CN110257393A - 翻译后水平低氧调控基因、应用及其调控方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了翻译后水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；翻译后水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因的表达；一种翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法；本发明可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。

Description

翻译后水平低氧调控基因、应用及其调控方法
【技术领域】
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及翻译后水平低氧调控基因、应用及其调控方法。
【背景技术】
在缺血相关疾病(如缺血性卒中)基因治疗的过程中，作为一种外源基因，如果治疗基因不加以调控，过表达的话可能会引起不良副作用，如肿瘤、癫痫等。在缺血相关疾病发生的病理生理过程中存在局部缺血/低氧微环境，针对这一特点，我们可以利用缺血/低氧靶向调控系统来实现对治疗基因表达的缺血/低氧靶向调控，使其在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
基因表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。因此我们可以从转录前、转录后、翻译后水平对基因的表达进行缺血/低氧靶向调控，如图1所示。
在转录水平的调控主要是通过其中低氧诱导因子-1(hypoxia induciblefactor-1，HIF-1)和低氧反应元件(hypoxia responsive element，HRE)低氧特异性结合后启动下游基因转录的机制来实现的。在常氧条件下，HIF-1α表达水平较低，而且极不稳定，迅速被降解；但在低氧/低氧环境下，HIF-1α表达水平上调、稳定性增强，与HIF-1β形成二聚体后，结合于相关基因的HRE，启动下游基因的转录。在我们前期的研究中已经通过5个拷贝的HRE在转录水平实现了对治疗基因NT-3的缺血/低氧靶向调控表达，但是在常氧条件下5HRE还是会启动下游基因的表达，尽管表达量很少。这就需要联合转录后和翻译后水平的低氧靶向调控，以降低或者消除转录水平低氧靶向调控遗漏的基因表达。
在转录后水平可以通过低氧相关基因5'-端或3'-端一段非翻译区(untranslatedregions，UTR)控制mRNA的稳定性来调节基因的转录后水平(图1)。在常氧条件下含有Epo3'-的UTR的mRNA的不稳定，迅速被降解；而在低氧条件下 Epo 3'-端UTR可以增强mRNA的稳定性，进而使相关基因表达增多。
在翻译后水平主要通过针对蛋白的稳定性来进行调节，在此过程中HIF-1α中部的氧依赖的降解(oxygen-dependent degradation，ODD)结构域起着重要作用(图1)。在低氧条件下，在常氧条件下，含有ODD结构域的融合蛋白稳定性差，会迅速被降解；而在低氧条件下，含有ODD结构域的融合蛋白的稳定性增强，进而使其维持在一定的表达水平。因此，在低氧靶向性调控表达过程中，UTR 和ODD结构域可以降低或消除转录水平低氧靶向调控遗漏的蛋白表达，可以进一步增强对治疗基因的低氧靶向调控。
【发明内容】
本发明的目的是提供翻译后水平低氧调控基因、应用及其调控方法，以解决 ODD从翻译后蛋白的稳定性对基因表达进行调控问题。
本发明采用以下技术方案：翻译后水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。
翻译后水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因的表达。
一种翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，由以下步骤组成：
用所述低氧调控基因构建重组质粒；
将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中；
控制环境中氧气含量，使得环境中氧气含量在小于1.5％，所述低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。
进一步地，所述重组质粒为pLNCX载体重组质粒。
进一步地，在获得有人ODD基因的重组质粒时，将连接反应体系转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人ODD基因的重组质粒 pT-ODD。
进一步地，环境中氧气含量在为0.3％。
本发明的有益效果是：本发明可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
【附图说明】
图1为本发明的基因表达翻译后低氧靶向调节示意图；
图2为本发明中质粒pT-NT3的酶切和PCR鉴定结果；
图3为本发明实施例1反转录PCR和westernblot分别检测NT-3mRNA和蛋白的表达情况。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了翻译后水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。
SEQ ID NO：1：
aagcttggtgatgtccatcttgttttatgtgatatttctcgcttatctccgtggcatccaaggtaacaacatggatcaaagg agtttgccagaagactcgctcaattccctcattattaagctgatccaggcagatattttgaaaaacaagctctccaagcagatg gtggacgttaaggaaaattaccagagcaccctgcccaaagctgaggctccccgagagccggagcggggagggcccgc caagtcagcattccagccggtgattgcaatggacaccgaactgctgcgacaacagagacgctacaactcaccgcgggtcc tgctgagcgacagcacccccttggagcccccgcccttgtatctcatggaggattacgtgggcagccccgtggtggcgaac agaacatcacggcggaaacggtacgcggagcataagagtcaccgaggggagtactcggtatgtgacagtgagagtctgt gggtgaccgacaagtcatcggccatcgacattcggggacaccaggtcacggtgctgggggagatcaaaacgggcaactc