CN101113427B - Hpd3cell、制备方法及其用于构建丝状噬菌体单链抗体库的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Hpd3cell细胞、制备方法和用途。Hpd3cell为含有缺乏基因III的辅助噬菌体基因组的F因子阳性细菌，菌种保藏编号为CGMCC 2057。将编码scFv-pIII融合蛋白的噬菌粒转化Hpd3cell，可用于构建以pIII为基础的新的丝状噬菌体抗体展示库。该文库构建方法采用了Hpd3cell细胞，能高效制备噬菌粒颗粒并使单链抗体在噬菌粒颗粒上获得高水平展示，可以充分提高展示单链抗体的噬菌体的特异性富集效率。此外，采用Hpd3cell还可以克服pIII抗性。因此，Hpd3cell可以提高噬菌体抗体库的富集效率并增加获得同种抗原的不同抗体的效率。

Description

Hpd3cell、制备方法及其用于构建丝状噬菌体单链抗体库的用途

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。具体地说，本发明涉及一种Hpd3cell细胞、制备方法和用途。Hpd3cell为含有缺乏基因III的辅助噬菌体基因组的F因子阳性细菌，已于2007年5月25日在中国科学院微生物研究所保藏，分类命名为大肠埃希氏杆菌(EscherichiaColi)，菌种保藏编号为CGMCC2057。可以用于构建单链抗体噬菌体文库以pIII为基础的新的丝状噬菌体抗体展示库，提供了一种制备多肽展示的噬菌粒颗粒的方法。 

背景技术

pIII为基础的噬菌体展示已经被广泛用于筛选并获得各种各样的抗原的特异抗体。为了增加抗体库的展示水平，Rondot S，等采用基因III缺失的辅助噬菌体(命名为Hyperphage，Rondot，S.，J.Koch，F.Breitling，and S.Dubel.2001.A helper phage to improve single-chainantibody presentation in phage display.Nat.Biotechnol.19：75-78.)去拯救编码抗体-pIII融合蛋白。用该方法，scFv展示在噬菌粒颗粒表面的数量可以增加100倍。但是，Hyperphage的方法非常繁琐，需要构建一个大肠杆菌包装细胞系(DH5α/pIII)去提供pIII用于辅助噬菌体制备，以免在辅助噬菌体的产生过程中有质粒的污染。此外Hyperphage  的产量(大约1.34×109/ml)相当低。还有就是用于构建单链抗体噬菌体展示库的噬菌粒的蛋白III所用启动子为野生型Lac启动子并不是绝对严格的，pIII可以在缺乏IPTG的情况下产生从而诱导pIII抵抗辅助噬菌体超感染(Boeke，J.D.，P.Model，and N.D.Zinder.1982.Effects ofbacteriophage fl gene III protein on the host cell membrane.Mol.Gen.Genet.186：185-192.)。因此，葡萄糖，pLac抑制子(repressor)经常被添加到培养基中去抑制pIII表达(Krebber A.，J.Burmester，and A.Pluckthun.1996.Inclusion of an upstream transcriptional terminator inphage display vectors abolishes background expression of toxic fusionswith coat protein g3p.Gene 178：71-74.)。为了解决以上问题，本发明人采用含有基因III缺失的辅助噬菌体基因组(VCSM13d3)的F⁺大肠杆菌(TG1)去构建pIII为基础的噬菌体单链抗体库。 

发明内容

本发明目的是提供一种Hpd3cell细胞。 

本发明目的还提供一种上述Hpd3cell细胞的制备方法。 

本发明另一目的是提供一种上述Hpd3cell细胞的用途。 

本发明的Hpd3cell细胞，其菌种保藏编号为CGMCC2057。是一种含有缺乏基因III的辅助噬菌体基因组的F因子阳性大肠埃希氏杆菌；所述的辅助丝状噬菌体基因组指包含了除pIII蛋白编码序列外的辅助丝状噬菌体基因组序列，该基因组上携带和不携带抗性标记。所述的Hpd3cell细胞，所述的抗性标记是指能表达抑制或降解氨苄抗生素、  卡那霉素、氯霉素或四环素等。 

本发明的Hpd3cell细胞的制备方法，是由缺少基因III的辅助噬 

菌体基因组(VCSM13d3)转化F因子阳性的细菌获得。 

本发明的Hpd3cell细胞的用途，是用于构建以pIII为基础的单链抗体噬菌体库。将编码scFv-pIII融合蛋白的噬菌粒转化Hpd3cell，可以高效制备噬菌粒颗粒，产生的噬菌粒颗粒滴度高达1.2×1011cfu/ml培养基，并使单链抗体在噬菌粒颗粒上获得高水平展示。采用Hpd3cell构建单链抗体噬菌体文库，可以充分提高特异性富集效率。此外，采用Hpd3cell还可以克服pIII抗性。因此，Hpd3cell可以提高噬菌体抗体库的富集效率并增加获得同种抗原的不同抗体的效率。 

