CN101122548B - 用于切出和收集解剖样本的方法 - Google Patents

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Abstract

用于解剖和收集样品的方法，包括以下步骤：将样品放置在激光解剖显微镜的滑动台上，所述滑动台可在其延伸的平面中移动，将在光轴上居中的粘性收集装置降低至取样器上，其中所述粘性收集装置在其降低状态粘附所述样品，并可以与所述滑动台一起自由地移动，并且与所述显微镜的所述光轴脱离，同时在其升高状态相对于所述光轴固定，从所述样品解剖一个或多个样品，其中，如果待解剖的下一个样本位于所述粘性收集装置的预定收集半径之外，则执行以下步骤：升高所述粘性收集装置，相对于所述显微镜的所述光轴将所述滑动台移动至给定位置，以便使待解剖的样本的中心与所述显微镜的所述光轴偏心，将所述粘性收集装置降低至所述样品上，以及解剖一个或多个连续的样品，其中，在升高所述粘性收集装置的每个步骤之后，预定的位置与所有先前确定的位置间隔开至少一个预定的距离。

Description

用于切出和收集解剖样本的方法
技术领域
本发明涉及用于从样品切出和收集解剖样本的方法。 
背景技术
在激光显微解剖，尤其是诸如组织的活体检查样品的生物或医学样品的激光显微解剖中，厚度为大致5至10微米的样品放置在激光解剖显微镜的滑动台上，随后通过IR激光二极管(例如AlGaAs激光二极管)的精确聚焦激光束从样品上切出解剖样本。为此，将在激光二极管的红外发射光谱中选择性吸收的透明热塑性传递薄膜放置在样品上。该薄膜在很好地限定的位置处被熔融并粘附于待切割的样品(解剖样本)所要求的部分。例如，解剖样本可以包括需要从取样器中提取的用于进一步分析的单个细胞或者一组细胞。换句话说，在切割之后需要收集尺寸的量级为大约1至10微米的解剖样本。此时，将出现若干问题，尤其是，如果必须切出并收集多个解剖样本时。此外，由于为了切割而采用的IR激光束将热量传输至样品上，故样品将受到热量的影响，并可能因此损坏样品，例如本示例中的细胞。 
在本领域中已知用于收集解剖样本的多种方法。例如，文献DE 20100 866 U描述一种载体装置，该载体装置自由地支承在框架内具有样品的传递薄膜，具有解剖样本的薄膜在由激光束切出之后从该装置向下落入接收器内。然而，这种方法具有以下缺点。一方面，由于所有的解剖样本以不受控制的方式落入接收器内，故缺乏解剖样本的参考能力，并因此不能与其原始位置相关。此外，由于解剖样本仅由于重力而自由下落，故尤其是，如果小解剖样本由于静电作用而捕捉在显微镜的部分或者接收器的壁上，则小解剖样本将错过分析。 
文献US 5,998,129描述一种激光显微解剖方法，其中，通过激光束从放置在平面的滑动台上的组织样品的周围组织切出所需的区域，例如细胞器官或者单细胞。仍然位于滑动台上的分隔的细胞由另外的激光脉冲沿激光束抛射并捕捉在反应接收器中。由于来自激光束的传输动量，解剖样本以不受控制的方式再次飞入反应接收器中，并不再能够被参考。此外，大的解剖样本不能被抛射并且必须预先分离。 
另一种已知的方法包括利用粘性收集装置，即所谓的帽状物。首先，从样品上切出多个解剖样本，然后将帽状物降低在样品上并将解剖的样本粘合至该帽状物。具有粘合的解剖样本的帽状物在显微镜内上升并移动。虽然在这种方法中，该帽状物可接收多个解剖样本，并因此能够更快地操作，但是由于解剖样本的不同尺寸和形状而产生问题，仅在不充分地使用粘附的帽状物表面时，帽状物的有限的接收区和粘附性以及帽状物的可能的倾斜将导致昂贵的帽状物不可避免的浪费。另一方面，如果多个解剖的样本互相堆叠，将产生如下危险，即解剖样本可能以不受控制的方式落下并丢失。因此，帽状物上的样品数目受到严格的限制，这是一个缺点，因为在一些应用中解剖样本的数目因此可能不足以进行分析。 
