CN101125139A - 原花青素b2在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原花青素B2在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用，实验证明原花青素B2能够一定程度降低大鼠的血糖浓度，同时更重要的是能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应，揭示其控制糖尿病血管并发症的益处主要来自强大的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代谢产物的形成，同时其还具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，对控制糖尿病血管并发症的进展也有很好的协同作用，有助于防治代谢综合症，原花青素B2所具有的多方面作用使其在防治糖尿病血管并发症方面的优势更加明显，原花青素高效无毒，安全性极高，因此在临床防治糖尿病血管并发症中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种原花青素B2在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高，各种各样的所谓“富贵病”也在不断威胁人类健康。糖尿病便是其中的一种具有代表性的终身疾病。最近的流行病调查证实，我国的糖尿病患病率高达10％，已成为继心脑血管疾病和癌症之后的第三号杀手。而糖尿病的危害主要来自糖尿病血管并发症，因此对糖尿病血管并发症的防治研究极为迫切。糖尿病个体体内蛋白质发生非酶糖基化致使非酶糖基化代谢产物增多，是导致糖尿病血管并发症的重要原因之一。非酶糖基化代谢产物增多，可以直接促进微血管基底膜增厚，诱导肿瘤生长因子-β(TGF-β)等多种细胞因子表达，刺激细胞外基质增生，还可以通过与非酶糖基化代谢产物受体(RAGE)结合产生一系列反应，最终导致糖尿病血管并发症的产生[1-2]。自身氧化在非酶糖基化代谢产物形成的一系列级连反应中具有重要作用，氧化应激增强可以导致非酶糖基化代谢产物生成增加。自由基清除基可以显著抑制非酶糖基化代谢产物的形成[3]，糖尿病时增强的氧化应激可以加速非酶糖基化代谢产物的形成，进而促进糖尿病血管并发症的发展。因此抑制非酶糖基化反应，抑制非酶糖基化代谢产物生成是防治糖尿病血管并发症的新策略。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的是提供一种原花青素B2在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
原花青素B2在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用。
我们观察到原花青素B2能够一定程度降低大鼠的血糖浓度，同时更重要的是能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应，揭示其控制糖尿病血管并发症的益处主要来自强大的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代谢产物的形成，同时其还具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，对控制糖尿病血管并发症的进展也有很好的协同作用，有助于防治代谢综合症。原花青素B2所具有的多方面作用使其在防治糖尿病血管并发症方面的优势更加明显。原花青素高效无毒，安全性极高，因此在临床防治糖尿病血管并发症中具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
原花青素B2降血糖及抑制非酶糖基化的活性测试
1.试验材料：动物：雄性Wistar大鼠，北京动物中心提供。试剂：原花青素B2(天津尖峰天然产物研究开发有限公司自制，纯度为98％)；链尿佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)均为美国Sigma公司产品；羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为美国Sigma公司产品，北京京科公司分装；仪器：DV650全自动生化仪，SHIMAZU 1601紫外可见分光光度计，微量移液器，电子分析天平，旋涡混匀器。
