康或拓扑替康(topotecane)。

已知不同类型的结构、物质和组能用于引起或增强例如使之进入细胞的内在化，例如包括RQIKIWFQNRRMKWKK；Penetratin(Prochiantz，1996)，以及硬脂基衍生物(Promega Notes Magazine，2000)。

作为可诱导细胞凋亡的结构，可以包括例如已报道的可与线粒体膜内侧细胞相互作用的肽序列KLAKLAK(Ellerby等，1999)。

为用于包括细胞分选或任何相关应用在内的本发明的实施方式，例如可使用本发明的靶向单元和试剂

a)与磁性颗粒结合或相连，

b)吸附、结合、链接或连接至塑料、玻璃或其他固体、多孔、纤维材料型或其他表面等，

c)吸附、共价键合或以其它方式链接、结合或连接至一种以上的能用于柱子或相关体系的物质或材料，

d)吸附、共价键合或以其它方式链接、结合或连接至一种以上的能被沉淀、离心或以其它方式分离或去除的物质或材料。

本发明的靶向剂的可选单元(OU)

本发明的靶向剂和靶向单元可以可选地包含其他单元，诸如：

用于靶向单元、效应器单元或其他本发明的可选单元之间相互结合的连接子单元；

用于改变所述靶向剂或其水解产物的溶解性的溶解性调节单元；

在合成、改性、处理、储存或在体内或体外使用时，用于使所述靶向单元或试剂的结构稳定的稳定子单元；用于改变所述靶向单元或试剂或其起始材料的电荷的电荷调节单元；

用于增加所述靶向剂或其起始材料的特定单元之间的距离，用于释放或降低所述产物或其起始材料的空间位阻或结构应力的间隔子单元；

反应性调节子单元；

用于增强所述靶向剂的靶向或摄取的内在化单元或增强子单元；

吸附增强子单元，如，例如能增强所述靶向剂在体内的吸附的脂溶性或水溶性结构；或者

其他相关单元。

大量合适的连接子单元在本领域内已知。合适的连接子的例子有：

1.用于连接含有氨基的单元：环酐、二羧基或多价的可选为活化或非活化的羧酸、具有两个以上活性卤素的化合物或具有至少一个活性卤素原子和至少一个羧基的化合物；

2.用于连接含有羧基或其衍生物的单元：具有至少两个相似或者不同基团的化合物，所述基团诸如氨基、具有取代基的氨基、羟基、-NHNH₂或其具有取代基的形式、用于所述目的的其他已知基团(可使用激活物)；

3.用于连接氨基和羧基：例如氨基酸或其活化或保护形式或衍生物；

4.用于连接甲酰基或酮基至其他基团：含有例如至少一个-N-NH₂或-O-NH₂或＝N-NH₂基团或其相似物的化合物；

5.用于连接数个含有氨基的单元：多羧基物质如EDTA、DTPA或多羧酸或其酸酐、酯或酰氯；

6.用于连接含有氨基的物质至含有甲酰基或羧基的物质：肼羧酸或其相似物，优选为所述肼部分或者羧基受保护或被活化，诸如4-(FMOC-肼基)苯甲酸；

7.用于连接有机结构至金属离子：能与所述有机结构(例如依靠其COOH基团或其NH₂基团)或者是其主要部分结合，以及另外包含多羧基部分的物质，例如类EDTA-或类DTPA-结构，含有多个组氨酸或其相似物的肽，含有多个半胱氨酸或其他具有-SH基的部分的肽，或其他含有可用于使其与有机结构相连的官能团的螯合剂。

大量上述物质以及其他类型的合适的连接剂在本领域内是公知的。

大量合适的溶解性调节子单元在本领域内是公知的。合适的溶解性调节子单元包括，例如：

-用于提高水溶解性：含有SO₃ ^-、O-SO₃ ^-、COOH、COO^-、NH₂、NH₃ ⁺、OH、磷酸基、胍基或脒基、或其他离子或可离子化的基团或糖型结构的分子；

-用于提高脂溶性或在有机溶剂中的溶解性：含有(长)脂肪族支化或非支化烷基或烯基、环状非芳香族基团如环己基、芳香环或甾族结构的单元。

大量在本领域内已知的单元可用作稳定子单元，例如用于增加空间位阻的大体积结构(诸如叔丁基、萘基和金刚烷基和相关基团等)，和用于防止或阻碍酶水解的D-氨基酸或其他非天然氨基酸(包括β-氨基酸、ω-氨基酸、具有非常巨大侧链的氨基酸等)。

含有正、负或两种类型电荷的单元能用作电荷调节子单元，也可以是能转变或能被转变为带有正、负或两种类型电荷的单元的结构。

间隔子单元可能非常重要，需要使用该单元取决于所述结构的其他部分(例如所使用的生物激活物的类型，以及其作用机理)和所使用的合成步骤。

合适的间隔子单元可包括例如长脂肪族链或糖型结构(以避免过高的亲脂性)，或大环。在本领域内可得到合适的化合物。间隔子单元的一个优选基团是具有长链的ω-氨基酸。该化合物也可(同时)用作含有氨基的单元和含有羧基的单元之间的连接子单元。许多这样的化合物以其本身以及以其各种被保护衍生物的形式均可商购获得。

在其中希望所述效应器单元为内在化、细胞内或细胞外DNA结合或受体结合从所述靶向剂上分离的情况下，易被水解(或者是自发化学水解或者是被体内自身的酶或向患者施用的酶水解)的单元是非常有利的。用于该目的的合适单元包括，例如，含有一个以上的酯或缩醛官能度的结构。各种蛋白酶可用于所述目的。用以制造前药的许多基团可适用于提高或引起水解、胞溶反应或其他降解过程的目的。

本发明的效应器单元，靶向单元和可选单元可同时发挥多种功能。因此，例如，靶向单元可同时为效应器单元或者含有数个效应器单元；间隔子单元可同时为连接子单元或电荷调节子单元或者为二者；稳定子单元可以是具有与其他效应器单元不同性质的效应器单元，等等。效应器单元也可例如具有数个相似或甚至完全不同的功能。

在本发明的一个优选实施方式中，所述肿瘤靶向剂含有超过一个的不同效应器单元。在该情况下，所述效应器单元可以是例如诊断单元和治疗单元。因此，例如，优选为使用该试剂用于硼中子俘获疗法，所述试剂的效应器单元，除含有硼原子之外，在施用该所述试剂之后还能在患者体内被检测或量化，用以确定所述试剂在需要被治疗的肿瘤内已经充分地积累，或者用以优化中子疗法的时机，等等。该目标可通过例如使用本发明的含有效应器单元的靶向剂来实现，其中所述效应器单元含有可被例如NMRI检测到的硼原子(优选富含同位素的硼)和基团。同样地，也优选存在超过一种类型的治疗用效应器单元。此外，如果需要，所述靶向单元和靶向剂可与一种或多种“经典的”或其他肿瘤治疗方式如手术、化学疗法、其他靶向手段、放射疗法、免疫疗法等组合使用。

本发明的靶向单元和试剂的制备

本发明的靶向单元优选为合成肽。可通过大量已知技术合成肽，诸如固相法(FMOC-、BOC-和其他保护方案、各种树脂类型)、溶液法(FMOC、BOC和其他不同方案)以及这些方法的组合。甚至可商购获得用于该目的的自动装置/设备，因为也是常规的例行合成和纯化服务。所有这些方法对本领域技术人员都是广泛已知的。例如一些方法和材料在以下参考文献中得以描述：

Bachem AG，

(1999)，The BACHEM Practise of SPPS(2000)，Bachem 2001 catalogue(2001)，Novabiochem 2000 Catalog(2000)，Peptideand Peptidomimetic Synthesis(2000)和The Combinatorial ChemistryCatalog&Solid Phase Organic Chemistry(SPOC)Handbook 98/99。肽合成在实施例中也有举例说明。

如本领域内已知，通常明智、重要和/或必要的是使用一个或多个保护基团，大量保护基团在本领域内是已知的，诸如FMOC、BOC和三苯甲基和其他在实施例中提到的保护基团。保护基团通常用于保护氨基、羧基、羟基、鸟嘌呤基和-SH基团，以及任何反应性基团/官能团。

如本领域技术人员所知，活化通常涉及羧基官能团活化和/或氨基活化。

保护也可以是正交的和/或半/准/假-正交的。保护基团和活化基团、物质及其使用在实施例中举例说明并在此处引用的参考文献中得以描述，在本领域广泛已知的大量书籍和其他信息来源中也得以描述(例如Protective Groups in Organic Synthesis，1999)。

用于固相合成的树脂在本领域中也是公知的，并在实施例和上述引用文献中得以描述。

环肽通常在生物环境中特别稳定，并因此是优选的。本发明的环状结构可通过基于使用正交保护的氨基酸而合成，在例如国际专利公报WO2004/031219中得以描述，在此以引用的方法引入。

本发明的靶向单元和试剂也可制备为融合蛋白或者通过本领域内已知的其他合适的重组DNA法制备。如此制备本发明的肽的方法在效应器单元和/或其他可选的单元是肽或蛋白质时尤其优选。有用的蛋白效应器单元的一个例子是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

本发明的靶向单元和靶向剂的优势

涉及旨在用于诊断或治疗应用的肽有已知的问题。其中一个问题源自序列的长度：序列生长得越长，所需产品的合成将变得越困难，尤其是如果还有其他合成问题，诸如存在要求保护-脱保护或引发副反应的难以操作的残基。

与已知的含有较长的难以制备的具有引发问题的氨基酸残基的序列的肽相比，本发明的肽显然更加优异。本发明的靶向单元可简单可靠地合成。与许多现有技术的肽相比的一个优点是本发明的靶向单元和基序不需要含有引发问题的碱性氨基酸赖氨酸和组氨酸，也没有色氨酸，它们在肽合成中均引起严重的副反应，并且由此使得所需产物的产率完全降低或者甚至不能得到足够量或者足够品质的产物。

由于其较小的尺寸以及因此在合成中非常少的步骤，本发明的肽与现有技术的大多数靶向肽相比可以更加容易和廉价地制造。

由于在本发明的制备中不需要组氨酸，因此不必顾虑外消旋化的风险。不考虑组氨酸的任何外消旋化不仅对本发明的产物的经济合成，而且对纯化和分析和质量控制都是非常大的优点。这还使得对人和动物的任何施用都变得更加安全和简单。

由于所述靶向单元的较小尺寸，整体成本明显降低并由于更加简单可靠的纯化，可以更大量地获得更好的产物。此外，所述纯化的可靠性更好，更少顾虑在治疗和诊断应用中的毒性残留物、致命性或者其他一些严重的副作用。

