CN101151532A - 胶态金属轭合物 - Google Patents

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Abstract

胶态金属轭合物可以生产成适于在例如免疫分析中直接使用的高浓度。胶态金属轭合物可以在装置中用于定性、半定量、或定量测定样品(包括生物样品)中存在的化合物。

Description

胶态金属轭合物
优先权要求
依据美国法典第35卷第119条(e)款，本申请要求2005年3月29日提交的美国专利申请No.60/665,851的优先权，该申请以其全文合并引作参考。
技术领域
本发明涉及胶态金属轭合物，包括胶态金属轭合物的装置，以及制备该胶态金属轭合物的方法。
发明背景
胶态金属轭合物可用于多种多样的用途，包括分析，例如免疫分析。在这些用途中，胶态金属轭合物可以是与抗体结合的金属粒子，所述抗体能与特定抗原结合。金属粒子使得所述结合在分析分析中通过光学或电子装置显现，包括，例如，视觉或分光光度观察由金属粒子的大小、组成和形状赋予的颜色。
发明概述
一般而言，胶态金属轭合物可以生产成适合直接用于例如免疫分析的高浓度。胶态金属轭合物可用于定性和半定量确定样品(包括生物样品)中存在的化合物的装置。制备胶态金属轭合物的方法可以包括形成具有与亲和试剂轭合的高浓度金属粒子的组合物。
高浓度可以有利地降低或消除胶态金属轭合物用于免疫分析所需的浓度或纯化的程度。该方法快速和容易地生产胶态金属和胶态金属轭合物，同时减少加工步骤数以及降低轭合物中亲和试剂组分的量。先前的方法一般要求纯化以从轭合物中去除过量亲和试剂。
在一个方面，生产分析装置的方法包括提供多个胶态金属粒子，将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂混合，所述量基本等于可与胶态粒子轭合形成轭合物的量，以及在基质之上或之内直接沉积轭合物。
在另一方面，生产金属轭合物的方法包括提供多个胶态金属粒子，并将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂混合，所述量基本等于可与胶态粒子轭合形成轭合物的量。
在另一方面，组合物包括多个最大光密度大于2的胶态金属粒子，多个胶态金属粒子的每一个都与亲和试剂轭合。组合物基本不含聚集的金属粒子，并且基本没有未结合的亲和试剂。多个胶态金属粒子的最大光密度介于3至7.5之间。
在另一方面，分析装置包括分析条，所述分析条包括含有胶态金属轭合物的组合物，所述胶态金属轭合物包括与亲和试剂轭合的金属粒子。该组合物基本不含聚集的金属粒子，并且基本没有未结合的亲和试剂。
在实施方案中，所述组合物和方法包括一个或多个下文的变体。
通过将轭合物放置在基质表面之上或基质之内，轭合物可以直接沉积到基质之上或之内，而无需纯化轭合物，或无需浓缩轭合物，或二者。
多个胶态金属粒子的最大光密度为至少2，小于8，介于3至7.5之间，或介于4至7之间。
亲和试剂可以包括生物分子，如抗体，其可以是抗原特异性抗体和非特异性抗体的混合物。金属可以是金。
金属轭合物可采用上述方法获得。分析装置可以包括由所述方法获得的金属轭合物。
一个或多个实施方案的细节阐述于下文的附图和说明书中。其他特征、目的和优点将从说明书、附图和从权利要求书中显见。
附图简述
图1图解说明诊断装置的顶部横截面图。
图2图解说明诊断装置的侧横截面图。
发明详述
胶态金属溶液和胶态金属轭合物可以用减少或消除产物的纯化或浓缩的方式制备。所得胶态金属组合物可直接应用于装置或分析。制备胶态金属轭合物的方法包括形成具有与亲和试剂结合的高浓度金属粒子的组合物。
金属粒子的直径可以介于5至100nm之间。金属可以是金属或过渡金属，金属或过渡金属化合物，或以金属或过渡金属或者金属或过渡金属化合物包被的聚合物核，或其合金。例如，金属可以是金，铂，银，铁，铜，硒，铬，钒，钛，或锰，或其合金。金属化合物或过渡金属化合物可以是金属盐，硫化物，氧化物，氢氧化物或类似化合物。具体而言，金属粒子可以是金粒子。