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种方法和设备，其解决上述问题，并且能够在不破坏样品或者出现复杂的结构或构造的情况下无污染地、可靠地、有效地并且有成本效率地收集不同尺寸的解剖的样本。该目的通过具有权利要求1的特征的方法，以及具有权利要求7的特征的设备实现。其他有利的实施例限定在从属权利要求中。 
用于切出和收集解剖的样本的发明方法，包括以下步骤：将生物样品放置在激光解剖显微镜的滑动台上，该滑动台可以在其延伸的平面中移动；将在光轴上居中的粘性收集装置降低至生物样品上，其中 粘性收集装置在其降低状态粘附至样品，并可以与滑动台一起自由地移动，并且与显微镜的光轴脱离，同时在其升高状态下，相对于光轴固定；从生物样品切出一个或多个样本，其中，如果待切出的下一个样本位于粘性收集装置的预定收集半径之外，则执行以下步骤：升高粘性收集装置；相对于显微镜的光轴将滑动台移动至预定的位置以便使待切出的下一个样本的中心偏心于显微镜的光轴；将粘性收集装置降低至生物样品上；以及切出一个或多个随后的样本，其中，在升高粘性收集装置的每个步骤之后，预定的位置与所有先前确定的位置间隔开至少一个预定的距离。 
可选地，用于切出和收集解剖的样本的发明方法包括以下步骤：将生物样品放置在激光解剖显微镜的滑动台上，该滑动台可以在其延伸的平面中移动，从生物样品中切出样本并通过将在光轴上居中的粘性收集装置降低至生物样品上收集解剖的样本，其中，粘性收集装置在其降低状态粘附至样品，并且可以与滑动台一起自由地移动，并且在其升高状态下与显微镜的光轴脱离并相对于光轴固定，其中，如果待收集的下一个样本位于粘性收集装置的预定收集半径之外，则执行以下步骤：升高粘性收集装置，相对于显微镜的光轴将滑动台移动至给定的位置以便使待收集的连续的样本的中心偏心于显微镜的光轴，将粘性收集装置降低至生物样品上，并将一个或多个后续的解剖样品粘附至粘性收集装置，其中，在升高粘性收集装置的每个步骤之后，预定的位置与所有先前确定的位置间隔开至少预定的距离。 
上述两种方法能够有效地利用粘性收集装置的整个粘性表面，以避免解剖样品的堆叠并且提高整体收集效率。此外，利用上述两种方法，避免了已知方法的上述缺点，例如施加于取样器的热应力和解剖样本的不受控制的飞行或下落。 
在本发明方法的优选实施例中，预定距离由解剖样本的尺寸限定。由于解剖的样本大部分具有不同尺寸，故预定距离可以例如由待切出 样本的平均尺寸限定。也可使用最大尺寸。因此本发明的方法能够切出所有尺寸的样品。 
在本发明方法的优选实施例中，该位置沿螺旋路径依次设置。这便于明确识别解剖样本，并且允许实现粘性收集装置上的解剖样本的高密度。 
粘性收集装置在其降低状态优选地正好位于生物样品上。这改善解剖的样本与粘性收集装置的粘附，提供更大的粘附表面并且因此允许更大的收集容量。优选地，粘性收集装置在其降低状态以受控的接触压力位于生物样品上。因此，可提高收集性能，同时能够避免对样品或解剖样本的损坏。此外，样品的平面度没有受到妨碍，以便样品保持在显微镜的成像平面和激光的切削平面中。 
在另一优选实施例中，在将样品放置在滑动台上的步骤之后，预先确定待解剖的样本(多个样本)，并且在升高粘性收集装置的任何一个步骤之后，滑动台相对于粘性收集装置移动，以便粘性收集装置位于滑动台的无样品部分的上方，并跟随有如下步骤，即确定解剖样品的数目和/或面积的步骤，以及将该确定的尺寸和/或面积与在解剖之前预先确定样本的数目和/或面积进行比较的步骤。通过这种样品检测，使用者可确定由其预先确定的样品样本实际上是否被解剖(切出)和收集。这对于小样本或者具有大量样本的小样本特别重要。在本文中，预先确定意味着例如通过基于计算机的图解法，确定或者预先设置样品的数目、形状、尺寸、面积、位置等等中的至少一个。 
优选地，预先确定步骤包括为待解剖的样本的预定的数目和/或面积和确定的数目和/或面积之间的数目差和/或面积之差设置极限值的步骤。由于实际解剖的样本数量，以及因此可用于随后分析的样本数量可能对分析结果具有决定性的影响，故设置极限值的步骤在DANN、RNA和蛋白质的分析中，以及法医领域特别重要。 
