CN101128217B - 改良的痘病毒快速诱导抗痘病毒或其它传染物的免疫力的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及，通过给动物(包括人)接种在所述动物(包括人)中不能复制的痘病毒，来快速诱导抗痘病毒和痘病毒感染(如天花)的保护性免疫应答。此类痘病毒的例子有改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。本发明还涉及重组痘病毒(如重组MVA)快速诱导保护性免疫应答的用途，所述病毒在接种该病毒的动物(包括人)中不能复制、但表达异源抗原和/或抗原性表位，所述免疫应答是抗所述异源抗原和/或抗原性表位(例如作为传染物一部分的抗原和/或抗原性表位)的保护性免疫应答。
Description
发明领域-免疫力的快速诱导
本发明涉及通过给动物包括人接种在所述动物(包括人)中不能复制的痘病毒来快速诱导抗痘病毒和痘病毒感染诸如天花的保护性免疫应答。此类痘病毒的例子有改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。本发明还涉及重组痘病毒(如重组MVA)快速诱导保护性免疫应答的用途，所述病毒在接种该病毒的动物(包括人)中不能复制、但表达异源抗原和/或抗原性表位，所述免疫应答是抗所述异源抗原和/或抗原性表位(例如作为传染物一部分的抗原和/或抗原性表位)的保护性免疫应答。
发明背景
对于许多疾病，诸如传染病，疫苗已经开发得到或者正在开发中。这些疫苗在某个时限内诱导保护性免疫应答。由于大多数疫苗用于接种以抵抗在人群中相当罕见的疾病，免疫应答的产生通常不需要特别快速。然而，有应当尽可能快的产生免疫应答诸如保护性免疫应答的情况。这可以是天花或任何其它人类痘病毒疾病爆发的情况。
天花的致病因子(causative agent)是天花(variola)病毒，它是正痘病毒(Orthopoxvirus)属的一个成员。痘苗病毒也是痘病毒科正痘病毒属的一个成员，曾经作为活疫苗用于抗天花的免疫。在世界范围内，用痘苗病毒进行的成功接种以天花病毒的根除而告终(The global eradication of smallpox.Finalreport of the global commission for the certification of smallpox eradication；History of Public Health，No.4，Geneva：World Health Organization，1980)。当时，销毁了传染性天花病毒的大多数原种。然而，不能排除包括天花或天花样疾病在内的痘病毒疾病可能再次成为重大健康问题。另外，存在动物的痘病毒疾病传播给人的风险。
此外，可能还有希望诱导快速免疫应答的其它情况，例如有些疾病是世界上部分地区流行的地方病，当接到通知必须在短期内到此类国家旅行时，可能希望诱导抵抗这些疾病的快速免疫应答。
发明详述
本发明涉及用于在动物(包括人)中快速诱导保护性免疫应答的方法，包括给动物(包括人)施用在所述动物(包括人)中不能复制的痘病毒的步骤。本发明还涉及所述不能复制的痘病毒用于制备在动物(包括人)中快速诱导保护性免疫应答的疫苗的用途，及作为疫苗用于快速诱导保护性免疫应答的痘病毒，其中所述痘病毒在所述动物(包括人)中不能复制。
术语“不能复制的痘病毒”及同义术语“不能复制成感染性后代病毒”的病毒指，在接种了疫苗的动物的细胞中根本不复制的痘病毒，及在施用了该痘病毒的动物(包括人)中显示出受到免疫系统控制的微小残余复制活性的病毒。
依照本发明的一个实施方案，不能复制的痘病毒是能够感染动物(包括人)的细胞的病毒，该病毒在其中用作疫苗。“能够感染细胞”的病毒是能够与宿主细胞相互作用，使该病毒或至少病毒基因组掺入宿主细胞的病毒。尽管依照本发明使用的病毒能够感染接种了疫苗的动物(包括人)的细胞，它们或是不能在接种了疫苗的动物的细胞中复制成感染性后代病毒，或是在施用了该痘病毒的动物(包括人)中只显示出受到免疫系统控制的微小残余复制活性。
应当理解，能够感染第一种动物物种的细胞但不能在所述细胞中复制成感染性后代病毒的病毒在第二种动物物种中可能有不同表现。例如，对于人，MVA-BN及其衍生物(见下文)是能够感染人的细胞但不能在人细胞中复制成感染性后代病毒的病毒。同样的病毒在鸡(chicken)中非常高效的复制；即，在鸡中，MVA-BN是能够感染细胞且能够复制成感染性后代病毒的病毒。本领域技术人员知道对具体动物物种该选择哪种病毒。WO 02/42480中公开了能够确定病毒是能够还是不能在小鼠中复制的测试法，它使用AGR129小鼠品系(见下文)不能生成成熟B和T细胞并因而严重免疫受损且对有复制能力的病毒高度易感的任何其它小鼠品系。在此动物模型中得到的结果对人有预示作用。
依照本发明的一个实施方案，依照本发明的病毒能够在至少一种动物物种的至少一种细胞类型中复制。如此，可以在对需要接种和/或治疗的动物施用前扩增病毒。举例而言，要提到能在CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞中扩增但不能在人中复制成感染性后代病毒的MVA-BN。
