CN101175847A - 基于计算机分析来改良菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于计算机分析来改良菌株的方法，其中将用于生产有用物质的靶菌株基因组信息与用于过量生产有用物质的菌株基因组信息相比对，以便初筛出对于过量生产有用物质来说不必要的基因，然后利用代谢流分析通过模拟来二次筛选出要去除的基因。根据本发明，通过代谢和遗传工程方法可以有效地构建改良的菌株，包括比对分析靶菌株用于生产有用物质的基因组信息和生产大量有用物质的菌株基因组信息以筛选出候选基因，并在筛选的候选基因上进行计算机模拟以选出要去除的基因组合，这表现出有用物质产量的提高。因此，可以显著减少实际试验所需的时间、精力和成本。

Description

基于计算机分析来改良菌株的方法
技术领域
本发明涉及一种基于计算机(in silico)分析来改良菌株的方法。更具体地，涉及一种将用于生产有用物质的靶菌株基因组信息与用于过量生产有用物质的菌株基因组信息相比对，以便初筛出对于过量生产有用物质来说不必要的基因，然后通过代谢流分析进行模拟来二次筛选出要去除的基因的基于计算机(in silico)分析来改良菌株的方法。
背景技术
代谢流研究利用与遗传重组技术相关的分子生物学技术、通过引入新的代谢途径或者去除、放大或改变现有代谢途径，提供了改变细胞或菌株在人们预期方向上的新陈代谢特征所需的各种信息。这种代谢流研究包括生物工程学的所有内容，例如过量生产现有代谢物、生产新的代谢物、抑制生产不想要的代谢物、以及利用廉价的底物。在随之新发展起来的日益增加的生物信息学的帮助下，由不同物种的基因组信息建立各自的代谢网络模型成为了可能。通过代谢网络信息与代谢流分析技术的结合，生产各种初级代谢物和有用的蛋白质的工业应用如今成为可能(Hong等，Biotech.Bioeng，83：854，2003；US2002/0168654)。
用于分析细胞代谢的数学模型可以分为两类，即包括动态和调控机制信息的模型，以及仅涉及生化途径系数的静态模型。动态模型通过预测随时间的细胞内变化表示出细胞的动态条件。然而，动态模型需要许多动态参数，因而在精确地预测细胞内部方面存在问题。
另一方面，静态数学模型利用生化途径的物质平衡与细胞组成信息来确定可用细胞能达到的理想代谢流空间。尽管这种代谢流分析(MFA)并不需要动态信息，已知其表示了理想的细胞代谢流，并准确地说明了细胞习性(Varma等，Bio-Technol，12：994，1994；Nielsen等，BioreactionEngineering Principles，Plenum Press，1994；Lee等，Metabolic Engineering，Marcel Dekker，1999)。
代谢流分析是通过测量代谢途径系数、生产量及代谢物的消费量来确定代谢流内部变化的技术。代谢流分析是基于准稳态的假设。也就是说，由于外部环境造成的内部代谢物浓度改变是非常即时的，因而上述改变通常被忽略并假设内部代谢物浓度没有变化。
如果所有的代谢物、代谢途径和途径中的化学计量矩阵(Sij T，j反应中的代谢物i)为已知，则可以计算出代谢流量向量(vj，j途径的流量)，其中代谢物X随时间的变化可以表示成所有代谢流量之和。设X随时间的变化是常数，即假设处于准稳态，可确定以下方程：
ST v＝dX/dt＝0
然而，在许多情况下只有途径是已知的，而各代谢物和途径的化学计量值以及代谢流量向量(vj)部分已知，因而上述方程扩展为以下方程：
ST v＝Smvm+Suvu＝0
上述方程分为两个矩阵，实验上已知的化学计量值(Sm(I×M)，I＝总代谢产物数(total metabolite number)，M＝化学计量已知的反应总数(totalstoichiometrically-known reaction number))乘以流量(vm(I×M))的确定矩阵，以及未知化学计量值(Su(I×M))乘以流量(vu(I×M))的矩阵。其中，m是测量值的下标，u是未测量值的下标。
如果未知流量向量(Su)的秩(Su)等于或大于u(即变量数等于或小于方程式)，则流量由简单的矩阵计算确定。然而，如果变量数大于方程式(即如果存在叠加方程式)，则将执行验证总方程式的一致性、代谢流测量值的准确度、和准稳态有效性的操作，以计算出更准确的值。
如果变量数大于方程式，则利用特定的目标函数和各种理化方程式通过线性编程来计算出最佳代谢流分布，其中特定的代谢反应流量可以限制在特定的范围内。其可以如下计算：
最小化/最大化：Z＝∑civi
s.t.STv＝0且αmin，i≤vi≤αmax，I
其中ci是重量值，vi是代谢流。