进一步优选地，通过图像分析软件执行比较步骤。采用图像分析软件允许样品检测的完全自动化，并且提高解剖工艺的可靠性和工艺安全性。 
根据本发明的另一优选实施例，在比较步骤之后，粘性收集装置在样品上方向后移动，以便根据比较的结果解剖(切出)没有解剖的或没有适当地粘合至粘性收集装置的样品。 
此外，有利地，在比较步骤之后，执行通过激光烧蚀从粘性收集装置去除任何不希望的样品材料的步骤。该导致工艺精确度和可靠性的进一步提高。 
应当理解，上述样品检测不限于利用根据权利要求1至6的用于解剖和收集样品的发明方法的应用，而是还可用于需要解剖和收集生物样品的其它激光解剖方法。 
根据本发明，用于切出和收集解剖的样本的激光解剖显微镜，包括：用于接收生物样品的滑动台，其中，滑动台可在其延伸的平面中自由地移动；粘性收集装置，其能够降低至在该滑动台上的生物样品上并可从该滑动台上的生物样品上升高，该粘性收集装置在其降低状态可与所述滑动台一起自由地移动，并与显微镜的光轴脱离，并且在其升高状态相对于光轴固定。 
由于显微镜在其降低状态的自由移动能力，故显微镜能够以协调和控制的方式相对于具有样品的滑动台设置粘性收集装置，因此有效利用粘性收集装置。 
优选地，本发明的激光解剖显微镜还包括用于控制粘性收集装置的接触压力的磁体。因此，可实现接触压力的特别细微的调节。 
在特别有利的实施例中，该磁体可自由地调整，以便能够调节粘性收集装置和样品之间的相对距离。因此，例如在工艺控制期间，可以降低帽状物上的收集的解剖样品，以正好位于样品的上方并且对其进行可视地观察而不粘附样品。 
有利地，在本发明的激光解剖显微镜中，粘性收集装置和样品之间的距离是可调节的。因此，例如为了工艺控制的目的，能够降低粘性收集装置，以正好位于样品上方而不接触该样品。然后，可利用显微镜实际清晰地观察粘性收集装置，而不存在影响观察的与样品的任何接触。 
进一步优选地，激光解剖显微镜包括多个粘性收集装置或者一个或多个粘性收集装置的阵列。因此，可依次处理多个解剖样品组，而无需更换粘性收集装置而中断解剖的任何使用者的干预。 
附图说明
图1a示出根据本发明实施例的激光解剖显微镜的侧视图； 
图1b示出图1的显微镜的前视图； 
图2a示出从图1显微镜的帽状物提升组件上方的局部剖视图； 
图2b示出图2a的帽状物提升组件的局部侧向剖视图； 
图2c示出图2a的帽状物提升组件的局部正面剖视图； 
图3示出说明根据本发明方法的实施例的流程图；和 
图4示出对用于容纳解剖样本的帽状物进行再分的网格图形的布局。 
具体实施方式
图1a和1b示出根据本发明实施例的激光显微解剖显微镜。该显微镜包括：显微镜照明单元10，其由照明臂11、具有过滤器的灯罩12和灯组成；聚光器支承13，其连接至照明臂并具有聚光镜14。在显微镜 的下部有可在XY平面中移动的工作台20，具有样品22的滑动台21固定至该工作台20。显微镜的光轴用点划线示出并由附图标记15表示。 
在聚光器支承13的下方有帽状物提升组件，该帽状物提升组件包括作为基本元件的帽状物提升机构120、帽状物提升臂110和实际的帽状物111(粘性收集装置)。帽状物提升机构120通过帽状物提升保持器130连接至显微镜的照明臂11。 
图2a，2b和2c详细地示出帽状物提升组件的结构。在帽状物提升机构120内有高度调节器121，通过该高度调节器121可以调节帽状物提升臂110相对于XY工作台20的高度。附图标记122表示用于将帽状物定心在显微镜的光轴15上的调节机构，附图标记123表示帽状物在样品上的接触压力的控制装置，该控制装置调节磁体124的位置。 
帽状物提升臂110可占据至少两个不同的位置，一方面为升高的上部位置，另一方面为底部降低位置，以及帽状物不接触样品的一个或多个浮动位置。在上部位置中，帽状物提升臂110相对于显微镜的光轴15固定，而在下部位置和浮动位置中，帽状物提升臂110与光轴脱离。在这个位置，帽状物提升臂110可以沿X和Y方向自由地移动。上述是必需的，以便在切割和移动期间帽状物提升臂110和帽状物111可以与XY工作台120一起移动。可调节的公差(最大偏移)为+/-10毫米。在该公差内，帽状物子111始终正好位于样品22上或者在样品上方平行地浮动。如果超出调节公差，控制器(未示出)可自动地升高帽状物子111。 