依照本发明的一个实施方案，将改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)用于人和数种动物物种，诸如小鼠和非人灵长类。已知MVA异常安全。MVA通过痘苗病毒安卡拉毒株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上的长期连续传代而生成(综述见Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V and Stickl，H.[1975]Infection3，6-14；瑞士专利第568,392号)。遵从布达佩斯条约的要求已经保藏且可用于实施本发明的MVA病毒株的例子有毒株MVA 572，保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)，Salisbury，UK)，保藏号ECACC94012707，保藏日1994年1月27日；MVA 575，保藏号ECACC00120707，保藏日2000年12月7日；和MVA-BN，保藏号ECACC 00083008，保藏日2000年8月30日。
依照本发明的一个实施方案，MVA毒株是MVA-BN及其衍生物。PCT/EP01/13628中给出了MVA-BN及其衍生物的定义。
简而言之，PCT/EP01/13628中所公开的MVA-BN及其衍生物特征在于具有至少一项、至少两项、至少三项或所有如下特性：
(i)能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)和细胞系BHK中繁殖性复制(reproductive replication)，但不能在人细胞系中繁殖性复制。依照本发明的一个实施方案，人细胞系是人骨骨肉瘤细胞系143B、人角质细胞(keratinocyte)细胞系HaCat和人子宫颈腺癌细胞系HeLa；
(ii)不能在免疫严重受损的小鼠体内复制；
(iii)在致死攻击模型中诱导与已知毒株MVA575(ECACC V00120707)相比更高的免疫原性；和/或
(iv)在痘苗病毒引发(prime)/痘苗病毒强化方案中诱导与DNA引发/痘苗病毒强化方案相比至少基本上相同水平的免疫力。
关于确定MVA毒株是否具有一项或多项上述特征(i)-(iv)的测定法的详细信息参见WO 02/42480(PCT/EP01/13628)。此出版物还公开了如何能够获取具有所需特性的病毒。下文简略概述了本领域技术人员如何能够测试MVA毒株是否具有一项或多项所述特征且因而是依照本发明所述实施方案的病毒。下面的概述不应理解为将WO 02/42480关于本申请的实用性限于下列信息。相反，在此完整收入WO02/42480作为参考。
在人细胞系诸如细胞系HaCat(Boukamp et al.1988，J Cell Biol106(3)：761-71)或HeLa中“不能繁殖性复制”，其在本发明中的含义如WO02/42480中所定义的。如此，在一细胞系中“不能繁殖性复制”的病毒是在所述细胞系中显示出小于1的扩增比率的病毒。病毒的“扩增比率”指由受感染细胞产生的病毒(输出)与最初用于感染这些细胞的量(输入)的比率。输出和输入之间的比率为“1”表示，由受感染细胞产生的病毒的量与最初用于感染这些细胞的量相同的扩增状态。依照本发明的一个实施方案，在人细胞系中“不能繁殖性复制”的病毒在任何上述人细胞系HeLa、HaCat和143B中可具有1.0(平均值)或更低或者甚至0.8(平均值)或更低的扩增比率。
术语“平均”在用于本申请时指由至少2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多次实验得到的平均值。本领域技术人员应当理解，单次实验可由于生物学系统的内在变异性而偏离平均值。
术语“不能在体内复制”在本申请中使用WO 02/42480中的定义。如此，所述术语指在小鼠模型中不复制的病毒，正如WO 02/42480中所解释的。WO 02/42480中所使用的小鼠不能生成成熟B和T细胞(AGR129小鼠)。MVA-BN及其衍生物在腹膜内施用107pfu病毒量感染AGR129小鼠后，至少45天(平均值)的平均时段内，诸如在至少60天(平均值)内，或者在90天(平均值)内不杀死所述小鼠。依照本发明的一个实施方案，“不能在体内复制”的病毒的进一步特征在于腹膜内施用107pfu病毒感染AGR129小鼠后45天(平均值)，或者60天(平均值)，或者90天(平均值)内不能从所述小鼠的器官或组织回收到病毒。除了AGR129小鼠，可使用不能生成B和T细胞及因而免疫严重受损且对有复制能力的病毒高度易感的任何其它小鼠品系。在所述小鼠模型中得到的数据对人有预示作用。如此，依照一个实施方案，本发明的病毒，诸如MVA-BN及其衍生物在人中根本不复制。在将涉及术语“不能复制的痘病毒”和“不能复制成感染性后代病毒的病毒”的部分中的定义应用于MVA-BN及其衍生物在人中的复制行为时，那些在施用了痘病毒的人中显示出受到免疫系统控制的微小残余复制活性的病毒也在本发明的范围内。
WO 02/42480中解释了用于确定MVA毒株是否具有“与已知毒株MVA575相比更高的免疫原性”的致死攻击实验的细节。在这样一种致死攻击模型中，未接种疫苗的小鼠在感染有复制能力的痘苗病毒株诸如WesternReserve毒株L929TK+或IHD-J后死亡。有复制能力的痘苗病毒的感染在描述致死攻击模型的语境中称为“攻击”。通常在攻击后4天杀死小鼠，通过标准噬斑测定法使用VERO细胞测定卵巢中病毒滴度。对未接种疫苗的小鼠和接种了MVA-BN及其衍生物的小鼠测定病毒滴度。更具体的说，MVA-BN及其衍生物特征在于，在此测试中，在接种102TCID50/ml病毒后，与未接种疫苗的小鼠相比，卵巢病毒滴度降低至少70％(平均值)，或者至少80％(平均值)，或者至少90％(平均值)。
