1.Brownnlee Mvlassara H,Aminoguanidine prevents diabetes induced arterial wall proteincross linking.Science,1986,232:1629-1728.
2.Sajithlal G B,Chrttha P,Chandrnkasan G.The role of metal-cat-analyzed oxidation in theformation of advanced glycation products:in vitro study on collagen.Free Radic Biol Med.1998,25:265-269.
3.Varvarovska J,Racek J,Stozickyky F,et al.Paranleters of oxidative stress in children withType I diabetes mellitus and their relatives.J Diabetes Complications,2003,17:7-10.
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
原花青素B2降血糖及抑制非酶糖基化的活性测试
1.试验材料:动物:雄性Wistar大鼠,北京动物中心提供。试剂:原花青素B2(天津尖峰天然产物研究开发有限公司自制,纯度为98%);链尿佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)均为美国Sigma公司产品;羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为美国Sigma公司产品,北京京科公司分装;仪器:DV650全自动生化仪,SHIMAZU 1601紫外可见分光光度计,微量移液器,电子分析天平,旋涡混匀器。
2.试验方法:(1)糖尿病动物模型制备:180-220g雄性Wistar大鼠90只,适应性喂养三天,随机选12只大鼠作为正常对照组。余78只大鼠空腹12h后左腹腔注射STZ60mg/kg,注射后均给予正常饮食,12h后测大鼠空腹尾静脉血糖,血糖>16.7mmol/L为糖尿病造模成功。取造模成功者60只纳入试验,余弃去。(2)动物分组及喂养:将糖尿病大鼠随机分为5组,空白对照组、AG治疗组、原花青素B2低、中和高剂量组,每组12只。空白对照组用自来水灌胃,AG治疗组用150mg/kg·d的AG灌胃,原花青素B2低、中和高剂量组分别用50、100、150mg/(kg·d)的原花青素B2进行灌胃,每日下午4时灌胃1次,各组均给予标准饲料常规喂养,自由进食及饮水,不使用胰岛素。在喂养过程中,各组大鼠均有正常死亡,试验开始时各组具有12只大鼠,试验结束时,各组均有10只大鼠。(3)标本取材:喂养12周后,大鼠空腹6h,称体重,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉,挖眼球取血5ml备用。另剖腹取出大鼠双肾,双肾去除包膜称重。取部分肾脏置入液氮中冷冻。(4)肾皮质中体内非酶糖基化终产物(AGEs)的检测:用荧光法测AGEs。取肾皮质0.5g,剪成小块,加生理盐水1ml磨成匀浆,2500r/min离心10min,弃上清,在沉淀中加入氯仿-甲醇(2∶1)5ml去脂,4℃振摇过夜。4000r/min离心15min,弃上清,留沉淀,用2ml甲醇及0.5ml蒸馏水冲洗沉淀。3000r/min离心7min,重复冲洗3次。新鲜配置0.1mol/L HEPES缓冲液:用总量为225ml的蒸馏水溶解NaCl 9.36g,KCl 0.433g,Na2HPO4·2H2O 0.158g,葡萄糖1.17g,HEPES 5.85g,用1mol/LNaOH调节pH值至7.05,再用蒸馏水定容至250ml。将沉淀颗粒悬浮在含有2ml的HEPES缓冲液的试管中,每试管加入280uIV型胶原酶,并作空白胶原酶对照管,37℃恒温震荡24h后,3500r/min离心15min,上清液即为被胶原酶消化的肾皮质胶原。用荧光光度计在激发波长370nm、发射波长440nm处测定荧光强度,其数值用空白胶原酶校正。然后用氯胺T法测定消化液中的羟脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羟脯氨酸(Hyp)所含荧光强度为一个单位(AU/mg Hyp)表示。(5)血糖的检测:取上述大鼠自凝血2ml,利用全自动生化仪测定血糖。
3.试验结果:(1)各组实验大鼠形态、肾重、体重及肾重/体重的比较:所有成模糖尿病大鼠均出现多饮、多食、多尿的表现,由于消瘦及多食逐渐呈小头大腹的形态,与正常对照组相比,毛色暗淡无光泽,尾静脉采血后伤口不易愈合。糖尿病大鼠12周时体重较正常对照组显著降低,肾重/体重比值明显升高;AG治疗组和B2各剂量组的肾重/体重比值比对照组低(P<0.01),结果见表2。
表2各组大鼠体重、肾重、肾重/体重比较(x±s)
组别 |
鼠数(只) |
肾重(g) |
体重(g) |
肾重/体重(×10-2) |
正常对照组空白对照组AG治疗组原花青素B2低剂量组原花青素B2中剂量组原花青素B2高剂量组 |
101010101010 |
2.79±0.873.48±0.522.35±0.762.98±0.333.11±0.822.87±0.45 |
399.4±71.6302.1±28.5317.5±54.8331.7±43.6336.9±67.3333.2±27.3 |
0.69±0.121.15±0.83**0.74±0.39**0.89±0.46*0.92±0.220.86±0.34 |
注:方差分析与t检验,与正常对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,与空白对照组比较,均为P<0.01。
(2)血清血糖及肾皮质AGEs:试验结束时,各试验组血糖值仅B2高剂量组与空白对照组存在显著性差异。同时AG治疗组、原花青素B2各剂量组与正常对照组、空白对照组相比,大鼠肾皮质AGEs均有非常显著性差异(**P<0.01),AG治疗组AGEs低于原花青素B2低剂量组(△P<0.05),原花青素B2高剂量组低于原花青素B2低剂量组(#p<0.01),原花青素B2中、高剂量组之间以及与AG治疗组相比较无显著性。(见表3)
