CN101117637B

CN101117637B - 一种严格缺氧靶向载体及其应用

Info

Publication number: CN101117637B
Application number: CN2006101101221A
Authority: CN
Inventors: 王玉霞; 吴少平; 武军华; 贾培媛; 孙曼霁
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2026-07-31
Also published as: CN101117637A

Abstract

本发明提供一种新型真核基因构建体，在其启动子上游插入HRE，在效应基因前插入ODD，从而使该基因构建体具有严格缺氧靶向性。本发明还提供含有所述基因构建体的载体。本发明另外涉及含有所述基因构建体的药物组合物。

Description

一种严格缺氧靶向载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和药学领域。具体地讲涉及一种严格缺氧靶向载体及其应用。

背景技术

临床研究表明，缺氧可引起多种心脑血管疾病。研究表明，恶性肿瘤内存在乏氧细胞。临床上已有许多证据表明，肿瘤乏氧细胞的存在不仅使肿瘤对放化疗的抗拒性增加，而且使肿瘤更具有侵袭性，容易发生远处转移。在乏氧条件下，细胞核产生缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)蛋白水平升高，与靶基因的结合活性增加，促进其转录，引起一系列细胞对缺氧的反应。现已发现的HIF靶基因有60多种，它们都具有缺氧反应元件(hypoxiaresponsive element，HRE)。HRE由HIF1结合点(共有序列为5’TACGTGCT 3’)和两侧的功能序列构成。HIF1结合点突变导致基因对缺氧的转录反应丧失。因此，可以利用缺氧反应元件作为启动表达的控制元件。Shibata等从血管内皮生长因子基因的5’端非翻译区序列中克隆了HRE，在低氧诱导下，它与CMV启动子共同调控的荧光素酶基因表达上升500倍。氧依赖性降解区域(oxygen-dependentdegradation domain，ODD)是HIF 1上控制其稳定的关键区域。在常氧条件下，氧依赖的HIF1多聚羟化酶羟化ODD区Pro 564，使得肿瘤抑制基因产物(von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product，pVHL)与HIF 1亚基结合，激活pVHL介导的泛素-蛋白酶途径，最终使其被蛋白酶降解，故蛋白半衰期小于5min；而在缺氧条件下，由于缺少氧原子(必需来自氧分子)而使得HIF 1多聚羟化酶羟化失活，以上的反应过程被阻断，蛋白可稳定存在。

本发明的目的，在于制备一种新型真核载体，在其启动子上游建入HRE，控制下游基因在缺氧条件下表达，在效应基因前融入ODD，使表达的蛋白在缺氧条件下稳定，在常氧条件下降解，以期达到严格缺氧靶向控制的作用，为提高药物到缺氧病灶的靶向性，更好发挥治疗作用。

发明内容：

在一方面，本发明提供一种新型真核基因构建体，在其启动子上游插入HRE，在效应基因前插入ODD，从而使该基因构建体具有严格缺氧靶向性。

满足这一要求的HRE可以是血管内皮生长因子基因、红细胞生成素基因来源的，可以是其单拷贝、可以是多拷贝，其序列可以为：TACGTGCT(SEQ ID NO：1)。

本发明的ODD优选具有序列：

ATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAG(SEQ IDNO：2)或其功能性片段，

翻译后的氨基酸序列为：

MNPFSTQDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLSPLESSSASPESASPQSTVTVFQ(SEQ ID NO：3)。

本发明基因构建体中的效应基因可以是EGFP或P53基因。

另一方面，本发明提供了含有上述基因构建体的表达载体。

还在另一方面，本发明提供了所述的基因构建体在制备用于治疗缺氧性疾病如肿瘤、心血管病的药物中的用途。还涉及含有上述基因构建体的药物组合物，其为适于进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的剂型。

附图说明：

图1：pVAX-HRE-ODD构建示意图；

图2：pVAX-HRE经Sma I和Bgl II双酶切鉴定，其中

M：DNA Marker，分别为100，200，300，400，500，600bp；

图3：pVAX-HRE-ODD经Hind III和BamH I双酶切鉴定，其中

M：DNA Marker，分别为100，200，300，400，500，600bp；HD：pVAX-HRE-ODD；

图4：pVAX-HRE-ODD-EGFP经BamH I和Not I双酶切鉴定，其中标签1，pVAX-EGFP；2，pVAX-HRE-EGFP；3，pVAX-HRE-ODD-EGFP；

M，DNA Marker分别为500，1000，2000，3500，5500，7000bp；

图5：pVAX-HRE-ODD-P53经BamH I和Not I双酶切鉴定，其中标签1，pVAX-P53；2，pVAX-HRE-P53；3，pVAX-HRE-ODD-P53；

M，DNA Marker分别为500，1000，2000，3500，5500，7000bp

实施例

本发明将通过下列实施例得到更清楚的说明。这些实施例只是说明性的，不应当理解成限制本发明的范围。

实施例1构建pVAX-HRE载体

委托生物公司合成HRE基因，其DNA序列如下，两端分别含Sma I和Bgl II酶切位点：

CCCGGGCTGCAGGAATTCGATGCACGCGTCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAACCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGACTTGACGCGTCCGGGTACCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTATCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGACTTGACGCGTCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCCGGGTAGCTGGCGTACGTGCTGCAGCTCGAGATCT(SEQ ID NO：4)。

分别取载体pVAX和HRE片段，用Sma I和Bgl II进行双酶切，分别经1％和2％的凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收各片段。将pVAX载体片段与HRE片段以1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒酶切鉴定(图1、图2)。阳性克隆命名为pVAX-HRE。