附图说明

图1是一种Hpd3cell设计图。 

图2是Hpd3cell增加单链抗体展示水平图。 

图3是Hpd3cell增强筛选效率示意图。 

图4是19单链抗体所编码的氨基酸序列。 

其中，附图2中，附图2a是Western Blot检测单链抗体的展示水平，2b是ELISA方法检测M13KO7或Hpd3cell制备的噬菌体与抗原结合的特异性，2c是ELISA方法检测M13KO7或Hpd3cell制备的噬菌体与抗原结合的灵敏度；附图3中，附图3a是每轮筛选后洗脱得到的噬菌体滴度，附图3b是多克隆噬菌体ELISA检测每轮筛选后洗脱得到的噬菌体与EGFP-S2蛋白结合的能力，附图3c是第二轮筛选  后得到的噬菌体随机挑选的单克隆与EGFP-S2结合的能力。 

符号说明 

图1中的fl ori指的是丝状噬菌体复制起始位点。Hpd3cells是Hpd3cell的复数形式。scFv：单链抗体；E.coli genome：大肠杆菌基因组；Transformation：转化。 

图2中：ScFv-pIII指的是单链抗体和pIII的融合蛋；BSA：牛血清白蛋；EGFP：增强型绿色荧光蛋白；M13wt：野生型M13噬菌体；Panning1：第一轮筛选；Panning 2：第二轮筛选；Ctrl：对照(10¹⁰cfu的M13KO7)。Clone no.：克隆号。 

具体实施方式

通过下述实施例将有助于理解本发明，但並不能限制本发明的内容。 

本发明人经过了深入的研究，提供了一种Hpd3cell细胞、制备方法和用途。Hpd3cell为含有缺乏基因III的辅助噬菌体基因组的F因子阳性细菌，菌种保藏编号为CGMCC2057。发展了新的噬菌体单链抗体库制备方法。该方法首先制备了Hpd3cell，它是将缺少基因III的辅助噬菌体基因组(VCSM13d3)转化F因子阳性的细菌(TG1)。然后将编码单链抗体库与pIII外壳蛋白融合蛋白(scFv-pIII)的噬菌粒转化Hpd3cell，从而获得噬菌体单链抗体库。首先采用这种方法展示一个针对EGFP(增强性绿色荧光蛋白)的单链抗体的噬菌体，结果发现该噬菌体和传统方法(用M13KO7超感染方法制备)相比，展  示水平明显增高。随后用EGFP-S2(增强型绿色荧光蛋白与表皮生长因子受体S2结构域融合的蛋白)免疫Balb/c小鼠，然后分离小鼠脾脏，抽提mRNA，并利用Hpd3cell的方法制备噬菌体单链抗体库，结果发现这个方法可以增强单链抗体选择性富集。 

实施例1质粒构建 

根据Sambrook(Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.)等进行标准的克隆步骤。VCSMl3d3由Jasna Rakonjac博士和Peter Model教授友情馈赠；pCANTAB5E-T，来源于pCANTAB-5E(Amersham，Piscataway，NJ，USA)。将编码Thrombin切割位点的寡核苷酸编码序列插到pCANTAB-5E的NotI限制性内切酶位点后。从pEGFP-N1(Clontech，USA)在替中克隆获得EGFP(增强的绿色荧光蛋白)编码序列，然后插入pET28a(Novagen，USA)。将EGFR(表皮生长因子受体)的S2结构域的编码序列插入pET28a-EGFP，产生质粒pET-EGFP-S2。 

实施例2  Hpd3cell制备 

根据Sambrook(Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.)的氯化钙法转化法，将VCSM13d3(Rakonjac，J.，G.Jovanovic，and P.Model.1997.Filamentous phage  infection-mediated gene expression：construction and propagation of thegIII deletion mutant helper phage R408d3.Gene 198：99-103.)质粒转化TG1细胞，然后铺于卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的琼脂平板，倒置，37℃生化培养箱过夜，第二天挑取单克隆，即为Hpd3cell。将Hpd3cell制备成电转感受态。 