由于其高溶解性、特异性、无毒性和非免疫原性，本发明的靶向单元也是高度有利的。现有技术的靶向肽的一个严重问题是其水溶性或普遍溶解性通常非常低或者甚至极其低。因此迫切需要易于合成和纯化的具有良好靶向性和优异溶解性的靶向肽。本发明提供了通过以下方式解决该严重问题的方法，即提供具有优异靶向性质，可以简单廉价的合成和纯化，以及在水中具有极其好的溶解性，甚至能与极其疏水的碳硼烷结合的靶向肽。

在本发明的靶向剂的固相合成中，当所述靶向肽还与树脂相连时，可将效应器单元和可选的其他单元与所述靶向肽相连，而不用担心保护基团的脱去将导致所述效应器或可选单元破坏的风险。溶液合成具有类似的优点。

本发明以及本发明的产物、方法和用途的另一重要优点在于所述产物的高选择性和有效的靶向。

与使用抗体或抗体片段的靶向疗法相比，由于多种原因，本发明的产品和方法具有非常大的优势。在大生物分子的情况下，潜在的免疫和相关风险是显而易见的。与诸如本发明的靶向剂、单元和基序的合成小分子相比，该产品还须非常担心过敏反应。

与靶向抗体或抗体片段相比，在本发明中描述的产物和方法是非常具有优势的，这是因为其结构在需要和要求时可很容易被改变。如果需要，可以去掉特定的氨基酸如组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苏氨酸，并且非常少的官能团是必须的。另一方面，可包括各种不同的结构单元以获得在特定的应用中具有特别价值的特别希望具有的性质，而不妨碍所述靶向效果。

本发明的靶向剂的用途

由于如实施例所示，其可在体内选择性地靶向肿瘤，尤其是NSCLC肿瘤，因此本发明的靶向单元和靶向剂可用于癌症诊断和治疗。所述效应器单元可根据所需的效果、检测或疗法进行选择。所需效果也可通过在所述靶向单元中直接包含效应器来实现。为用于放射疗法，所述靶向单元本身可例如被放射性标记。

本发明还涉及含有有效量的至少一种本发明的靶向剂的诊断组合物。本发明的靶向剂的诊断有效量为1飞摩尔～10毫摩尔，这取决于例如所选择的效应器单元。除所述靶向剂之外，本发明的诊断组合物可选地包括载体、溶剂、媒介、悬浮剂、标记剂和其他在诊断组合物中通常使用的添加剂。该诊断组合物可用于诊断肿瘤、肿瘤细胞及转移，特别是肺部肿瘤，更特别是非小细胞肺癌肿瘤和NSCLC型的腺癌。

本发明的诊断组合物可配制为液体、凝胶或固体制剂或者为吸入式制剂等，优选为水性液体，含有本发明的靶向剂的浓度为约1×10^-10mg/l～25×10⁴mg/l。所述组合物可进一步包含稳定剂、去污剂如聚山梨醇酯，以及其他添加剂。这些成分的浓度可根据所使用的制剂而明显变化。所述诊断组合物可体内或体外使用。

本发明还包括所述靶向剂和靶向单元在制造用于治疗癌症的药物组合物中的用途。

本发明还涉及含有治疗有效量的至少一种本发明的靶向剂的药物组合物。通过施用治疗有效剂量的含有本发明的靶向剂或靶向单元的药物组合物或其可药用盐、酯或其他衍生物，所述药物组合物可用于治疗、预防或缓解癌症疾病。所述组合物也可包括靶向剂和靶向单元以及标记剂、成像剂、药物和其他添加剂的不同组合。

本发明的靶向剂的治疗有效量可根据所述药物组合物的制剂而变化。优选为，本发明的药物组合物可含有的靶向剂的浓度为约0.00001mg/l～250g/l，更优选为约0.001mg/l～50g/l，最优选为0.01mg/l～20g/l。

本发明的药物组合物可用于施用本发明的靶向剂。适用于口服使用、静脉内或局部注射、或输液、或吸入的药物组合物是特别优选的。所述药物组合物可体内或体外使用。

所述制剂可冻干并在施用前重新配制，或者例如作为溶液、悬浮液、悬浮-溶液等进行保存以备施用或者处于任何普通的形式和形状，包括粉末、浓缩物、冷冻液体以及任何其他类型。它们也可由分开的几部分构成，所述几部分将在使用前被混合，以及可被加工和/或处理。液体制剂提供了无需重新配制即可施用的优点。所述溶液产品的pH为约1～约12、优选为接近生理pH。所述溶液的摩尔渗透压浓度可用例如氯化钠和/或糖、多醇和/或氨基酸和/或相似成分调节至预定值。所述组合物可进一步包括可药用赋形剂和/或稳定剂，诸如白蛋白、糖和各种多醇，以及任何可接受的添加剂，或其他活性成分如化学疗法试剂。

本发明还涉及通过向需要该治疗的患者施用治疗有效剂量的本发明的药物组合物从而治疗癌症、尤其是实体肿瘤的方法。

可在体外或体内测试体系中测试可用的靶向剂和靶向单元从而经验性地确定治疗剂量。合适的治疗有效剂量可随后由这些实验进行估计。

为口服施用，重要的是所述靶向单元和靶向剂是稳定的并能从肠道中充分吸收。

本发明的药物组合物可系统性地、非系统性地、局部地或局部性地、肠胃外以及非肠胃外使用，例如皮下、静脉内、肌肉内、口部、鼻内施用，通过肺部气雾剂或粉末施用，通过注射或输液进入特定器官或区域，口腔、颅腔内(intracranically)或腹膜内施用。

本发明的肿瘤靶向剂的用量和施用方案可容易地由治疗癌症的临床领域的技术人员确定。通常，所述剂量根据以下考虑而变化，例如：采用的靶向剂类型；年龄；健康；被治疗对象的医疗状况；如果有的话，同时进行治疗的种类；治疗的频率和所期待的效果的性质；性别、症状持续时间；和任何可能有的禁忌，以及其他可由个人医师调整的变量。向人类患者施用的本发明的靶向单元或试剂的优选剂量例如作为日剂量以单次(bolus)或多次施用为每kg体重约1×10^-9mg～约40mg或。

本发明的靶向单元和靶向剂和药物组合物也可用作靶向装置用于输送DNA或RNA或其结构性或功能性类似物，诸如硫代磷酸或肽核酸(PNA)进入肿瘤或其转移，或者输送至体外的分离细胞和器官；即用作体内和体外基因疗法的工具。在这些情况下，所述靶向剂或靶向单元可以是病毒衣壳或包膜的一部分，或者是脂质体或其他DNA/RNA或相关物质的“容器”的一部分，或者直接与DNA/RNA或上述提到的其他分子结合。特别优选的本发明的实施方式是含有TU作为氨基酸链或其结构性或功能性类似物，EU作为PNA或其类似物，通过肽键相互连接作为一邻接分子的靶向剂。该靶向剂也可用于小干扰RNA(siRNA；在该情况下“siPNA”)的细胞内运输以用于基因表达的基因产物特异性抑制(沉默)。

本发明还包括用于体内或体外诊断、检测或分析癌症或者癌细胞的试剂盒或试剂盒的成分。该试剂盒包括至少一种本发明的靶向剂或靶向单元和使之能进行检测的诊断实体。所述试剂盒可例如包括靶向剂或靶向单元，所述靶向剂或靶向单元与用于通过例如免疫方法、放射或酶方法或其他本领域已知的方法进行检测的单元相结合。

此外，本发明的靶向单元和试剂以及靶向基序和序列能用作先导化合物以设计用于上述任何目的的肽模拟物。

再此外，本发明的靶向单元和试剂以及靶向基序和序列，以其原样或者与其他材料相结合，可用于细胞、分子和相关生物目标的分离、纯化和鉴别。

给出以下实施例以进一步描述本发明的优选实施方式，但并非旨在限制本发明的范围。对本领域技术人员显而易见的是，随着技术进步，发明性概念可以多种方式实现。本发明及其实施方式并不受限制于上述实施例并可在所述权利要求的范围内变化。

实施例

实施例1

患者试样生物淘选的常规筛选方法

噬菌体展示库。采用根据Smith和Scott(1993)的标准步骤。用于筛选临床试样的噬菌体展示库在fUSE5载体中克隆，并为结构X7和X10，因此为含有七个或十个随机的氨基酸的线形。所述库可单独使用或作为混合物使用。将E.coli株K91kan用作噬菌体增殖的宿主。

减式淘选(subtractional panning)。生物淘选开始于删减与正常肺结合的噬菌体克隆。将取自外科肺切除术的、在肿瘤解剖中移取的正常肺组织放置于冰冷却的DMEM(Dulbecco介质)，其中含有蛋白酶抑制剂(PI)；10mM PMSF(对甲基-磺酰基氟化物，Para-methyl-sulphonyl-fluoride)、抑肽酶(10mg/ml)、亮肽素(10mg/ml)。用刀片在1ml的DMEM-PI中的小细胞培养板中将组织试样切碎。将所述试样转移至eppendorf管并用1ml DMEM-PI清洗。

将试样在4000rpm离心5分钟，然后与噬菌体(来自于一个或多个肽库)的10¹⁰转化单元(TU)在1ml DMEM-PI中在25℃温育45分钟。之后，将试样用含有1％BSA(牛血清白蛋白)的DMEM-PI清洗三次。

在25℃，将1ml在含有100μg/ml卡那霉素(kan)的LB(Lurian broth)中的K91kan细菌，OD600(600nm的光密度)1～1.5，用含有噬菌体颗粒但未与正常肺组织相结合的上清液感染25分钟。在感染后，用含有100μg/mlkan的LB将体积增加至2ml。然后，在200μl的等分试样中，将所述感染细菌放置在含有40μg/ml四环素(tet)的LB琼脂板上。所述板在+37℃温育过夜。

次日，从所述板上收集细菌菌落至200ml LB(100μg/ml kan，20μg/mltet)中继续生长。所述培养物在37℃生长1～1.5小时。

然后，将所述细菌在5000rpm下颗粒化(pellete)15min。通过加入PEG(聚乙二醇)至0.04g/ml和NaCl至0.03g/ml使含有增殖噬菌体的上清液沉淀。在+4℃，在冰上晃动所述噬菌体过夜。此后，在+4℃将所述噬菌体在10,000rpm离心下颗粒化20分钟。将所得颗粒在TBS(Tris-缓冲盐水)中再次悬浮，并通过加入上述的PEG/NaCl在+4℃在冰上再次沉淀1h。