一般来说，生物量形成速率(即比生长速率)的最大化、代谢物生产的最大化以及副产物生产的最小化等等可用作目标函数。αmax，i和αmin，i是各代谢流具有的极限值，其指定各代谢流中允许的最大值和最小值。
迄今为止，为了使有用代谢物达到最高产量提出了改良菌株的各种方法，但改良菌株存在困难，因为筛选基因并证实具有优良产量的菌株的过程很复杂。上面所述的代谢流分析可以用于确定通过菌株改良得到的预期代谢物的最高产量，而该确定值可用于分析菌株中的代谢途径性质。通过确定代谢途径的性质，可以确定需要运行的代谢途径并可建立运行代谢循环。这可以以最有效的方式控制代谢流并生产出预期的代谢物。
因此，当前的发明者们发现，通过将用于生产有用物质的靶菌株的中央代谢途径上的基因组信息与过量生产该有用物质的菌株的中央代谢途径上的基因组信息相比对，从不存在于过量生产有用物质的菌株中而存在于实质操作的相应菌株的基因中筛选出干扰细胞生长或者不必要的基因，可以很容易地改良菌株。随后，当前发明者们在这些候选基因的各种组合上进行了代谢流分析以筛选出一组最终被去除的基因，同时考虑了特定的生长速率和有用物质的形成速率，由此完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的主要目的在于提供一种通过计算机分析改良靶菌株的方法，其中使用了基因组信息和代谢流分析技术来改良靶菌株以生产有用的物质。
本发明的另一个目的在于提供一种通过计算机分析来改良靶菌株以生产琥珀酸的方法。
本发明还有一个目的在于提供一种通过上述方法改良的过量生产琥珀酸的突变菌株，以及一种利用该方法来制备琥珀酸的方法。
为实现上述目的，一方面，本发明提供一种用于改良生产有用物质的菌株的方法，该方法包括以下步骤：
(a)选择用于生产有用物质的靶菌株和过量生产有用物质的菌株，并构建两种菌株的代谢流分析模型系统；
(b)筛选存在于生产有用物质的靶菌株中而不存在于过量生产有用物质的菌株中并且对于细胞生长来说是不必要的或者是不会造成干扰的基因；
(c)由筛选出的基因构建出要去除的基因组合；
(d)利用步骤(a)中构建的代谢流分析模型系统，通过从上述生产有用物质的靶菌株中去除步骤(c)中构建的各基因组合从而获得突变菌株，在该突变菌株上进行计算机模拟；
(e)从模拟结果中选出要去除的基因组合，其具有优异的有用物质产量与比生长速率；
(f)构建去除了选择基因组合的突变菌株。
改良生产有用物质菌株的方法可以另外包括的步骤为：(g)培养所构建的突变菌株以试验性地测定该突变菌株的有用物质产量。同样，优选通过绘制产物形成速率和比生长速率之间的平衡曲线并通过比较突变菌株的比生长速率和有用物质产量来进行计算机模拟。
另一种方式中，本发明提供了一种用于改良生产琥珀酸菌株的方法，该方法包括以下步骤：
(a)选择生产琥珀酸的靶菌株和过量生产琥珀酸的菌株，并构建两种菌株的代谢流分析模型系统；
(b)筛选存在于生产琥珀酸的靶菌株中而不存在于过量生产琥珀酸的菌株中并且对于细胞生长来说是不必要的或者是不会造成干扰的基因；
(c)由筛选出的基因构建出要去除的基因组合；
(d)利用步骤(a)中构建的代谢流分析模型系统，通过从上述生产琥珀酸的靶菌株中去除步骤(c)中构建的各基因组合从而获得突变菌株，在该突变菌株上进行计算机模拟；
(e)从模拟结果中选出要去除的基因组合，其具有优异的琥珀酸产量与比生长速率；
(f)构建去除了选择基因组合的突变菌株。
在本发明的改良生产琥珀酸菌株的方法中，步骤(b)中筛选出的基因优选选自以下组：ptsG、pykF、pykA、mqo、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、aceB和aceA，而步骤(e)中选出的要去除的基因组合优选包括ptsG、pykF和pykA。
改良产琥珀酸菌株的方法可以另外包括的步骤为：(g)培养所构建的突变菌株以试验性地测定该突变菌株的琥珀酸产量。同样，优选通过绘制产物形成速率和比生长速率之间的平衡曲线并比较突变菌株的比生长速率和琥珀酸产量来进行计算机模拟。
在本发明中，过量生产琥珀酸的菌株优选为Mannheimia属。Mannheimia属菌株优选为Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)，而产琥珀酸的靶菌株优选为E.coli。
而另一种方式中，本发明提供了一种突变菌株，其去除了ptsG、pykF和pykA基因，并具有生产高产量琥珀酸的能力，以及一种生产琥珀酸的方法，包括将所述突变菌株在厌氧条件下培养。在本发明中，突变菌株优选为去除了ptsG、pykF和pykA基因的E.coli菌株。
通过以下详细说明和所附的权利要求，将会更加清楚地理解本发明的其他特征和实施方式。
附图说明