如果以WO 02/42480中公开的“测定法1”和“测定法2”之一测得的CTL应答在痘苗病毒引发/痘苗病毒强化方案中与DNA引发/痘苗病毒强化方案相比至少基本上相同，那么认为痘苗病毒诸如MVA毒株在痘苗病毒引发/痘苗病毒强化方案中诱导与DNA引发/痘苗病毒强化方案相比至少基本上相同水平的免疫力。依照本发明的一个实施方案，以WO 02/42480中公开的“测定法1”和“测定法2”二者测得的CTL应答在痘苗病毒引发/痘苗病毒强化方案中与DNA引发/痘苗病毒强化方案相比至少基本上相同。依照本发明的一个实施方案，至少在一种测定法中，实施痘苗病毒引发/痘苗病毒强化方案后的CTL应答与DNA引发/痘苗病毒强化方案相比更高。依照本发明的一个实施方案，在两种测定法中，CTL应答都更高。
依照本发明的一个实施方案，MVA-BN的衍生物特征在于(i)能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)和幼仓鼠肾细胞系BHK中繁殖性复制，但不能在人细胞系中繁殖性复制，其中依照本发明的一个实施方案，人细胞系是人骨骨肉瘤细胞系143B、人角质细胞细胞系HaCat和人子宫颈腺癌细胞系HeLa，及(ii)不能在免疫严重受损的小鼠体内复制。
依照本发明的一个实施方案，病毒是克隆纯化的病毒，诸如单克隆病毒。
依照本发明的一个实施方案，病毒是在无血清条件下生成/传代的病毒，采用无血清条件是为了降低感染血清中所含传染物的风险。
依照本发明的MVA以104-109TCID50/ml，例如105-5x108TCID50/ml，或例如106-108TCID50/ml的浓度范围施用。实际浓度取决于病毒的类型和待接种的动物物种。对于MVA-BN，用于人的典型接种剂量包括皮下施用5x107TCID50-5x108TCID50，例如约1x108TCID50。
依照本发明的一个实施方案，上文定义的痘病毒，例如MVA毒株，诸如MVA-BN及其衍生物通过单次施用来诱导快速保护性免疫应答。临床数据证明，单次接种MVA-BN在几乎100％的接种个体中导致可检测的免疫应答。
依照本发明的另一个实施方案，上文定义的痘病毒，例如MVA毒株，诸如MVA-BN及其衍生物还可用于同源引发-强化方案，即可将痘病毒诸如MVA用于首次接种，及通过施用与首次接种中所用相同或相关的痘病毒毒株，强化在首次接种中产生的免疫应答。上文定义的痘病毒，例如MVA毒株，诸如MVA-BN及其衍生物还可用于异源引发-强化方案，其中用上文定义的痘病毒进行一次或多次接种并用另一类型的疫苗，例如另一种病毒疫苗、蛋白质或核酸疫苗进行一次或多次接种。
施用模式可以是静脉内、皮内、鼻内或皮下。可使用任何其它施用模式，诸如划痕法(scarification)。
依照本发明的痘病毒可以是非重组痘病毒，诸如MVA毒株，例如MVA-BN及其衍生物。在这种情况中，可进行疫苗接种以快速诱导抗痘病毒感染诸如天花的保护性免疫应答。如此，依照本发明，上文定义的痘病毒，诸如MVA毒株，例如MVA-BN及其衍生物适于快速诱导抗天花的保护性免疫应答。这例示于实施例1，其中比较了在接种MVA-BN(依照本发明的一种毒株)和非MVA毒株诸如Dryvax和Elstree后，在小鼠中产生抗致病性痘苗病毒毒株的保护性免疫应答需要多长时间。与MVA-BN相反，这些毒株有完全的复制能力。证明了MVA-BN显然具有与Elstee和Dyvax相比改良的特性，即给小鼠单次接种MVA-BN在4，3和甚至2天内导致显著的保护性免疫应答。这是通过例如评估接种MVA-BN后2、3或4天后，肺中致病性痘苗病毒毒株西里瑟夫(Western Reserve)(VV-WR)的滴度证实的。在接种的3天后用12.5x MLD50VV-WR攻击小鼠时，在接种标准剂量MVA-BN的小鼠中检测不到VV-WR病毒滴度，而接种Dryvax或Elstree的小鼠不受保护且具有与未接种疫苗的对照小鼠非常相似的肺滴度。在接种的4天后用50xMLD50攻击小鼠时，在接种标准剂量MVA-BN的小鼠中检测不到VV-WR病毒滴度，而接种Dryvax或Elstree的小鼠不受保护且具有与未接种疫苗的对照小鼠非常相似的肺滴度。术语“MLD50”指50％的接种小鼠死亡时致病性痘苗病毒毒株的浓度。
应当注意，小鼠数据对人有预示作用。此外，应当考虑到自然界中通常不会存在50倍致死剂量的致病性病毒浓度，特别是对于诱发天花的人痘病毒。
依照本发明的一个实施方案，术语“在动物(包括人)中快速诱导保护性免疫应答”优选指，在接种本发明病毒的7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、或甚至2天或更短时间内，产生保护性免疫应答。这是出乎意料的，因为本领域所知的是，产生抗传统天花疫苗的保护性免疫应答需要至少10-14天，取决于复制型痘苗病毒毒株。保护性免疫应答的诱导的快速性可在实施例部分中所描述的动物模型中评估。所述模型对人也有预示作用。如此，依照本发明的一个实施方案，当根据实施例部分中所描述的测试系统的测定，在给小鼠接种有效量的痘病毒疫苗诸如MVA，例如MVA-BN及其衍生物，并在接种的4天后分别用1x、12.5x和50x MLD50VV-WR攻击后，肺中的病毒滴度平均低于5x103pfu(对应于log3.69)，那么痘病毒疫苗在小鼠中有效诱导快速免疫应答。或者，在接种有效量的痘病毒疫苗的3天后，分别用1x和12.5x MLD50VV-WR攻击后，数值平均低于5x103pfu(对应于log3.69)。广义上，当病毒在实施例中所描述的肺滴度测定法和体重测定法中的表现与MVA-BN相似，那么所述病毒在小鼠中快速诱导保护性免疫应答。如此，实施例部分中所描述的限制、阈值、条件和参数一般意义上也适用于认为快速诱导保护性免疫应答的其它痘病毒疫苗。由此，实施例部分中所给出的数据和信息显然一般可用于补充此段中缺失的任何数据和信息，例如关于测试系统的描述的信息。