亲和试剂可包括生物分子，例如，核苷酸，核苷酸序列，肽，蛋白质，抗体，抗体片段，抗原，链亲和素，生物素，受体片段，或其他反应分子。抗体可包括抗原特异性抗体，非特异性抗体或其混合物。抗体可以是，例如，能够选择性结合半抗原，诸如药物、生物分子、类固醇、药用药物、或另一种亲和试剂的抗体。结合可以是选择性的。药物可以是四氢大麻酚，安非他明或安非他明类，巴比妥酸盐或巴比妥酸盐类，苯二氮卓或苯二氮卓类，可卡因，迷幻药，美沙酮，甲基苯丙胺，吗啡，或苯环己哌啶，或其代谢物。
高浓度的胶态金属粒子，或高浓度的胶态金属轭合物，可以通过测量特定波长处的胶态溶液或悬浮液的光密度(或吸光度/反射比)来确定。溶液或悬浮液的最大光密度是在例如从250nm到850nm的波长范围内，溶液的最高吸光度或反射比。最大光密度可以通过例如利用UV/VIS分光光度计，扫描波长范围而确定出现最大光密度时的波长。对胶态金粒子而言，最大光密度出现在520-560nm，并可在540nm处测量。高浓度胶态金属粒子的最大光密度可以为至少2，至少3，少于8，介于3至7.5，介于4至7，或介于5至7。趋于聚集的浓度对产生稳定和有用的胶态金属粒子源是不理想的。
具有高浓度轭合粒子的胶态金属轭合物溶液，例如，与亲和试剂结合的金属粒子可以从高浓度胶态金属粒子直接制备。一般而言，高浓度胶态金属轭合物不需要显著纯化或浓缩。由于避免了纯化或浓缩，在制备轭合物的方法中，可以避免耗时的过程，诸如离心、洗涤、和搅拌以重悬浮粒子，或使之最小化。这在制备过程中显著减少了材料损失，粒子聚集，和时间损失。高浓度粒子的制备可在30分钟或更少时间完成。在本发明之前，利用制备胶态金属粒子的其他方法时，浓缩和纯化步骤可能需要1小时或更长时间完成，因为所述方法通常产生低浓度的粒子，最大光密度范围0.5-1.5，从而必然需要浓缩和洗涤过程。
总之，直接制备高浓度胶态金属轭合物溶液的方法包括添加一定量亲和试剂，所述一定量基本等于可与胶态粒子轭合的量，该量可视为胶态粒子的最大负载值。胶态金属粒子组合物的最大负载值可通过例如计算粒子的表面积和存在的粒子数，或通过实验，例如通过吸附实验，而理论上确定，由此使得轭合物的制备无需利用过量亲和试剂。
例如，待添加至胶态金属粒子的亲和试剂的量可通过测试不同浓度的抗原特异性抗体和非特异性抗体而确定。非特异性抗体可以是，例如小鼠、山羊和兔的IgG抗体。例如，总抗体溶液可以为每20ml金胶态溶液0.01-0.20mg的范围，例如每20ml金胶态溶液0.1mg，所述金胶体溶液在540nm处的光密度介于3至7之间。在其他情形下，总抗体溶液可以是每20ml金胶态溶液0.01-0.05mg的范围，所述金胶态溶液在540nm处的光密度介于4.5-6.5之间。在实施例中，只要浓度维持在每20ml金胶态溶液0.001-0.10mg，或每20ml金胶态溶液的0.1-10mg总抗体当量，可采用抗体和金溶液的总量。总之，抗体的量可设计为与金粒子完全或几乎完全结合。所得的混合物比旧方法制备的混合物更纯，很少或基本没有未结合的抗体分子。
生产优化的金胶态溶液的方法学可适用于众多用途。在一个实施例中，优化的金胶态溶液可用于免疫分析。例如，在一个实施方案中，金胶态溶液与抗-THC抗体和小鼠IgG抗体的抗体溶液混合。然后标记的抗-THC抗体和小鼠IgG用于竞争性分析，以检测四氢大麻酚(THC)代谢物的存在。
对生物分析，诸如免疫分析而言，用于制备利用胶体金属轭合物的装置的足够高的OD值，在其最大值处测量介于0.5至7.0 OD。光密度可在其他波长处测量，但通常在可见光谱之内测量，例如375nm-740nm。例如，制备胶态金属轭合物无需纯化步骤或浓缩步骤或两者，并通过将光密度介于3至7的高浓度胶态金属粒子(例如，0.1-5mg/ml)与一定量的抗体的例如0.01-10mg/ml金胶态溶液混合，而具有介于3至7之间的最大光密度。该轭合物然后可直接利用，或可稀释用于分析。