2.试验方法：(1)糖尿病动物模型制备：180-220g雄性Wistar大鼠90只，适应性喂养三天，随机选12只大鼠作为正常对照组。余78只大鼠空腹12h后左腹腔注射STZ60mg/kg，注射后均给予正常饮食，12h后测大鼠空腹尾静脉血糖，血糖＞16.7mmol/L为糖尿病造模成功。取造模成功者60只纳入试验，余弃去。(2)动物分组及喂养：将糖尿病大鼠随机分为5组，空白对照组、AG治疗组、原花青素B2低、中和高剂量组，每组12只。空白对照组用自来水灌胃，AG治疗组用150mg/kg·d的AG灌胃，原花青素B2低、中和高剂量组分别用50、100、150mg/(kg·d)的原花青素B2进行灌胃，每日下午4时灌胃1次，各组均给予标准饲料常规喂养，自由进食及饮水，不使用胰岛素。在喂养过程中，各组大鼠均有正常死亡，试验开始时各组具有12只大鼠，试验结束时，各组均有10只大鼠。(3)标本取材：喂养12周后，大鼠空腹6h，称体重，2％戊巴比妥钠腹腔麻醉，挖眼球取血5ml备用。另剖腹取出大鼠双肾，双肾去除包膜称重。取部分肾脏置入液氮中冷冻。(4)肾皮质中体内非酶糖基化终产物(AGEs)的检测：用荧光法测AGEs。取肾皮质0.5g，剪成小块，加生理盐水1ml磨成匀浆，2500r/min离心10min，弃上清，在沉淀中加入氯仿-甲醇(2∶1)5ml去脂，4℃振摇过夜。4000r/min离心15min，弃上清，留沉淀，用2ml甲醇及0.5ml蒸馏水冲洗沉淀。3000r/min离心7min，重复冲洗3次。新鲜配置0.1mol/L HEPES缓冲液：用总量为225ml的蒸馏水溶解NaCl 9.36g，KCl 0.433g，Na2HPO4·2H2O 0.158g，葡萄糖1.17g，HEPES 5.85g，用1mol/LNaOH调节pH值至7.05，再用蒸馏水定容至250ml。将沉淀颗粒悬浮在含有2ml的HEPES缓冲液的试管中，每试管加入280uIV型胶原酶，并作空白胶原酶对照管，37℃恒温震荡24h后，3500r/min离心15min，上清液即为被胶原酶消化的肾皮质胶原。用荧光光度计在激发波长370nm、发射波长440nm处测定荧光强度，其数值用空白胶原酶校正。然后用氯胺T法测定消化液中的羟脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羟脯氨酸(Hyp)所含荧光强度为一个单位(AU/mg Hyp)表示。(5)血糖的检测：取上述大鼠自凝血2ml，利用全自动生化仪测定血糖。
3.试验结果：(1)各组实验大鼠形态、肾重、体重及肾重/体重的比较：所有成模糖尿病大鼠均出现多饮、多食、多尿的表现，由于消瘦及多食逐渐呈小头大腹的形态，与正常对照组相比，毛色暗淡无光泽，尾静脉采血后伤口不易愈合。糖尿病大鼠12周时体重较正常对照组显著降低，肾重/体重比值明显升高；AG治疗组和B2各剂量组的肾重/体重比值比对照组低(P＜0.01)，结果见表2。
表2各组大鼠体重、肾重、肾重/体重比较(x±s)
| 组别 | 鼠数(只) | 肾重(g) | 体重(g) | 肾重/体重(×10-2) |
| 正常对照组空白对照组AG治疗组原花青素B2低剂量组原花青素B2中剂量组原花青素B2高剂量组 | 101010101010 | 2.79±0.873.48±0.522.35±0.762.98±0.333.11±0.822.87±0.45 | 399.4±71.6302.1±28.5317.5±54.8331.7±43.6336.9±67.3333.2±27.3 | 0.69±0.121.15±0.83**0.74±0.39**0.89±0.46*0.92±0.220.86±0.34 |
注：方差分析与t检验，与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与空白对照组比较，均为P＜0.01。
(2)血清血糖及肾皮质AGEs：试验结束时，各试验组血糖值仅B2高剂量组与空白对照组存在显著性差异。同时AG治疗组、原花青素B2各剂量组与正常对照组、空白对照组相比，大鼠肾皮质AGEs均有非常显著性差异(**P＜0.01)，AG治疗组AGEs低于原花青素B2低剂量组(△P＜0.05)，原花青素B2高剂量组低于原花青素B2低剂量组(#p＜0.01)，原花青素B2中、高剂量组之间以及与AG治疗组相比较无显著性。(见表3)
表3各组大鼠的血糖及肾皮质AGEs测定结果
| 组别 | 鼠数(只) | 血糖(mmol/L) | AGEs(AU/mgHyp) |
| 正常对照组空白对照组AG治疗组原花青素B2低剂量组原花青素B2中剂量组原花青素B2高剂量组 | 101010101010 | 5.68±08631.28±6.8525.7±5.3121.87±4.7218.84±4.3112.39±1.79** | 4.95±1.8718.13±4.72**10.91±3.09**16.21±3.11**△13.46±2.31**11.27±2.15**# |
结果显示：B2高剂量组具有一定的降血糖功效，同时高中低剂量组均能抑制肾皮质AGEs的形成，从而抑制非酶糖基化，防治糖尿病血光综合症的发生。
实施例2
(1)提取：500g葡萄籽中加入2000g的水常压95℃温浸提取5次，提取时间分别为5、4、3、2、1小时，过滤，滤网的目数为120，提取液合并静置至温度低于50度，弃沉淀，得上清液；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中提取液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得原花青素B2的富集物；
(3)聚酰胺树脂分离：大孔树脂吸附分离后得到的原花青素B2的富集物分散至水中(1∶4)进行聚酰胺树脂分离，用水、体积百分比浓度为20％、50％、70％、95％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，得原花青素B2的富集物。原花青素B2的含量为37.4％。
(4)ODS中低压柱层析分离：将通过聚酰胺分离后富含原花青素B2的组分进行ODS中低压柱层析，用水、体积百分比为10％、20％、30％、40％、50％的甲醇水溶液梯度洗脱，每50ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为10，用实施例1的方法测定：原花青素B2的含量为75.3％。
(5)Sephadex LH-20进行纯化：将(4)中得到的含有原花青素B2的组分进行SephadexLH-20柱层析纯化，用体积百分比30％的甲醇进行洗脱，每10ml作为一个接收体积，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，以原花青素B2纯品作为对照品，收集富含原花青素B2的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06-0.08MPa减压浓缩，得到糖度为20的组分，冷冻干燥得到原花青素B2(260mg)。
利用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR等光谱手段并于文献数据进行对照，鉴定了根据上述方法分离得到的原花青素B的结构。在此基础上利用标准品(美国CHROMDEX公司购买)进行标定，测定原花青素素B2含量为98％。原花青素B2淡黄色粉末，聚酰胺薄膜以正丁醇-醋酸-水(4∶1∶3)展开，Rf为0.3，5％三氯化铁乙醇溶液显单一蓝色斑点。阴离子ESI-MS中给出了准分子离子峰[M-H]-577和[M-H+Cl]-612，其1H-NMR(300MHz，inDMSO)中信号交叠较严重，其13C-NMR(75MHz，in DMSO)中信号清晰，与文献相对照进行了全归属，鉴定为原花青素B2，结果见下表。
表1本发明中化合物的13C-NMR数据
| 位置 | 13C-NMR | |||
| 化合物 | PB2(文献) | |||
| Aunit | Bunit | Aunit | Bunit | |
| 2 | 78.6 | 76.1 | 79.9 | 76.9 |
| 3 | 65.2 | 72.1 | 67.0 | 73.5 |
| 4 | 28.3 | 36.3 | 29.9 | 36.7 |
| 4a | 99.4 | 102.6 | 99.6 | 103.9 |
| 5 | 154.5 | 156.4 | 156.5 | 157.6 |
| 6 | 96.4 | 95.1 | 96.8 | 95.6 |
| 7 | 154.9 | 157.2 | 156.6 | 157.8 |
| 8 | 107.7 | 94.4 | 107.2 | 95.5 |
| 8a | 153.6 | 157.2 | 154.5 | 157.7 |
| 1′ | 130.9 | 131.9 | 132.1 | 132.5 |
| 2′ | 115.0 | 115.1 | 114.9 | 114.9 |
| 3′ | 145.2 | 144.9 | 145.8 | 145.7 |
| 4′ | 144.8 | 144.6 | 145.5 | 145.4 |
| 5′ | 115.4 | 115.5 | 115.6 | 115.7 |
| 6′ | 118.2 | 118.4 | 118.7 | 119.0 |
本实施例中的原料还可以选：松科松属植物的根、树皮、叶；或蔷薇科植物的根、茎、叶、果实、种子；或葡萄科葡萄属植物的根、茎、果实、种子；或豆科植物的茎或种皮为原料。
Claims (1)
1.原花青素B2在制备防治糖尿病及血管并发症药物的应用。
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