实施例319单链抗体的展示及其与EGFP的结合 

pCANTAB-5ET-19噬菌粒是pCANTAB5E-T载体插入了编码19单链抗体(可以与EGFP特异结合)的编码序列。将pCANTAB-5ET-19转化Hpd3cell，收集噬菌粒颗粒，然后用ELISA滴定，结果所产生的噬菌粒颗粒滴度高达1.2×10¹¹cfu/ml。另外作为对照，将pCANTAB-5ET-19转化TG1，铺于氨苄抗生素琼脂平板，过夜，挑单克隆，用M13KO7辅助噬菌体拯救，结果所得到的噬菌粒颗粒滴度为1.5×10¹¹cfu/ml。两者几乎没有差别。 

实施例4  免疫印迹检测单链抗体展示水平 

上样约10¹⁰cfu噬菌体每泳道于10％聚丙烯酰胺胶。用含2％脱脂奶粉的PBS室温下孵育2h，然后用小鼠抗-pIII抗体(New EnglandBiolabs Inc，Beverly，MA，USA)及辣根过氧化物酶标记的山羊抗-小鼠IgG二抗(ImmuClub Labs，Sunnyvale，CA，USA)进行免疫染色，然后用SuperSignal 

West Pico kit(Pierce Biotechnologies，Rockford，IL，USA)显色。如图2A所示，采用Hpd3cell制备的噬菌粒颗粒主要是  scFv-pIII融合蛋白，而用M13KO7制备的噬菌粒颗粒主要是野生型pIII，表明Hpd3cell能明显增加单链抗体的展示水平。 

实施例5  噬菌体ELISA确定抗原结合能力 

为了确定重组噬菌体颗粒的抗原结合特异性，100ng BSA(Sigma，St.Louis，MO.USA)，或重组EGFP于包被缓冲液(0.1M NaHCO3pH9.1)包被于96孔板，4℃过夜。用含有pET28-EGFP质粒的BL21(DE3)大肠杆菌表达重组EGFP蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和纯化(Qiagen，Germany)。平板用含1％BSA的PBS封闭。每孔加入1×10¹⁰用M13KO7或Hpd3cell包装的单链抗体噬菌体(溶于1％BSA)，室温孵育1h。用M13KO7(10¹⁰cfu)辅助噬菌体作为阴性对照。用含0.5％Tween-20的PBS洗涤，用anti-M13 antibody conjugated with HRP(Amersham)检测结合的噬菌体，结合信号用ABTS底物(Sigma)显示并用ELISA reader(Bio-Rad)检测OD₄₀₅。如图2B所示，pCANTAB-5ET-19/Hpd3cell和pCANTAB-5ET-19/M13KO7制备的噬菌粒颗粒都可以与重组的EGFP结合，而不与BSA(牛血清白蛋白)结合。但是，前者产生的信号超过后者的两倍，表明单链抗体的展示水平可以增加抗原(EGFP)的亲和力。然后用ELISA检测10¹⁰ pCANTAB-5ET-19/Hpd3cell噬菌体或pCANTAB-5ET-19/M13KO7噬菌体的抗原结合能力。在产生同样的ELISA信号(OD₄₀₅＝0.37)的情况下，前者与后者相比，其所需要结合的抗原的浓度要低100倍。前者产生阳性信号所需要抗原的浓度也比后者低得多，表明增加  scFv-pIII融合蛋白可以直接增强重组噬菌粒颗粒的抗原结合敏感性(如图2C)。 

实施例6  抗原准备及免疫 

用BL21(DE3)表达EGFP-S2重组蛋白，然后用Ni-NTA树脂亲和纯化。将100μl弗氏佐剂(Sigma)与100μg EGFP-S2蛋白(溶于100μl0.9％NaCl)混合，然后皮下免疫小鼠。每隔两周用同样剂量免疫1次，重复3次。在第三次免疫后，尾静脉注射50μg EGFP-S2蛋白。4天后，牺牲小鼠，取脾脏。 

实施例6  构建单链抗体噬菌体文库 

抽取脾脏总RNA，用纯化的mRNA扩增抗体轻链和重链编码序列。采用搭桥PCR(Overlap Assembly PCR)单链抗体编码序列，然后用SfiI and NotI酶切。所用引物参考见附表1。将所得片断纯化并与pCANTAB-5ET的SfiI/NotI骨架连接，16℃，4小时。根据Bio-RadMicroPulser^TM Electroporation Apparatus操作手册进行电转化到Hpd3cell。具体操作如下：(1)准备电转化的感受态细胞 