所用抗体的总量限定在范围内，抗原特异性抗体和非特异性抗体的比率可基于剂量曲线而确定。例如，在THC的竞争性分析中，分析可被设计为检测50ngTHC/ml尿或更高的剂量。竞争性分析依赖于样品中存在的THC和与酶连接的THC之间与特异性抗体结合的竞争性。酶可加以选择，以便酶活性导致颜色形成。在样品中没有游离THC的情形下，特异性抗体结合至酶联THC，这导致酶活性降低；换言之，存在的THC越少，则形成的颜色也越浅。
制备胶态金属轭合物的说明性例子如下。
将10.0g柠檬酸钠(Sigma)添加至1L体积去离子水中，制备1％柠檬酸钠溶液。该混合物搅拌约5-10分钟，直至柠檬酸钠完全溶解。该柠檬酸钠溶液储存于环境室温下。
将20.0g氯化金(Sigma-Aldrich，三水合三氯化金(III))添加至1L体积去离子水中，制备2％氯化金溶液。该混合物搅拌约5-10分钟，直至氯化金完全溶解。氯化金溶液在环境室温下储存于避光容器中。
胶态金溶液的制备如下。容器中放入240.0ml等份的1％柠檬酸钠溶液(如上制备)。在另外的容器中放入40.0ml等份的2％氯化金溶液(如上制备)。装有1L去离子水和磁力搅棒的容器置于加热套中。打开加热套至满功率。容器中加入先前测量的240.0ml体积的1％柠檬酸钠溶液。温度探头置于溶液内。加热溶液，直至达到98℃，此时将先前测量的40ml体积的2％氯化金溶液添加至容器中。快速混合该混合物，使之达到沸腾。然后关掉加热，使其沸腾3-5分钟。然后将溶液从加热套取出，盖上，冷却至室温。接着容器在环境温度下储存于暗处。胶态金溶液的光密度在540nm处为4.98。
抗-THC胶态金轭合物的制备如下。将0.03mg/ml抗-THCmAb(Biostream，PN：ND-TA2201，LN：TA-03H02)和0.02mg/ml小鼠IgG(Biostream，Biostride，Biocapture，Omega，Biospecific，和YJBioproducts)添加至1.0ml去离子水中，制备抗体溶液。旋涡混合溶液。接着，全部抗体溶液(如上制备)、2ml 30％BSA、1M HEPES缓冲液、2ml50％浓蔗糖液、以及2ml 10％Triton X-100溶液放在另外的容器中。20 ml等份金属胶态溶液(540nm处光密度4.98)置于带有搅棒(stirbar)的烧杯中。烧杯中加入0.8ml1MHEPES缓冲液。烧杯置于搅拌盘(stirplate)上。设定250 rpm，剧烈搅拌该混合物。一旦搅拌盘达到250 rpm，两分钟之内，将早先测量的各抗体溶液、BSA、HEPES缓冲液、50％浓蔗糖和10％Triton X-100添加到烧杯中，形成胶态金轭合物。胶态金轭合物转移到避光储存容器。胶态金轭合物2-8℃下稳定长达1个月。
胶态金轭合物直接或稀释后适用于分析装置。因此，合适的分析和装置可以是同类的或不同类的。不同类分析装置的例子在本领域是指一种具有侧流有孔载体的装置，如美国专利No.5,602,040所述，以其全文引作参考。有孔载体可以是硝酸纤维素。或者，分析装置可从非孔侧流型分析装置构建，如美国专利No.6,143,576所述。分析装置可并入外罩内。一个这样的实施方案描述如下。参照图1和2，显示测试室5包括外部模制的外壳10，其限定了中空细长的壳体，其中填充了有孔载体12。外壳10还限定了测试液体进口14和一对开孔16和18，开孔包括通过其可见有孔载体12的窗口。
有孔载体12和外壳10的内部一起限定了图1和2中一般从左到右通过的流路。当测试室与置于液体样品内或与液体样品接触的进口14一起放置时，液体的运输通过毛细作用、毛吸作用(wicking)、或简单润湿，沿着流路通过下游流动部分20、测试体积22、并进入库体积24，总体如箭头所示。置于进口14内部的流路的流动部分20充当过滤器，其可从测试样品中去除颗粒物质和干扰因子。位于进口14下游的过滤装置20有助于防止假阳性测试结果。
置于有孔载体12内的是脱水轭合物，例如抗体-胶态金属轭合物的带26。由于液体样品运动通过带26，轭合物被带入液体，重构，并与配体(如果存在的话)反应或竞争，溶解于液体样品。或者，可以取消轭合物带26，并在轭合物导入测试室5之前将其添加至测试液中。