或者，保护性免疫应答的快速诱导可用下文所解释的血清转化测试来评估，在此语境中，将观察到血清转化的时间点视作保护性免疫诱导诱导的时间点。
依照本发明的一个实施方案，动物(包括人)指就痘病毒感染而言是首次使用的(
)动物(包括人)，即从未接触过痘病毒且尚未接种痘病毒疫苗的动物(包括人)。
依照一个相关实施方案，动物(包括人)是接触过痘病毒和/或接种过痘病毒疫苗的动物(包括人)。这些动物(包括人)已经产生抗痘病毒和/或痘病毒疫苗诸如MVA的免疫应答。
术语“保护性免疫应答”意味着接种了疫苗的动物能够控制疫苗接种所针对的致病因子的感染。通常，形成了“保护性免疫应答”的动物只形成轻度至中度的临床症状或者根本没有症状。通常，具有抗某一因子的“保护性免疫应答”的动物不会由于感染所述因子而死亡。
如上文所指出的，MVA-BN或其衍生物用于在人中产生抗天花的保护性免疫应答的浓度为5x107TCID50-5x108TCID50，如1x108TCID50，其中所述病毒可皮下或肌肉内施用。
似乎接种上文定义的痘病毒，诸如MVA毒株，例如MVA-BN及其衍生物后形成快速免疫保护的机制依赖于接种了疫苗的动物(包括人)是首次使用(
)的动物(即之前从未接触过痘病毒)还是之前曾经接触过痘病毒(例如经疫苗接种)的动物。在首次使用
的动物(包括人)中，施用依照本发明的痘病毒，诸如MVA-BN或其衍生物，有效引发免疫系统，即使在疫苗接种后的最初几天可能检测不到中和性抗体。致病性病毒的感染强化免疫系统，致使已被有效引发的免疫系统能出乎意料的有效且快速控制所述感染。如此，曾经接种过本发明病毒的首次使用的动物仅仅在单次接种后就很容易地受到保护，可以抵抗该接种所针对的致病性病毒。
依照本发明定义的病毒，诸如MVA-BN及其衍生物及其衍生物，在之前曾经接触过痘病毒的动物中，出乎意料的有效且快速强化早些时候的疫苗接种，使得在这种情况中也快速产生保护性免疫应答。
保护性免疫应答的诱导的快速性还表现为，给动物(包括人)接种本发明病毒如MVA，例如MVA-BN及其衍生物后，出乎意料的快速血清转化。在非人灵长类中证明了血清转化在短于10天内，例如7天内发生，这比接种其它天花疫苗诸如Elstree后的血清转化快了一周。下文描述了如何评估接种MVA-BN及其衍生物后的血清转化。相同的测试原理在适当变更后也适用于测试接种其它病毒后的血清转化。评估由所述其它病毒诱导的血清转化时，要求的唯一改动是，定量测定对所述其它病毒特异的总IgG抗体，而非对MVA-BN特异的总IgG抗体。评估样品是否是阳性的截留值(cut off value)和标准基本上以相同方式决定，可在本领域技术人员技术范围内进行任选的微小修改。为了评估接种MVA-BN(或其衍生物)后的血清转化，使用直接ELISA定量测定测试血清中的
特异性总IgG抗体。这种ELISA是用于检测血清中抗体的灵敏方法。
特异性ELISA是用于检测人测试血清中的总IgG抗体的标准结合ELISA。ELISA结果表述成通过直接测定对数趋势线(logarithmic trend line)得到的终点抗体滴度。截留或终点吸光度定义为0.35。样品的终点滴度通过绘制对数图来测定，例如使用商品化计算机程序Excel(y轴为光密度(OD)，x轴为血清稀释度的log)。同样，非人灵长类中的数据对人有预示作用。当测试样品在1:50稀释度时，其OD大于0.35认为该测试样品是阳性的。几何平均滴度(geometric mean titre，GMT)通过log10滴度转化的平均值取反对数来计算。GMT通常为报告的ELISA滴度。血清转化率定义为，最初为血清阴性但在MVA特异性IgG ELISA中表现出抗体滴度>1:50的受试者的百分比。如此，依照本发明的一个实施方案，术语“在动物(包括人)中快速诱导保护性免疫应答”指，在接种本发明病毒的10天或更短、7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、或甚至2天或更短时间内，以上文定义的测试法得出上文定义的血清转化。
上文定义的痘病毒，诸如MVA毒株，例如MVA-BN及其衍生物还可以是重组痘病毒株，诸如重组MVA-BN或其衍生物。依照本发明的重组病毒，诸如重组MVA-BN及其衍生物可包含至少一种异源核酸序列。术语“异源”在下文中用于指核酸序列的任意组合，所述核酸序列在自然界中通常未发现与所述病毒密切相关。异源序列可以是抗原性表位或抗原，它们选自任何非痘苗病毒来源。依照本发明的一个实施方案，所述重组病毒表达一种或多种抗原性表位或抗原，它们是来自传染物的抗原性表位或抗原。传染物可以是任何传染物，诸如病毒、真菌、致病性单细胞真核和/或原核生物体、或寄生生物体。传染物的例子有疟原虫(Plasmodium falciparum)、分枝杆菌、流感病毒、黄病毒、副粘病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、引起出血热的病毒诸如汉坦病毒(Hantavirus)或纤丝病毒(Filovirus)，即埃博拉(Ebola)病毒或马尔堡(Marburg)病毒。
依照此实施方案，上文定义的重组痘病毒不仅可用于诱导抗痘病毒感染的快速免疫应答，而且还可(或者备选)用于诱导抗异源抗原性表位/抗原的快速免疫应答，所述异源抗原性表位/抗原由重组病毒中所包含的异源核酸表达。如此，举例而言，如果重组MVA表达HIV表位或黄热病病毒表位，那么该重组MVA可用于诱导分别抗HIV和黄热病病毒的快速免疫应答。
