CN101115839B - 通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法 - Google Patents

通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101115839B
CN101115839B CN2005800371903A CN200580037190A CN101115839B CN 101115839 B CN101115839 B CN 101115839B CN 2005800371903 A CN2005800371903 A CN 2005800371903A CN 200580037190 A CN200580037190 A CN 200580037190A CN 101115839 B CN101115839 B CN 101115839B
Authority
CN
China
Prior art keywords
decorin
leu
ser
pro
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2005800371903A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101115839A (zh
Inventor
杨梦甦
孔祥复
张雅鸥
郑思敏
张碧源
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN101115839A publication Critical patent/CN101115839A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101115839B publication Critical patent/CN101115839B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及通过直接施用重组的rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白来体外和/或体内抑制肝纤维发生的方法。在一个实施方案中，提供了介于核心蛋白聚糖(Decorin)和Fc铰链片段之间的接头，以形成融合蛋白，所述融合蛋白增加核心蛋白聚糖的生物学活性，并增加与TGF-β结合的能力，以及延长核心蛋白聚糖在血清中的寿命，其中Fc铰链片段是Fc的修饰形式，其包括用能延长核心蛋白聚糖-Fc蛋白寿命50％的10个不同的氨基酸替换4个N-末端氨基酸。

Description

通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法
发明领域
本发明涉及通过施用肝星形细胞活化和成纤维细胞活化的拮抗剂来抑制纤维发生(尤其是肝纤维发生)的方法。本发明还涉及制备融合蛋白构建体和生产融合蛋白。
发明背景
关于肝纤维化，纤维化在结构改造的最终共有途径中起着整体性的作用，所述结构改造减少了损伤后的正常器官功能。它是针对发育或炎症疾病的最具根本破坏性和最不需要的应答中的一种，而且在暴露于高氧压后的数百万的处于许多不同疾病进程的晚期阶段的个体中被观察到，所述疾病包括诸如囊性纤维化、间质性肾炎、肝硬化和肺纤维化。肝纤维化的特征在于肝中的细胞外基质组分的过量沉积。如S.L.Friedman在题为“Molecular Regulation of HepaticFibrosis，an Integrated Cellular Response to Tissue Injury，”J Biol Chem 2000；275：2247-2250的文章中所述，有几种肝细胞类型参与基质沉积，主要类型是如B.Tuchweber等在题为“Proliferation and Phenotypic Modulation of PortalFibroblasts in the Early Stages of Cholestatic Fibrosis in the Rat，”Lab Invest 1996；74：265-278的文章所述的肝星形细胞(HSC)和门成纤维细胞。在过去的10年间，已有大量注意力关注于造成肝中的纤维发生细胞活化的刺激物。如以上Friedman之文章说述，主要焦点是在生长因子和氧化剂应激上。
纤维发生经典地是由器官成纤维细胞介导的，所述细胞表达足量的I和III型胶原蛋白。肝中纤维发生的表达已是以前几年详尽研究的主题。该过程的细胞因子调节是复杂的。一般认为I和III型胶原蛋白是主要的纤维变性胶原蛋白，而且它们由肝星形细胞(HSC)和成纤维细胞良好地表达。这些胶原蛋白的表达由细胞因子复合物调节。例如，肿瘤坏死因子β1(TGFβ1)在刺激过程中是早期而且关键的组分。一般认为，在肺、肝和肾中TGFβ1是针对这些胶原蛋白基因的调节分子。(Wahhl，S.M.，1992 J.Clin.Immunol.12：61-74；Sharma，K.和Ziyadeh，F.N.，1993 Seminars in Nephrology 13：116-128；Roberts等，1986 Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 83：4167-4171。)
最重要的肝纤维化硬化的成因是慢性乙型和丙型肝炎的感染和长期酗酒。肝硬化是肝纤维化的临床终点。直到目前，没有可用的回复肝硬化的有效方法，而那些受到威胁到生命的肝功能损伤的人只能指望肝移植来抢救。可是，每年新硬化病例的数目为可用于移植的肝的数目5至10倍。所以，防止纤维发生和早期治疗纤维化是硬化的最佳疗法(Achord JL.1991，Compr Ther.17：57-64，Habib等，2001，Postgrad Med.109：101-13)。抑制纤维发生的策略可以分成如下几组：(a)抗炎剂和抗氧化剂；(b)细胞因子或细胞因子受体的拮抗剂；(c)星形细胞活化的抑制剂；和(d)抗胶原蛋白剂(D.Montgomery Bissell，2001，EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE，Vol.33：179-190)。可是，这些试剂中的大部分在治疗纤维化中并不是很有效或者有严重的副作用。
因此需要开发新的用于抑制肝纤维发生和治疗肝纤维化的方法。
其他背景有，如美国专利5,824,655所述，核心蛋白聚糖已被用于通过利用基因治疗来限制TGF-β活性。另外，如美国专利6,436,900所述，核心蛋白聚糖已被用于治疗病理学。可是，后一个专利没有讨论肝疾病的治疗。核心蛋白聚糖是小的富含亮氨酸的多功能蛋白聚糖，而且它由核心蛋白和共价连接的糖胺聚糖链组成。人的核心蛋白聚糖核心蛋白质的大小和分子量是359个氨基酸；39746Da，猪的是360个氨基酸。该分子的原始功能涉及原纤维形成。核心蛋白聚糖体内结合I、II和IV型胶原蛋白并促进具有增加的稳定性并改变了溶解度的纤维形成。(Krusius和Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7683-7687(1986)；Day等，Biochem.J.，248：801-805(1987)；Pearson等，J.Biol.Chem.，258：15101-15104(1983)；Vogel等，Biochem.J.223：587-597(1984)。)
有证据显示，核心蛋白聚糖在细胞生长调控中起着作用。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中核心蛋白聚糖的表达已经被证明会导致降低的生长速率、降低的饱和密度和改变的形态学(Yamaguichi和Ruoslahti.Nature 336：244-246(1988))。核心蛋白聚糖的这些生长抑制性质包括(a)在静止期核心蛋白聚糖的表达显著地提高；(b)活跃增殖的或经转化的细胞很少表达核心蛋白聚糖；(c)通过病毒转化能消除核心蛋白聚糖表达；和(d)在各种致瘤的细胞系和肿瘤组织中通过其控制区的甲基化而抑制核心蛋白聚糖的基因转录(Iozzo，等Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.32：141-174(1997))。核心蛋白聚糖通过结合EGFR的离散的区域而抑制肿瘤细胞生长，从而导致产生能抑制EGFR功能并活化EGF受体/MAP激酶/p21轴的蛋白质模拟物。(Moscatello等.J.Clin Invest.15；101(2)：406-12.(1998)；Santra等，J Biol Chem 20；277：35671-81(2002))核心蛋白聚糖也通过抑制肿瘤细胞介导的血管发生抑制肿瘤生长(Grant等，Oncogene21：4765-77(2002))。