图1是表示根据本发明的改良菌株的方法流程图；
图2表示根据本发明的筛选候选基因以改良生产有用物质的菌株的方法；
图3表示根据本发明的筛选候选基因以改良生产琥珀酸菌株以及构建突变的E.coli菌株的方法。
图4表示在过量生产琥珀酸菌株Mannheimia(A)和生产有用物质的靶菌株E.coli(B)之间的代谢途径比较；
图5a和图5b表示琥珀酸产量和比生长速率之间的平衡曲线，其中图5a表示去除一个基因(-○-：ptsG；-■-：ΔaceBA；-△-：野生型/pykFA/sdhA/mqo)形成的平衡曲线，而图5b表示去除两个基因(-○-：ΔptsGΔpykAF；-■-：ΔptsGΔmqo/ΔptsGΔsdhA/ΔptsGΔaceBA；-△-：ΔpykAFΔmqo/ΔpykAFΔsdhA/ΔpykAFΔaceBA/ΔmqoΔsdhA/ΔmqoΔaceBA/ΔsdhAΔaceBA)形成的所有10种可能组合的平衡曲线。
图6表示利用MetaFluxNet绘制的平衡曲线实例。
具体实施方式
在本发明中，开发了通过筛选靶基因来改良菌株的方法，其中允许计算机预测通过去除特定的基因人为地改变细胞内代谢途径所获得的结果。
根据本发明为了改良菌株，首先筛选基因，该基因不存在于过量生产有用物质的菌株中而存在于生产有用物质的靶菌株中，并且对于细胞生长来说是不必要的或者不会造成干扰的。
然后，对筛选的基因进行一种或多种组合。在这些基因组合中，利用代谢流分析程序进一步筛选出当候选基因从生产有用物质的靶菌株中去除时表现出具有高有用物质形成速率与比生长速率的基因组合。
从靶菌株中去除二次筛选出的基因组合，以构建生产有用物质的突变菌株，并培养所构建的突变菌株及检测有用物质的产量。
图1是表示选择大量生产琥珀酸的菌株的本发明方法的流程图。如图1所示，首先筛选不存在于过量产琥珀酸的菌株中但存在于生产琥珀酸的靶菌株中并且对于细胞生长来说是不必要的或者是不会造成干扰的基因。使用代谢流分析技术来比较琥珀酸产量与比生长速率，然后构建去除了候选基因组合的突变菌株。
图2表示了利用基因组信息来实现初筛候选基因的方法，用于改良生产有用物质的菌株。如图1所示，在初筛过程中，通过检查每个菌株是否存在基因来筛选当基因发生突变时没有显著的变化的基因。
在本发明中，首先筛选出不存在于过量生产琥珀酸的菌株中但存在于生产琥珀酸的靶菌株中并且对于细胞生长来说是不必要的或者是不会造成干扰的基因。
将筛选出的基因从靶菌株中去除从而使所述靶菌株突变以生产有用物质。对突变进行计算机模拟，在其中选出提高了有用物质产量的突变菌株，最后通过实际培养试验检测有用物质产量。
在本发明中，选择了E.coli突变菌株和重组E.coli菌株作为应用上述方法的模型系统，并将其应用于生产琥珀酸。
这里所使用的术语“基因去除”意思是包括所有使特定基因无效的操作，包括去除或修饰所有或部分的基因碱基序列。
实施例
在下文中，将通过实施例更详细地说明本发明。然而应当明白，这些实施例仅在于说明的目的，并不在于限制本发明的范围。
特别地，尽管以下实施例通过与过量生产琥珀酸的菌株Mannheimiasucciniciproducens的基因组信息相比对来说明改良生产琥珀酸菌株E.coli的方法，但显然对于本领域技术人员来说，根据本发明的公开内容还可以使用其它的过量生产琥珀酸的菌株以及其它的生产琥珀酸菌株。而且，尽管以下实施方式仅将琥珀酸作为有用物质进行说明，但显然对于本领域技术人员来说根据本发明也可以改良除了琥珀酸之外的其它有用菌株。
实施例1：模型系统的构建
选择E.coli突变菌株、重组E.coli菌株以及生产琥珀酸菌株Mannheimia succiniciproducens作为模型系统。为此，构建了E.coli和Mannheimia的新的代谢流分析系统。
(A)E.coli
在E.coli的情况下，新代谢途径由979个生化反应组成并且在代谢途径上考虑有814个代谢物。该系统由几乎所有的E.coli代谢途径组成，并且在代谢流分析中以目标函数使用的、构成菌株的生物量形成方程式的E.coli生物量组成如下(Neidhardt等，Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology，1996)：55％的蛋白质、20.5％的RNA，3.1％的DNA，9.1％脂质，3.4％的脂多糖，2.5％的肽聚糖，2.5％的糖原，0.4％的聚胺，3.5％的其它代谢物、辅助因子和离子。
(B)曼海姆(Mannheimia)
Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)，一种整个基因组已被解码并完成了功能分析的菌株，是从韩国本地牛的瘤胃中直接分离的韩国本土菌株，具有生产大量各种工业领域中使用的琥珀酸的能力。