然后在+4℃，在冰上将所述噬菌体在14,000rpm颗粒化20min。最后，将所述颗粒在1ml含有0.02％NaN₃的TBS中再悬浮并在+4℃储存。

噬菌体的滴定。为下几轮的临床试样的生物淘选，如下测定TBS噬菌体储备物的滴度：制得数个稀释液(1∶1000～1∶1×10⁷)用于宿主细菌的感染。在感染后，将细菌放置在含有40μg/ml四环素(tet)的LB琼脂板上，然后将所述板在+37℃温育过夜。

次日，通过菌落计数计算滴度(TU/ml TBS噬菌体储备物)。

临床肿瘤试样的噬菌体展示。从非小细胞肺癌患者的原发肿瘤上手术取出组织试样并放置在冰DMEM-PI上。取出部分试样用于病理检测。首先核实所述肿瘤试样的类型和属性为NSCLC。然后，由病理学家完成NSCLC亚型和其所处阶段的规格。

在1ml含有蛋白酶抑制剂的DMEM中的小细胞培养板上用刀片将组织试样切碎。将试样转移至eppendorf管并用1ml DMEM-PI清洗。

将试样在4000rpm离心5分钟，然后与10¹⁰TU的噬菌体(来自于一个或多个肽库)在1ml DMEM-PI中在25℃温育15分钟。之后，将试样用含有1％BSA(牛血清白蛋白)的DMEM-PI清洗三次。

在25℃，将1ml在含有100μg/ml卡那霉素(kan)的LB中的K91kan细菌，OD600∶1～1.5，用经洗涤的含有选择性附着的噬菌体粒子的颗粒感染25分钟。在感染后，用含有100μg/ml kan的LB将体积增加至2ml。

然后，如下将所述感染细菌放置在含有40μg/ml四环素(tet)的LB琼脂板上：在200μl等分试样中的三份稀释液(1∶50，1∶500，1∶5000)和剩余的上述K91kan培养物的两块平行板。所述板在+37℃温育过夜。

次日，从LB tet板上取24～48菌落放入96-孔微量板用于噬菌体DNA测序。作为另外一种选择，所述克隆储存在-20℃以备以后分析。

在取出用于测序的菌落后，将剩余的细菌菌落从板上收集至200mlLB(100μg/ml kan，20μg/ml tet)中继续生长。所述培养物在37℃生长1～1.5h。

然后，将所述细菌在5000rpm下颗粒化15min。通过加入PEG至0.04g/ml和NaCl至0.03g/ml使含有增殖噬菌体的上清液沉淀。在+4℃，在冰上晃动所述噬菌体过夜。此后，将所述噬菌体在10,000rpm离心下在+4℃颗粒化20分钟。如上所述将所得颗粒再次悬浮在TBS中，然后通过加入PEG/NaCl在4℃在冰上再次沉淀1h。然后在4℃，在冰上将所述噬菌体在14,000rpm颗粒化20min。最后，将所述颗粒在1ml含有0.02％NaN₃的TBS中再悬浮并在+4℃储存。对于下几轮的临床试样的生物淘选，所述TBS噬菌体储备物的滴度如上述进行测定。

为实现肿瘤靶向肽的选择性富集，将如上述制备的噬菌体储备物用于三至六轮的临床试样的生物淘选。

肽富集的监测。为测定选择性富集的肽的序列的数目，对来自于前面第二轮生物淘选的代表单独噬菌体克隆的24～48个菌落进行DNA测序。

首先，进行菌落PCR以制得用于测序的DNA：将在96孔板的孔中的细菌菌落悬浮在10ml TBS缓冲液中，然后取其5μl进行PCR反应。其次，制得PCR混合物-一次反应的PCR混合物是：0.1ml 10mM dNTP，5.0μl的模板，0.7μl的F1-正向引物(15μM)，0.7μl F1-反向引物(15μM)，4μl 10×Dynazyme缓冲液，0.5μl的Dynazyme聚合酶(＝1U)和29μl的dH₂O，最终体积为40ml。所使用的PCR程序的设置为96℃下5分钟，随后是一个三步的循环1)92℃下30秒，2)60℃下30秒和3)72℃下1分钟。该三步循环重复35次。在PCR扩增中使用的引物序列是5′-gCAAgCTgATAAACCgATACAATTAAAgg-3′用于F1-F和5′-gCCC TCATAg TTA gCg TAA CgA TC-3′用于F1-R。

在测序前，插入所述噬菌体克隆的DNA的增殖经电泳证实。利用ALF自动DNA测序仪(AmershamPharmacia Biotech)使用上述F1-F和F1-R引物进行测序。

由人类肺部肿瘤组织的生物淘选选择性富集的肽序列。与肺部肿瘤选择性结合的肽列在表1中。所富集的肽序列收集自第四轮～第六轮的离体淘选。

表1

实施例2

合成肽的制备

手工或者通过自动合成仪(Applied Biosystems 433A或AdvancedChem Tech 396DC)进行所有肽的合成。所述方法是基于N-FMOC保护和HBTU/HOBt/DIPEA活化的固相肽合成。采用的合成树脂是Rink酰胺MBHA树脂，巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂或预装填FMOC-氨基酸Wang树脂。在自动合成中采用制造商推荐的标准操作步骤和试剂。

这些合成中的主要试剂来自Applied Biosystems或Novabiochem：Fmoc-Ala-OH(用于′A′)，Fmoc-Asp(OtBu)-OH(用于′D′)，Fmoc-Gly-OH(用于′G′)，Fmoc-Lys(tBoc)-OH(用于′K′)，Fmoc-Leu-OH(用于′L′)，Fmoc-Pro-OH(用于′P′)，Fmoc-Arg(Pbf)-OH(用于′R′)。所述间隔子氨基酸：Fmoc-11-氨基-3，6，9-十一酸(用于′PEG′)购自University of Kuopio，Finland，并如前所述进行制备(Boumrah等，1997)。

连接子：2-氨基乙硫醇通过切割所述巯基乙胺树脂进行制备。依靠两个氨基的正交保护，采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH用于支化结构的制备。通过一个羧基相连的金属螯合剂Dota，即1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，通过来自于Macrocyclics，Dallas，Texas的Dota三(叔丁基酯)的固相偶联引入。

标记：硫醇反应性标记试剂，来自于Perkin Elmer的对-碘代乙酰氨基苯甲基-DTPA的铕(III)螯合物，按照Perkin Elmer的推荐步骤与含有巯基的肽化合物偶联。

在此使用以下缩写：

′Ac′指：CH₃C(O)即乙酰基(不是锕)。

′ADGA′指：Ala-Asp-Gly-Ala。

′AMB-DTPA-Eu′指：通过伯氨基(在氨基乙基处)相联的(p-((2-氨基乙基巯基)乙酰氨基)苯甲基)二亚乙基三胺-N1，N2，N3，N3-五乙酸的Eu³⁺-螯合物。′酰胺′指：与羰基相连的NH₂基。(例如在肽的C-端)。

′Dota′指：通过一个羧基相连的1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，即(CH₂CH₂N(CH₂COOH))₄去掉一个OH。

′DPLKRAR′指：Asp-Pro-Leu-Lys-Arg-Ala-Arg。

′DTPA′指：二亚乙基三胺-N1，N2，N3，N3-五乙酸

′DTPA-Eu′指：DPTA的Eu³⁺-螯合物

′EAT′指：2-氨基乙硫醇，即亚乙基氨基硫醇，即-NHCH₂CH₂SH。

′G3′指：Gly-Gly-Gly。

′GA′指：Gly-Ala。

′GAAG′指：Gly-Ala-Ala-Gly.

′PEG′指：NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂-C(O)。

′EG′指：NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂NH。

′生物素′指：D-生物素基，即通过其羧基偶联的维生素H。

′碳硼烷′指：5-(1-o-碳硼烷基)-戊酰基部分，C(O)-(CH₂)₄-C₂B₁₀H₁₁。

试剂列表

Fmoc-Gly-OH，CAS No.29022-11-5，Novabiochem Cat.No.04-12-1001，分子量：297.3g/mol。

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，CAS No.154445-77-9，Applied Biosystems Cat.No.GEN911097，分子量：648.8g/mol。

Fmoc-L-Leu-OH，CAS No.35661-60-0，Applied Biosystems Cat.No.GEN911048，分子量：353.4g/mol。

Fmoc-L-Pro-OH，CAS No.71989-31-6，Applied Biosystems Cat.No.GEN911060，分子量：337.4g/mol。

Fmoc-L-Lys-OH，CAS No.71989-26-9，Applied Biosystems Cat.No.GEN911051，分子量：468.6g/mol。

巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂，Novabiochem 01-64-0107，subst.：1.33mmol/g。Rink酰胺MBHA树脂，Novabiochem 01-64-0107，subst.：1.33mmol/g。Fmoc-Gly树脂，Applied Biosystems Cat.No.401421，0.65mmol/g。Fmoc-Gly树脂(用于羧基端′Gly-OH′)，Applied Biosystems Cat.No.401421，0.65mmol/g。

O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂(用于′EG′)，Novabiochem产品号01-64-0235。

D-生物素(维生素H)，CAS No.58-85-5，Sigma B-4501，分子量：244.3g/mol。5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸(用于′碳硼烷′)，Katchem，Prague，Czech Republic，分子量：244.34g/mol。

用于肽合成的一般过程：手工固相合成。质谱测量。

所有手工合成过程在可密封的玻璃漏斗中进行，所述玻璃漏斗配有孔隙等级为2～4的烧结玻璃过滤盘，顶部有聚丙烯或酚醛塑料螺帽(用于密封)，以及两个PTFE键式旋塞阀(key stopcock)：一个位于所述过滤盘以下(用于排空)和一个以倾斜角位于用螺帽盖紧的颈状部分的肩部(用于氩气进口)。

所述漏斗装填有用于每次处理的合适的固相合成树脂和溶液，借助“手腕运动”瓶摇动器进行合适时间的有效摇动，随后施加适度的氩气压力进行过滤。

合成的一次循环的一般步骤(＝加上一个氨基酸单元)如下：

装载有大约0.25mmol的由一个以上具有推荐保护基的氨基酸构成的FMOC-肽(＝氨基端氨基用9-芴基甲氧基羰基保护的肽)的合适的合成树脂(来自Applied Biosystems或Novabiochem)；大约0.5g树脂(0.5mmol/g)按以下方法处理，如果没有另外提及，每步处理步骤包括用10ml的指定的溶液或溶剂摇动1～2分钟并过滤。

′DCM′指用二氯甲烷摇动，′DMF′指用N，N-二甲基甲酰胺(DMF可由NMP即N-甲基吡咯烷酮替代)摇动。

处理步骤为：

1. DCM，摇动10～20分钟

2. DMF

3. DMF中20％(体积)的哌啶，5分钟

4. DMF中20％(体积)的哌啶，10分钟

5.～7. DMF

8.～10. DCM

11. DMF

12. 0.75mmol的活化氨基酸(如下制备)的DMF溶液，摇动2小时

13.～15. DMF

16.～18. DCM

在最后的处理(18)之后，使氩气流过所述树脂大约15分钟，并将树脂在氩气下保存(如果所述合成需要继续加入更多单元则在所述密封的反应漏斗中保存)。

待加入到位于树脂上的氨基酸或肽链的9-芴基甲氧基羰基-N-保护氨基酸(FMOC-氨基酸)的活化采用下列试剂在处理步骤12之前在另外的容器中进行。因此，所述FMOC-氨基酸(0.75mmol)溶解在大约3ml的DMF中，用溶解在1.5ml的0.5M HOBt在DMF中的溶液的0.75mmolHBTU的溶液处理1分钟，然后立即用0.75ml的2.0M DIPEA溶液处理5分钟。

用于活化所述FMOC-氨基酸的活化试剂如下：

HBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯，CASNo.[94790-37-1]，Applied Biosystems Cat.No.401091，分子量：379.3g/mol；HOBt＝1-羟基苯并三唑，在DMF中的0.5M溶液，Applied Biosystems Cat.No.400934；

DIPEA＝N，N-二异丙基乙基胺，在N-甲基吡咯烷酮中的2.0M溶液，Applied Biosystems Cat.No.401517

使用不同的含有合适保护基的FMOC-氨基酸在多个循环中重复上述步骤，制得“与树脂相连”的肽(即合适肽的树脂源)。所述步骤同时也提供了一种方法以连接某些效应器或连接子单元，例如Dota或FMOC-Teg(即Fmoc-11-氨基-3，6，9-十一烷酰基部分)至与树脂相连的肽。同时，通过上述的常规偶联方法，所述最头上的单元(在序列的C-端)能连接至Rink酰胺树脂或连接至巯基乙胺树脂；在巯基乙胺树脂的情况中，用哌啶初步处理(步骤3～11)在第一循环中不是必需的。

当需要N-端酰化产物时，在步骤12中除用乙酸酐替代活化的FMOC-氨基酸，使用以下试剂混合物进行所述步骤：在4体积的N，N-二异丙基乙基胺在N-甲基吡咯烷酮中的2.0M溶液中的1体积乙酸酐。

使用以下试剂混合物进行从树脂上的切割：

三氟乙酸(TFA)92.5体积％

水5.0体积％

乙二硫醇2.5体积％

在经过步骤1.～10.(如以上一般步骤所述)去掉保护性FMOC基后，用DCM清洗树脂，在氩气流下干燥并用三份上述试剂混合物(每一份约10ml)处理，每份进行一小时。以上述方式在氩气气氛下进行处理。在所述处理开始三小时之后，通过过滤所得的TFA溶液在减压下用旋转蒸发仪浓缩，并再次充满氩气。采用反相高效液相色谱(HPLC)法完成纯化，使用的是“Water 600”泵装置，具有C-18型柱(粒径10微米)和线性洗脱液梯度，所述洗脱液梯度组成经过30分钟由99.9％水/0.1％TFA变至99.9％乙腈/0.1％TFA。所述HPLC柱的尺寸为25cm×21.2mm(Supelcocat.No.567212-U)和15cm×10mm(Supelco cat.No.567208-U)。根据218nm处的吸收，并使用″Waters 2487″仪器进行检测。

上述切割混合物也同时去掉以下保护基：用于保护赖氨酸侧链的叔丁氧基羰基(Boc)；用于保护精氨酸侧链的2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；用于保护天冬氨酸侧链羧基的叔丁基酯(OtBu)，并且通常也能用于去掉类似结构(硫醇、鸟嘌呤基、羧基)上的这些保护基。

按此方法合成的化合物是从以惯例(在本文中也是同样)表示的序列的″右至左″，即从所述肽链的C端开始构建的。

采用的质谱方法：

基质辅助激光脱附离子化-飞行时间(MALDI-TOF)

仪器类型：

Bruker Ultraflex MALDI TOF/TOF质谱仪

仪器供应商：

Bruker Daltonik GmbH

Fahrenheitstrasse 4

D-28359 Bremen

Germany

MALDI-TOF正离子反射体模式：

外标：

血管紧张素II、血管紧张素II、物质P(RPKPQQFFGLM)、铃蟾肽、ACTH(1-17)ACTH(18-39)、生长激素抑制素28和缓激肽1-7。

基质：

α-氰基-4-羟基肉桂酸(在含有0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液中的2mg/mL溶液，对于酸敏感试样则仅用丙酮)。

MALDI-TOF负离子反射体模式

外标：

胆囊收缩素和胰高血糖素或[Glu1]-纤维蛋白原肽B。

基质：

α-氰基-4-羟基肉桂酸(在丙酮中的饱和溶液)。

试样制备：

以10皮摩尔/微升～100皮摩尔/微升的浓度将样品与所述基质溶液混合并在靶上干燥。

在真空中通过氮激光在波长337nm的“射击”进行离子化。探针板的电压在正离子反射体模式中是19kV，在负离子反射体模式中是-19kV。

关于谱图的一般解释(仅关于正离子模式)：

在所有情况下，M+1(即单质子加成物)信号以及其基于同位素卫星峰的典型精细结构都是清晰显著的。在几乎所有情况下，M+1信号图案均伴随着在M+23(Na+加成物)的相似的但明显更弱的峰带。除所述在M+1和M+23的带之外，在许多情况下也可观察到在M+39(K+加成物)或M+56(Fe+加成物)的带。

在合成例中报道的分子量值对应于每种元素的最丰度同位素，即“准确质量”。

实施例3

靶向剂IS257的合成

Ac-ARRPKLD-酰胺(IS257)，即CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-NH₂的合成根据上述通用方法手工进行，并且基于Rink酰胺MBHA树脂。依照以上序列按合成方向(始自Fmoc-Asp(OtBu)-OH，即从右至左)使用试剂(按照试剂列表中所述)。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：896.51Da。

计算同位素M：895.54Da。

实施例4

靶向剂HP196的合成

ADGA-ARRPKLD-GAAG(HP196)，即H-Ala-Asp-Gly-Ala-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-Gly-Ala-Ala-Gly-NH₂的合成根据上述通用方法手工进行，并且基于Rink酰胺MBHA树脂。依照以上序列按合成方向(始自Fmoc-Gly-OH，即从右至左)使用试剂(按照试剂列表中所述)。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1424.8Da。

计算同位素M：1423.8Da。

实施例5

靶向剂HP199的合成

包含包括在肽序列ADGA-ARRPKLD-GAAG中的靶向单元ARRPKLD以及在所述肽序列的C端通过间隔子单元还含有含巯基连接子单元的靶向剂ADGA-ARRPKLD-GAAG-PEG-G3-EAT的合成利用Applied Biosystems 433A肽合成仪并基于巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂和固相Fmoc-化学以及常规保护氨基酸试剂(包括在常规方法中使用的不常见的Fmoc-PEG-OH)进行。

所述靶向剂的结构是：Ala-Asp-Gly-Ala-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-Gly-Ala-Ala-Gly-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂-C(O)-Gly-Gly-Gly-NHCH₂CH₂SH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1845.27Da。

计算同位素M：1843.93Da。

实施例6

靶向剂HP201的合成

含有靶向单元ARRPKLD以及通过间隔子单元位于所述靶向单元的C端的含巯基连接子试剂的靶向剂Ac-ARRPKLD-GAAG-PEG-G3-EAT的合成利用Applied Biosystems 433A肽合成仪基于巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂和固相Fmoc-化学以及常规保护氨基酸试剂(包括在常规方法中使用的不常见的Fmoc-PEG-OH)进行。靠近脯氨酸的精氨酸通过双处理进行偶联并且利用乙酰化封闭N-端。

所述靶向剂的结构是：Ala-Gly-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂-C(O)-Gly3-NHCH₂CH₂SH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1572.85Da。

计算同位素M：1571.82Da。

实施例7

靶向剂A48的合成

包含包括在肽序列ARRPKLD-GA中的靶向单元ARRPKLD以及在所述靶向单元的C端通过间隔子单元还含有含巯基连接子单元的靶向剂Ac-ARRPKLD-GA-EAT的合成利用Applied Biosystems 433A肽合成仪基于巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂和固相Fmoc-化学以及常规保护氨基酸试剂进行。N-端被乙酰基化。

所述靶向剂的结构是：CH₃C(O)-Ala-Asp-Gly-Ala-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-Gly-Ala-NHCH₂CH₂SH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1085Da。

计算同位素M：1083.60Da。

实施例8

铕标记的靶向剂A48-Eu的合成

按照Perkin-Elmers的方案用购自Perkin-Elmer(PerkinElmer LifeSciences and Analytical Sciences-Wallac Oy，Turku，Finland)的硫醇反应性(碘代乙酰胺基活化的)IAA-DTPA铕螯合物对在其C-端具有巯基的靶向剂Ac-ARRPKLD-GA-EAT进行处理。

因此将6.6mg的肽(编号A48)溶解在1ml的0.05M NaHCO₃中。将1.5ml的0.05NaHCO₃中的(对碘代乙酰胺苯甲基)二亚乙基三胺-N1，N2，N3，N3-五乙酸(8mg)的Eu³⁺螯合物加入到所述肽溶液中。在将pH调节至8.5之后，使溶液避光并在30℃放置过夜。利用0.05M乙酸铵缓冲的水-乙腈洗脱液梯度通过RP-HPLC纯化产品：CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-Gly-Ala-NHCH₂CH₂S-p-CH₂CONH-苯甲基-DTPA铕螯合物，并且根据负离子模式MALDI-TOF质谱进行鉴定。

观察到的负离子M-1：具有典型同位素分布的1770.74Da。

计算同位素M：1771.68Da。

实施例9

靶向剂A49的合成

在含有靶向单元ARRPKLD以及在所述靶向单元的C端通过间隔子单元还含有含巯基连接子单元的靶向剂Ac-ARRPKLD-GAAG-PEGSU-EAT[′PEGSU′指：NH-(CH₂)₃-(O-CH₂CH₂)₃-CH₂-NH-C(O)CH₂CH₂C(O)]的合成使用AppliedBiosystems 433A肽合成仪基于巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂和固相Fmoc-化学以及常规保护氨基酸试剂进行，除了第一个氨基酸：1-氨基-4，7，10-三氧-13-十三烷基胺琥珀酰胺酸。用于此的试剂是NeoMPS(Strasbourg，France)的产品No.FA18801：Fmoc-1-氨基-4，7，10-三氧-13-十三烷基胺琥珀酰亚胺酸，并类似于常规Fmoc-氨基酸用于合成中。将N-端乙酰化。