重组病毒或可表达进一步提高MVA免疫原性的抗原性表位/抗原，这也在本发明的范围内。
依照本发明使用的重组病毒还可包含表达治疗性化合物的异源基因/核酸。由病毒中的异源核酸编码的“治疗性化合物”可以是例如具有所需生物学活性的治疗性核酸诸如反义核酸或肽或蛋白质。
依照本发明的一个实施方案，异源核酸序列的表达可处于痘病毒启动子的转录控制下。合适的痘病毒启动子的例子有牛痘ATI启动子(见WO03/097844)。
依照本发明的一个实施方案，将异源核酸序列插入病毒基因组的非必须区。依照本发明的另一个实施方案，将异源核酸序列插入MVA基因组的天然缺失位点(公开于PCT/EP96/02926)。依照还有一个备选实施方案，可将异源序列插入痘病毒基因组的基因间区域(见WO 03/097845)。本领域技术人员知道如何将异源序列插入痘病毒基因组的方法。
上文为关于非重组病毒的实施方案给出的所有定义也适用于关于重组病毒的实施方案。
发明概述
痘病毒用于制备在动物(包括人)中快速诱导保护性免疫应答的疫苗的用途，其中所述痘病毒在所述动物(包括人)中不能复制。
用于在动物(包括人)中快速诱导保护性免疫应答的方法，包括给动物(包括人)施用在所述动物(包括人)中不能复制的痘病毒的步骤。
如上所述的用途或方法，其中所述保护性免疫应答在7天内或更短时间内产生。
如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
如上所述的用途或方法，其中所述MVA选自MVA毒株MVA575、MVA572和MVA-BN。
如上所述的用途或方法，其中所述病毒是克隆纯化的病毒。
如上所述的用途或方法，其中所述病毒在无血清培养过程中获得。
如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒以105-5x108TCID50/ml的剂量施用。
如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒静脉内、肌肉内或皮下施用。
如上所述的用途或方法，其中所述保护性免疫应答是抗痘病毒感染的保护性免疫应答。
如上所述的用途或方法，其中所述免疫应答抗天花感染。
如上所述的用途或方法，其中所述痘病毒是重组痘病毒。
如上所述的用途或方法，其中所述重组痘病毒包含至少一种异源核酸序列。
如上所述的用途或方法，其中所述异源核酸序列是编码至少一种抗原、抗原性表位、和/或治疗性化合物的序列。
如上所述的用途或方法，其中所述抗原性表位和/或抗原是传染物的抗原性表位和/或抗原。
如上所述的用途或方法，其中所述传染物选自病毒、真菌、致病性单细胞真核和/或原核生物体、寄生生物体。
如上所述的用途或方法，其中所述病毒选自流感病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、肝炎病毒科、人免疫缺陷病毒科或者来自引起出血热的病毒。
如上所述的用途或方法，其中所述免疫保护抗衍生所述抗原性表位和/或抗原的传染物。
附图简述
图1：不同疫苗接种的小鼠在1x MLD50VV-WR鼻内攻击后的体重变化给BALB/c小鼠皮下接种
Elstree、Dryvax、或盐水(PBS)4天，或
3天或2天，然后每只小鼠用4x104TCID50VV-WR攻击。在攻击前(第0天)和攻击后的每一天，在同一时刻测量体重。该图代表每组随时间的平均体重变化，使用经标准化的(第0天作为基线值)各数值。
图2：不同疫苗接种的小鼠在12.5x MLD50VV-WR鼻内攻击后的体重变化
给BALB/c小鼠皮下接种
Elstree、Dryvax、或盐水(PBS)4天，或
3天，然后每只小鼠用5x105TCID50VV-WR攻击。在攻击前(第0天)和攻击后的每一天，在同一时刻测量体重。该图代表每组随时间的平均体重变化，使用经标准化的(第0天作为基线值)各数值。
图3：不同疫苗接种的小鼠在50x MLD50VV-WR鼻内攻击后的体重变化
给BALB/c小鼠皮下接种
Elstree、Dryvax、或盐水(PBS)4天，或
3天，然后每只小鼠用2x106TCID50VV-WR攻击。在攻击前(第0天)和攻击后的每一天，在同一时刻测量体重。该图代表每组随时间的平均体重变化，使用经标准化的(第0天作为基线值)各数值。
图4、5和6：1x MLD50VV-WR(图4)、12.5x MLD50VV-WR(图5)或50x MLD50VV-WR(图6)鼻内攻击后死亡或处死时肺的病毒载量
自每只动物收集肺，并使用标准噬斑测定法在Vero细胞上测定病毒载量。条代表每组平均肺滴度±标准误差。
实施例
下面的实施例将进一步例证本发明。本领域技术人员将完全理解，所提供的实施例绝非解释为将本发明所提供的技术的适用性限于此实施例。
实施例1：接种了MVA-BN、Elstree或DryVax的小鼠中用1x、12.5x或50x MLD50痘苗病毒西里瑟夫(VV-WR)攻击后保护作用的发起
1.引言
开发了鼠鼻内牛痘攻击模型来测试天花疫苗候选物的功效。在此模型中，给小鼠接种要测定功效的疫苗。对照小鼠接受盐水对照代替疫苗。接种疫苗后几天，用致病性痘苗病毒毒株诸如痘苗病毒毒株西里瑟夫(VV-WR)感染小鼠。痘苗病毒毒株西里瑟夫(VV-WR)的鼠致死剂量50(MLD50)在未接种疫苗的小鼠中测定为3.6x104TCID50。