在直接置于外壳10的环形开孔16和18下方的有孔载体12的体积内，分别放置对照位点16’和测试位点18’。图中，对照和测试位点被图解成沿着流路连续放置。或者，对照和测试位点可并排放置或以另一空问关系放置。
测试位点18’包括预先选定量对抗固定于流路中待检测的配体表位的抗体。对照位点16’优选与测试位点18’在大小和化学组成上相同，除了测试位点18’处存在的固定化抗体在对照位点16’处缺失。因此，任何发生在测试位点18’处的例如配体-轭合物或游离轭合物的非特异性聚集也同样会发生在对照位点16’处。三明治分析中，与对照位点16’相比，测试位点18’处的颜色更深，则是样品中配体的阳性指示。如果灵敏度减少能够容忍，则可取消对照位点16’。
一般而言，根据公知方法，利用吸附、吸附、离子或共价偶联，抗体或其他结合蛋白可被固定于测试位点18’处。例如，对抗配体表位的单克隆抗体可被固定在乳胶珠上，然后在区域18’被截获或与有孔载体12连接。对照位点16’可以相同制作，除乳胶珠含有非特异性免疫球蛋白，例如来自未被免疫的动物出血的免疫球蛋白。
置于测试体积22之外的是库体积24，库体积包含相对大质量的吸附材料或超吸附材料。库体积24的目的在于确保，合理大的量的测试液体通过测试体积22被抽取。增加库24的体积具有增加分析程序灵敏度的作用，因为其导致通过测试区22的配体量增加。合适的吸附剂包括现有类型的市售材料，例如来自Dow Chemical Company ofMidland，Mich.，和Chemical division of American Colloid，ArlingtonHeights，I11。这些材料可吸附多倍于其重量的水，并常用于一次性尿布。它们包括轻度交联的聚丙烯酸盐，通常是碱金属盐。
流体，例如生物流体，包括例如血液，血浆，血清，间质液，唾液，汗液，尿液，精液，泪液，羊水，提取的样品如咽喉、阴道、或鼻拭子，组织匀浆或组织流出物可通过该装置加以分析。
令人惊奇的是，本方法产生的胶态金属轭合物溶液较先前的方法可相对快地加以生产。由本发明方法生产的金属轭合物溶液显著减少了加工时间，因为不需要纯化或浓缩步骤，或明显减少了对纯化或浓缩步骤的需要。胶态金属轭合物可直接用于分析装置中。
其他实施方案落入下列权利要求的范围内。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.生产分析装置的方法，包括：
提供多个胶态金属粒子；
将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂混合，所述量基本等于与胶态粒子轭合形成轭合物的量；以及
直接在基质上沉积轭合物，其中直接在基质上沉积轭合物包括将轭合物置于基质的表面上，而无需纯化轭合物。
2.权利要求1的方法，其中直接在基质上沉积轭合物包括将轭合物放置在基质表面上，而无需浓缩轭合物。
3.权利要求1的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为至少2。
4.权利要求3的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为小于8。
5.权利要求1的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度介于3至7.5之间。
6.权利要求1的方法，其中亲和试剂是生物分子。
7.权利要求1的方法，其中亲和试剂是抗体。
8.权利要求1的方法，其中亲和试剂是抗原特异性抗体和非特异性抗体的混合物。
9.权利要求1的方法，其中金属是金，铂，银，铁，铜，硒，铬，钒，钛，或锰，或其合金。
10.权利要求1的方法，其中金属是金。
11.生产分析装置的方法，包括：
将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂混合，形成包括结合了亲和试剂的胶态金属粒子的混合物；以及
无需先从未结合的亲和试剂分离结合了亲和试剂的胶态金属粒子，就将混合物沉积在基质上。
12.权利要求11的方法，包括在将混合物沉积在基质上之前，稀释或浓缩该混合物。