据报道，核心蛋白聚糖通过干扰转化生长因子-β(TGF-β)——纤维发生的主要刺激物的生物活性来减少纤维发生。TGF-β不仅调节作为对组织损伤的正常应答部分的细胞外基质(ECM)积聚和沉积ECM，而且调节病理上的纤维化。TGF-β体内稳态的改变对于多种组织的纤维化疾病是重要的(Wells RG.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol.279：G845-50.(2000))。作为TGF-β抑制剂，核心蛋白聚糖通过其蛋白质部分特异结合并中和TGF-β配体以以剂量依赖的方式体外干扰TGF-β生物活性。在体内，TGF-β的超表达导致显著的肺纤维化，其可通过伴随的核心蛋白聚糖超表达而显著降低(Yamaguchi等，Nature 346：281-284，(1990)；Kolb等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.280：L1327-34(2001))。
核心蛋白聚糖参与细胞凋亡的调节。已发现，核心蛋白聚糖减少在胶原蛋白网格中培养的内皮细胞的细胞凋亡(Schonherr等，Eur J Cell Biol.78：44-55(1999))。核心蛋白聚糖在EC中作为信号传导分子并通过Akt依赖性和非依赖性途径影响细胞的存活(Schonherr等，Ann N Y Acad Sci.973：149-52(2002))。
在扩大生物活性的努力中，Fc融合蛋白已经得到关注。已注意到，重组蛋白是正出现的一类治疗剂。一种这类修饰是使用免疫球蛋白Fc区制备融合蛋白。抗体包含两个功能独立的部分，即被称作“Fab”的可变结构域，其结合抗原，和被称作“Fc”的恒定结构域，其提供了与诸如补体或吞噬细胞的效应子功能的连接。免疫球蛋白的Fc部分具有长的血浆半衰期，而Fab是短命的。(Capon，等.，Nature 337：525-531(1989))Fc融合蛋白应保持亲本蛋白的生物活性并具有比其亲本更长的半衰期，这是因为IgG能循环几天(WO99/25044)。
注意到，美国专利6,277,375提及突变的Fc片段来延长生物半衰期，美国专利6,660,843也一样。可是，这些专利都没有将Fc片段应用于核心蛋白聚糖上。
发明概述
通过研究对与TGFβ1所诱发的肝星形细胞活化和肝纤维化相关的纤维变性条件的拮抗作用，已经发现特定配制的核心蛋白聚糖融合蛋白通过更有效地抑制肝纤维发生来提高肝纤维化的弱化。在该蛋白质中，用肽接头将修饰的Fc片段加到rh核心蛋白聚糖上。发现产生的蛋白质能更有效地治疗肝纤维化并具有延长了50％的生物半衰期。
更具体地，发现修饰的核心蛋白聚糖拮抗剂防止肝纤维化的发展，尤其在病毒性肝炎病程中，如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。
在一个实施方案中，rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白包含rh核心蛋白聚糖、肽接头和修饰的人IgG Fc片段或结构域(表示为IgG1Fc)。也发现，优选使用长度为约20或更少的氨基酸的柔性肽接头，而且柔性肽接头含两个或更多的选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。IgG Fc变体具有非裂解特性，其带有通过用10个新的氨基酸替代通常使用的4个氨基酸而制成的修饰的Fc片段。因为使用了修饰的Fc片段和肽接头，所以发现rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的生物学半衰期比单独使用核心蛋白聚糖的长50％。
在本发明的另一个实施方案中，公开了用于从诸如Cos-7细胞系的哺乳动物细胞系制备或生产主题重组融合蛋白的方法。
如所观察到的，rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白特征在于并显示出相对于rh核心蛋白聚糖增强的生物学活性并延长了血清半衰期而无不希望的副作用，从而导致改善的药物代谢动力学和药物动力学。因此，只需要更低的剂量和更少的注射就能获得相似的功效。
总之，本发明涉及通过直接施用重组的rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白来体外和/或体内抑制肝纤维发生的方法。在一个实施方案中，在核心蛋白聚糖和Fc铰链片段之间提供接头以形成融合蛋白，所述融合蛋白增加了核心蛋白聚糖的生物学活性，并增加了结合TGF-β的能力，并延长了核心蛋白聚糖在血清中的寿命，其中Fc铰链片段是修饰的Fc形式，其包括用10个不同的氨基酸替代4个N-末端氨基酸，所述替代将核心蛋白聚糖-Fc蛋白的寿命延长50％。
附图简述
本发明的这些和其它特征将结合详细说明、结合附图来更好地理解，其中：
图1A和1B显示了在用CCl.sub.4(四氯化碳)处理8周(苏木精和曙红(HE)染色)后核心蛋白聚糖处理对肝纤维化的作用，其中图1A显示了对单独用CCl.sub.4处理的大鼠的作用，而图1B显示了对用CCl.sub.4和rh核心蛋白聚糖处理的大鼠的作用。(X100)；
图2A和2B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGFβ1诱发的肝星形细胞增殖的作用，其中LX-2细胞(人HSC细胞系)单独地或在2ng/mlTGFβ1存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc 48小时，而且其中通过测量染料3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-2，5二苯基四唑(MTT)的减少来评估细胞数目，其中图2A显示了rh核心蛋白聚糖对由TGFβ1诱发的LX-2细胞增殖的作用((C；对照；D：rh核心蛋白聚糖(4ug/ml)；T：TGFβ1(2ng/ml)；T+D：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4μg/ml))。(*指对照对TGFβ1 p＜0.05；#指TGFβ1对TGFβ1加rh核心蛋白聚糖p＜0.05。N＝4)，而且其中图2B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGFβ1诱发的LX-2细胞增殖的作用((C；对照；T：TGFβ1(2ng/ml)；D-Fc：rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml)；T+D-Fc：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml))。(**指对照对TGFβ1p＜0.01；#指TGFβ1对TGFβ1加rh核心蛋白聚糖p＜0.05。N＝4)；
图3A和3B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处理对用TGFβ1刺激的HSC细胞的MMP-2(基质金属蛋白酶-2)mRNA水平的作用，图3A和3B中用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc单独地或在2ng/ml TGFβ1存在的情况下处理LX-2细胞24小时，收获细胞用于总RNA提取，进行RT-PCR以检测rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGFβ1刺激的LX-2细胞的MMP-2mRNA水平的作用，而且其中将GADPH用作为对照，图3A显示了rh核心蛋白聚糖处理对MMP-2的作用，而图3B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc处理对MMP-2的作用((C；对照；D：rh核心蛋白聚糖；T：TGFβ1(2ng/ml)；D+T：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4μg/ml)；D-Fc：rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml)；T+D-Fc：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml))。
图4A和4B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处理对用TGFβ1刺激的HSC细胞的TIMP-1(基质金属蛋白酶组织抑制剂-1)mRNA水平的作用，其中在图4A和4B中，LX-2细胞分别用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc单独地或在2ng/ml TGFβ1存在的情况下处理24小时，其中收获rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处理过的细胞用于总RNA提取，其中进行RT-PCR以检测rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGF-β刺激的LX-2细胞的TIMP-1mRNA水平的作用，其中将GADPH用作对照，图4A显示了rh核心蛋白聚糖处理对TIMP-1的作用，而图4B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc处理对TIMP-1的作用。((C；对照；D：rh核心蛋白聚糖；T：TGFβ1(2ng/ml)；D+T：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4μg/ml)；D-Fc：rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml)；T+D-Fc：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml).)；