在一项初步研究中证明，接种MVA-BN的BALB/c小鼠受到25x或50xMLD50VV-WR攻击后，迅速从该病毒攻击中恢复，不显示临床症状的明显征候，而且这些动物的肺中不存在病理损伤。在另一项初步研究中，调查了接种疫苗后从VV-WR的致死攻击建立保护作用所需要的时间：给小鼠接种3天后用亚致死剂量的VV-WR(5x103TCID50/小鼠)攻击，结果显示出保护作用(在体重降低和病毒肺滴度方面)。此实施例的目标是缩短
(或Elstree或Dryvax)接种后在VV-WR的致死攻击后获得保护所需要的时间。
2.病毒和对照
测试疫苗1
改良的安卡拉(Ankara)-Bavarian Nordic痘苗病毒浓度为5.0E+08TCID50/ml。配制：在10mM Tris 140mM NaCl pH7.4中。在
接种组中，
原种(stock)不做进一步稀释，皮下施用200μl，导致最终剂量为1.0E+08TCID50。
测试疫苗2
痘苗病毒毒株Elstree，标称浓度为1.0E+08TCID50/ml；配制：在10mMTris 140mM NaCl pH7.4中。Elstree原种不做进一步稀释，每只小鼠在尾部通过划痕法施用2.5μl，导致最终剂量为2.5E+05 TCID50。
测试疫苗3
DryVax，标称浓度为2.9E+07 TCID50/ml；配制：在10mM Tris 140mMNaCl pH7.4中。DryVax原种不做进一步稀释，每只小鼠在尾部通过划痕法施用8μl，导致最终剂量为2.5E+05 TCID50。
测试疫苗1-3都是以其最佳施用剂量和路径施用的。
攻击病毒
痘苗病毒西里瑟夫(VV-WR)，标称浓度为4.0E+08 TCID50/ml。
对VV-WR(4.0E+08 TCID50/ml)进行如下稀释以产生最终工作储液(finalworking stock)，8.0E+04 TCID50/ml和4.0E+07 TCID50/ml：对于1x MLD50VV-WR/小鼠(8.0E+05 TCID50/ml工作储液悬浮液)：将100μl VV-WR原种4.0E+08 TCID50/ml加到900μl PBS中，通过旋涡震荡混匀(以产生4.0E+07TCID50/ml的浓度)，将100μl此悬浮液转移到900μl PBS中，再次通过旋涡震荡混匀(以产生4.0E+06 TCID50/ml的浓度)，将600μl此悬浮液加到2400μlPBS中，通过旋涡震荡混匀以产生8.0E+05 TCID50/ml的终浓度。对于50xMLD50VV-WR/小鼠(4.0E+07 TCID50/ml工作储液悬浮液)：将300μl VV-WR原种4.0E+08 TCID50/ml加到2700μl PBS中并通过旋涡震荡混匀以产生4.0E+07 TCID50/ml的终浓度。
盐水对照
在盐水对照组中，将200μl PBS(由制造商供应)用于皮下注射各只小鼠。
3.方法和实验设计
测试系统
无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)的雌性Balb/c小鼠H-2d获自Taconic M&B，P.O.Box 1079，DK-8680 Ry，Denmark。研究中的动物数：60。攻击开始时的年龄：9周。攻击开始时的体重范围：18-23克。BALB/c小鼠品系广泛用于测试天花疫苗的免疫原性和功效。该品系对VV-WR攻击高度易感。
实验依照丹麦的
进行。
处理组的分配：在到达时，将动物随机分配到处理组，每个测试组(和笼)由5只动物组成。
剂量水平的论证：
以在先实验中已经证明的在小鼠中诱导体液和细胞介导的强免疫应答的最佳剂量使用。Elstree和Dryvax以建议的人用剂量使用。
接种和攻击时间表
此项研究中使用了总共80只小鼠(见下表)。在接种
或Elstree、或Dryvax的4天后，用1x、12.5x或50x MLD50VV-WR攻击小鼠。在另外的组中，在接种
的3天后，用1x、12.5x或50x MLD50VV-WR攻击小鼠，或者在接种
的2天后，用1x MLD50VV-WR攻击小鼠。在对照组中，用1x、12.5x或50x MLD50VV-WR攻击没有进行预先接种的小鼠。接受1x和12.5x或者50x MLD50VV-WR的对照动物分别在攻击的5天或者4天后，当体重比最初降低20％以上或者动物呼吸困难时处死。这是为了减轻痛苦。
组大小的论证
研究的主要终点是通过鼻内VV-WR攻击后第4或5天的保护水平测定的功效。根据先前的临床前实验，假设在攻击后疫苗接种组的至少95％受到保护，而安慰剂处理组的不超过5％受到保护。使用费歇尔精确检验(Fisher′sExact test)，5对5的组容量大小足以在双侧(two-sided)显著性水平α＝0.05时证明显著差异，且power大于80％。
施用测试物品进行疫苗接种
在微生物学安全橱(SW 100040/class II，Holten Lamin Air)中进行接种。使用1ml29G结核菌素胰岛素注射器(Terumo)在后腿的皮肤皱纹中经皮下路径给小鼠接种200μl
(1x108TCID50/ml)或盐水对照(200μl PBS)。接受Elstree和DryVax的小鼠在尾部划痕前麻醉：配制含75mg氯胺酮(Ketamine)、5mg赛拉嗪(Xylazine)和水的新鲜混合液，使用1ml27G胰岛素注射器经皮下路径施用80μl麻醉剂。属于一个笼子的所有小鼠在施用疫苗前麻醉。经尾部划痕施用2.5μl或8μl Elstree或Dryvax。
肺攻击模型
在微生物安全橱(SW100040/class II，Holten Lamin Air)中经鼻内路径将测试物品(即VV-WR)施用于麻醉的小鼠。