下面将通过图3的流程图说明根据本发明方法的实施例。 
首先，在方法开始时(S100)，检查是否采用新的未使用的帽状物，如果回答是肯定的，则将待切出的一个或多个样本组的中心位置和相交线输入控制器。该控制器还了解其他的参数，例诸如帽状物的收集半径。在由使用者规定的收集半径内，在不升起帽状物的情况下切割 所有的样品。如果样品上有另外的待解剖的样本，但位于收集半径S之外，则帽状物提升机构必须升高并重新定位。 
具有网格宽度G的虚拟网格现在叠置在帽状物上(S101)。网格常数G根据相应组中的待切出的目标(样本)的平均尺寸设置，并规定为由使用者选择的Q与在该组中规定的样本的平均直径dave和直径的离散程度σd的两倍之和之间的乘积： 
                   G＝Q·(dave+2σd)。 
对于还未使用的帽状物，仍然没有样本粘合至该帽状物，升高的帽状物111在显微镜的光轴15上居中，即设置距离D＝(0；0)，并且使用网格单元(0，0)。换句话说，第一解剖样本粘合在帽状物的中心。滑动台现在根据相交线和中心位置移动至样本位置P(S102，D＝(0；0)。 
然而，如果位置P设置在收集半径S的外部，帽状物必须进行重新定位。在这种情况下，待切出的(下一个)目标移动至新的网格单元位置P-D(S102)。解剖样本的中心现在不再位于光轴15上，而是与其间隔距离D＝(Dx；Dy)。距离D(网格移位)能够以多种方式确定，其中一种如下所述。条件在于，解剖样本不遇到已经出现在帽状物111上的样本，即新的位置与旧的位置相隔网格常数。根据单元索引(Zx；Zy)计算帽状物移位D， 
D＝(G·Zx；G·Zy)。 
然后，帽状物111降低至下部位置(S103)。只有现在通过移动XY工作台20将解剖样本移动至光轴15(激光)，并利用位于在其上的帽状物切出下一个目标(S104)。因此，帽状物离开解剖样本的中心移动受控距离D。 
如果下一个待解剖的样本位于帽状物的收集半径的外部，即如果|P-D|＞S(S105)，则如果帽状物仍然没有满，|D|+S＞CC(S106)，并且如果 该组的最后样本仍然没有解剖(S107)，则升高帽状物并使用下一个网格单元(S108)。参数CC对应于帽状物的容量。该帽状物的容量为帽状物的最大有效面积的测量值，并由帽状物的公差FR和帽状物的可用粘合表面KF中的最小值确定(CC＝min(FR，KF))。换句话说，如果帽状物必须移动超过有效的帽状物容量，以便实现网格移位，则假定帽状物是满的(见S106)。在这种情况下，必须升高帽状物，并且新的帽状物必须连接至帽状物提升臂110(S111)。然后，新的帽状物再次居中在光轴上(S112)。 
在本发明的又一实施例中，该实施例也预计在图3的流程图中，解剖多组样本。此时，可利用所谓的多帽状物系统，其由同时保持在帽状物提升臂110上的多个帽状物组成。如果实际利用中的帽状物为满的(S106)或者解剖该组的最后样本(S107)以及仍然未处理上一组(S109)，则可用的多帽状物系统(S110)可以使用新的帽状物(S114)，用于待切出的下一组。此时，还应检查多帽状物系统的所有帽状物是否已满(S113)，如果回答是肯定的，则需要插入新的多帽状物系统(S115)。 
在说明该方法的实施例中，该位置由滑动台沿螺旋路径滑动台横越(网格单元)。这在图4中举例说明。此时，当前的单元索引Z＝(Zx，Zy)计算为 
N＝0；Z＝(0，0) 
进行循环N＝N+1 
{  Zx增加1直到Zx＝N 
   Zy增加1直到Zy＝N 
   Zx减少1直到Zx＝-N 
   Zy减少1直到Zy＝-N 
} 
D＝(G·Zx，G·Zy)。 