tcccgtcaaacaatatttttatgaaacgcgatgtaaggaagccaggccggtcaaaaacggttgcaggggtattgatgataaa cactggaactctcagtgcaaaacatcccaaacctacgtccgagcactgacttcagagaacaataaactcgtgggctggcgg tggatacggatagacacgtcctgtgtgtgtgccttgtcgagaaaaatcggaagaacatggattgaattcgccccagccgctg gagacacaatcatatctttagattttggcagcaacgacacagaaactgatgaccagcaacttgaggaagtaccattatataat gatgtaatgctcccctcacccaacgaaaaattacagaatataaatttggcaatgtctccattacccaccgctgaaacgccaaa gccacttcgaagtagtgctgaccctgcactcaatcaagaagttgcattaaaattagaaccaaatccagagtcactggaactttc ttttaccatgccccagattcaggatcagacacctagtccttccgatggaagcactagacaaagttcacctgagcctaatagtcc cagtgaatattgtttttatgtggatagtgatatggtcaatgaattcaagttggaattggtagaaaaactttttgctgaagacacag aagcaaagaacccattttctactcaggacacagatttagacttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttcca gttacgttccttcgatcagttgtcaccattagaaagcagttccgcaagccctgaaagcgcaagtcctcaaagcacagttacag tattccagtgaatcgat
本发明公开的翻译后水平低氧调控基因用于低氧靶向调控治疗基因的表达。
本发明还公开了一种采用翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，由以下步骤组成：
用所述低氧调控基因构建重组质粒；
将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中；
控制环境中氧气含量，使得环境中氧气含量在小于1.5％，所述低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。
实施例1
载体质粒的构建方法如下：
步骤1：扩增NT-3全长序列，将NT-3片段连接于pMD18-T载体上，抽提出携带有人NT-3基因的重组质粒pT-NT3，对重组质粒pT-NT3进行鉴定，筛选出含有完全正确序列的人NT-3基因的克隆；
其中，扩增NT-3全长序列利用Chelex-100从人外周血中抽提人基因组DNA 作为模板，根据GeneBank中人NT-3序列(NM_002527)设计NT-3上、下游引物，如下：
Forward primer：5'GGC AAGCTT GGTG ATGTCCATCTTC3'
Reverse primer：5'GCG CAATTG AAT TCATGTTCTTCCG3'
在上、下游引物中分别插入酶切位点HindIII、Hpa I进行扩展，进行PCR 扩增反应后，用凝胶回收试剂盒，将NT-3片段回收、纯化、连接于pMD18-T载体，将连接反应体系转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人NT-3基因的重组质粒pT-NT3。
利用对NT-3基因的PCR扩增和HindIII/Hpa I的双酶切对重组质粒pT-NT3 进行初步鉴定，再筛选出可能的阳性克隆进行测序鉴定，进而筛选出含有完全正确序列的人NT-3基因的克隆，如图2所示，Lane 1：DNA marker DL2000，Lane 2：质粒pT-NT3，Lane 3：HindIII/Hpa I双酶切，Lane 4：pT-NT3为模板进行 NT-3PCR扩增产物。
其中，NT-3信息如下：
Homo sapiens neurotrophin 3,GenBank:BC069773.1
CDS 84..857＝774bp
1 tgccagaata acacagactc agctgccaga gcctgctctt aacacctgtg tttccttttc
61 agatcttaca ggtgaacaag gtgatgtcca tcttgtttta tgtgatattt ctcgcttatc
121 tccgtggcat ccaaggtaac aacatggatc aaaggagttt gccagaagac tcgctcaatt
181 ccctcattat taagctgatc caggcagatattttgaaaaa caagctctcc aagcagatgg
241 tggacgttaa ggaaaattac cagagcaccc tgcccaaagc tgaggctccc cgagagccgg
301 agcggggagg gcccgccaag tcagcattcc agccggtgat tgcaatggac accgaactgc
361 tgcgacaaca gagacgctac aactcaccgc gggtcctgct gagcgacagc acccccttgg
421 agcccccgcc cttgtatctc atggaggatt acgtgggcag ccccgtggtg gcgaacagaa
481 catcacggcg gaaacggtac gcggagcata agagtcaccg aggggagtac tcggtatgtg
541 acagtgagag tctgtgggtg accgacaagt catcggccat cgacattcgg ggacaccagg
601 tcacggtgct gggggagatc aaaacgggca actctcccgt caaacaatat ttttatgaaa
661 cgcgatgtaa ggaagccagg ccggtcaaaa acggttgcag gggtattgat gataaacact
721 ggaactctca gtgcaaaacatcccaaacct acgtccgagc actgacttca gagaacaata
781 aactcgtggg ctggcggtgg atacggatag acacgtcctg tgtgtgtgcc ttgtcgagaa
841 aaatcggaag aacatgaatt ggcatctctc cccatatata aattattact ttaaattata