配制75mg氯胺酮(Ketamine)、5mg赛拉嗪(Xylazine)在水中的新鲜混合液作为麻醉剂。使用1ml29G胰岛素注射器经皮下路径施用80μl该麻醉剂。属于一个笼子的所有小鼠在施用VV-WR测试物品前麻醉。
在微生物安全橱(SW100040/class II，Holten Lamin Air)中进行鼻内攻击。从冰上取出攻击病毒工作稀释液(working dilution)，通过轻轻旋涡震荡几秒钟来混匀。使用100μl移液器(pipette)量取50μl稀释的VV-WR测试物品。抓住麻醉小鼠颈后的皮/毛，用同一只手的手掌握住小鼠的躯体。将测试项目缓慢加到小鼠的单个鼻孔中。如上所述掌握小鼠直至停止喘气。
在攻击前(第0天)和攻击后每一天观察动物，以监测健康变坏的任何征候。在攻击前(第0天)和攻击后每一天测量体重，直至尸检那天，以监测疾病的进展。
接受50x MLD50VV-WR的盐水组由于在攻击后第4天超过了设定的体重截留值而处死。接受1x或12.5x MLD50VV-WR的盐水组由于在攻击后第5天超过了设定的体重截留值而处死。用1x MLD50VV-WR攻击的疫苗接种小鼠在攻击后第5天处死，而用12.5x或50x MLD50VV-WR攻击的
接种小鼠最晚在攻击后第8天处死。
取出肺，使用标准噬斑测定法在Vera细胞上测定肺中的病毒总量。在肺滴度低于5x103pfu时，认为动物受到完全保护，该滴度是在Vero细胞上使用我们的病毒滴定法能检测到的最低滴度。
4.结果和讨论
体重变化
在此项研究的一些组中调查了接种不同天花疫苗对其后4天用1xMLD50痘苗病毒毒株西里瑟夫(VV-WR)攻击后体重的影响。如图1所示，用1x MLD50VV-WR攻击的未接种疫苗(盐水对照)的小鼠组在攻击后3天可首次检测到体重降低。体重继续降低，直至在第5天处死时比平均初始体重平均低20.9％。在用VV-WR攻击前4天接种Elstree或Dryvax的组中检测到类似的体重降低：这些组中处死那天的平均体重比初始平均体重分别低23.2％或21.1％。在用VV-WR攻击前2天接种的组中，在攻击后2天检测到首次体重降低(大约比平均初始体重降低4％)。在这组中平均体重继续降低，直至攻击后第4天的平均体重比初始平均体重低17.6％。攻击后第5天，平均体重不再降低，此时比初始平均体重低16.7％。在攻击前3天接种
的组中，从攻击后第3天开始只检测到体重的轻微降低，攻击后第4天最多，为比初始体重低4.2％。在这组中，体重在第5天恢复至初始值。攻击前4天接种
的小鼠组在用1x MLD50VV-WR攻击后不显示出任何体重降低。
在第二批小组中，用12.5x MLD50VV-WR攻击小鼠，再次监测攻击前和攻击后每一天的小鼠体重。如图2所示，未接种疫苗(盐水对照)的小鼠组在攻击后2天可首次检测到体重降低。体重继续降低，直至在第5天处死时比平均初始体重平均低23.3％。如此，比用1x MLD50VV-WR攻击的未接种疫苗组早1天可检测到体重降低，而且在处死那天更加显著(见图1)。在用VV-WR攻击前4天接种Elstree或Dryvax的组中，检测到与未接种疫苗的小鼠类似的体重降低。在用VV-WR攻击前3天接种
的组中，在攻击后2天检测到首次轻微体重降低(大约比平均初始体重低1.7％)。在这组中平均体重继续降低，直至攻击后第4天的平均体重比初始平均体重低16.1％。此后，在这组中平均体重开始恢复，在攻击后第8天检测到平均体重比平均初始体重低2.3％。在攻击前4天接种
的小鼠组中，检测到与平均初始体重相比10.8％的平均体重降低。在攻击后第3天检测到13.8％的平均体重降低最大值。在随后几天了观察到体重的恢复，在攻击后8天观察到与攻击前相似的平均体重。
在第三批小组中，用50x MLD50VV-WR攻击小鼠，再次监测攻击前和攻击后每一天的小鼠体重。如图3所示，未接种疫苗(盐水对照)的小鼠组早在攻击后1天就可首次检测到体重降低。平均体重继续降低，直至在第4天处死时比平均初始体重平均低20.1％。如此，分别比用1x或12.5x MLD50VV-WR攻击的未接种疫苗组早2天或1天可检测到体重降低。接种Elstree或Dryvax的组在攻击后2天开始可检测到体重降低，到攻击后第4天时这些组中的小鼠分别揭示出相对于初始体重20.1％或19.7％的平均体重降低。在用VV-WR攻击前3天接种
的组中，在攻击后第1天检测到首次体重降低(大约比平均初始体重低1.6％)。在这组中平均体重继续降低，直至攻击后第4天处死时平均体重比初始平均体重低24.0％。在攻击前4天接种
的小鼠组中，在攻击后第1天可检测到首次体重降低，平均体重继续降低，在攻击后第4天比平均初始体重低22.5％。在随后几天了检测到体重的恢复，在攻击后8天检测到比平均初始体重低5.1％的平均体重。
肺滴度
在小鼠死亡或处死后，取出肺，使用标准噬斑测定法在Vero细胞上测定该组织中病毒总量。在肺滴度低于log10 3.69(5x103pfu)时，认为动物受到完全保护，该滴度是在Vero细胞上使用我们的病毒滴定法能检测到的最低滴度。在第一批小组中，比较了用1x MLD50VV-WR攻击的小鼠。如图4所示，未接种疫苗的小鼠揭示出log10 7.81的平均病毒载量。在攻击前4天接种Elstree或Dryvax的小鼠揭示出log10 7.75和log10 6.68的平均肺病毒载量。如此，接种Elstree的小鼠不能阻止肺部病毒感染，接种Dryvax的小鼠只能在一定程度上阻止肺部病毒感染。在攻击前4天接种