通过生物信息技术发现，Mannheimia的基因组由2,314,078个碱基构成(Hong等，Nat.Biotechnol.，22：1275，2004)并具有2,384个候选基因。Mannheimia的基因分布在整个环状基因组中，根据其细胞内功能分类时期用于预测整个基因组的性质。
通过基因组信息的整体分析，在计算机上构建出Mannheimia的计算机模型。由373个酶促反应方程式和352种代谢物构成了代谢网络，根据该结果，可以预测出细胞内代谢流的变化。
实施例2：靶基因筛选
使用BioSilico的数据库(http://biosilico.kaist.ac.kr)来构建模拟模型，其中构建了过量生产琥珀酸的Mannheimia中央代谢途径和E.coli的中央代谢途径。
为了比较代谢，将过量生产琥珀酸的菌株Mannheimia(A)的代谢途径与生产琥珀酸的靶菌株E.coli(B)的代谢途径进行比较，结果表示于图4中。然后，比对中央代谢途径上的基因，并筛选出E.coli中对于生产琥珀酸来说不必要的或者不会造成干扰的基因。
将Mannheimia中用于琥珀酸生产的中央代谢途径上的基因与E.coli中用于琥珀酸生产的中央代谢途径上的基因相比对，结果，仅在E.coli中存在的基因有ptsG、pykF、pykA、mqo、sdhABCD、aceBA、poxB和acs。，在这些基因中，除已知在厌氧条件下无效的poxB和acs之外的基因首先被筛选出作为候选基因，其对于琥珀酸生产来说是不必要的或者不会造成干扰的。即筛选出ptsG、pykF、pykA、mqo、sdhABCD和aceBA。
实施例3：筛选突变菌株
为了利用微生物生产特定的代谢物，除产量之外通常应当考虑到细胞的比生长速率。一般来说，菌株看上去会生长得使细胞成分最大化而不会生长形成有用的产物，这种生长表示为比生长速率。因此，为了预测哪个基因的去除使得有用产物最大化的同时使得比生长速率优异，采用了代谢流分析技术。
为了同时考虑首选候选基因中来自一个基因去除和两个基因去除组合的产量和比生长速率，可选择两个目标函数(即比生长速率和有用物质形成速率)并分别绘制在x-和y-轴上，结果表示在图5a和图5b中。即选择使所得菌株具有最佳产量与比生长速率的曲线，从而选出对应于靶代谢途径的基因组合。
(A)多基因突变菌株的模拟
为了对每个基因组合构建多基因突变体，应当进行大量的突变组合。通过实际试验制备这种大量突变实际上非常困难或者几乎不可能。因此，对各种突变进行构建，在可突变系统基础上进行计算机模拟以确定产物形成速率和比生长速率的平衡曲线。可采用MetaFluxNet 1.6，下载网址为“http://mbel.kaist.ac.kr”(Lee等，Bioinformatics，19：2144，2003)，进行模拟。
在模拟时，考虑到通常已知的葡萄糖摄取速率10mmol/g DCW·h和厌氧条件，以葡萄糖作为碳来源，将氧摄取速率设置为零。同样，将对应于目的基因去除的生化反应速率设置为零。
为了绘制平衡曲线，改良了现有技术文献中提出的算法(Burgard等，Biotechnol.Bioeng.，84：647，2003)。在现有技术文献中，并没有精确地披露过通过平衡曲线来寻找候选基因的方法，而在本发明使用的方法中，通过检测去除了相关基因的突变菌株的有用物质生产速率和生物量形成速率来选择候选基因组合，其即使在有用物质生产速率减少的情况下也没有表现出生物量减少的曲线，因而可以比较相关突变菌株生产有用物质的能力。
也就是说，首先计算出有用产物形成速率的最大值和最小值以确定有用产物形成速率的允许范围，然后在该允许范围内最大化其生长速率从而绘制出两个目标函数之间的平衡曲线。图6表示利用MetaFluxNet绘制的平衡曲线实施例。
为了测出有用产物的产量，在考虑比生长速率的情况下，确定在应用于代谢流控制技术中所需的产物形成速率和比生长速率之间的平衡曲线(图5a和5b)。
如图5b所示，对应于目标代谢途径的基因组合检测结果表明，与去除其他基因组合的菌株不同，在突变菌株同时去除了ptsG、pykF和pykA的情况下，能够获得最佳产量和比生长速率的曲线。也就是说，在相关基因的情况下，可以获得与比生长速率增加而有用物质生产速率下降趋势不同的曲线，其中产琥珀酸速率也最佳。
这种大量检测结果表明，如果在厌氧条件下培养同时去除ptsG、pykF和pykA的E.coli，与野生型菌株和去除其它基因组合的菌株相比，会生产过量的琥珀酸(表1)。
表1：每种突变体的模拟结果
  去除基因   最大生物量形成速率(-h)   产琥珀酸速率(mM/DCW/h)   琥珀酸a的最大生产能力
  野生型   0.2156   0.1714   1.000