图5A和5B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处理对用TGFβ1刺激的HSC细胞的胶原蛋白III蛋白水平的作用，其中LX-2细胞用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc在2ng/ml TGFβ1存在的情况下处理24小时，而且收获培养基，图5A显示，进行蛋白印迹以评估rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGFβ1刺激的LX-2细胞的胶原蛋白III蛋白水平的作用，而图5B显示了定量结果。T：TGFβ1(2ng/ml)；T+D：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4μg/ml)；T+D-Fc：TGFβ1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1μg/ml)。T+Fc：TGFβ1(2ng/ml)加Fc(1μg/ml))。
图6显示了rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白构建体，其包括1：核心蛋白聚糖；2：接头；3：免疫球蛋白Fc片段；4：二硫键。
图7A和7B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc核酸分子的蛋白表达，其中用rh核心蛋白聚糖-Fc重组质粒转染Cos-7，用G418(0.6mg/ml)筛选，其中收集培养基用于蛋白印迹，而且其中将核心蛋白聚糖重组质粒用作对照，图7A显示了抗-IgG Fc，而图7B显示了抗人核心蛋白聚糖抗体，其与用于检测rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的HRP缀合，其中对于图7A，M：标记；泳道1-3：转染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和载体的细胞的培养基。泳道4：来自Sigma的核心蛋白聚糖对照，而且其中对于图7B，M：标记；泳道1-3：转染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和载体的细胞的细胞溶解产物，泳道4-6：转染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和载体的细胞的培养基，泳道7：来自Sigma的核心蛋白聚糖对照；和
图8A和8B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc寿命的50％延长，其中用rh核心蛋白聚糖-Fc重组质粒转染Cos-7，并且其中收集培养基并于37℃温育从0天到5天的不同时间，其中将rh核心蛋白聚糖用作对照，并且其中用蛋白印迹来测定rh核心蛋白聚糖的稳定性，其中对于图8A的泳道1、3、5、7、9和11：于37℃温育核心蛋白聚糖0、1、2、3、4和5天。泳道2、4、6、8、10和12：于37℃温育核心蛋白聚糖-Fc 0、1、2、3、4和5天，而且其中图8B显示了蛋白印迹的定量。
详细说明
1.rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对纤维化(尤其是肝纤维化)的 作用
首先研究rh核心蛋白聚糖对四氯化碳(CCl4)诱发的大鼠肝纤维化的作用。如图1A中所示，与对照相比，用CCl4处理8周诱发出了显著的纤维化，形成了缺少中央静脉的小结并消失了肝小叶的正常结构。如图2B中所示，最初用CCl4处理后2周，在余下的6周将rh核心蛋白聚糖与CCl4一起注射。如所观察到的，加入rh核心蛋白聚糖显著减少了纤维发生的病理学改变。
也研究了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGF-β诱发的肝星形细胞(HSC)活化的作用。HSC活化是肝纤维发生的基本过程。纤维发生呈现为HSC的增殖和细胞外基质的改造，包括，肝细胞基底膜中的胶原蛋白IV的降解和过量细胞外基质组分(如胶原蛋白I和胶原蛋白III)在肝中的沉积。在该过程中，基质金属蛋白酶2(MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)的表达在mRNA水平被上调。胶原蛋白IV是MMP-2的底物。TIMP-1是MMP-1的抑制剂，其能清除胶原蛋白I和III的沉积。发现rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc通过抑制细胞增殖、胶原蛋白III产生和由TGF-β刺激的MMP-2和TIMP-1表达，来消除TGF-β对肝星形细胞的作用。
根据这些结果并考虑到rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc有非常好的安全特征的事实，可将rh核心蛋白聚糖-Fc用作抗肝纤维发生的药物。
肝纤维发生是活跃的过程，其导致肝中过量的细胞外基质组分的沉积。其已在许多状况下观察到，如慢性乙型和丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、药物诱发的肝病、血色素沉着症、自身免疫性肝炎、Wilson病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、肝血吸虫病等。纤维发生可在其它器官中类似地发生，如肺、肾、胰、心和皮肤。
本发明尤其有助于治疗肝纤维化。“肝纤维化”是肝中的细胞外基质组分已确定的过量沉积。其终点是肝硬化。
在本发明优选的实施方案中，rh核心蛋白聚糖-Fc用于防止肝纤维化的发展，所述肝纤维化可在已感染了肝炎病毒(如乙型肝炎病毒(HBV)、或丙型肝炎病毒(HCV))的患者中发生。
更具体地，慢性病毒性肝炎尤其是针对乙型慢性肝炎和丙型慢性肝炎。
术语“需要该治疗的患者”指的是任何患有器官疾病的人受试者或哺乳动物，包括绵羊、牛、狗、猫、啮齿类动物、兔或山羊，在所述疾病中观察到了纤维发生或通常由疾病发展导致纤维发生。
术语“治疗”和“防止”包括在任何现象发展阶段或在其发生前治疗和预防纤维发生。
本发明的目的尤其是防止、或减少或减轻患有器官疾病的患者的肝纤维化。
根据本发明，治疗有效量的rh核心蛋白聚糖-Fc的使用有效减少或防止肝纤维化发展。
2.rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的分子结构
本发明提供了用于防止纤维化的融合蛋白。本发明的融合蛋白和/或编码该融合蛋白的核酸可直接向需要用抗纤维化蛋白治疗的哺乳动物施用。
因而，本发明提供了融合蛋白，其包含本文中被称为核心蛋白聚糖的靶蛋白、人工接头和免疫球蛋白Fc区或片段。
因为二聚体构建体是优选的，所以主题融合蛋白特征为二聚体，其通过相邻亚基中半胱氨酸间的一对二硫键交联。在图6中，将二硫键描述为通过每个重链内的部分免疫球蛋白铰链区或片段将两个免疫球蛋白重链Fc区、片段或结构域连在一起，并因此具有该分子天然形式的特征。
应当理解，免疫球蛋白Fc区或片段包括至少一部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域(参见SEQ.ID.NO.1和2)。在本发明中，Fc区N-末端的核酸序列是轻微修饰的，从cctgtctccg ggtaaa至atcactagtg aattcgcggc cgctcgagtc tag(参见SEQ.ID.NO.3)。注意到，在Fc区或片段修饰中，用10个氨基酸ITSEFAAARV(参见SEQ.ID.NO.4)替代4个氨基酸SPGK。通过柔性接头将Fc区附着到核心蛋白聚糖的C-末端。
本文中所用的术语“多肽接头”被理解为指能将两个并不天然连在一起的蛋白质连在一起的肽序列。多肽接头优选包含多种氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸或这些氨基酸的组合。多肽接头优选包含一系列长度为约19个残基的甘氨酸和丝氨酸肽(参见SEQ.ID.NO.5和6)。可是，预计最佳的接头长度和氨基酸组成可由常规实验来确定。
本文中所用的重组分子具有构型X-Fc，其中X是靶分子。例如，免疫球蛋白Fc区可通过链间二硫键结合以产生图6中所示类型的构建体。
本文中所用的术语“核心蛋白聚糖”被理解为指全长核心蛋白聚糖(参见SEQ ID NO：7和8)。
实施例
实施例1
通过rh核心蛋白聚糖抑制大鼠的肝纤维发生
材料和方法，动物和实验设计
利用可接受的伦理指导方针来进行所有实验。该研究中使用重量为200-250g的雄性Wistar大鼠(北京医科大学)。动物能自由接近食物和饮用水。通过将CCl4与橄榄油混合来制备40％CCl4(Sigma)。通过以3ml/kg体重皮下注射给予40％CCl4，一周两次，进行8周，来诱发出肝损伤和纤维化。CCl4的对照动物仅接受橄榄油。