的小鼠组中，在用1x MLD50VV-WR鼻内攻击后，检测不到肺病毒滴度，如此受到抵抗病毒感染的完全保护。将
接种和VV-WR攻击之间的时间间隔从4天缩短至3或2天，分别将每组病毒阳性肺数目提高至5只中1只或5只中4只，平均肺病毒滴度分别为log10 3.77或log10 4.68。在第二批小组中，比较了用12.5x MLD50VV-WR攻击的小鼠。如图5所示，未接种疫苗的小鼠揭示出log10 8.38的平均病毒载量。在攻击前4天接种Elstree或Dryvax的小鼠揭示出log10 8.17和log10 8.00的平均肺病毒载量。如此，接种Elstree和Dryvax的小鼠不能阻止肺部病毒感染。在攻击前4或3天接种
的小鼠组中，在用12.5x MLD50VV-WR鼻内攻击后，检测不到肺病毒滴度，如此受到抵抗病毒感染的完全保护。在第三批小组中，比较了用50x MLD50VV-WR攻击的小鼠。如图6所示，未接种疫苗的小鼠揭示出log108.59的平均病毒载量。在攻击前4天接种Elstree或Dryvax的小鼠揭示出log10 8.49和log10 8.25的平均肺病毒载量。如此，接种Elstree和Dryvax的小鼠不能阻止肺部病毒感染。
在接种的小鼠组中，在攻击前4天施行接种，则检测不到肺病毒滴度。因此，这些小鼠在用50x MLD50VV-WR鼻内攻击后受到抵抗病毒感染的完全保护。在接种和VV-WR攻击之间的时间间隔为3天的小鼠组中，平均肺病毒载量经测定为log10 7.63。如此，这组只在一定程度上受到抵抗病毒感染的保护。
5.结论
在此项研究中，测定了体重降低以及病毒肺滴度这两方面的恢复情况，以指示抵抗VV-WR致死鼻内攻击的“保护作用”。
用1x、12.5x或50x MLD50VV-WR攻击的对照动物揭示出连续的体重降低，且死后尸检(postmortem)发现肺中具有高病毒载量(攻击剂量越高，肺中检测到的病毒载量越高)。故这些小鼠不能控制感染。
天花疫苗候选物IMVAMUNETM 
能够提供抵抗高达50xMLD50VV-WR的鼻内攻击的保护作用。这种保护作用伴有初始体重降低后的体重恢复，以及肺中无病毒的状态。VV-WR的攻击剂量越高，攻击前4天接种
的小鼠中体重恢复需要的攻击后时期越长：在用12.5xMLD50VV-WR攻击时，在攻击后第4天检测到体重恢复，而在用50x MLD50VV-WR攻击小鼠时，在攻击后第5天检测到体重恢复。另外，此项研究清楚揭示了，给小鼠接种
和用1x MLD50VV-WR攻击之间的时间间隔可缩短至2天，该时间间隔足以在用1x MLD50VV-WR攻击后能够稳定体重并降低肺病毒滴度。另外，提高攻击剂量导致获得抵抗致死攻击的保护作用所需要的、
接种和攻击之间的时间间隔延长：在用50x MLD50VV-WR攻击的情况中，3天间隔不足以获得保护作用，而在用12.5x MLD50VV-WR攻击后，接种和攻击之间的3天间隔足以获得保护作用。
与
相反，第一代和第二代天花疫苗，分别是Dryvax和Elstree，在攻击前4天施用时不能提供抵抗高达50x MLD50VV-WR的鼻内攻击的保护作用。这种差异的原因可能是由于施用的路径不同：
是皮下施用于小鼠(及在临床试验中施用于人)的，而Elstree和Dryvax是经划痕法施用于小鼠(及施用于人)的。
总之，此项研究清楚证明了
较之Elstree和Dryvax在引起保护作用方面的优越性。
Claims (17)
1.痘病毒用于制备疫苗的用途，所述疫苗在动物包括人中快速诱导保护性免疫应答，其中：
-所述痘病毒在所述动物包括人中不能复制；
-所述保护性免疫应答在7天内或更短时间内产生；
-所述痘病毒是改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
2.依照权利要求1的用途，其中所述MVA选自MVA病毒株MVA 575、MVA 572和MVA-BN。
3.依照权利要求1或2的用途，其中所述病毒是克隆纯化的病毒。
4.依照权利要求1或2的用途，其中所述病毒在无血清培养过程中获得。
5.依照权利要求1或2的用途，其中所述痘病毒是用量为105-5x108TCID50/ml的痘病毒。
6.依照权利要求1或2的用途，其中所述痘病毒是静脉施用、肌肉施用或皮下施用的痘病毒。
7.依照权利要求1或2的用途，其中所述保护性免疫应答是抗痘病毒感染的保护性免疫应答。
8.依照权利要求7的用途，其中所述免疫应答是抗天花感染的免疫应答。
9.依照权利要求1或2的用途，其中所述痘病毒是重组痘病毒。
10.依照权利要求9的用途，其中所述重组痘病毒包含至少一种异源核酸序列。
11.依照权利要求10的用途，其中所述异源核酸序列是编码至少一种抗原、抗原性表位、和/或治疗性化合物的序列。
12.依照权利要求11的用途，其中所述抗原性表位和/或抗原是传染物的抗原性表位和/或抗原。
13.依照权利要求12的用途，其中所述抗原选自由致病性单细胞真核生物体、致病性原核生物体和寄生生物体组成的组。
14.依照权利要求13的用途，其中所述抗原为真菌。
15.依照权利要求12的用途，其中所述抗原选自病毒。
16.依照权利要求15的用途，其中所述病毒为流感病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、肝炎病毒科、人免疫缺陷病毒科或者引起出血热的病毒。
17.依照权利要求12-16任一项的用途，其中所述免疫保护是抵抗产生所述抗原性表位和/或抗原的传染物的免疫保护。
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