所述靶向剂的结构是：CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-Gly-Ala-Ala-Gly-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂CH₂)₃-CH₂-NH-C(O)CH₂CH₂-C(O)-NHCH₂CH₂SH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1514.86Da。

计算同位素M：1513.84Da。

实施例10

靶向剂F5M-A49的合成

利用荧光素-5-马来酰亚胺(Promega)合成荧光素标记的靶向剂A49-F。在此反应中，肽A49与所述标记的马来酰亚胺部分通过其巯基基团相连。在偶联反应中，F5M和A49在偶联缓冲液(10mM Tris/HCI pH 7.5，5mM Na₂HPO₄，2mM EDTA)中为4mM。反应中F5M的摩尔浓度是A49的摩尔浓度的三倍。通过在37℃过夜避光混合进行反应。加入β-巯基乙醇终止反应，反应产物使用HPLC纯化，然后冻干。使用时将F5M-A49溶解在PBS pH 7.4中。

所述靶向剂的结构是：CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-Gly-Ala-Ala-Gly-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂CH₂)₃-CH₂-NH-C(O)CH₂CH₂-C(O)-NHCH₂CH₂S-C₂H₃(COOH)-C(O)-NH-(C₂₀H₁₁O₅)，即A49的荧光素-5-琥珀酰胺酸硫醚衍生物。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1959.95Da。

计算同位素M：1958.92Da。

实施例11

靶向剂HP192的合成

含有靶向单元ARRPKLD和通过连接子单元位于所述靶向单元C-端的金属螯合剂Dota的靶向剂Dota-Lys(Ac-ARRPKLD-(PEG)2)-酰胺(HP192)根据上述常规方法进行手工合成，并且是基于与Rink酰胺MBHA树脂相连的Fmoc-Lys(Mtt)-OH。按普通方式将Dota tris-叔丁基酯与树脂上的Lys(Mtt)偶联。在连续合成之前，通过试剂混合物：在二氯甲烷中的4％三氟乙酸/1％乙二醇的连续两次10分钟处理将保护性4-甲基三苯甲基(即Mtt)从赖氨酸部分的侧链上切掉。在脱保护之后的洗涤为：在第一个Fmoc-PEG-OH的偶联之前，用二氯甲烷洗涤两次，用0.1M在二氯甲烷中的乙基-N，N-二异丙胺洗涤一次以及用N，N-二甲基甲酰胺洗涤三次。根据常规方法使用合适的氨基酸试剂手工继续所述合成：Fmoc-PEG-OH(两个循环)，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH(两个循环)以及Fmoc-Ala-OH。使用以下试剂混合物进行两小时的最终端封闭：1体积的乙酸酐与4体积在N-甲基吡咯烷酮(即NMP)中的2M乙基-N，N-二异丙基胺相混合。在用三份N，N-二甲基甲酰胺和四份二氯甲烷洗涤之后，按上述普通方法分离产物。

所述靶向剂的结构是：Dota-Lys[CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-PEG-PEG]-NH₂。

将所述肽序列ARRPKLD在N-端乙酰化并与赖氨酸的侧枝通过两个间隔子氨基酸单元(PEG)相偶联。′PEG′指：NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂-C(O)。′Dota′指：通过一个羧基偶联的1，4，7，10-四氮杂环十二烷基-1，4，7，10-四乙酸，即(CH₂CH₂N(CH₂COOH))₄去掉一个OH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1788.94Da。

计算同位素M：1788.0Da。

实施例12

HP186-化合物HP187和IS248的起始材料的合成

含有靶向单元ARRPKLD，并且还含有位于肽序列C-端的间隔子单元的靶向剂Ac-ARRPKLD-EG-H的原材料的合成根据上述常规方法手工进行，并且是基于购自Novabiochem(产品号01-64-0235)的O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂。依照以上序列按合成方向(始自Fmoc-Asp(OtBu)-OH，即从右至左)使用试剂(按照试剂列表中所述)，并通过乙酰化封闭N-端。按照与常规步骤不同的方式切下树脂以保留保护基：用两份在二氯甲烷中的2体积％三氟乙酸分别处理树脂各15分钟。将过滤溶液倾倒入与酸等摩尔量的吡啶中，用水沉淀产物并真空干燥。所述产物可就此使用，其鉴定基于进一步产物(编号HP186和IS248)的分析。

源化合物的结构为：CH₃C(O)-Ala-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Pro-Lys(tBoc)-Leu-Asp(OtBu)-NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NH₂。″EG″指：NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NH-。

实施例13

靶向剂HP187的合成

含有靶向单元ARRPKLD，并且还含有通过间隔子单元位于肽序列C-端的含生物素的连接子单元的靶向剂Ac-ARRPKLD-EG-生物素(HP 187)的合成在购自Novabiochem的二-(6-羧基-HOBt)-N-(2-氨基乙基)-氨基甲基聚苯乙烯树脂(产品号01-64-0179)上进行。在与过量三倍的生物素和PyBroP(溴-三吡咯烷基膦六氟磷酸酯，CAS No.132705-51-2，分子量：466.2g/mol，Novabiochem产品号01-62-0017)的混合物和过量六倍的在N，N-二甲基甲酰胺中的DIPEA一起摇动树脂5小时之后，按照以上在常规手工固相合成法的描述用DMF和二氯甲烷洗涤树脂。用生物素的处理反复进行13个小时，随后洗涤。接着，将25％过量的树脂与含有上述源化合物的受保护靶向单元(编号HP186)在N，N-二甲基甲酰胺中摇动过夜。将溶液过滤，用二氯甲烷萃取残留物，将合并的溶液蒸发至干并用上述通常用于脱保护(并切下树脂)的92％TFA/水试剂混合物处理，用HPLC纯化。

靶向剂的结构是：CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NH-生物素基，其中在所述靶向单元的C-端，生物素通过其羧基与″EG″间隔子相偶联。

基于Q-TOF ES+质谱进行的产物鉴定：

观察到的正离子M+1：1253.81Da。

计算同位素M：1252.71Da。

实施例14

靶向剂IS248的合成

含有靶向单元ARRPKLD，并且还含有通过间隔子单元位于肽序列C-端的含多个硼的效应器单元的靶向剂Ac-ARRPKLD-EG-碳硼烷(IS248)的合成。

所述靶向剂的结构为：CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NHC(O)-(CH₂)₄-(1-o-碳硼烷基)，其中5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸通过其羧基与位于所述靶向单元C-端的″EG″间隔子相连。

含有靶向单元ARRPKLD，并且还含有通过间隔子单元位于肽序列C-端的含多个硼的效应器的靶向剂Ac-ARRPKLD-EG-碳硼烷(IS244)的合成在有机溶液中进行。因此将0.185mol的5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸和0.192mol购自于Novabiochem(产品号01-62-0011)的WSC(1-乙基-3-(3′-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺.HCI，(CAS No.25952-53-8，MW.155.2+36.5)溶解在1.5mL的二氯甲烷中。在20min后，将0.062mol的含有上述源化合物(编号HP 186)的受保护靶向单元与所述溶液合并并在室温下搅拌过夜。然后，将混合物蒸发至干并用95％TFA/5％水的混合物处理两小时。在残留物蒸干之后用二乙基醚使其粉碎，并使用HPLC纯化沉淀物。

靶向剂的结构为：CH₃C(O)-Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp-NH(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂NHC(O)-(CH₂)₄-(1-o-碳硼烷基)，其中5-(1-o-碳硼烷基)-戊酸通过其羧基与位于所述靶向单元C-端的″EG″间隔子相连。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1254.87Da，针对由10硼原子导致的典型同位素图案的最高峰。

计算同位素M：1254.86Da(1253.89Da，针对同位素图案的最高峰)。

实施例15

靶向单元变体的合成

合成15种化合物：通过用A(即丙氨酸)替换其中一个氨基酸残基得到靶向肽ARRPKLD(即Ala-Arg-Arg-Pro-Lys-Leu-Asp)的6种变体，即AARPKLD、ARAPKLD、ARRAKLD、ARRPALD、ARRPKAD和ARRPKLA。通过用D(即天冬氨酸)、O(即鸟氨酸)、R(即精氨酸)或Y(即酪氨酸)替换K(即赖氨酸)得到5种所述靶向肽的变体，即ARRPDLD、ARRPOLD、ARRPRLD或ARRPYLD。通过用I(即异亮氨酸)、V(即缬氨酸)、或F(即苯丙氨酸)替换L(即亮氨酸)得到4种变体，即ARRPKID、ARRPKVD和ARRPKFD。通过用N(即天冬酰胺)或K(即赖氨酸)替换D(即天冬氨酸)得到所述靶向肽的最后2种变体，即ARRPKLN和ARRPKLK。

所述15种合成通过Advanced Chem Tech 396DC多通道肽合成仪(供应商：Advanced Chemtech，Louisville，Kentucky，USA)进行并基于预装填的Wang树脂。所述合成方法是基于N-FMOC保护和HBTU/HOBt/DIPEA活化的固相肽合成。采用仪器制造商所建议的标准操作步骤和试剂。

实施例16

对照肽BTK148的合成

通过Advanced Chem Tech 396DC肽合成仪进行并基于甘氨酸Wang树脂、固相Fmoc-化学和常规保护氨基酸试剂进行比较肽ADGA-DPLKRAR-GAAG的合成。

结构：H-Ala-Asp-Gly-Ala-asp-Pro-Leu-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Ala-Ala-Gly-OH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1424.75Da。

计算同位素M：1425.8Da。

实施例17

对照肽HP205的合成

含有杂混肽序列，并且含有通过间隔子单元位于肽序列C-端的含巯基连接子单元的对照化合物ADGA-DPLKRAR-GAAG-PEG-G3-EAT的合成通过Applied Biosystems 433A肽合成仪进行并基于巯基乙胺-2-氯三苯甲基树脂和固相Fmoc-化学和常规保护氨基酸试剂(包括在常规方法使用中不常见的Fmoc-PEG-OH)。

所述化合物的结构为：H-Ala-Asp-Gly-Ala-asp-Pro-Leu-Lys-Arg-Ala-Arg-Gly-Ala-Ala-Gly-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂-C(O)-Gly3-NHCH₂CH₂SH。

基于MALDI-TOF质谱进行产物的鉴定：

观察到的正离子M+1：1844.91Da。

计算同位素M：1843.93Da。

实施例18

在体内、体外试验中使用的细胞系的描述

在所述实施例中，如没有另外指明使用以下细胞系和培养条件：

非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌细胞系NCI-H23，在此处也称为″NCI-H23″，之前已进行描述(Little等，1983)。在经调节含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES、1.0mM丙酮酸钠、1％盘尼西林/链霉素、10％胎牛血清的具有2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养所述细胞系。