每天以20ug/kg/d体重的剂量腹膜内使用rh核心蛋白聚糖。从用核心蛋白聚糖转染的Cos-7细胞的培养基中提取rh核心蛋白聚糖。
这样，可区分3组，每组包括7只动物。组I：只有橄榄油；组II：40％CCl4；组III：40％CCl4加rh核心蛋白聚糖。在第三周开始rh核心蛋白聚糖治疗并持续6周。
在指定的时间点，处死动物。从几个叶中取肝样品并在液氮中冷冻。
也收集血清样品。
肝功能测试
在自动分析仪上进行常规肝功能血液测试，包括透明质酸糖胺多糖(hyaluronan)、IV型胶原酶、γGT和转氨酶。
纤维化评估
在用福尔马林固定的、石蜡包埋的、用苏木精和曙红(HE)染色的切片上进行纤维化评估。用图像分析系统获取图片。将来自一系列实验的所有样品同时染色。由高级病理学者判断肝纤维化沉积并用METAVIR等级分级，其将纤维化分级为F0(无纤维化)到F4(硬化)。METAVIR等级是广泛使用的等级，其具有极好的观测者间的可靠性。表1显示了结果。
统计学分析
表1中的统计学分析通过WILCOXON进行，在其他表和图中使用SPSS11.0软件通过ANOVA进行。
结果
用rh核心蛋白聚糖对CCl4-处理的大鼠进行处理造成纤维化的减少。在用CCl4处理8周并用rh核心蛋白聚糖处理6周后的大鼠组中，与用CCl4单独处理的相比，结果最显著(WILCOXON得出p＜0.01)。肝功能的生物化学测试如表2所示。
表1.用CCl4处理8周并用rh核心蛋白聚糖处理6周后的大鼠肝的病理学改变
Figure G05837190320070522D000101
表2.用CCl4处理8周并用rh核心蛋白聚糖处理6周后的肝功能测试
表2中的结果表示为平均值±1SD。
CCl4单独处理和CCl4加rh核心蛋白聚糖之间的大鼠肝功能血清生物化学测试的差异在统计学上是显著的。
N＝使用的动物数。
在肝纤维发生期间，由于有纤维组织广泛沉积，所以细胞外基质成分(如透明质酸(HA)、胶原蛋白VI(cIV)和许多它们的分解产物)的血清水平将由于改造和复发的瘢痕形成而增加。
血清丙氨酸和天冬氨酸转氨酶(ALT和AST)水平与纤维化并不良好相关。可是，具有记录的、持续正常ALT水平的患者，通常患有轻微程度的肝炎而没有或只有轻微阶段的纤维化。
肝损伤(尤其是慢性肝损伤)状况中发现了γ-GT的增加。注意到γ-GT与纤维化良好相关。
实施例2
rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc通过抑制HSC细胞活化来抑制纤 维发生
为了阐明纤维发生中rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc的作用，检查了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGF-β1刺激的HSC细胞活化的作用。HSC活化是肝纤维发生的基本过程。它呈现为HSC的增殖和细胞外基质的改造，包括，基底膜中的胶原蛋白IV的降解和过量细胞外基质组分(如胶原蛋白I和胶原蛋白III)的沉积，和MMP和TIMP表达的mRNA水平的改变。TGF-β1是该过程中最重要的活化因子之一。
材料和方法
细胞
本发明人使用确立的被称作LX-2的人HSC细胞系。这些细胞已进行充分表征，并显示出许多与HSC初级培养物的相似性。
rh核心蛋白聚糖
从人成纤维细胞系中克隆全长核心蛋白聚糖基因，然后将基因插入pCDNA3.1载体(Invitrogen)并将基因与聚(组氨酸)(poly(histadine))尾在C-末端重组，以用于纯化。用重组质粒转染Cos-7细胞。因为大多数核心蛋白聚糖被分泌入培养基，所以收集培养基并利用ProBond纯化系统(Invitrogen)进行核心蛋白聚糖纯化，其中用镍柱进行His-tag核心蛋白聚糖纯化。
rh核心蛋白聚糖-Fc
制备rh核心蛋白聚糖-Fc的方法如实施例3所述。
细胞增殖测定
将LX-2细胞(2000/孔)接种于96孔微量培养板中24小时。用补加有0.5％FBS的DMEM替代培养基并使细胞饥饿48小时。饥饿后，将培养基用补加了2％血清的DMEM培养基替代。然后加入试剂处理细胞并将LX-2细胞单独地或在2ng/ml TGFβ1存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc 48小时。通过测量染料3-(4，5-二甲基噻唑-2基)-2，5二苯基四唑(MTT)的减少来评估细胞数目。
基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP- 1)的mRNA水平
MMP-2是能降解胶原蛋白IV的酶，而TIMP-1通过抑制由基质金属蛋白酶的降解而增加纤维化沉积。通过培养的LX-2细胞测量rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对MMP-2和TIMP-1mRNA表达的作用。将2×105个LX-2细胞接种于6-孔细胞培养板24小时。然后用补加有0.5％FBS的DMEM替代培养基。使细胞饥饿24小时。饥饿后，将培养基用补加了2％血清的DMEM培养基替代。然后加入试剂处理细胞并将LX-2细胞单独地或在2ng/ml TGFβ1存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc 24小时。最后，收获细胞并用TRIZOL试剂(GIBCOL，MD，美国)裂解。然后根据厂商规程提取总RNA。进行RT-PCR。通过管家基因——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)，标准化MMP-2和TIPM-1的基因表达水平。
III型胶原蛋白蛋白水平的表达
过量细胞外基质组分(如胶原蛋白III)的沉积是纤维发生期间的病理学过程。通过培养的LX-2细胞测量rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc对胶原蛋白III表达的作用。将2×105个LX-2细胞接种于6-孔细胞培养板24小时。然后用补加有0.5％FBS的DMEM替代培养基并使细胞饥饿24小时。饥饿后，将培养基用补加了2％血清的DMEM培养基替代。然后加入试剂处理细胞并将LX-2细胞在2ng/ml TGFβ1存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc 48小时。收获培养基并进行蛋白印迹以评估rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGF-β1处理的LX-2细胞的胶原蛋白III水平的作用
结果
增殖
如图2所示，TGF-β1增加了LX-2细胞增殖。TGF-β1(2ng/ml)对LX-2的促有丝分裂作用被同时加入的rh核心蛋白聚糖(4ug/ml)或rh核心蛋白聚糖-Fc(1ug/ml)消除了。因为1ug/ml的rh核心蛋白聚糖-Fc能达到4ug/ml rh核心蛋白聚糖的同样效果，所以rh核心蛋白聚糖-Fc显示出增强的体外生物学活性，相对于核心蛋白聚糖为至少4倍。在不存在TGF-β1的情况下，rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc单独都不对细胞增殖具有显著的作用。
MMP-2和TIMP-1
如图3和4所示，TGF-β1(2ng/ml)提高了LX-2中的MMP-2和TIMP-1表达，而rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc抑制该提高。
III型胶原蛋白
图5显示了TGF-β1(2ng/ml)增加LX-2细胞培养基中III型胶原蛋白的蛋白水平，而rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc消除TGF-β1的作用。
实施例3
1.构建编码h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的基因
融合蛋白从几个DNA片段组装而成。为了获得编码前导肽和人核心蛋白聚糖成熟蛋白的基因，从人成纤维细胞中提取总RNA，并进行RT-PCR以克隆核心蛋白聚糖。表3显示了用于克隆h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的寡核苷酸序列。根据厂商说明书，将产生的长度为约1077bp的DNA片段直接插入定向TOPO克隆载体中，如pCDNA 3.1(Invetrogen)。通过DNA测序确证人核心蛋白聚糖基因序列。
利用从人淋巴细胞中制备的RNA和合适的5′和3′引物(表3)通过反转录和PCR来获得编码人IgG1的Fc区或片段(Fc.sub..gamma.1)的基因。产生的Fc.sub..gamma.1DNA片段含IgG1的铰链、CH2和CH3结构域的部分序列，将该片段直接插入pGEM-T Easy载体(Promaga)中。通过DNA测序确证Fc基因序列。