  pykFA   0.2156   0.1714   1.000
  ptsG   0.1884   0.1714   0.8738
  ptsG pykFA   0.1366   6.834   25.26
  ptsG mqo   0.1884   0.1714   0.8738
  ptsG sdhA   0.1884   0.1714   0.8738
  ptsG aceBA   0.1884   0.1714   0.8738
  pykFA sdhA   0.2156   0.1714   1.000
  pykFA aceBA   0.2156   0.1714   1.000
  mqo sdhA   0.2156   0.1714   1.000
  mqo aceBA   0.2156   0.1714   1.000
  sdhA aceBA   0.2156   0.1714   1.000
a计算公式：(突变体的生产琥珀酸速率x最大生物量形成速率)/(野生型的琥珀酸生产速率x最大生物量形成速率)
B.实际测试结果
为了根据模拟结果来构建E.coli突变菌株，采用了DNA工程的标准方法并且使用了λ噬菌体red操纵子中存在的red重组酶(Sambrook等，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，3rd edition，2001；Datsenko等Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97：6640，2000)。首先，将含有抗生素抗性基因的DNA模版利用含有位于靶基因上游和下游的寡核苷酸的引物(见表2)来进行两步骤的PCR。
表2
将PCR产物转化到亲本菌株中，并通过双同源重组技术用抗生素抗性基因取代靶基因，从而构建出去除了靶基因的突变菌株。构建的菌株如表3中所示。
表3
  菌株   特征
E.coli W3110   Coli基因储存中心No.4474菌株(Coli Genetic Stock Center strain No.4474)
  E.coli W3110G   ptsG∷Spr
  E.coli W311OGF   ptsG∷Spr，pykF∷Tcr
  E.coli W3110GFA   ptsG∷Spr，pykF∷Tcr，pykA∷Kmr
  E.coli W3110GFO   ptsG∷Spr，pykF∷Tcr，mqo∷Cmr
  E.coli W3110GFH   ptsG∷Spr，pykF∷Tcr，sdh∷Kmr
  E.coli W3110GFHO   ptsG∷Spr，pykF∷Tcr，sdh∷Kmr，mqo∷Cmr
  E.coli W3110GFHOE   ptsG∷Spr，pykF∷Tcr，sdh∷Kmr，mqo∷Cmr，aceBA∷Pmr
在表3中，Spr表示壮观霉素抗性，Tcr表示四环素抗性，Cmr表示氯霉素抗性，Kmr表示卡那霉素抗性，Pmr表示腐草霉素抗性。
在初始葡萄糖浓度为60mM的厌氧条件下，培养如上所述构建的突变体24小时，并检测剩余的葡萄糖浓度以及琥珀酸、乳酸、甲酸盐、乙酸盐和乙醇浓度。结果示于表4中(实际试验结果中各有机酸的比例)。从表4中可以看出，在去除了ptsG、pykF和pykA的突变菌株(W3110GFA)中琥珀酸对其它有机酸的比率(S/A比)比野生型菌株(W3110)中的琥珀酸对其它有机酸的比率(S/A比)升高了8.28倍。
表4：实际试验中琥珀酸、乳酸、甲酸盐、乙酸盐和乙醇的浓度
Figure A20058004543000181
a24小时的厌氧培养
b剩余的葡萄糖浓度(初始葡萄糖浓度：50mM)
c计算公式：(琥珀酸)/(琥珀酸+乳酸+甲酸盐+乙酸盐+乙醇)
d计算公式：琥珀酸比例/0.017(野生型的琥珀酸比例)
从以上结果可以看出，本发明可提供代谢和遗传工程的方法，包括比较分析典型靶菌株E.coli基因组信息，其用于生产有用物质的基因组信息和过量生产琥珀酸Mannheimia菌株的基因组信息，并利用模拟程序将E.coli改良成生产大量琥珀酸的突变菌株。
尽管本发明是参考特定的特征进行详细说明的，但对本领域技术人员来说显然这种说明仅仅针对优选的实施方式，而并没有限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附的权利要求及其等同方式来确定。本领域技术人员应当明白，在不偏离所附权利要求揭示的本发明范围和实质的情况下可以对本发明进行简单的改变、变形和增加。
工业实用性