NSCLC腺癌细胞系A549，在此处也称为″A549″，之前已进行描述(Giard等，1973)。Ham′s F-12培养基经调节含有2mM L-谷氨酰胺、1％盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清。

NSCLC表皮样癌细胞系NCI-H520，在此处也称为″NCI-H520″，之前已进行描述(Banks-Schlegel等，1985)。在经调节含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES、1.0mM丙酮酸钠、1％盘尼西林/链霉素、10％胎牛血清的具有2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养所述细胞系。

NSCLC大细胞癌细胞系NCI-H460，在此处也称为″NCI-H460″，之前已进行描述(Banks-Schlegel等，1985)。在经调节含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES、1.0mM丙酮酸钠、1％盘尼西林/链霉素、10％胎牛血清的具有2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养所述细胞系。

人类原生性肺动脉平滑肌细胞(PASMC)，在此处也称为″PASMC″(CAMBREX，CC-2581)用Clonetics SmGM

-2BulletKit(CC-3182)进行培养。上皮内癌细胞系HeLa，在此处也称为″HeLa″，之前已进行描述(Scherer等，1953)。所述细胞系在经调节含有2mM L-谷氨酰胺、1％盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清的Dulbecco′s改性Eagle Medium(DMEM)培养基中培养。

小鼠成纤维细胞系NIH3T3，在此处也称为″NIH3T3″，之前已进行描述(Koga等，1979)。所述细胞系在经调节含有2mM L-谷氨酰胺、1％盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

小鼠胚胎内皮细胞系E10V，在此处也称为″E10V″，之前已进行描述(Garlanda等，1994)。所述细胞系在经调节含有2mM L-谷氨酰胺、1％盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

小鼠脉管内皮细胞系SVEC4-10，在此处也称为″SVEC4-10″，之前已进行描述(O′Connell，1990)。所述细胞系在经调节含有2mM L-谷氨酰胺、1％盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

人类黑素瘤细胞系C8161/M1，在此处也称为″C8161/M1″，之前已进行描述(Bregman，1986)。所述细胞系在经调节含有2mM L-谷氨酰胺、1％盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

实施例19

非小细胞肺癌细胞与固定的靶向剂的选择性结合

用于试验的板的制备。用浓度为30μg/ml的本发明的靶向剂包被经Reacti-Bind Maleimide活化的透明条形板(Pierce，Prod#.15150)的孔。在20℃温育过夜。从所述孔中除去含有未结合肽的结合缓冲液。

用封闭缓冲液(在磷酸缓冲盐水(PBS)、pH 7.0中的1.0％BSA、0.05％Tween20，如下制备PBS：将40g NaCl、1g KCl、7g Na₂HPO₄×2H₂O和1g KH₂PO₄溶解在1000ml去离子H₂O中)封闭所述孔。用作对照的空白孔通过使用封闭缓冲液处理空的孔得到。所述板在20℃温育1小时30分钟。

温育后将所述板用PBS清洗三次。细胞结合分析。将在150μl体积的培养基中的75000个细胞加入到经包被孔中，并在37℃温育30分钟。在细胞结合后，用PBS将孔清洗30分钟。结合有靶向剂的细胞的检测基于MTT测试(在实施例23，细胞毒性中详细描述)。将10μl MTT试剂和90μl培养基加入到孔中。将所述板在+37℃温育三小时。在温育后，将100μl的溶胞缓冲液加入到所述孔中并使之在37℃温育。次日，用ELISA-读数器(ThermoLabsystems，multiskan EX)测量所述板在560nm的吸光度。

在所述细胞结合中使用细胞系NCI-H23、NCI-H520、A549、HeLa和NIH3T3(在实施例18中描述)和靶向剂HP199、HP201和HP205(在实施例5、6、17中描述)。

证实NSCLC细胞系对所述靶向剂的高度选择性结合的细胞结合试验的结果显示在图1中。所述NSCLC细胞系NCI-H23(A)、A549(B)和NCI-H520(C)与固定的靶向剂HP199(1)和HP201(2)选择性地结合，然而对照细胞系PASMC(D)、人类原生性肺动脉平滑肌细胞系和NIH3T3(E)、小鼠成纤维细胞系却不行。同样，所述NSCLC细胞系不与对照肽HP205(3)结合。结果显示为在560nm测量的吸光度。

实施例20

荧光靶向剂与非小细胞肺癌细胞的选择性结合

A549细胞和HeLa细胞(在实施例18中描述)在玻璃载玻片上生长，用PBS清洗后用甲醇固定。如下使用荧光靶向剂F5M-A49(在实施例10中描述)使这些细胞染色：首先在20℃用封闭缓冲液(在PBS中的1.0％BSA，0.05％Tween20，pH7.4)封闭细胞一小时。用20μl的F5M-A49靶向剂(在PBS中，50μg/ml，pH 7.4)温育在所述玻璃载玻片上的细胞。作为对照，在加入所述靶向剂之前，F5M-A49的结合与20μl的IS257靶向单元(在实施例3中描述的游离肽，在PBS中，500μg/ml，pH 7.4)进行竞争。作为负对照，使用未与任何靶向剂温育的细胞。在染色后用mountex(Histolab Products Ltd)将所述细胞放置在目标玻璃上。之后，在荧光显微镜(Carl Zeiss Microscopy，Jena，Germany)下观察这些细胞。所述分析显示A549细胞的强烈染色，HeLa细胞未染色，以及F5M-A49与A549细胞的结合被游离肽IS257阻断。因此，所述染色结果证实了所述荧光标记靶向剂(F5M-A49)与A549NSCLC细胞系的选择性结合。

实施例21

靶向剂细胞结合竞争试验

将5000个细胞，A549、NCI-H23、NCI-H520、NCI-H460和对照细胞PASMC和HeLa(在实施例18中描述)依照实施例18中所述的条件在多孔板上生长。将靶向剂A48-Eu(在实施例8中描述)加入到所述孔中使最终浓度为5pM，然后在37℃将细胞温育30分钟。至于所述竞争试验，将50pM不同的靶向单元、靶向单元变体和对照肽(在实施例3，4，15和16中描述)，每一种在其自身的一组孔中，在加入A48-Eu靶向剂之前15分钟加入。

在30分钟的温育后，用PBS清洗细胞5次。除去PBS并在诱导剂溶液中(Perkin-Elmer Ltd)晃动15分钟使细胞溶解。此后，用Victor III荧光计(Perkin-Elmer Ltd)通过时间解析荧光测量荧光。

结果显示所述靶向剂A48-Eu与NSCLC细胞的结合被在其序列中含有XRXP基序的所有靶向单元变体选择性地阻断。此外，对于对照细胞系PASMC和HeLa没有观察到靶向剂A48-Eu的结合。

实施例22

靶向剂在患有肿瘤的小鼠体内的生物分布

在该实施例中，对于两种不同类型的原发肿瘤A549和NCI-H520，显示了靶向剂A48-Eu(在实施例8中描述)的生物分布。显示出所测试的本发明的靶向剂在体内选择性地靶向原发肿瘤，但不靶向正常组织或器官。

为形成试验性肿瘤，将1×10⁷A549和NCI-H520NSCLC细胞系的细胞(在实施例18中描述)皮下注射入无胸腺裸鼠品系(Harlan Laboratories)的两肋。当肿瘤重量达到约0.2g时收集肿瘤。在向腹膜内施用(i.p.)0.02ml/g体重的阿佛丁[在10ml的2-甲基-2-丁醇(Sigma Aldrich)中的10g 2，2，2-三溴甲醇(Fluka)]之前，通过s.c.注射60μl的Domitor(在1ml无菌水中的1mg/ml甲基-对羟基苯，1mg/ml丙基-对羟基苯，9mg/ml氯化钠，购自Orion Pharma)和40μl Ketalar(在1ml的无菌水中的50mg/ml克他命，0.1mg/ml benzethon.Chlorid.，购自Pfizer)，从而使患有肿瘤的小鼠麻醉。

为确定所述靶向剂A48-Eu的生物分布图，将在200μl体积的生理盐水溶液(Baxter)中的275nmol的A48-Eu靶向剂注射到无胸腺裸鼠的尾部静脉中。使所述靶向剂循环15分钟。然后用60ml的生理盐水通过心脏对小鼠进行灌注。收集包括肿瘤在内的器官和组织。

为确定各个组织的Eu含量，取0.2g的组织样品用于使用诱导-偶合等离子质谱(ICP-MS)的分析。将所述样品在微波炉中溶解在HNO₃-H₂O₂(2.5ml HNO₃+0.5ml H₂O₂)的混合物中。然后用1％HNO₃将样品稀释至30ml。然后将10ng/ml的铍加入到样品中作为内标。然后用标准ICP-MS装置(VG Plasma Quad.2+；Varian)分析整个样品。结果计算为每g的小鼠组织中的ng镧系元素(表2)。

表2

组织	Eu含量(ng/g)
组织	Eu含量(ng/g)	肿瘤(A549)	225+/-28.6
肿瘤(NCI-H520)	101+/-18.1	肿瘤(A549)	225+/-28.6
肿瘤(NCI-H520)	101+/-18.1	肌肉	14.3+/-4.77
脑	11.3+/-0.25	肌肉	14.3+/-4.77
脑	11.3+/-0.25	心脏	4.59+/-1.38
卵巢	30.2+/-12.7	心脏	4.59+/-1.38
卵巢	30.2+/-12.7	肺	11.5+/-4.80
肠	20.7+/-4.72	肺	11.5+/-4.80
肠	20.7+/-4.72	脾	27.7+/-22.9
肾	1072+/-295	脾	27.7+/-22.9
肾	1072+/-295	肝	144+/-33.8

在小鼠组织中检测到的铕的量之间的比较显示与正常组织相比，除了由于所述试剂经肾和肝路径排泄而导致的在肾和肝中显示高信号以外，A48-Eu靶向剂在A549肿瘤中选择性地剧烈累积。

所观察到的肿瘤对肌肉的高比例15.7∶1进一步证明A48-Eu与A549肿瘤的高度选择性结合。同样，NCI-H520肿瘤也显示出所述靶向剂的显著选择性累积。

因此，所使用的靶向剂显示出高选择性肿瘤靶向特性。

实施例23

细胞毒性试验

在该试验中，将细胞系暴露于两种不同浓度(50μg/ml和500μg/ml)的IS257靶向单元(在实施例3中描述)两天至三天以测试所述肽的毒性。用MTT(噻唑蓝，Sigma M-5655)四唑盐完成细胞生存能力的测量。MTT被仅在活细胞中有活性的“琥珀酸-四唑还原酶”体系切割为不溶于水的甲