为了制备h核心蛋白聚糖-Fc.sub..gamma.1融合基因，用Not I从Fc质粒上切下Fc片段并通过琼脂糖凝胶电泳来纯化。用Not I在核心蛋白聚糖C-末端对核心蛋白聚糖质粒进行单个切割。然后将纯化的Fc片段插入核心蛋白聚糖质粒的切口以形成h核心蛋白聚糖-Fc.sub..gamma.1融合基因(图6)。融合基因包含核心蛋白聚糖、柔性肽接头和修饰的Fc.sub..gamma.1基因。
用以下方法修饰Fc片段：在RT-PCR期间通过3′引物从Fc片段的C-末端去除4个氨基酸。在Fc片段被插入核心蛋白聚糖质粒中的切口后，将来自pGEM-T Easy和pCDNA3.1载体并编码10个氨基酸的序列引入到Fc片段C-末端。终止密码子也被引入到Fc片段C-末端(参见SEQ ID Nos.3和4)。
表3
引物名称              序列
核心蛋白聚糖正向引物  5’CAC CAT GAA GGC CAC TAT CAT CCT C 3’
核心蛋白聚糖反向引物  5’CTT ATA GTT TCC GAG TTG AAT GGC 3’
IGG 1FC正向引物       5’ACT CAC ACA TGC CCA CCG T 3’
IGG 1FC反向引物       5’GAG AGG CTC TTC TGC GTG 3’
由pGEM-T Easy和pCDNA3.1载体提供的核心蛋白聚糖C-末段和Fc片段N-末端之间的序列形成了柔性肽接头。核心蛋白聚糖和Fc部分之间存在肽接头增加了核心蛋白聚糖结构域的灵活性。对于本发明，肽接头具有以下有益特征：它由长度为19的氨基酸组成，并包含2种或更多以下氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸(SEQ ID No.6)。
2.在转染的细胞系中表达融合蛋白
将重组pCDNA3.1表达载体质粒转染到哺乳动物宿主细胞系中，以获得hDecrin-Fc融合蛋白的表达。为了稳定的高水平的表达，优选的宿主细胞系是Cos-7。优选的转染方法是lipofectin法(Invitrogen)。转染后2天，将培养基用含0.6mg/ml的G418的生长培养基替换。通过抗人核心蛋白聚糖和Fc蛋白印迹测试抗选择药物的转染子的融合蛋白分泌(图7A和B)。产生高水平h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的孔被亚克隆。在Cos-7细胞中产生的重组h核心蛋白聚糖-Fc显示出与天然核心蛋白聚糖中发现的非常相似的糖胺聚糖模式。当在摩尔基础上与rHuEPO进行比较时，根据本发明表达并产生的h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白显示出增强的生物学活性。
3.体外生物学测定
在LX-2细胞中进行体外生物学测定以测试rh核心蛋白聚糖-Fc通过抑制HSC细胞活化而抑制纤维发生的作用(参见实施例2)。
4.体外稳定性研究
因为免疫球蛋白的Fc部分有长的半衰期，所以预计Fc融合蛋白能保持亲本蛋白的生物活性并比其亲本有更长的半衰期。通过以下方法进行rh核心蛋白聚糖-Fc的稳定性测定：收集转染了rh核心蛋白聚糖-Fc的Cos-7细胞的培养基并在37℃温育不同时间。将rh核心蛋白聚糖用作对照。用蛋白印迹测定rh核心蛋白聚糖-Fc和rh核心蛋白聚糖的稳定性。图8显示了，核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的降解率低于核心蛋白聚糖，其中50％的rh核心蛋白聚糖在5天后降解，而仅有25％的rh核心蛋白聚糖-Fc在5天后降解。
SEQ ID No.1
长度：660
类型：DNA
生物：智人(Homo sapiens)
序列：1
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc  60 ttccccccaa aacccaagga
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg  120 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca
actggtacgt ggacggcgtg       180 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac
gtaccgtgtg  240 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag  300
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag       360 ccccgagaac
cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag  420 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag       480 agcaatgggc agccggagaa caactacaag  accacgcctc
ccgtgctgga ctccgacggc 540 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc
600 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctca 660
SEQ ID No.2
长度：220
类型：PRO
生物：智人(Homo sapiens)
序列：2
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1         5           10           15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
      20            25           30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
    35           40           45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
  50          55           60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65           70           75          80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
         85          90           95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
      100           105          110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
     115          120           125
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
  130           135          140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145          150          155           160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
         165          170           175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
      180           185          190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
     195         200          205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    210          215          220
SEQ ID No.3
长度：33
类型：DNA
生物：人工的接头
序列：3
atcactagtg aattcgcggc cgctcgagtc tag         33
SEQ ID No.4
长度：10
类型：PRO
生物：人工的
序列：4
Ile Thr Ser Glu Phe Ala Ala Ala Arg Val
1          5            10
SEQ ID No.5
长度：57
类型：DNA
生物：人工的
序列：5
aagggtcaag acaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgcgggaa ttcgatt    57
SEQ ID No.6
长度：19
类型：PRO
生物：人工的