1)接种2ml过夜细菌培养产物于200ml of LB。 

2)37℃，300转，直到OD₆₀₀约为0.6。 

3)冰浴细胞20分钟。以下所有步骤，全部在冰上进行[3)-8)]。把所有容器也先冰上预冷。 

4)转移细胞到50ml管子，4000×g，4℃，15分钟。 

5)轻轻倒掉上清，(切记上清一定要去干净)。 

6)用200ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。4000×g，4℃，15分钟。除去上清。 

7)用100ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。4000×g，4℃，15分钟。除去上清。 

8)用8ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。4000×g，4℃，15分钟。除去上清。 

(2)电转 

1)细胞在冰上解冻。放一个0.2厘米的电极杯于冰上。 

2)添加1-2μl的DNA(DNA应该存在于低离子强度的缓冲液如TE)，混合。冰上约1分钟。 

3)设定微脉冲于Ec2。 

4)转移细胞和DNA混合物至冰冷的电极杯，清敲，使悬液位于杯底。把电极杯放于小腔滑片，把滑片推入腔内，电击约6毫秒。 

5)取出电极杯，马上加入1mlSOC培养基(具体配方见分子克隆)于电极杯。用移液枪快速温柔重悬细胞。 

把细胞转入10ml离心管，37℃，225rpm，1小时，然后瞬时离心，去掉900ul上清，把沉淀重悬，取1μl梯度稀释，涂于含有100μg/mL氨苄青霉素及50μg/mL卡纳霉素的琼脂平板。将剩余的经转化的Hpd3cell转移到一个含有200ml LB(含有100μg/mL氨苄青霉素及50μg/mL卡纳霉素)的锥形瓶中，于37℃摇16h。收集噬菌体，具体步骤如下： 

1)收集菌液到离心管，4℃，10000rpm离心10min，转移上清到的新管中。 

2)4℃，10000rpm重离心10min，小心取上清约80％到新管中。 

3)加1/6体积PEG/NaCl，4℃放置过夜。 

4)4℃，10000rpm离心5min，去上清，离心，去残余上清。 

5)用1ml TBS重悬沉淀，转移到1.5ml Eppendorf管中。 

6)4℃，10000rpm离心5min。将上清转移至新1.5mlEppendorf离心管。 

7)重新用1/6体积PEG/NaCl，冰浴60min。 

8)4℃，10000rpm离心5min，弃上清，瞬时离心，去残余上清。 

9)用200μl TBS溶解沉淀，，将上清移至新1.5ml Eppendorf管中，加入NaN3使终浓度为0.02％。然后用0.45μm过滤装置过滤。 

10)然后用ELISA定量。 

为了用M13KO7辅助噬菌体制备噬菌体库，将编码scFv基因的pCANTAB-5ET噬菌粒电击转化TG1细胞，然后铺于含有氨苄的琼脂平板(含1％glucose)。将在含有氨苄的LB生长后的细胞用M13KO7辅助噬菌体超感染后(MOI等于50)，通过PEG/NaCl将所得到的噬菌体收集和纯化。用Hpd3cell构建的噬菌体抗体库，其复杂度为3.75×10⁷，而用TG1 cells构建的噬菌体抗体库复杂度为4.38×10⁷。 

表1：小鼠单链抗体库所用引物 

M＝A or C，R＝A or G，W＝A or T，S＝C or G，Y＝C or T，K＝G or T，V＝A or C or G，H＝A or C or T，D＝A or G or T，B＝C or G or T，N＝G or A or T or C. 