从在此说明的示例中，本领域技术人员肯定能够认识也属于本发明范围内的其他的有利实施例。 

Claims (11)

1.用于解剖和收集样本的方法，包括以下步骤：
将样品放置在激光解剖显微镜的滑动台上，所述滑动台可在其延伸的平面中移动，
将在光轴上居中的粘性收集装置降低至所述样品上，其中所述粘性收集装置在其降低状态粘附至所述样品，并可以与所述滑动台一起自由地移动，并且与所述显微镜的所述光轴脱离，并且在其升高状态下，相对于所述光轴固定，
从所述样品解剖一个或多个样本，其中，如果待解剖的下一个样本位于所述粘性收集装置的预定收集半径之外，则执行以下步骤：
升高所述粘性收集装置，
相对于所述显微镜的所述光轴将所述滑动台移动至给定位置，以便使待解剖的样本的中心偏心于所述显微镜的所述光轴，
将所述粘性收集装置降低至所述样品上，和
解剖一个或多个随后的样本，其中，在升高所述粘性收集装置的每个步骤之后，预定的位置与所有先前确定的位置间隔开至少一个预定的距离。
2.用于解剖和收集样本的方法，包括以下步骤：
将样品放置在激光解剖显微镜的滑动台上，所述滑动台可以在其延伸的平面中移动，
从所述样品切出所述样本，和
通过将在光轴上居中的粘性收集装置降低至所述样品上来收集解剖样本，其中所述粘性收集装置在其降低状态下粘附至所述样品，并可以与所述滑动台一起自由地移动，并且与所述显微镜的所述光轴脱离，并且在其升高状态下，相对于所述光轴固定，
其中，如果待解剖的下一个样本位于所述粘性收集装置的预定收集半径之外，则执行以下步骤：
升高所述粘性收集装置，
相对于所述显微镜的所述光轴将所述滑动台移动至给定位置，以便使待解剖的下一个样本的中心偏心于所述显微镜的所述光轴，
将所述粘性收集装置降低至所述样品上，和
将一个或多个随后的样本粘附至所述粘性收集装置上，
其中，在升高所述粘性收集装置的每个步骤之后，预定的位置与所有先前确定的位置间隔开至少一个预定的距离。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述预定的距离由所述样本的最大尺寸确定。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述位置沿螺旋路径依次设置。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，处于其降低状态下的所述粘性收集装置正好位于所述样品上。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，处于其降低状态下的所述粘性收集装置以受控的接触压力位于所述样品上。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中，在将所述样品放置在所述滑动台上的步骤之后，预先确定待解剖的样本；并且在升高所述粘性收集装置的任何一个步骤之后，所述滑动台相对于所述粘性收集装置移动，以便所述粘性收集装置位于所述滑动台的无样品部分的上方，并跟随有如下步骤：确定解剖样本的数目和/或面积；以及将确定的数目和/或面积与在解剖之前预先确定的样本的数目和/或面积进行比较。
8.如权利要求7所述的方法，其中，预先确定步骤包括如下步骤，即为所述待解剖的样本的预先确定的数目和/或面积与确定的数目和/或面积之间的数目差和/或面积差设置极限值。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述比较步骤通过图像分析软件执行。
10.如权利要求7所述的方法，其中，在所述比较步骤之后，所述粘性收集装置在所述样品上方向后移动，以便根据所述比较的结果，对没有解剖的或没有适当地粘合至所述粘性收集装置的样本进行解剖。
11.如权利要求7所述的方法，其中，在所述比较步骤之后，执行通过激光烧蚀从所述粘性收集装置去除任何不希望的样品材料的步骤。
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