序列：6
Lys Gly Gln Asp Asn Ser Ala Asp Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Gly
1        5           10           15
Asn Ser Ile
SEQ ID No.7
长度：1077
类型：DNA
生物：智人(Homo sapiens)
序列：7
atgaaggcca ctatcatcct ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa  60  cagagaggct tatttgactt
tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt  120  cctgatgacc gcgacttcga gccctcccta ggcccagtgt
gccccttccg ctgtcaatgc  180  catcttcgag tggtccagtg ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc
240  cctgacacaa  ctctgctaga  cctgcaaaac  aacaaaataa  ccgaaatcaa  agatggagac  300  tttaagaacc
tgaagaacct tcacgcattg attcttgtca acaataaaat tagcaaagtt  360  agtcctggag catttacacc tttggtgaag
ttggaacgac tttatctgtc caagaatcag  420  ctgaaggaat tgccagaaaa aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc
ccatgagaat  480  gagatcacca aagtgcgaaa agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa    540
ctgggcacca atccgctgaa gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag  600  aagctctcct acatccgcat
tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct  660  ccttccctta cggaattaca tcttgatggc aacaaaatca
gcagagttga tgcagctagc  720  ctgaaaggac tgaataattt ggctaagttg ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt
780  gacaatggct  ctctggccaa cacgcctcat  ctgagggagc ttcacttgga  caacaacaag    840  cttaccagag
tacctggtgg gctggcagag cataagtaca tccaggttgt ctaccttcat  900  aacaacaata tctctgtagt tggatcaagt
gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa  960  aaggcttctt attcgggtgt gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg
ggagatacag 1020 ccatccacct tcagatgtgt ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataag  1077
SEQ ID No.8
长度：359
类型：PRO
生物：智人(Homo sapiens)
序列：8
Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala
1        5              10          15
Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu
      20            25          30
Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro
    35            40           45
Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val
  50          55            60
Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro
65          70           75          80
Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile
         85          90          95
Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu
      100           105         110
Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu
    115           120           125
Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu
  130           135          140
Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn
145          150          155           160
Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met
          165           170          175
Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu
        180          185            190
Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala
    195          200          205
Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr
  210           215            220
Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser
225          230         235            240
Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser
         245         250          255
Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg
        260          265         270
Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu
    275          280         285
Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile
  290           295          300
Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys
305          310          315            320
Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr
         325           330           335
Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala
      340            345          350
Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys
     355
尽管本发明已结合各种附图的优选实施方案进行了描述，然而要理解的是，可用其他相似的实施方案，或可对所述实施方案进行修改或添加从而执行本发明的相同功能，而不偏离它。所以，本发明不应限于任何单一的实施方案，而可根据附加权利要求书所引用的宽度和范围来解释。
计算机可读的序列表
 