13.权利要求11的方法，其中基质是硝酸纤维素基质。

Claims (34)

1.生产分析装置的方法，包括：
提供多个胶态金属粒子；
将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂混合，所述量基本等于与胶态粒子轭合形成轭合物的量；以及
在基质上直接沉积轭合物。
2.权利要求1的方法，其中在基质上直接沉积轭合物包括将轭合物放置在基质表面上，而无需纯化轭合物。
3.权利要求1的方法，其中在基质上直接沉积轭合物包括将轭合物放置在基质表面上，而无需浓缩轭合物。
4.权利要求1的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为至少2。
5.权利要求4的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为小于8。
6.权利要求1的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度介于3至7.5之间。
7.权利要求1的方法，其中亲和试剂是生物分子。
8.权利要求1的方法，其中亲和试剂是抗体。
9.权利要求1的方法，其中亲和试剂是抗原特异性抗体和非特异性抗体的混合物。
10.权利要求1的方法，其中金属是金，铂，银，铁，铜，硒，铬，钒，钛，或锰，或其合金。
11.权利要求1的方法，其中金属是金。
12.生产金属轭合物的方法，包括：
提供多个胶态金属粒子；以及
将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂混合，所述量基本等于与胶态粒子轭合形成轭合物的量。
13.权利要求12的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为至少2。
14.权利要求12的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为小于8。
15.权利要求12的方法，其中多个胶态金属粒子的最大光密度介于3至7.5之间。
16.权利要求12的方法，其中亲和试剂是生物分子。
17.权利要求12方法，其中亲和试剂是抗体。
18.权利要求12的方法，其中亲和试剂是抗原特异性抗体和非特异性抗体的混合物。
19.权利要求12方法，其中金属是金，铂，银，铁，铜，硒，铬，钒，钛，或锰，或其合金。
20.权利要求12的方法，其中金属是金。
21.一种组合物，包括多个胶体金属粒子，多个胶态金属粒子每一个与亲和试剂轭合，所述组合物基本不含聚集的金属粒子，并且基本没有未结合的亲和试剂。
22.权利要求21的组合物，其中多个胶态金属粒子的最大光密度为大于2。
23.权利要求21的组合物，其中多个胶态金属粒子的最大光密度介于3至7.5之间。
24.权利要求21的组合物，其中亲和试剂是生物分子。
25.权利要求21的组合物，其中亲和试剂是抗体。
26.权利要求21的组合物，其中亲和试剂是抗原特异性抗体和非特异性抗体的混合物。
27.权利要求21的组合物，其中金属是金，铂，银，铁，铜，硒，铬，钒，钛，或锰，或其合金。
28.权利要求21的组合物，其中金属是金。
29.一种分析装置，包括分析条，所述分析条包括含有胶态金属轭合物的组合物，所述胶态金属轭合物包括与亲和试剂轭合的金属粒子，所述组合物基本不含聚集的金属粒子，并且基本没有未结合的亲和试剂。
30.由权利要求11的方法获得的金属轭合物。
31.包含权利要求29的金属轭合物的分析装置。
32.生产分析装置的方法，包括：
将多个胶态金属粒子与一定量的亲和试剂组合，形成包括结合了亲和试剂的胶态金属粒子的混合物；以及
无需先从未结合的亲和试剂分离结合了亲和试剂的胶态金属粒子，就将混合物沉积在基质上。
33.权利要求31的方法，包括在将混合物沉积在基质上之前，稀释或浓缩该混合物。
34.权利要求31的方法，其中基质是硝酸纤维素基质。
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