表3各组大鼠的血糖及肾皮质AGEs测定结果
组别 |
鼠数(只) |
血糖(mmol/L) |
AGEs(AU/mgHyp) |
正常对照组空白对照组AG治疗组原花青素B2低剂量组原花青素B2中剂量组原花青素B2高剂量组 |
101010101010 |
5.68±08631.28±6.8525.7±5.3121.87±4.7218.84±4.3112.39±1.79** |
4.95±1.8718.13±4.72**10.91±3.09**16.21±3.11**△13.46±2.31**11.27±2.15**# |
结果显示:B2高剂量组具有一定的降血糖功效,同时高中低剂量组均能抑制肾皮质AGEs的形成,从而抑制非酶糖基化,防治糖尿病血光综合症的发生。
实施例2
(1)提取:500g葡萄籽中加入2000g的水常压95℃温浸提取5次,提取时间分别为5、4、3、2、1小时,过滤,滤网的目数为120,提取液合并静置至温度低于50度,弃沉淀,得上清液;
(2)大孔树脂吸附分离:将(1)中提取液经HP20型大孔树脂吸附,用水、体积百分比浓度为10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脱,每250ml作为一个接收体积,通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测,收集富含原花青素B2的组分,将其合并,在温度≤60℃,真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩,糖度为40,得原花青素B2的富集物;
(3)聚酰胺树脂分离:大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离,用水、体积百分比浓度为20%、50%、70%、95%的乙醇水溶液,通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测,收集富含原花青素B2的组分,将洗脱液在温度≤60℃,真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩,糖度为10,得原花青素B2的富集物。原花青素B2的含量为37.4%。
(4)ODS中低压柱层析分离:将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析,用水、体积百分比为10%、20%、30%、40%、50%的甲醇水溶液梯度洗脱,每50ml作为一个接收体积,通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测,以原花青素B2纯品作为对照品,收集富含原花青素B2的组分,并将其在温度≤60℃,真空度为0.06~0.08MPa减压浓缩,糖度为10,用实施例1的方法测定:原花青素B2的含量为75.3%。
(5)Sephadex LH-20进行纯化:将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化,用体积百分比30%的甲醇进行洗脱,每10ml作为一个接收体积,通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测,以原花青素B2纯品作为对照品,收集富含原花青素B2的组分,将洗脱液在温度≤60℃,真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩,得到糖度为20的组分,冷冻干燥得到原花青素B2(260mg)。
利用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR等光谱手段并于文献数据进行对照,鉴定了根据上述方法分离得到的原花青素B的结构。在此基础上利用标准品(美国CHROMDEX公司购买)进行标定,测定原花青素素B2含量为98%。原花青素B2淡黄色粉末,聚酰胺薄膜以正丁醇-醋酸-水(4∶1∶3)展开,Rf为0.3,5%三氯化铁乙醇溶液显单一蓝色斑点。阴离子ESI-MS中给出了准分子离子峰[M-H]-577和[M-H+Cl]-612,其1H-NMR(300MHz,inDMSO)中信号交叠较严重,其13C-NMR(75MHz,in DMSO)中信号清晰,与文献相对照进行了全归属,鉴定为原花青素B2,结果见下表。
表1本发明中化合物的13C-NMR数据
位置 |
13C-NMR |
化合物 |
PB2(文献) |
Aunit |
Bunit |
Aunit |
Bunit |
2 |
78.6 |
76.1 |
79.9 |
76.9 |
3 |
65.2 |
72.1 |
67.0 |
73.5 |
4 |
28.3 |
36.3 |
29.9 |
36.7 |
4a |
99.4 |
102.6 |
99.6 |
103.9 |
5 |
154.5 |
156.4 |
156.5 |
157.6 |
6 |
96.4 |
95.1 |
96.8 |
95.6 |
7 |
154.9 |
157.2 |
156.6 |
157.8 |
8 |
107.7 |
94.4 |
107.2 |
95.5 |
8a |
153.6 |
157.2 |
154.5 |
157.7 |
1′ |
130.9 |
131.9 |
132.1 |
132.5 |
2′ |
115.0 |
115.1 |
114.9 |
114.9 |
3′ |
145.2 |
144.9 |
145.8 |
145.7 |
4′ |
144.8 |
144.6 |
145.5 |
145.4 |
5′ |
115.4 |
115.5 |
115.6 |
115.7 |
6′ |
118.2 |
118.4 |
118.7 |
119.0 |
本实施例中的原料还可以选:松科松属植物的根、树皮、叶;或蔷薇科植物的根、茎、叶、果实、种子;或葡萄科葡萄属植物的根、茎、果实、种子;或豆科植物的茎或种皮为原料。