901 tgatatgcat gtagcatata aatgtttata ttgtttttat atattataag ttgaccttta
961 tttattaaac ttcagcaacc ctacagtatataagcttttt tctcaataaa atcagtgtgc
1021 ttgccttc
由于NT-3序列后方有一段ODD来调控，所以NT-3的终止密码子(tga)取消，置于ODD的后方。
治疗基因NT-3表达后的信息如下：
Neurotrophin 3(人源)
长度：257aa，GenBank:AAH69773.1。
氨基酸序列：
1 MSILFYVIFL AYLRGIQGNN MDQRSLPEDS LNSLIIKLIQ ADILKNKLSK QMVDVKENYQ
61 STLPKAEAPR EPERGGPAKS AFQPVIAMDT ELLRQQRRYN SPRVLLSDST PLEPPPLYLM
121 EDYVGSPVVA NRTSRRKRYA EHKSHRGEYS VCDSESLWVT DKSSAIDIRG HQVTVLGEIK
181 TGNSPVKQYF YETRCKEARP VKNGCRGIDD KHWNSQCKTS QTYVRALTSE NNKLVGWRWI
241 RIDTSCVCAL SRKIGRT。
步骤2：将pT-NT3和pLNCX分别进行双酶切反应，回收酶切产物，再用 T4DNA连接酶将NT3片段插入pLNCX中，获得重组逆转录病毒质粒pLNC-NT3；
步骤3：人来源HIF-1αODD基因的克隆和鉴定
用Trizol抽提法，从HEK293细胞中抽提的总RNA进行反转录PCR后，获得cDNA作为模板，根据GeneBank中人HIF-1α的序列(AF208487.1)设计ODD 片段上、下游引物(在上、下游引物中分别插入酶切位点Hpa I、Cla I，扩增ODD (片段1211-1819)序列，序列如下：
Forward primer：5'GC GTTAAC GCCCAGCCGCTGGAGAC3'
Reverse primer：5'GC ATCGAT TCA CTGGAATACTGTAAC3'
进行PCR扩增反应后，用凝胶回收试剂盒，将ODD片段回收、纯化、连接于pMD18-T载体，将连接反应体系转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人ODD基因的重组质粒pT-ODD。
利用对ODD基因的PCR扩增和Hpa I/ClaI的双酶切对重组质粒pT-ODD进行初步鉴定，再筛选出可能的阳性克隆进行测序鉴定，进而筛选出含有完全正确序列的人ODD基因的克隆。如图3所示，Lane 1：质粒pT-ODD，Lane 2：Hpa I/Cla I双酶切，Lane 3：pT-ODD为模板进行ODD PCR扩增产物，Lane 4：DNA marker DL2000。
其中，ODD信息如下：
人来源HIF-1α，GenBank:AF208487.1，ODD：1211-1819。由于ODD为NT-3 序列后方的一段调控序列，所以NT-3的终止密码子取消，置于ODD的后方，终止密码子为tga。
1201 aactttgctg gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttggcagcaacga
1261 cacagaaact gatgaccagc aacttgagga agtaccattatataatgatg taatgctccc
1321 ctcacccaac gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattacccaccgctga
1381 aacgccaaag ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaagttgcattaaa
1441 attagaacca aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccagattcaggatca
1501 gacacctagt ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagcctaatagtcccag
1561 tgaatattgtttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaattcaagttgg aattggtaga
1621 aaaacttttt gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattttctactcagg acacagattt
1681 agacttggag atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagttacgttcctt
1741 cgatcagttg tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaagtcctcaaag
1801 cacagttaca gtattccag
步骤4：将pT-ODD和pLNC-NT3分别进行HpaI/Cla I双酶切反应，并回收酶切产物，再用T4DNA连接酶将ODD片段插入pLNC-NT3中，获得重组逆转录病毒质粒pLNC-NT3-ODD，通过PCR、酶切和测序鉴定。
将各质粒用脂质体Lipofectamine 2000转染入PC12细胞中，然后在缺氧条件下处理。将培养瓶置于已经预工作的厌氧工作站(BUGBOX)中，37℃孵育相应时间点24h后取出进行下一步实验。
厌氧工作站中气体含量分别为：5％CO2，0.3％O2和94.7％N2，在孵育期间用氧气检测仪(CY-100B)持续监测氧气含量，使其维持在0.3％水平。
结果：
反转录PCR和westernblot分别检测NT-3mRNA和蛋白的表达情况，如图3 所示，反转录PCR(A)和Western blot法(B)检测PC12-NT3(lane 1)和 PC12-NT3-ODD(lane 2)细胞中NT-3的mRNA和蛋白表达情况。
反转录PCR结果显示，与PC12-NT3组相比，无论是在常氧还是缺氧条件下， PC12-NT3-ODD组中NT-3mRNA表达量均无显著性差异；而且在 PC12-NT3-ODD组中，与常氧条件下相比较，在缺氧条件下，细胞内NT-3mRNA 表达量也无显著性差异，说明ODD对NT-3mRNA表达无影响。Westernblot结果显示，在常氧条件下，PC12-NT3-ODD组中NT-3蛋白表达量明显低于 PC12-NT3组，有显著性差异(P＜0.05)；而且在PC12-NT3-ODD组中，与常氧条件下相比较，在缺氧条件下细胞内中NT-3mRNA表达量明显升高，有显著性差异(P＜0.05)；但在PC12-NT3组中，与常氧条件下相比较，在缺氧缺氧条件下细胞内NT-3蛋白表达量无显著性差异。以上结果提示，在不影响NT-3mRNA 表达的情况下，在常氧条件下，ODD可以下调NT-3的表达，而在低氧条件下， ODD可以上调NT-3的表达。