实施例7  单链抗体筛选 

将免疫管用50μg抗原(溶于PBS)包被，4℃过夜，然后用1％BSA(溶于PBS)在37℃孵育2h。用PBS洗3次，加入5×10¹¹ scFv噬菌体库(溶于1％BSA和0.1％Triton X-100)，然后于37℃孵育2h。完全去掉溶液，用0.5％Tween-20(溶于PBS)洗20次，用PBS洗20次。用4U凝血酶原(Sigma，溶于PBS)洗脱结合的噬菌体，37℃1h。将同样体积的对数生长期的Hpd3cell或TG1细胞加于溶液中，37℃摇1h。细胞离心，然后用新鲜的LB洗涤2次。将细胞梯度稀释然后铺于含氨苄/卡那霉素(Hpd3cell)或氨苄(TG1)的L B琼脂平板，30℃孵  育过夜。对于Hpd3cell，将剩余的细胞悬液加到含有氨苄/卡那霉素的LB中，扩大培养，然后收集噬菌体，用于下一轮筛选。对于TG1细胞，将它转入含有氨苄的L B中，然后用M13KO7辅助噬菌体超感染。以100ng/孔包被EGFP-S2，4℃过夜，然后进行噬菌体ELISA。对于多克隆噬菌体ELISA，将10¹⁰筛选后并扩增的噬菌体加入96孔板；对于单克隆噬菌体ELISA，将洗脱的噬菌体感染TG1或Hpd3cell，室温20min，然后分别平铺于含氨苄的L B琼脂平板或含氨苄/卡那霉素的平板，37℃孵育过夜。对于Hpd3cell，随机挑取大肠杆菌克隆，然后接种于200μl含氨苄/卡那霉素的L B的96孔板，30℃过夜(Corning，USA)；对于TG1，随机挑取大肠杆菌克隆接种于200μl含氨苄/卡那霉素的L B的96孔板，然后用M13KO7超感染，30℃过夜。从每孔取50μl含有噬菌体颗粒的培养上清，加入包被有EGFP-S2的96孔板中，然后进行ELISA。BSA作为抗原的阴性对照，M13KO7作为辅助噬菌体的阴性对照。筛选两轮后，Hpd3cell包装的噬菌体有显著的富集(图3A)。在第二轮筛选后，采用EGFP-S2作为抗原进行多克隆噬菌体ELISA分析富集的亚文库的抗原结合能力发现Hpd3cell包装的噬菌体的OD₄₀₅＞1.0。相反，M13KO7包装的噬菌体在第二轮筛选后包装的噬菌体没有明显的抗原结合活性(图3B)。为了检测特异富集到EGFP-S2的抗体克隆的产量，我们在第二轮筛选后随机挑取了96个克隆。ELISA结果显M13KO7包装的克隆小于10％是与EGFP-S2结合的(图3C)。相反，Hpd3cell制备的噬菌体克隆超过80％是与EGFP-S2结合的，而且其中有19％(18/96)的克隆的，表明它的高水平结合能  力。将这些噬菌粒(OD₄₀₅＞1)的DNA抽提后，然后进行测序，发现其scFv序列都是不一样的，表明采用Hpd3cell可以增加获得同一靶抗原的不同抗体。 

实施例8  pIII抗性试验 

用M13KO7超感染TG1 scFv文库，然后转至氨苄培基，30℃摇16h.PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，然后用之感染TG1细胞。将感染的TG1细胞铺于氨苄平板(有或无1％glucose)37℃孵育过夜，然后挑取96个单克隆，加入有或无1％glucose的培基，30℃摇1h。随后，将感染的TG1cells用M13KO7辅助噬菌体超感染(MOI＝50)，再培养20h。另外，用来自TG1/M13KO7 scFv文库的96个单克隆去感染Hpd3cell，然后铺于不含葡萄糖的氨苄/卡那霉素平板37℃过夜，随后进行同样的操作。测定培养无的OD₆₀₀值。将噬菌体上清收集，用PEG/NaCl纯化，然后于OD₂₆₅定量。结果所有的感染Hpd3cell的克隆的OD₆₀₀值都大于2.0。但是，克隆感染TG1后，再用M13KO7超感染后，在无葡萄糖时，其OD₆₀₀值小于0.5的有17％(16/96)，在有葡萄糖时2％(2/96)(如表2所示)。为了进一步检测噬菌体的产生情况，这些克隆的上清都分别用PEG/Nacl沉淀，然后其滴度都用ELISA检测。所有的Hpd3cell克隆都能产生噬菌体。TG1/M13KO7的克隆如OD₆₀₀ 值大于0.5时，也可产生噬菌体，但是若其OD₆₀₀值小于0.5时，就不产生噬菌体。 

表2：pIII抗性实验结果。 

Claims (7)

1.一种Hpd3cell细胞，其菌种保藏编号为CGMCC2057。

2.一种如权利要求1所述的Hpd3cell细胞的制备方法，其特征是由缺少基因III的辅助噬菌体基因组VCSM13d3转化F因子阳性的细菌获得。

3.如权利要求2所述的Hpd3cell细胞的制备方法，其特征是将所述的VCSM13d3质粒转化TG1细胞，然后铺于含有抗性的琼脂平板，倒置，生化培养箱过夜，挑取单克隆，即为Hpd3cell。

4.如权利要求3所述的Hpd3cell细胞的制备方法，其特征是所述抗性是氨苄抗生素、卡那霉素、氯霉素或四环素。

5.一种如权利要求1所述的Hpd3cell细胞的用途，其特征是用于构建以pIII为基础的单链抗体噬菌体库。

6.如权利要求5所述的Hpd3cell细胞的用途，其特征是所述的单链抗体库文库构建是采用噬菌粒编码单链抗体-蛋白III融合蛋白。

7.如权利要求1所述的Hpd3cell细胞的用途，其特征是将编码scFv-pIII的抗体-蛋白III融合蛋白基因的噬菌粒文库导入到Hpd3cell。

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