(formazan)染料。在甲

用10％SDS-0.01M HCI增溶后，在560nm用ELISA分光计(ThermoLabsystems Multiscan EX)对其定量。将CuSAO₂[反式-二(水杨基-aldoximato)铜(II)](Elo HO，Lumme PO.，1985)7.5μg/ml用作100％毒性的正对照。

步骤。用1ml的TE将来自细胞培养碟(

9cm)的细胞用胰蛋白酶处理1～5分钟，并移至50ml Falcon试管。此后，将体积增加至20ml的细胞系专用培养基并将细胞转移至Bürker室并在培养基中根据细胞系稀释至2500～3500细胞/100μl的浓度。如下制备二块或三块96孔微型板24h、48h(和72h)：将96孔板的第一列填满100μl培养基/孔(不含(w/o)细胞)，然后用100μl的细胞溶液填满其余需要用于试验的列使得每孔盛有2500～3000个细胞。此后，在细胞培养温育箱中使细胞过夜附着。

次日，40μl的培养基从所有孔中取出，除了仅含有培养基的孔和一列有细胞的孔(如果在同一块板上使用不同的细胞系，则每种细胞系的一列孔将不动)。

然后，将40μl的在合适培养基中的IS257靶向单元以两种浓度加入孔中，使得最终浓度为50μg/ml和500μg/ml，并使孔体积增加回至100μl。相似地，将40μl的参照物质Cu(SAO)₂加入到一列的所有孔中使得最终浓度为7.5μg/ml。将所述板在温育箱中温育24h(48h或者72h)。次日，用显微镜分析细胞形态。此后，将10μl的在PBS中为5mg/ml的MTT试剂加入到板上所有孔中，所述板在37℃温育3h。最后，将100μl在0.01MHCl中的10％SDS加入到所有孔中，并且所述微孔板在37℃温育过夜。

次日，进行上述MTT试验。存活计数(v.c.)计算如下：

测试的细胞系。全部在实施例18中进行描述的总共9个细胞系针对IS257靶向单元进行测试：

NSCLC细胞系其他细胞系

A549 腺癌 C8161/M1 黑素瘤

NCI-H23 腺癌 HeLa 上皮内癌

NCI-H520 上皮癌 NIH3T3 小鼠成纤维细胞

NCI-H460 大细胞癌 E10V 小鼠胚胎内皮

SVEC4-10 小鼠脉管内皮

发现IS257靶向单元对所有测试细胞系都没有毒性。用作正对照的CuSAO₂ 7.5μg/ml在1h处理后显示出100％细胞致死。所述结果的一个例子显示在图2中的存活计数对时间图，其中所述结果以存活计数对时间来显示。

将靶向单元IS257以两种最终浓度50μg/ml(1)和500μg/ml(2)分别加入到NSCLC细胞系NCI-H23中。对于1h处理后100％的细胞致死，将CuSAO₂ 7.5μg/ml(3)用作正对照。在两个或三个时间点(24h、48h、72h)完成监测。利用MTT测试分析细胞致死/存活性。

实施例24

体内细胞毒性

将在100μl体积的无菌生理盐水中的1mg的靶向单元IS257(在实施例3中描述)i.v.注射到无胸腺裸鼠的尾部静脉中。在注射后30min内观察和次日观察15min小鼠的行为(与非注射小鼠对比)。在该研究中共有三只小鼠(加上未注射的对照)。因此，靶向单元IS257的注射对小鼠没有任何毒性。

实施例25

本发明的靶向单元的免疫原性的测试

小鼠和免疫。在本研究中使用雌性6～8周龄balb/c雌性小鼠(HarlanLaboratories，The Netherlands)。将靶向单元IS257(在实施例3中进行描述)以0.5mg/ml和0.25mg/ml的浓度溶解在无菌盐水中。将1组五只小鼠在第0天用50μg的靶向单元腹膜内进行最初免疫。用25μg的靶向单元在第14日、28日、56日和84日完成随后的免疫。在第0日(免疫前血样)，之后在第42日、70日和98日(终点血样)从尾部静脉对小鼠进行采血。血液收集在试管中，通过在3500RPM离心7分钟使血清清澈。收集来自于小鼠的血清样品并用于血清学分析。

血清学抗体分析。通过酶联免疫吸附分析(ELISA)，使用靶向剂HP201(在实施例6中进行描述)作为俘获抗原分析来自于用靶向单元IS257免疫的小鼠的血清中的抗靶向单元抗体的水平和来自于非免疫对照小鼠的血清中的抗靶向单元抗体水平。简言之，在4℃，用150μl的在PBS中的30μg/ml HP201溶液(pH 7.0)包被Reacti-Bind Maleimide活化的透明条形板(Pierce)过夜。在37℃，用封闭溶液(在PBS中的3％BSA，0.05％Tween，pH 7.0)封闭所述孔1.5h。在37℃，将来自终点血样的测试血清或者对照血清在封闭溶液中的1∶40稀释液以150μl的体积加入到孔中并温育2小时。用清洗缓冲液清洗所述孔五次(含有0.05％Tween20的PBS)，之后用150μl的辣根过氧化物酶共轭的Affinipure山羊抗小鼠IgG+IgM(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd)的1∶1000稀释液在37℃温育1h，并使用用于过氧化物酶的DAB(3，3′-二氨基联苯胺)底物试剂盒进行检测(Vector Laboratories)。

作为正对照，在4℃，将辣根过氧化物酶共轭的Affinipure山羊抗小鼠IgG+IgM(10μg/ml)用于包被Reacti-Bind Maleimide活化的透明条形板过夜。直接用DAB底物试剂盒完成正对照信号的发展。用ELISA板读取器(ThermoLabsysrems Multiskan EX)在405nm对所述板进行读数。在所述血清学抗体分析中发现所述靶向单元IS257是非免疫原性的，因为没有抗靶向单元抗体被检测到。

在图3中显示了结果。用本发明的靶向单元免疫的小鼠没有发展出任何免疫应答。来自于用靶向单元IS257免疫的小鼠(A)和来自于非免疫小鼠(B)的血清中的抗体水平通过酶联免疫吸附分析(ELISA)，采用HP201作为俘获抗原(1)进行分析。作为正对照，将山羊抗小鼠抗体用作俘获抗原(2)。结果显示为在405nm处的吸光度。

参考文献列表

Little CD等Amplification and expression of the c-myc oncogene in humanlung cancer cell lines.Nature 306：194-196，1983.PubMed：6646201Giard DJ等In vitro cultivation of human tumors：establishment of cell linesderived from a series of solid tumors.J.Natl.Cancer Inst.51：1417-1423，1973.PubMed：4357758

Banks-Schlegel SP等Intermediate filament and cross-linked envelopeexpression in human lung tumor cell lines.Cancer Res.45：1187-1197，1985.PubMed：2578876

Scherer WF等Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses.IV.Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells(strain HeLa)derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.J Exp Med.1953年5月；97(5)：695-710.没有摘要。

PMID：13052828[PubMed-OLDMEDLINE for Pre1966]

Koga M等，Cytotoxic，cell agglutinating，and syncytium forming effect ofpurified lectins from Ricinus communis on cultured cells.

Gann.1979年10月；70(5)：585-91.

PMID：520750[PubMed-indexed for MEDLINE]

Garlanda C等，Progressive growth in immunodeficient mice and host cellrecruitment by mouse endothelial cells transformed by polyoma middle-sizedT antigen：implications for the pathogenesis of opportunistic vascular tumors.Proc Natl Acad Sci USA.1994年7月19日；91(15)：7291-5.

PMID：8041783[PubMed-indexed for MEDLINE]

O′Connell KA等，A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized bysimian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics ofnormal endothelial cells.

JImmunol.1990年1月15日；144(2)：521-5.

PMID：2153170[PubMed-indexed for MEDLINE]

Bregman MG，等，Difluoromethylornithine enhances inhibition of melanomacell growth in soft agar by dexamethasone，clone A interferon and retinoicacid.

Int J Cancer.1986年1月15日；37(1)：101-7.

PMID：3079741[PubMed-indexed for MEDLINE]

Smith GP，Scott JK.Libraries of peptide and proteins displayed on filamentousphage.Methods Enzymol.1993，217；228-257.

Elo HO，Lumme PO，Antitumor activity of trans-bis(salicylaldoximato)-copper(ll)：a novel antiproliferative metal complex.Cancer Treat Rep.1985年9月；69(9)：1021-2.

PMID：4028035[PubMed-indexed for MEDLINE]

Boumrah D等，

Spacer Molecules in Peptide Sequences：Incorporation into Analogues ofAtrial Natriuretic Factor，Tetrahedron，1997，第53卷，第20期，第6977-6992页