从上述说明可以看出，根据本发明，通过代谢和遗传工程方法可以有效地构建改良的菌株，包括比较分析靶菌株用于生产有用物质的基因组信息和生产大量有用物质的菌株基因组信息以筛选出候选基因，并在筛选的候选基因上进行计算机模拟以选出要去除的基因组合，这表现出有用物质产量的提高。因此，可以显著减少实际试验中所需的时间、精力和成本。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>韩国科学技术院(KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE ANDTECHNOLOGY)
<120>基于计算机分析来改良菌株的方法
<130>FP07KR328
<140>PCT/KR2005/001501
<141>2005-05-23
<150>10-2005-0029568
<151>2005-04-08
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<400>1
tgcccgccgt tgtatcgcat gttatggcag ggggatcgat cctctaga    48
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<400>2
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<213>Artificial
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 gaggttagta atgttttctt taccaccaaa tgcagcaacc agagccgg    48
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<213>Artificial
<220>
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<213>Artificial
<220>
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<212>DNA
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<220>
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<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<400>17
gcaccttgtg atggtgaacg caccgaagaa cgagctcggt acccgggc    48
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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ctttcgcctg ttgcagcgcc tgaccgccag caatagacca gttgcaat    48
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer ACEBA3
<400>19
gacgcgccga ttactgccga tcagctgctg gcaccttgtg atggtgaa    48
<210>20
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer ACEBA4
<400>20
atcccgacag atagactgct tcaatacccg ctttcgcctg ttgcagcg    48
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer PYKA1
<400>21
cacctggttg tttcagtcaa cggagtatta catcgggggg gggggaaag    49
<210>22
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer PYKA2
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gtggcgtttt cgccgcatcc ggcaacgtac atcccaattc tgattag     47
<210>23
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer PYKA3
<400>23
ttatttcatt cggatttcat gttcaagcaa cacctggttg tttcagtc    48