实施例2.构建pVAX-HRE-ODD载体

委托生物公司合成ODD基因，其DNA序列如下，两端分别含HindIII和BamH I酶切位点：

AAGCTTATGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGGATCC(SEQ ID NO：5)。

分别取载体pVAX-HRE和ODD片段，用Hind III和BamH I进行双酶切，分别经1％和2％的凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收各片段。将pVAX-HRE载体片段与ODD片段以1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒酶切鉴定(图3)。阳性克隆命名为pVAX-HRE-ODD。

实施例3.构建pVAX-HRE-ODD-EGFP载体

以pEGFP-N1为模板，EGFP-P1：5’GCAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3’(SEQ ID NO：6)；EGFP-P2：5’GCAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA3’(SEQ ID NO：7)为引物，进行PCR反应30个循环，经1％凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收EGFP的PCR片段。

分别取载体pVAX、pVAX-HRE、pVAX-HRE-ODD和EGFP的PCR片段，用BamH I和Not I进行双酶切，经1％凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒分别回收pVAX、pVAX-HRE、pVAX-HRE-ODD和EGFP片段。分别将pVAX、pVAX-HRE、pVAX-HRE-ODD载体片段与EGFP片段按1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒酶切鉴定(图4)。阳性克隆分别命名为pVAX-EGFP、pVAX-HRE-EGFP、pVAX-HRE-ODD-EGFP。

实施例4.构建pVAX-HRE-ODD-P53载体

本人已构建成功pET28a-P53质粒(插入了P53基因的pET28a质粒)，P53基因两端分别含BamH I和Not I酶切位点。

将pET28a-P53质粒经BamH I和Not I酶双酶切，经1％凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收P53片段。分别将pVAX、pVAX-HRE、pVAX-HRE-ODD载体片段与P53片段按1∶3的比例混合，加T4连接酶，16℃反应16h，将反应产物转化于感受态大肠杆菌DH5a中，挑取转化成功的菌落，提质粒酶切鉴定(图5)。阳性克隆分别命名为pVAX-P53、pVAX-HRE-P53、pVAX-HRE-ODD-P53。

实施例5.pVAX-HRE-ODD-EGFP载体在常氧及缺氧细胞中的表达

1.pVAX-HRE-ODD-EGFP载体在常氧状态下在细胞中的表达

转染前一天，用不含抗性培养液调SW480细胞至1-4×10⁵/ml，24孔板种0.5ml/孔，转染时细胞长至90-95％满；用不含血清培养液分别稀释pVAX、pVAX-EGFP、pVAX-HRE-EGFP、pVAX-HRE-ODD-EGFP质粒至160μg/ml，轻轻混匀；将Lipofectamine 2000(Lipo)混匀后，按1∶24比例用无血清培养液稀释，25分钟内完成下一步；将稀释后质粒分别与Lipo等量混匀，室温放置25分钟，24孔板中每孔加入100μl混合物，前后晃动培养板至混匀；37℃培养4-6小时后换液，18-48小时后荧光镜下观察EGFP荧光(图6)。

结果显示：pVAX质粒转染后SW480细胞无荧光，pVAX-EGFP转染的细胞荧光最强最多，pVAX-HRE-EGFP转染的细胞有荧光，但较pVAX-EGFP转染的细胞少，pVAX-HRE-ODD-EGFP转染的细胞无荧光。

另外还研究了pVAX-HRE-ODD-EGFP载体在缺氧状态下在细胞中的表达。

实施例6.pVAX-HRE-ODD-P53载体在常氧及缺氧状态下对细胞的影响

以与实施例5类似的方法研究了pVAX-HRE-ODD-P53载体在常氧状态下对细胞的影响，以及pVAX-HRE-ODD-P53载体在缺氧状态下对细胞的影响。

发明效果

利用基因工程手段构建出新的真核表达载体，将缺氧反应元件构建在真核表达载体启动子上游，控制下游基因在缺氧条件下表达；在表达蛋白的N-端融合氧依赖性降解区域，使表达蛋白在常氧条件下快速降解，在缺氧组织中稳定存在。将具有不同功能的表达蛋白基因构建在载体中，使其发挥严格缺氧靶向作用。P53基因及其它肿瘤杀伤基因构建入载体可用于多种缺氧肿瘤的治疗；其他保护性基因构建入载体可用于各种缺血、缺氧性疾病的防治，具有重要的医学研究及临床使用价值。

序列表

Claims

1.一种基因构建体，其含有：

由SEQ ID NO：8所示序列构成的缺氧反应元件HRE；

由SEQ ID NO：2所示的序列构成的缺氧诱导因子HIF-1的氧依赖性蛋白降解结构域ODD，和

效应基因，

其中HRE、ODD和效应基因的相互位置关系为HRE-启动子-ODD-效应基因。

2.权利要求1的基因构建体，其中所述效应基因为任何具有生物活性的基因。

3.一种表达载体，其含有权利要求1-2中任一项的基因构建体。

4.权利要求3的表达载体，其为质粒或病毒。

5.权利要求4的表达载体，其中所述质粒为真核表达载体。

6.权利要求1-5中任一项的基因构建体或表达载体在制备用于治疗缺氧疾病的药物中的用途。

7.权利要求6的用途，其中所述缺氧疾病是指缺氧型肿瘤。

8.一种药物组合物，含有权利要求1-2任一项的基因构建体或权利要求3-5任一项的表达载体。

9.权利要求8的药物组合物，其为适于进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的剂型。