序列表

<110>卡尔扬-CTT有限公司

<120>诊断剂和治疗剂

<130>FCI07FI3076-C

<160>73

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>1

Ala Arg Arg Pro Lys Leu Asp

1 5

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>2

Ala Arg Pro Pro Lys Gly Val Asn Trp Thr

1 5 10

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>3

Ala Arg Leu Pro Gln Val Glu Leu Ser Ala

1 5 10

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>4

Ala Arg Ala Pro Gly Val Met Pro Thr Thr

1 5 10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>5

Ala Arg Met Pro Pro Arg Ser

1 5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>6

Ala Arg Arg Pro Ala Thr Leu

1 5

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>7

Ala Arg Arg Pro Ala Val Ala Ala Phe Glu

1 5 10

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>8

Ala Arg Arg Pro Pro Gln Met

1 5

<210>9

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>9

Ala Arg Gln Pro Ala His Phe

1 5

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>10

Ala Arg Lys Pro Val Phe Gln

1 5

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>11

Ala Arg Asn Pro Thr Leu Gly Asn Ser Ser

1 5 10

<210>12

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>12

Ala Arg Pro Pro Arg Ser Thr

1 5

<210>13

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>13

Ala Arg Ser Pro Arg Val Lys

1 5

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>14

Ala Arg Ser Pro His Val Thr Pro Ile Ala

1 5 10

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>15

Ala Arg Ser Pro Ile Ser Pro

1 5

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>16

Ala Arg Tyr Pro Val Thr Met

1 5

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>17

Ala Arg Thr Pro Ser Arg Thr Pro Val Val

1 5 10

<210>18

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>18

Ala Arg Ala Pro Lys Met Gly

1 5

<210>19

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>19

Ala Arg Ala Pro Gly Val Arg

1 5

<210>20

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>20

Ala Arg Ala Pro Gly Pro Pro Arg Leu Ala

1 5 10

<210>21

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>21

Ala Arg Ala Pro Lys Met Gly

1 5

<210>22

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>22

Ala Arg Ala Pro Tyr Ala Ser

1 5

<210>23

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>23

Ala Arg Met Pro Gln Tyr Thr

1 5

<210>24

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>24

Ala Arg Leu Pro Arg Ala Val Val Pro Leu

1 5 10

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>25

Ser Arg Asn Pro Gly Leu Leu Thr Val Arg

1 5 10

<210>26

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>26

Ser Arg Ala Pro Asn Ser Val Gln His Asp

1 5 10

<210>27

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>27

Ser Arg Ala Pro Val Ala Pro

1 5

<210>28

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>28

Ser Arg Leu Pro Ser Ala Gly Thr Phe Gln

1 5 10

<210>29

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>29

Ser Arg Arg Pro Ala Ile Met

1 5

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>30

Ser Arg Arg Pro Val Trp Phe

1 5

<210>31

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>31

Ser Arg Arg Pro Gln Leu Pro

1 5

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>32

Ser Arg Arg Pro Ala Phe Val Val Arg Val

1 5 10

<210>33

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>33

Ser Arg Arg Pro Gly Leu Ser His Ala Ala

1 5 10

<210>34

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>34

Ser Arg Arg Pro Leu Val Val

1 5

<210>35

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>35

Ser Arg Gln Pro Thr Ser Leu

1 5

<210>36

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>36

Ser Arg Ser Pro Arg Val Val Glu Gly Leu

1 5 10

<210>37

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>37

Ser Arg Ser Pro Leu Val Val

1 5

<210>38

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>38

Ser Arg Tyr Pro Val Val Ser

1 5

<210>39

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>39

Ser Arg Thr Pro Pro Leu Leu

1 5

<210>40

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>40

Ser Arg Ser Pro Arg Leu Ala Leu Pro Thr

1 5 10

<210>41

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>41

Ser Arg Ser Pro Val Met Ser

1 5

<210>42

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>42

Ser Arg Tyr Pro Leu Glu Leu

1 5

<210>43

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>43

Ser Arg Trp Pro Gly Ser Val

1 5

<210>44

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>44

Ser Arg Pro Pro Ala Arg Thr

1 5

<210>45

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>45

Ser Arg Ala Pro Leu Leu Arg Pro Ile Ile

1 5 10

<210>46

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>46

Ser Arg Ala Pro Val Ala Pro

1 5

<210>47

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>47

Ser Arg Ala Pro Leu Gly Ser Ile Ala Asp

1 5 10

<210>48

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>48

Ser Arg Ala Pro Ala Val Ala Gly Trp Lys

1 5 10

<210>49

<211>11

<212>PRT

<213>合成的

<400>49

Ser Arg Ala Pro Ala Gln Lys Val Phe Phe Gly

1 5 10

<210>50

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>50

Ser Arg Ala Pro Ser Asn Val Glu Arg Met

1 5 10

<210>51

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>51

Ser Arg Ala Pro Ser Thr Leu Ala His Val

1 5 10

<210>52

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>52

Ser Arg Ala Pro Ser Pro Ser Tyr Arg Gln

1 5 10

<210>53

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>53

Ser Arg Met Pro Gly Ser Val

1 5

<210>54

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>54

Ser Arg Met Pro Leu Pro Val

1 5

<210>55

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>55

Ser Arg Met Pro Thr Leu Met Ser Gly Leu

1 5 10

<210>56

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>56

Ser Arg Leu Pro Glu Val Val Leu Gly Gln

1 5 10

<210>57

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>57

Ser Arg Leu Pro Ala Arg Thr

1 5

<210>58

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>58

Ser Arg Leu Pro Val Ser Ala Thr Leu Ala

1 5 10

<210>59

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>59

Ser Arg Val Pro Gly Arg Ala Thr Ala Thr

1 5 10

<210>60

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>60

Ser Arg Val Pro Leu Gly Pro

1 5

<210>61

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>61

Ser Arg Val Pro Leu Gly Arg Ala Ser Ser

1 5 10

<210>62

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>62

Ser Arg Val Pro Ser Asp Val

1 5

<210>63

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>63

Ser Arg Val Pro Tyr Gln Asn

1 5

<210>64

<211>10

<212>PRT

<213>合成的

<400>64

Ser Arg Val Pro Val Arg Gly Val Phe Gln

1 5 10

<210>65

<211>7

<212>PRT

<213>合成的

<400>65

Ser Arg Arg Pro Lys Leu Asp

1 5

<210>66

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>66

Ala Arg ARg Pro

1

<210>67

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>67

Ser Arg Ala Pro

1

<210>68

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>68

Ala Arg Ala Pro

1

<210>69

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>4

Ser Arg Val Pro

1

<210>70

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>4

Ser Arg Leu Pro

1

<210>71

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>71

Ala Arg Leu Pro

1

<210>72

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>72

Ala Arg Pro Pro

1

<210>73

<211>4

<212>PRT

<213>合成的

<400>73

Ser Arg Arg Pro

1

Claims

1.一种包含肽序列X-R-Y-P-Z_n的靶向单元或其可药用或生理上可接受或诊断上可接受的盐，其中，

X是丙氨酸、丝氨酸或高丝氨酸，或其结构性或功能性类似物；

R是精氨酸或高精氨酸，或其结构性或功能性类似物；和

Y是精氨酸、高精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、缬氨酸或脯氨酸，或其结构性或功能性类似物；

或者

R和Y共同构成这样的单元，所述单元是或者含有精氨酸或高精氨酸的至少一个光学异构体或其结构性或功能性类似物，所述结构性或功能性类似物含有至少一个鸟嘌呤基或脒基或带有或者可通过质子化获得离域正电荷的相关基团；

P是脯氨酸或其结构性或功能性类似物；

Z是任何氨基酸残基，并且其中每一个Z_n可以是不同、相似或相同；以及

n是0～7的整数，

其特征在于所述单元特异性地靶向于肿瘤。

2.如权利要求1所述的靶向单元，其中所述肿瘤是肺癌肿瘤。

3.如权利要求1或2所述的靶向单元，其中所述肺癌是非小细胞肺癌肿瘤。

4.如权利要求1～3中任一项所述的靶向单元，其中X是丙氨酸或其结构性或功能性类似物。

5.如权利要求1～3中任一项所述的靶向单元，其中X是丝氨酸或其结构性或功能性类似物。

6.如权利要求1～5中任一项所述的靶向单元，其中Y是精氨酸或其结构性或功能性类似物。

7.如权利要求1～5中任一项所述的靶向单元，其中Y是丙氨酸或其结构性或功能性类似物。

8.如权利要求1～7中任一项所述的靶向单元，其中n为0～6。

9.如权利要求8所述的靶向单元，其中n是0～5。

10.如权利要求9所述的靶向单元，其中n是0～4。

11.如权利要求10所述的靶向单元，其中n是0～3。

12.如权利要求11所述的靶向单元，其中n是0。

13.如权利要求1～12中任一项所述的靶向单元，其中所述肽是线形的。

14.如权利要求1～12中任一项所述的靶向单元，其中所述肽是环状的或者形成部分环状结构。

15.如权利要求1～14中任一项所述的靶向单元，所述靶向单元选自由经SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.73确定的肽所组成的组。

16.如权利要求15所述的靶向单元，所述靶向单元选自由ARRPKLD(SEQ ID NO.1)、SRRPKLD(SEQ ID NO.65)、ARRP(SEQ ID NO.66)、SRAP(SEQ ID NO.67)、ARAP(SEQ ID NO.68)、SRVP(SEQ IDNO.69)、SRLP(SEQ ID NO.70)、ARLP(SEQ ID NO.7 1)、ARPP(SEQ ID72)、SRRP(SEQ ID NO.73)组成的组。

17.一种肿瘤靶向剂，该肿瘤靶向剂含有选自权利要求1～16中任一项所述的至少一个靶向单元，该肿瘤靶向单元直接或间接与至少一个效应器单元结合。

18.如权利要求17所述的肿瘤靶向剂，其中所述效应器单元是可被直接或间接检测的试剂或是治疗剂。

19.如权利要求18所述的肿瘤靶向剂，其中所述可检测试剂包括螯合剂、金属络合物、富集同位素、放射性物质、顺磁性物质、亲和标记或者荧光或发光标记。

20.如权利要求18所述的肿瘤靶向剂，其中所述可检测试剂含有稀土金属。

21.如权利要求18所述的肿瘤靶向剂，其中所述可检测试剂包括β-或者α-辐射体。

22.如权利要求18所述的肿瘤靶向剂，其中所述可检测试剂含有钆或铕。

23.如权利要求18所述的肿瘤靶向剂，其中所述治疗剂选自由细胞毒素性物质、细胞抑制性物质和辐射性物质组成的组。

24.如权利要求23所述的肿瘤靶向剂，其中所述治疗剂包括紫杉醇、长春瑞滨、伊立替康、顺铂、卡铂、阿霉素、柔红霉素、甲氨蝶呤、吉西他滨、α-或β-辐射体、或者硼。

25.如权利要求17～24中任一项所述的肿瘤靶向剂，所述肿瘤靶向剂进一步包含至少一个可选的单元。

26.一种诊断或药用组合物，所述诊断或药用组合物含有至少一种如权利要求1～16中任一项所述的靶向单元，或者至少一种如权利要求17～25中任一项所述的靶向剂。

27.如权利要求1～16中任一项所述的靶向单元，或者如权利要求17～25中任一项所述的靶向剂在治疗中的应用。

28.如权利要求1～16中任一项所述的靶向单元，或者如权利要求17～25中任一项所述的靶向剂在诊断中的应用。

29.如权利要求1～16中任一项所述的靶向单元，或者如权利要求17～25中任一项所述的靶向剂在制造用于癌症或者癌症相关疾病的药物中的应用。

30.如权利要求29所述的应用，其中所述癌症或者癌症相关疾病是实体瘤或其转移。

31.如权利要求30所述的应用，其中所述实体瘤是非小细胞肺癌或其转移。

32.如权利要求1～16中任一项所述的靶向单元，或者如权利要求17～25中任一项所述的靶向剂在制造用于诊断癌症或癌症相关疾病的诊断组合物中的应用。

33.一种用于治疗癌症或者癌症相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者提供治疗有效量的如权利要求26所述的药用组合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述癌症或者癌症相关疾病是肺癌或其转移。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述实体瘤是非小细胞肺癌或其转移。

36.一种用于诊断癌症或者癌症相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者提供诊断合适量的如权利要求26所述的诊断组合物。