<210>24
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>PrimerPYKA4
<400>24
gttgaactat cattgaactg taggccggat gtggcgtttt cgccgcatc   49

Claims (16)

1.一种用于改良生产有用物质的菌株的方法，该方法包括以下步骤：
(a)选择用于生产有用物质的靶菌株和过量生产有用物质的菌株，并构建两种菌株的代谢流分析模型系统；
(b)筛选存在于生产有用物质的靶菌株中而不存在于过量生产有用物质的菌株中并且对于细胞生长来说是不必要的或者不会造成干扰的基因；
(c)由筛选出的基因构建出要去除的基因组合；
(d)利用步骤(a)中构建的代谢流分析模型系统，通过从上述生产有用物质的靶菌株中去除步骤(c)中构建的各基因组合从而获得突变菌株，在该突变菌株上进行计算机模拟；
(e)从模拟结果中选出要去除的基因组合，其具有优异的有用物质产量与比生长速率；
(f)构建去除了选择基因组合的突变菌株。
2.如权利要求1所述的用于改良生产有用物质的菌株的方法，其特征在于，通过绘制产物形成速率和比生长速率之间的平衡曲线并比较突变菌株的比生长速率和有用物质产量来进行计算机模拟。
3.如权利要求1所述的用于改良生产有用物质的菌株的方法，其特征在于，所述生产有用物质的靶菌株为E.coli。
4.如权利要求1所述的用于改良生产有用物质的菌株的方法，其特征在于，所述方法另外包括的步骤为：(g)培养所构建的突变菌株以试验性地测定该突变菌株的有用物质产量。
5.一种用于改良产琥珀酸菌株的方法，该方法包括如下步骤：
(a)选择生产琥珀酸的靶菌株和过量产琥珀酸的菌株，并构建两种菌株的代谢流分析模型系统；
(b)筛选存在于生产琥珀酸的靶菌株中而不存在于过量产琥珀酸的菌株中并且对于细胞生长来说是不必要的或者是不会造成干扰的基因；
(c)由筛选出的基因构建出要去除的基因组合；
(d)利用步骤(a)中构建的代谢流分析模型系统，通过从上述生产琥珀酸的靶菌株中去除步骤(c)中构建的各基因组合从而获得突变菌株，在该突变菌株上进行计算机模拟；
(e)从模拟结果中选出要去除的基因组合，其具有优异的琥珀酸产量与比生长速率；
(f)构建去除了选择基因组合的突变菌株。
6.如权利要求5所述的用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，通过绘制琥珀酸形成速率和比生长速率之间的平衡曲线并且比较突变菌株的比生长速率和琥珀酸产量来进行计算机模拟。
7.如权利要求5所述的用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，所述过量生产琥珀酸的菌株为Mannheimia属。
8.如权利要求7所述的用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，所述过量生产琥珀酸的菌株为Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)。
9.如权利要求5所述的一种用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，所述生产琥珀酸的靶菌株为E.coli。
10.如权利要求5所述的用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，在步骤(b)中筛选出的基因选自以下组：ptsG、pykF、pykA、mqo、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、aceB和aceA。
11.如权利要求5所述的用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，在步骤(e)中选出的要去除的基因组合包括ptsG、pykF和pykA。
12.如权利要求5所述的用于改良产琥珀酸菌株的方法，其特征在于，所述方法另外包括的步骤为：(g)培养所构建的突变菌株以试验性地测定该突变菌株的琥珀酸产量。
13.一种去除了ptsG、pykF和pykA基因的突变菌株，并具有生产高产量的琥珀酸的能力。
14.一种生产琥珀酸的方法，包括在厌氧条件下培养如权利要求13所述的突变菌株。
15.一种E.coli突变体，其去除了ptsG、pykF和pykA基因。
16.一种生产琥珀酸的方法，包括在厌氧条件下培养如权利要求15所述的E.coli突变体。
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