SEQ ID No.1
长度：660
类型：DNA
生物：智人(Homo sapiens)
序列：1
 
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 60ttccccccaa
aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 120gtggtggacg tgagccacga
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 180gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg  240gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg
gcaaggagta caagtgcaag 300gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc
caaagggcag 360ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaacacg
420gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 480
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 540tccttcttcc
tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 600ttctcatgct ccgtgatgca
tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctca 660
 
SEQ ID No.2
长度：220
类型：PRO
生物：智人(Homo sapiens)
序列：2
 
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1               5                   10                  15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
            20                  25                  30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
        35                  40                  45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
    50                  55                  60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65                  70                  75                  80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
                85                  90                  95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
            100                 105                 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
        115                 120                 125
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145                 150                 155                 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
                165                 170                 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
            180                 185                 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
        195                 200                 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    210                 215                 220
 
SEQ ID No.3
 
长度：33
类型：DNA
生物：人工的序列
序列：3
 
atcactagtg aattcgcggc cgctcgagtc tag                               33
 
SEQ ID No.4
长度：10
类型：PRO
生物：人工的
序列：4
 
Ile Thr Ser Glu Phe Ala Ala Ala Arg Val
1               5                   10
 
SEQ ID No.5
长度：57
类型：DNA
生物：人工的
序列：5
 
aagggtcaag acaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgcgggaa ttcgatt     57
 
SEQ ID No.6
长度：19
类型：PR0
生物：人工的
序列：6
 
Lys Gly Gln Asp Asn Ser Ala Asp Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Gly
1               5                   10                  15
 
Asn Ser Ile
SEQ ID No.7
长度：1077
类型：DNA
生物：智人(Homo sapiens)
 
序列：7
atgaaggcca ctatcatcct ccttctgctt gcacaagttt cctgggctgg accgtttcaa 60cagagaggct
tatttgactt tatgctagaa gatgaggctt ctgggatagg cccagaagtt 120cctgatgacc
gcgacttcga gccctcccta ggcccagtgt gccccttccg ctgtcaatgc 180catcttcgag tggtccagtg
ttctgatttg ggtctggaca aagtgccaaa ggatcttccc 240cctgacacaa ctctgctaga cctgcaaaac
aacaaaataa ccgaaatcaa agatggagac 300tttaagaacc tgaagaacct tcacgcattg attcttgtca
acaataaaat tagcaaagtt 360agtcctggag catttacacc tttggtgaag ttggaacgac tttatctgtc
caagaatcag 420 ctgaaggaat tgccagaaaa aatgcccaaa actcttcagg agctgcgtgc ccatgagaat
480gagatcacca aagtgcgaaa agttactttc aatggactga accagatgat tgtcatagaa 540
ctgggcacca atccgctgaa gagctcagga attgaaaatg gggctttcca gggaatgaag 600aagctctcct
acatccgcat tgctgatacc aatatcacca gcattcctca aggtcttcct 660ccttccctta cggaattaca
tcttgatggc aacaaaatca gcagagttga tgcagctagc 720ctgaaaggac tgaataattt ggctaagttg
ggattgagtt tcaacagcat ctctgctgtt 780gacaatggct ctctggccaa cacgcctcat ctgagggagc
ttcacttgga caacaacaag 840cttaccagag tacctggtgg gctggcagag cataagtaca tccaggttgt
ctaccttcat 900aacaacaata tctctgtagt tggatcaagt gacttctgcc cacctggaca caacaccaaa
960 aaggcttctt attcgggtgt gagtcttttc agcaacccgg tccagtactg ggagatacag 1020
ccatccacct tcagatgtgt ctacgtgcgc tctgccattc aactcggaaa ctataag 1077
 
SEQ ID No.8
长度：359
类型：PRO
生物：智人(Homo sapiens)
 
序列：8
Met Lys Ala Thr Ile Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gln Val Ser Trp Ala
1               5                   10                  15
Gly Pro Phe Gln Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe Met Leu Glu Asp Glu
            20                  25                  30
Ala Ser Gly Ile Gly Pro Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val
    50                  55                  60
Val Gln Cys Ser Asp Leu Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro
65                  70                  75                  80
Pro Asp Thr Thr Leu Leu Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile
                85                  90                  95
Lys Asp Gly Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu
            100                 105                 110
Val Asn Asn Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu
        115                 120                 125
Val Lys Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu
    130                 135                 140
Pro Glu Lys Met Pro Lys Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn
145                 150                 155                 160
Glu Ile Thr Lys Val Arg Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met
                165                 170                 175
Ile Val Ile Glu Leu Gly Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu
            180                 185                 190
Asn Gly Ala Phe Gln Gly Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala
        195                 200                 205
Asp Thr Asn Ile Thr Ser Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr
    210                 215                 220
Glu Leu His Leu Asp Gly Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser
225                 230                 235                 240
Leu Lys Gly Leu Asn Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser
                245                 250                 255
Ile Ser Ala Val Asp Asn Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg
            260                 265                 270
Glu Leu His Leu Asp Asn Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu
        275                 280                 285
Ala Glu His Lys Tyr Ile Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile
    290                 295                 300
Ser Val Val Gly Ser Ser Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys
305                 310                 315                 320
Lys Ala Ser Tyr Ser Gly Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr
                325                 330                 335
Trp Glu Ile Gln Pro Ser Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala
            340                 345                 350
Ile Gln Leu Gly Asn Tyr Lys
        355