序列表
<110> 西安医学院
<120> 翻译后水平低氧调控基因、应用及其调控方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1411
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
aagcttggtg atgtccatct tgttttatgt gatatttctc gcttatctcc gtggcatcca 60
aggtaacaac atggatcaaa ggagtttgcc agaagactcg ctcaattccc tcattattaa 120
gctgatccag gcagatattt tgaaaaacaa gctctccaag cagatggtgg acgttaagga 180
aaattaccag agcaccctgc ccaaagctga ggctccccga gagccggagc ggggagggcc 240
cgccaagtca gcattccagc cggtgattgc aatggacacc gaactgctgc gacaacagag 300
acgctacaac tcaccgcggg tcctgctgag cgacagcacc cccttggagc ccccgccctt 360
gtatctcatg gaggattacg tgggcagccc cgtggtggcg aacagaacat cacggcggaa 420
acggtacgcg gagcataaga gtcaccgagg ggagtactcg gtatgtgaca gtgagagtct 480
gtgggtgacc gacaagtcat cggccatcga cattcgggga caccaggtca cggtgctggg 540
ggagatcaaa acgggcaact ctcccgtcaa acaatatttt tatgaaacgc gatgtaagga 600
agccaggccg gtcaaaaacg gttgcagggg tattgatgat aaacactgga actctcagtg 660
caaaacatcc caaacctacg tccgagcact gacttcagag aacaataaac tcgtgggctg 720
gcggtggata cggatagaca cgtcctgtgt gtgtgccttg tcgagaaaaa tcggaagaac 780
atggattgaa ttcgccccag ccgctggaga cacaatcata tctttagatt ttggcagcaa 840
cgacacagaa actgatgacc agcaacttga ggaagtacca ttatataatg atgtaatgct 900
cccctcaccc aacgaaaaat tacagaatat aaatttggca atgtctccat tacccaccgc 960
tgaaacgcca aagccacttc gaagtagtgc tgaccctgca ctcaatcaag aagttgcatt 1020
aaaattagaa ccaaatccag agtcactgga actttctttt accatgcccc agattcagga 1080
tcagacacct agtccttccg atggaagcac tagacaaagt tcacctgagc ctaatagtcc 1140
cagtgaatat tgtttttatg tggatagtga tatggtcaat gaattcaagt tggaattggt 1200
agaaaaactt tttgctgaag acacagaagc aaagaaccca ttttctactc aggacacaga 1260
tttagacttg gagatgttag ctccctatat cccaatggat gatgacttcc agttacgttc 1320
cttcgatcag ttgtcaccat tagaaagcag ttccgcaagc cctgaaagcg caagtcctca 1380
aagcacagtt acagtattcc agtgaatcga t 1411

Claims (6)

1.翻译后水平低氧调控基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的翻译后水平低氧调控基因的用途，其特征在于，用于低氧靶向调控治疗基因的表达。
3.一种采用权利要求1的翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，其特征在于，由以下步骤组成：
用所述低氧调控基因构建重组质粒；
将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中；
控制环境中氧气含量，使得环境中氧气含量在小于1.5％，所述低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。
4.根据权利要求3所述的翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，其特征在于，所述重组质粒为pLNCX载体重组质粒。
5.根据权利要求4所述的翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，其特征在于，在获得有人ODD基因的重组质粒时，将连接反应体系转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人ODD基因的重组质粒pT-ODD。
6.根据权利要求3所述的翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，其特征在于，环境中氧气含量在为0.3％。
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Non-Patent Citations (2)

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Title
张军峰等: "缺氧特异性调控基因表达在缺血性卒中治疗中的研究进展", 《神经损伤与功能重建》 *
张军峰等: "缺氧调控表达的NT-3逆转录病毒载体的构建及鉴定", 《西安交通大学学报（医学版）》 *

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