Claims (11)

1.有效量的rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白在制备用于通过抑制肝星形细胞活化来在需要治疗的患者中抑制肝纤维发生的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述融合蛋白用于防止病毒性肝炎和/或诱发的肝损伤病程中肝纤维化的发展。
3.权利要求1的用途，其中所述融合蛋白用于防止慢性肝炎和/或诱发的肝损伤病程中肝纤维化的发展。
4.权利要求1的用途，其中所述融合蛋白是与肝星形细胞活化相关的纤维变性状况的拮抗剂。
5.权利要求1的用途，其中所述融合蛋白是由核酸分子编码的，其包含通过肽接头相连的核心蛋白聚糖和IgGI 1 Fc片段。
6.权利要求5的用途，其中所述含19个氨基酸的肽接头出现在rh核心蛋白聚糖和其中的人IgG1 Fc之间；而且所述肽接头含8个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
7.权利要求5的用途，其中所述人IgG1 Fc含有N-末端调节的人IgG1的铰链、CH2和CH3结构域的部分。
8.权利要求5的用途，其中所述rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白显示出增强的体外生物学活性，其相对于核心蛋白聚糖为至少4倍。
9.权利要求5的用途，其中所述rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白显示出比其亲本蛋白——核心蛋白聚糖更长的寿命。
10.制备含rh核心蛋白聚糖、柔性肽接头和修饰的人IgG1 Fc的重组融合蛋白的方法，其包括以下步骤
构建编码rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的基因；和，
在转染的Cos-7细胞系中表达所述融合蛋白。
11.权利要求10的方法，其中所述人IgG Fc包含N-末端有修饰的人IgG1的铰链、CH2、和CH3结构域的部分，其中IgG1 Fc N-末端的4个氨基酸SPGK被10个氨基酸ITSEFAAARV替代。
CN2005800371903A 2004-08-30 2005-07-18 通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法 Expired - Fee Related CN101115839B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92915904A 2004-08-30 2004-08-30
US10/929,159 2004-08-30
PCT/IB2005/002999 WO2006038107A2 (en) 2004-08-30 2005-07-18 Method for inhibiting fibrogenesis by an rhdecorin-fc fusion protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101115839A CN101115839A (zh) 2008-01-30
CN101115839B true CN101115839B (zh) 2011-05-04

Family

ID=36142914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800371903A Expired - Fee Related CN101115839B (zh) 2004-08-30 2005-07-18 通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101115839B (zh)
WO (1) WO2006038107A2 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112638403A (zh) 2018-07-03 2021-04-09 康泰伦特药物解决方案有限责任公司 包括饰胶蛋白聚糖的多功能蛋白质分子及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436900B1 (en) * 1988-06-28 2002-08-20 La Jolla Cancer Research Foundation Methods of treating a pathology or a fibrotic condition by administering decorin
CN1467222A (zh) * 2002-07-10 2004-01-14 清华大学 人白细胞介素-17受体样分子融合蛋白及其编码基因与表达细胞系
WO2004072100A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-26 The Regents Of The University Of California Nell peptide expression systems and bone formation activity of nell peptide

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436900B1 (en) * 1988-06-28 2002-08-20 La Jolla Cancer Research Foundation Methods of treating a pathology or a fibrotic condition by administering decorin
CN1467222A (zh) * 2002-07-10 2004-01-14 清华大学 人白细胞介素-17受体样分子融合蛋白及其编码基因与表达细胞系
WO2004072100A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-26 The Regents Of The University Of California Nell peptide expression systems and bone formation activity of nell peptide

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ladayi A等人.Expression of a Decorin-Like Molecule in Human Melanoma.《Pathology Oncology Research》.2001,第7卷(第4期),260-266. *
张萍等人.hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达.《细胞与分子免疫学杂志》.2004,第20卷(第1期),11-14. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006038107A3 (en) 2006-08-31
CN101115839A (zh) 2008-01-30
WO2006038107A2 (en) 2006-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU737106B2 (en) Type II TGF-beta receptor/immunoglobulin constant region fusion proteins
CN103479994B (zh) Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
US8957043B2 (en) Methods of treating retinitis pigmentosa using nucleic acids encoding RDCVF1 or RDCVF2
US20020004037A1 (en) Variant type II TGF-beta receptor fusion proteins and methods
US20030108549A1 (en) Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
KR20070057789A (ko) 인터루킨-21 수용체 활성의 상쇄
JP2002523036A (ja) イムノフュージンとしての新脈管形成インヒビターの発現および輸送
KR20090085662A (ko) Ａｌｋ１ 수용체 및 리간드 길항제 및 그의 용도
KR20210113446A (ko) 혈관신생 및 혈관주위세포 적용범위의 조정을 위한 ａｌｋ１ 길항제 기재의 방법 및 조성물
CN107970445A (zh) Bmp-alk3拮抗剂和促进骨生长的用途
US9353162B2 (en) Disease-associated proteins
KR20140123558A (ko) Alk1 길항제 및 신세포 암종 치료에서의 그의 용도
CN107969127A (zh) Apoa-1融合多肽及相关组合物和方法
AU2002312794A1 (en) Disease-associated protein
CN101115839B (zh) 通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法
CN113061192B (zh) 一类对pd-1受体具有高亲和力的pdl1融合蛋白及其作为t细胞抑制剂的应用
CA2512138C (en) Kim-1 antagonists and use to modulate immune system
CN101052419A (zh) 拮抗白介素－21受体活性
KR101193940B1 (ko) 레서스 원숭이 ｃｔｌａ-4 융합 이뮤노글로불린
KR20090053987A (ko) 유세포 분석기를 이용한 신규한 ｒａｎｋ와 ｒａｎｋ리간드의 결합 분석방법
JP2003128576A (ja) エンドトキシン誘発性疾患治療薬
CN114292337A (zh) 一种可溶性nk-car融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用
CZ368299A3 (cs) Fúzní protein obsahující TGF-beta receptor typu II a konstantní úsek imunoglobulinu

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110504

Termination date: 20200718

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee