CN101107011A - 血管内皮生长因子受体1+细胞在治疗和监测癌症以及在筛选化疗药中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的方法，也涉及预防肿瘤转移的方法。这些方法包括：在有效抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成或预防肿瘤转移的条件下，给予癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。可根据候选化合物是否能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞，并将血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的所测水平与先验水平进行比较，来筛选用于上述目的的候选化合物。

Description

血管内皮生长因子受体1+细胞在治疗和监测癌症以及在筛选化疗药中的用途

[0001]本申请要求于2004年11月19日申请的美国临时专利申请顺序号60/629,662和2005年10月5日申请的60/723,770的权益，所述临时申请的全部公开内容通过引用全部结合到本文中。

[0002]本申请的主题是在美国政府资助下完成的(美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)的资助号为1 R01CA098234-01)。美国政府在本发明中可以享有一定的权利。

发明领域

[0003]本发明涉及血管内皮生长因子受体1⁺细胞在治疗和监测癌症以及在筛选化疗药中的用途。

发明背景

[0004]癌症在美国是仅次于心脏病发作的第二大死因。在开发治疗这类破坏性疾病的新疗法中已经取得了重大进步。这些进步大部分归功于对正常细胞与癌细胞的细胞增殖的更多了解。

[0005]正常细胞的增殖是通过生长因子受体各自的配体高度控制生长因子受体活化的结果。这类受体的实例是生长因子受体酪氨酸激酶。

[0006]癌细胞的增殖是正常细胞的DNA突变或肿瘤抑制基因功能丧失的结果。这些遗传变化产生许多新的蛋白质产物，例如过量表达的肿瘤相关生长因子或趋化因子或受体，这可刺激其它细胞(例如内皮细胞)的增殖，并在肿瘤内形成新血管以供其继续生长并促进肿瘤转移。

[0007]在非肿瘤细胞中发现的能支持肿瘤生长、并且在某些环境下本身就在肿瘤细胞表面的某些生长因子受体的实例包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、神经生长因子受体(NGFR)和成纤维细胞生长因子受体(FGF)。

[0008]在胚胎发育期间，造血细胞和早期内皮细胞(成血管细胞)起源于共同的前体细胞，称为成血成血管细胞(hemagioblast)。因为它们具有共同的细胞来源，所以造血细胞和血管细胞共享一些信号转导途径。一个这样的途径是VEGFR信号转导途径。VEGF受体(VEGFR)包括VEGFR1(也称为FLT-1，由Shibuya M.等人测序(Shibuya M.等，Oncogene 5：519-524(1990))和VEGFR2(也称为KDR或FLK-1，参见Terman等，Oncogene 6：1677-1683(1991)；并由Matthews W.等人测序(Matthews W.等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA88：9026-9030(1991))。

[0009]除非上下文中另有说明或有明确表示，否则本说明书将会遵循VEGF受体的习惯命名法。KDR是指VEGFR2的人形式。FLK-1是指VEGFR2的鼠同系物。FLT-1与KDR/FLK-1受体不同，但与之相关。

[0010]VEGFR能结合VEGFR1和VEGFR2，对内皮细胞和造血细胞发挥增殖和迁移效应。过去认为VEGRF2只由内皮细胞表达。然而，近来发现VEGFR2也存在于多能造血干细胞亚群上(Ziegler等，Science 285(5433)：1553-8(1999))。若干研究已经表明，某些白血病细胞也表达VEGFR1和VEGFR2(Fiedler等，Blood 89(6)：1870-5(1997))。

[0011]介导VEGF的不同生物学效应的两种主要信号转导酪氨酸激酶受体是VEGFR2和VEGFR1。尽管VEGFR1与VEGF的结合亲和性非常高，Kd值为10-70pM(Klagsbrun等，Cytokine GrowthFactor Rev 7(3)：259-70(1996))，但是大多数研究表明，VEGFR2是传送用于内皮细胞增殖和分化的细胞信号的关键性受体(Ortega等，Am JPathol 151(5)：1215-24(1997))。VEGFR1看来对血管重塑更加重要。在通过同源重组破坏鼠胚胎干细胞的VEGFR2基因和VEGFR1基因的研究中，已经确定VEGF受体在调节血管发生和血管生成中的相对重要性。VEGFR2缺陷型小鼠是在血管发生、血管生成和血细胞生成中具有重大缺陷的小鼠(Shalaby等，Nature 376(6535)：62-6(1995))。相比之下，VEGFR1敲除小鼠发育异常血管通道，表明该受体在调节细胞相互作用和血管稳定方面的作用(Fong等，Nature376(6535)：66-70(1995))。

[0012]通过破坏VEGFR2信号转导而抑制血管生成，导致对实体瘤生长和转移的抑制。例如，在鼠模型中，中和抗鼠VEGFR2的单克隆抗体(MoAb)，抑制肿瘤侵袭(Skobe等，Nat Med 3(11)：1222-7(1997)和Prewett等，Cancer Res 59(20)：5209-18(1999))。此外，在VEGFR2显性失活的小鼠中，成胶质细胞瘤的生长受到抑制(Millauer等，Nature 367(6463)：576-9(1994))。这类对肿瘤生长的抑制，归功于对血管生成的抑制，有效限制了对肿瘤的血液供应。

[0013]白血病起源于其成熟和分化的不同时期的造血干细胞。目前已经清楚地知道，急性白血病起源于具有自我更新能力的未成熟的造血干细胞，而某些攻击性较弱的白血病(例如慢性白血病)则似乎起源于更成熟的定型造血祖细胞。

[0014]一些研究表明，VEGF几乎总是由所有已确定的白血病细胞系以及新分离的人类白血病细胞系(包括已充分研究的HL-60白血病细胞系)表达(Fiedler等，Blood 89(6)：1870-5(1997)，Bellamy等，Cancer Res 59(3)：728-33(1999))。利用RT-PCR，一些研究已经表明，VEGFR-2和VEGFR-1仅由某些人类白血病表达(Fiedler等，Blood89(6)：1870-5(1997)，Bellamy等，Cancer Res 59(3)：728-33(1999))。然而，这些研究都没有说明，VEGF表达是否与任何平行表面VEGFR2/VEGFR1表达或功能性反应相关。

[0015]骨髓(BM)衍生细胞(BMDC)可促进恶性转化(Coussens等，“MMP-9 Supplied by Bone Marrow-derived Cells Contributes to SkinCarcinogenesis(骨髓衍生细胞所供应的MMP-9能促进皮肤癌的发生)”Cell 103：481-490(2000))、肿瘤血管形成(Lyden等，“ImpairedRecruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and HematopoieticPrecursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth(骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长)，”Nat.Med.7：1194-1201(2001)和Autiero等，“Placental Growth Factor and itsReceptor，Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1：Novel Targetsfor Stimulation of Ischemic Tissue Revascularization and Inhibition ofAngiogenic and Inflammatory Disorders(胎盘生长因子及其受体，血管内皮生长因子受体-1：刺激缺血组织的血管再形成并抑制血管生成及炎性疾病的新靶标)，”Journal of Thromb.Haemost.1：1356-1370(2003))和肿瘤细胞迁移(Neson等，“Lymphocyte-facilitated Tumor CellAdhesion to Endothelial Cells：the Role of High Affinity LeukocyteIntegrins(淋巴细胞促进肿瘤细胞粘附内皮细胞：高亲和力白细胞整联蛋白的作用)，”Pathology 35：50-55(2003))。先前已经鉴定了表达血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)的造血祖细胞(HPC)群体，其干细胞驻留在BM的特异性生态位依赖区内。在新血管生成过程中，这种小于0.01％总BM细胞的正常小群体增殖并与BM衍生的VEGFR2⁺内皮祖细胞(EPC)一起被动员到外周循环中，这两种细胞都是原发性肿瘤血管形成和生长必不可少的(Lyden等，“Impaired Recruitment ofBone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor CellsBlocks Tumor Angiogenesis and Growth(骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长)，”Nat.Med.7：1194-1201(2001)和Hattori等，“Placental Growth Factor ReconstitutesHematopoiesis by Recruiting VEGFR1(+)Stem Cells from Bone-marrowMicroenvironment(胎盘生长因子通过从骨髓微环境募集VEGFR1(+)干细胞而重建血细胞生成)，”Nat.Med.8：841-9(2002))。这些骨髓单核细胞来源的VEGFR1⁺细胞定位于肿瘤床的血管周围部位，为新形成血管起到支持和稳定的作用(Lyden等，“Impaired Recruitment ofBone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor CellsBlocks Tumor Angiogenesis and Growth(骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长)，”Nat.Med.7：1194-1201(2001))。已经发现这些细胞和其它肿瘤相关细胞能增强原发性肿瘤生长并促进肿瘤扩散，但是它们对肿瘤转移的精确作用目前尚不清楚(Pollard，“Tumor-educated Macrophages Promote TumorProgression and Metastasis(肿瘤驯化巨噬细胞促进肿瘤发展和转移)，”Nat.Rev.Cancer.4：71-78(2004)和Hiratsuka等，“MMP9 Inductionby Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 is Involved in Lung-specific Metastasis(血管内皮生长因子受体-1的MMP9诱导，参与肺特异性肿瘤转移)，”Cancer Cell.2：289-300(2002))。

[0016]本发明涉及利用这些现象监测和治疗癌症和肿瘤转移。

发明概述

[0017]本发明涉及抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的方法。该方法包括：在有效抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的条件下，给予癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。

[0018]本发明的另一方面涉及预防癌症患者肿瘤转移的方法。该方法包括：在有效抑制癌症患者肿瘤转移的条件下，给予癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。

[0019]本发明的另一方面涉及用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物的鉴定方法。该方法包括提供试验化合物，并将试验化合物与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞一起孵育。鉴定能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的试验化合物，作为用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物。

[0020]本发明的另一方面涉及监测癌症患者肿瘤转移的方法。该方法包括评价患者样品的血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞水平，并将血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞先前的水平进行比较，其中血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞水平增加，就表明未来会有肿瘤转移。

[0021]本发明的另一方面涉及抑制患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的方法。该方法包括：在有效抑制患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的条件下，给予患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。

[0022]目前，对完全切除或部分切除实体瘤并进行辅助化疗后又发生肿瘤转移的患者进行确定，是非常困难的。在任何指定肿瘤转移频发部位(例如结肠癌患者的肝脏、骨肉瘤患者的肺部、乳癌患者的淋巴结)测定VEGFR1⁺骨髓衍生细胞的体系，可有助于预测患者是否需要针对这些VEGFR1⁺骨髓衍生簇的额外辅助治疗以及更常规疗法，例如在切除后用化疗提前治疗，而不是等待出现转移或复发之后才开始治疗。这些细胞簇作为表达VEGFR1或VLA的循环或动员细胞在血流中也可以被示踪。另外，有可能在将来可以标记这些VEGFR1⁺造血祖细胞，这样可以通过造影研究以跟踪对治疗的反应或评价未来的转移危险性。它可用于改变最小残余疾病的分期和监测方法。这样的标记和潜在治疗策略将证明对原发性肿瘤患者以及那些患者的照顾是非常有用的。可以预知的是，该策略也可用于患有缺血性疾病和炎性疾病(例如类风湿性关节炎和炎性肠病)的患者。

[0023]肿瘤扩散之前，这些VEGFR1⁺骨髓衍生细胞在转移部位的存在，导致形成利于导入VEGFR2⁺内皮细胞和肿瘤细胞的微环境，这提供证据表明：这些细胞产生新趋化因子或生长因子，这可解释这些特性。新蛋白质/基因的分离/鉴定包括VEGFR1⁺细胞和转移前生态位引起肿瘤细胞迁移和粘附的增加，这将为预防肿瘤扩散提供重要靶标。

附图简述

[0024]图1A-E显示骨髓衍生细胞形成转移前生态位。在图1A中，在辐射后和LLC细胞植入前，在肺部罕见β-gal⁺骨髓细胞(左图，n＝6)。到第14天，β-gal⁺骨髓衍生簇出现在肺实质中(左中图和箭头区域的放大插图；n＝25)并在第23天与微小转移联合(右图，箭头)并且在总体转移中(右图，插图；n＝12)。也显示了与终末细支气管和支气管静脉间基质(常见的转移部位)联合的簇(右中图)。B是终末细支气管，V是支气管静脉。图1B显示在辐射后和DsRed-标记的B16细胞植入前的肺部GFP⁺骨髓(左图；n＝6)。在第14天，可见GFP⁺ BMDC没有DsRed⁺肿瘤细胞(左中图和插图；n＝12)。从第18天开始，少量单个DsRed⁺ B16细胞粘附到GFP⁺骨髓簇上(右中图)，到第23天，DsRed⁺肿瘤细胞在簇部位增殖(右图；n＝8)。DAPI染色显示细胞核。图1C是曲线图，表示肺部骨髓衍生的GFP⁺ BMDC和DsRed⁺ B16细胞的流式细胞术数据(n＝30)，以及第14天(左图)和第18天(右图)的两幅流向图。图1D显示与仅接受培养基的动物相比(左图；P＜0.01)，用B16条件培养基时GFP⁺ BMDC的动员，然后在粘附24小时后通过尾静脉注射DsRed标记的肿瘤细胞(右图，箭头)。插图表示4天后簇中增殖的肿瘤细胞(右图插图；n＝6)。图1E显示具有皮内LLC或B16肿瘤的动物中，每100X物镜视野中簇的数量(n＝12)。右下角的比例尺适用于图1A(左，左中，右中，80mm；左中插图，8mm；右图，20mm；右插图，47mm)，适用于图1B(左，左中，80mm；左中插图，8mm；右中，右，40mm)，适用于图1D(40mm；右插图，20mm)。转移前簇包括VEGFR1⁺造血祖细胞。图1F-I显示转移前簇包括VEGFR1造血祖细胞。图1F显示在辐射过的肺中，在肿瘤植入之前的VEGFR1染色(左图和插图；n＝10)，以及在LLC细胞植入后14天显示肺部的簇(右图，箭头；n＝18，每100X物镜视野中3.9±0.2％细胞带有VEGFR1染色，P＜0.05)。图1G和H显示带有第14天LLC肿瘤的动物肺部的双重免疫荧光。VEGFR1⁺和GFP⁺骨髓细胞(左图)、VEGFR1⁺和CD133⁺(右图)见图1G。VEGFR1⁺和CD117⁺见图1H。图1I显示在生命的第40天和肿瘤发生之前，c-Myc转基因淋巴结中的VEGFR1⁺簇(中图和插图显示VEGFR1⁺细胞)，相比之下，野生型同窝出生幼仔淋巴结没有转基因(左图)，在第120天，c-Myc转基因结具有淋巴瘤(右图)。在右图的插图中，箭头指淋巴瘤周围围绕的VEGFR1⁺簇(n＝6)。右下角的比例尺适用于图1E(80mm；左插图，40mm)、图1G(20mm)、图1H(20mm)和图1I(80mm；插图，8mm)。

[0025]图2A-B显示对骨髓细胞归巢的抑制可预防肿瘤转移。图2A显示在LLC植入后第24天，VEGFR1⁺-选择的骨髓(R1-pos)允许微小转移(箭头，中图)，但能预防血管形成良好的大转移，正如在野生型中所见(左图)。插图显示CD31(内皮标记)表达。VEGFR1⁺细胞的骨髓耗尽(非R1)消除簇和转移(右图)(经ANOVA，P＜0.01)。该表显示每100X物镜视野下簇和微小转移的数量。*表示转移填充在肺部。(R1-pos，n＝4；非R1，n＝4；野生型，n＝6；非R1加上野生型，n＝4)。图2B显示在带有LLC肿瘤的小鼠中用抗VEGFR1抗体(抗R1)和抗VEGFR2抗体(抗R2)进行治疗，能阻止簇和肿瘤转移(经ANOVA，P＜0.01；对于所有组，n＝5)。野生型肺部中的箭头指大的LLC转移。抗R2中的箭头指簇，插图显示簇内微小转移。T，肿瘤细胞。该表显示肺部每100X物镜视野下簇和LLC微小转移的数量。*表示转移填充在组织中。右下角的比例尺适用于图2A(20mm；野生型插图，26mm；R1-pos插图，32mm)和图2B(40mm；抗R2插图，20mm)。

[0026]图3A-F显示VLA4/纤连蛋白途径介导簇的形成。图3A-C显示野生型小鼠在肿瘤移植后第14天出现能表达VLA-4(插图，VEGFR1和VLA-4)、MMP9和Id3的簇(插图，VEGFR1和Id3)。图3D显示给予VEGFR1⁺GFP⁺BMDC的带有LLC肿瘤的Id3敲除(KO)小鼠的肺部组织(经ANOVA，P＜0.01；n＝6)。箭头指上插图区域。箭头(下插图)显示用GFP⁺VEGFR1⁺细胞的转移部位。图3E显示野生型肺部的基线纤连蛋白表达(n＝6)(左图)。在第3天，转移前肺部的支气管周围基质纤连蛋白增加(中图，箭头)，在第14天达到最大表达(右图)。插图，PDGRFα表达表明驻留的成纤维细胞释放纤连蛋白。图3F显示定量RT-PCR，表明与野生型相比，带有LLC肿瘤小鼠肺部的纤连蛋白表达增加(经ANOVA，^*P＜0.05；n＝6)，而且带有B16黑素瘤动物肺部也有类似的早期趋势。右上角的比例尺适用于图3A-C(40mm；插图，8mm)、图3D(80mm；右上插图，20mm；右下插图80mm)和图3E(40mm；插图，20mm)。

[0027]图4A-E显示LLC转移改道向非典型部位。图4A-B显示与野生型并用LCM-治疗小鼠相比，通过定量RT-PCR分析，在给予MCM的小鼠中可见输卵管(图4A)和肠(图4B)内纤连蛋白表达增加。与野生型相比，对于输卵管，第3-5天，经ANOVA，^*P＜0.05，第7-9天，^**P＜0.001；而与野生型相比，对于肠道，第7-9天，^*P＜0.001(n＝6)。图4C显示条件培养基中VEGF和PlGF水平的ELISA测定(一式三份)(当与L-LCM相比，经ANOVA，^*P＜0.05，而当与培养基单用相比，^**P＜0.01)。图4D显示transwell迁移测定(一式三份)，证明VEGFR1⁺细胞向LCM和MCM的迁移增加(经ANOVA，^**P＜0.001)。图4E显示用MCM处理，使LLC的转移扩散改道B16黑素瘤转移部位，例如脾(左图)、肾(左中图)、肠(右中图)和输卵管(右图)。箭头指转移边界区，见插图(n＝6)。T，LLC肿瘤细胞。右下角的比例尺适用于图4E(200mm；插图，20mm)。

[0028]图5A-E显示肿瘤和VEGFR2⁺细胞在VEGFR1⁺HPC之后到达。图5A显示第8、14、18和23天的流式细胞术分析，表明肺部GFP⁺BMDC群体和DsRed B16黑素瘤肿瘤细胞(n＝30)。图5B显示VEGFR1和CD34(中图)、VEGFR1和这些造血标记共表达的频率(右图)。图5C显示在第12、14、18和27天通过流式细胞术对肺部CD117⁺祖细胞和荧光GFP⁺-LLC肿瘤细胞进行分析，表明这些细胞的存在先于肿瘤细胞到达。图5D显示骨髓衍生的VEGFR2⁺循环内皮祖细胞在VEGFR1⁺造血祖细胞之后到达转移前生态位。VEGFR1与VEGFR2的双重免疫荧光(左图)。VEGFR1和CD31/PECAM(中图)(箭头指内皮细胞)。VEGFR2⁺细胞和GFP的双重免疫荧光，表明已建立和生长的转移生态位内的这些细胞起源于骨髓(右图)。图5E是曲线图，表明VEGFR-2⁺细胞到达转移生态位的时间，其与带有16天和24天肿瘤的动物肺部组织中可见的肿瘤细胞的到达是一致的(细胞/簇/100x视野)(n＝6)。比例尺：20μm(图5B)；左，左中20μm，右10μm(图5D)。

[0029]图6A-F显示转移前人体组织中VEGFR1的表达。在患有乳癌(n＝15)、肺癌(n＝15)和胃肠癌(n＝3)的个体中，在恶性和非恶性组织中，细胞簇用VEGFR1染色。图6A显示具有乳腺癌转移证据的淋巴结(箭头指肿瘤)，而图6B显示同一患者没有恶性肿瘤的淋巴结。图6C显示原发性肺腺癌，而图6D显示没有肿瘤的邻近“正常”肺(箭头指VEGFR1⁺细胞)。无肿瘤个体的淋巴结(图6B插图；n＝6)和肺组织(图6D插图；n＝3)中未见VEGFR1⁺簇。也显示胃食管连接的原发性腺鳞状上皮癌(图6E)和无癌肝淋巴结(图6F)。图6E-F中的插图显示VEGFR1和c-Kit的共免疫荧光。右下角的比例尺适用于所有图(40mm；插图，40mm)。

[0030]图7A-C显示肿瘤在其趋化因子特性和纤连蛋白表达模式方面是不同的。图7A显示，与培养基对照相比(左图和中图插图)(n＝12)，用LLC条件培养基(LCM)治疗的WT小鼠诱导肝(左图)和肺(中图)的纤连蛋白表达。LCM支持肺部β-gal⁺BM簇(右图，TB＝终末细支气管，BV＝支气管静脉)(n＝6)。图7B显示与培养基对照的肠中纤连蛋白表达相比(中图插图)(n＝12)，用MCM处理的小鼠显示出在肝(左图)和肠(中图)以及肾、睾丸和肺中纤连蛋白表达增加。带有β-gal⁺BM并用MCM处理的WT小鼠，表现出局限于富含纤连蛋白区域的邻近簇形成。(右图)(n＝6)。图6C显示对于得自14天肿瘤的动物的LLC和B16黑素瘤来说，肿瘤衍生血浆中VEGF和P1GF的ELISA水平(一式三份，与WT血浆相比，对于肿瘤衍生血浆，经单侧ANOVA，^*p＜0.05)。图7A-B的比例尺为：左图和中图40μm，插图35.2μm，右图20μm。

[0031]图8A-D显示骨髓衍生的VEGFR1⁺细胞吸引肿瘤细胞。图8A显示VEGFR1⁺细胞分离自BM，并与B16肿瘤细胞共培养，形成聚集和增殖，用抗VEGFR1抗体(中图)或抗VLA-4抗体(右图)进行治疗，可消除该效应。图8B显示transwell迁移测定，证明B16肿瘤细胞向VEGFR1⁺选择群体的迁移增加(一式三份，与非R1和培养基相比，对于R1，p＜0.001％)。图8C显示低和高放大倍数的VEGFR1⁺细胞簇的SDF-1(CXCL12)免疫荧光染色。SDF-1α和VEGFR1的共免疫荧光，对于SDF-1α表达，VEGFR1⁺细胞簇染色阳性。图8D显示LLC和B16肿瘤细胞表达CXCR4。比例尺：对于图8A，50μm，插图120μm，对于图8C，左图和右图40μm，中图8μm，对于图8D，20μm。

[0032]图9显示Id3敲除小鼠缺乏HPC动员，而Id3缺陷型小鼠的CD11b⁺VEGFR1⁺造血祖细胞动员增加。

[0033]图10显示VEGFR1抗体抑制B16肿瘤转移。在用抗VEGFR1和/或VEGFR2的中和抗体处理的小鼠中可见B16肿瘤(右图)。WT脾脏中的实心箭头指有活性的黑素瘤，也见于插图，而空心箭头指坏死和黑素颗粒。抗R1(抗VEGFR1)中的箭头指脾脏中典型的生发中心。抗R1⁺抗R2组的插图代表动物肺部分离的转移瘤。比例尺为：20μm：插图WT脾8μm，抗R1⁺抗R2 66μm。

[0034]图11A-D显示对VLA-4和MMP-9的抑制能抑制肿瘤转移。B16黑素瘤诱导肺部纤连蛋白表达。图像显示LLC植入后14天，用抗VLA-4抗体治疗的WT小鼠的肺组织(β-gal用伊红复染，n＝8，经学生氏t检验，p＜0.01)(图11A)和MMP9-/-小鼠的肺组织(VEGFR1 DAB，用苏木精复染，n＝6)(图11B)。给予VLA-4抗体的WT小鼠或MMP-9缺陷型小鼠的β-gal和VEGFR1细胞簇形成减少，见图11C的下图，定量测定的簇或转移/100x视野(经学生氏t检验，p＜0.01)。图11D显示B16黑素瘤肿瘤植入后第3和14天的肺组织的纤连蛋白表达。第14天的箭头指簇部位的纤连蛋白表达。比例尺为：80μm(图11A)和左图、中图40μm，右图8μm(图11D)。

发明详述

[0035]本发明涉及抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的方法。该方法包括：在有效抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的条件下，给予癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。该抑制剂也可用于预防原发肿瘤部位的肿瘤复发。

[0036]该方法的给药步骤是在刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。由于化疗、应激、手术、癌症患者的骨髓重建(bone marrow recovery)、炎症、辐射或生长因子，可发生这样的刺激。在刺激生长因子(例如粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和红细胞生成素)中，可以刺激造血细胞被动员进入血流中并促进肿瘤生长和转移。

[0037]在实施本发明时，选择血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂，以结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞。

[0038]选择血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂，以预防或减少血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的形成。合适的抑制剂可以是血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞特异性生物分子或者抑制RNA或DNA的小分子。

[0039]生物分子包括所有脂质和分子量大于450的单糖、氨基酸和核苷酸的聚合物。因此，生物分子包括例如寡糖和多糖、寡肽、多肽、肽和蛋白质；以及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多核苷酸包括例如DNA和RNA。

[0040]生物分子还包括任何上述分子的衍生物。例如，生物分子的衍生物包括脂质以及寡肽、多肽、肽和蛋白质的糖基化衍生物。生物分子的衍生物还包括寡糖和多糖的脂质衍生物，例如脂多糖。

[0041]最典型的生物分子是血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞特异性抗体或所述抗体的功能性等价物。这样的功能性等价物包括例如嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体及其片段。

[0042]抗体的功能性等价物优选为嵌合抗体或人源化抗体。嵌合抗体包含非人类抗体的可变区和人类抗体的恒定区。人源化抗体包含非人类抗体的超变区(CDR)。人源化抗体的可变区(不是超变区)，例如构架可变区，以及恒定区，都是人类抗体的。

[0043]为了本申请的目的，非人类抗体的合适可变区和超变区可来自任何非人类哺乳动物产生的抗体，其中制备了单克隆抗体。哺乳动物(而不是人类)的合适实例包括例如兔、大鼠、小鼠、马、山羊或灵长类动物。优选小鼠。

[0044]功能性等价物还包括结合特性与完整抗体相同或相当的抗体片段。

[0045]这样的片段可以例如含有F(ab′)₂片段中的一个或两个Fab片段。优选的抗体片段含有完整抗体的全部6个互补决定区，尽管也包括功能性片段，含有少于所有这样的区域，例如包含3、4或5个CDR。

[0046]优选的片段是单链抗体或Fv片段。单链抗体是多肽，其至少包含抗体重链可变区及与其相连的抗体轻链可变区，含有或不含相互连接的接头。因此，Fv片段包含完整抗体结合位点。可在细菌或真核细胞中产生这些链。

[0047]抗体和功能性等价物可以是任何类别的免疫球蛋白成员，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类成员。优选的抗体是IgG1亚类成员。功能性等价物也可以是任何以上类别或亚类的组合。

[0048]本发明的抗体能够结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞，并能起到抑制其活性的作用。通过抑制血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的功能，这类抗体可具有治疗潜力，尤其是在癌症治疗中。

[0049]本发明的抗体能结合VLA-4(α4β1)整联蛋白，抑制这些骨髓衍生簇的形成。通过抑制VEGFR1⁺和VLA-4⁺骨髓衍生细胞的功能，这类抗体可具有治疗潜力，尤其是在癌症治疗中。

[0050]本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

[0051]单克隆抗体可通过本领域众所周知的技术来制备。概括地讲，该方法包括首先用目标抗原在体内或体外免疫哺乳动物(例如小鼠)，再从其脾脏获取免疫细胞(淋巴细胞)。然后，将分泌抗体的淋巴细胞与能在细胞培养物中无限增殖的(小鼠)骨髓瘤细胞或转化细胞融合，由此产生无限增殖的、分泌免疫球蛋白的细胞系。培养所得融合细胞即杂交瘤，筛选所得集落，用于制备所需单克隆抗体。克隆能产生这类抗体的集落，在体内或体外培养以产生大量抗体。有关融合这类细胞的理论基础和实践方法的描述参见Kohler等，Nature 256：495(1975)，所述文献通过引用全部结合到本文中。

[0052]通过用血管内皮生长因子受体1⁺体内免疫动物(例如小鼠)，免疫哺乳动物淋巴细胞。如有必要，间隔数周重复进行这样的免疫，以得到足够效价的抗体。在最后一次抗原加强免疫之后，处死动物，取出脾细胞。

[0053]采用标准和公知的技术，可以与在细胞培养时能无限增殖的哺乳动物骨髓瘤细胞或其它融合伙伴进行融合，所述技术例如通过使用聚乙二醇(“PEG”)或其它融合剂(Milstein等，Eur.J.Immunol.6：511(1976)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。选择这种无限增殖细胞系(优选鼠，但也可来自其它哺乳动物细胞，包括但不限于大鼠和人)，所述细胞系缺乏利用某些营养物质的酶，能够快速生长，并具有良好融合性能。许多这样的细胞系是本领域技术人员已知的，其它细胞系也有常规描述。

[0054]多克隆抗体的制备方法也是众所周知的。通常，可通过将血管内皮生长因子受体1⁺皮下给予新西兰白兔(其事先已经采血以获取免疫前血清)，产生这类抗体。在6个不同部位注射抗原，每个部位总体积为100μl。各注射材料含有合成表面活性剂佐剂泊洛沙姆多聚醇(pluronic polyol)，或经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后含有蛋白质或多肽的研磨过的丙烯酰胺凝胶。第一次注射后2周给兔子放血，然后每6周定期用相同抗原加强免疫3次。每次加强免疫后10天，采集血清样品。然后，通过亲和色谱，使用相应抗原捕获抗体，从血清中回收多克隆抗体。最终，用150mg/Kg IV戊巴比妥麻醉兔子。产生多克隆抗体的上述方法和其它方法都公开于Harlow等(主编)，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)，所述文献通过引用全部结合到本文中。

[0055]原本是人抗体的抗体可由转基因哺乳动物、尤其是转基因小鼠产生，所述动物经基因修饰以产生人抗体。嵌合抗体和人源化抗体的制备方法也是本领域已知的。例如，嵌合抗体的制备方法可参见美国专利第4,816,397和4,816,567号，所述文献通过引用全部结合到本文中。人源化抗体的制备方法参见美国专利第5,225,539号，所述文献通过引用全部结合到本文中。

[0056]抗体人源化的优选方法称为CDR移植法。在CDR移植中，将直接参与抗原结合的小鼠抗体区(即CDR互补决定区)移植到人可变区上，产生“重构人”可变区。这类完全人源化的可变区再拼接到人恒定区上，产生完整的“完全人源化”抗体。

[0057]为了产生与抗原结合良好的完全人源化的抗体，最好是仔细设计重构的人可变区。应该仔细选择用于移植CDR的人可变区，通常在人可变区的构架区(FR)内关键位置上有必要改变几个氨基酸。

[0058]例如，重构的人可变区在所选人轻链可变区FR内可包含至多10个氨基酸改变，在所选人重链可变区FR内可包含至多12个氨基酸改变。将编码这些重构的人重链和轻链可变区基因的DNA序列与编码人重链和轻链恒定区基因的DNA序列(分别优选γ1和κ)连接起来。再在哺乳动物细胞中表达重构的人源化抗体，将其对其靶标的亲和力与相应鼠抗体和嵌合抗体进行比较。

[0059]选择人源化抗体中有待取代的残基并进行取代的方法是本领域众所周知的。参见例如Co等，Nature 351：501-502(1992)；Queen等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 86：10029-1003(1989)和Rodrigues等，Int.J.Cancer，增刊7：45-50(1992)，所述文献通过引用全部结合到本文中。225种抗EGFR单克隆抗体的人源化和重构方法参见WO96/40210，所述文献通过引用全部结合到本文中。该方法可用于针对其它蛋白质的抗体的人源化和重构。

[0060]单链抗体的制备方法也是本领域众所周知的。一些实例包括以下文献中描述的例子：欧洲专利申请第502 812号和Wels等，Int.J.Cancer 60：137-144(1995)，所述文献通过引用全部结合到本文中。单链抗体也可通过筛选噬菌体展示文库而制备。

[0061]产生上述功能性等价物的其它方法公开于WO93/21319、欧洲专利申请第239400号、WO89/09622、欧洲专利申请第338745号、美国专利第5,658,570号、美国专利第5,693,780号和欧洲专利申请第332424号，所述文献通过引用全部结合到本文中。

[0062]在本发明方法的实践中，可通过口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内给予患者抑制剂而进行给药步骤。本发明的抑制剂可单独给予或与合适的药用载体一起给予，可以呈固体或液体形式，例如片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。

[0063]本发明的抑制剂可口服给予，例如与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体一起给予，或者可将其包入硬壳或软壳胶囊中，或者可将其压制成片剂，或者可将其直接混入食物中。对于口服治疗性给予，本发明的抑制剂可以与赋形剂混合，以片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等形式使用。这类组合物和制剂应含有至少0.1％的本发明抑制剂。这些组合物中抑制剂的比例当然可以不同，通常介于约2％至约60％的单位重量。这类治疗用组合物中本发明抑制剂的用量使得能达到合适剂量。

[0064]片剂、胶囊剂等也可含有粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精。当单位剂型是胶囊剂时，除了以上类型的材料之外，它还可含有液体载体，例如脂肪油。

[0065]各种其它材料可以包衣或改良剂量单位的物理形式的方式存在。例如片剂可以用虫胶、糖或这两者来包衣。糖浆剂中除了活性成分之外，还可含有蔗糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、染料和矫味剂(例如樱桃味或橘子味)。

[0066]本发明的抑制剂也可通过胃肠外给予。可以用与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水来制备抑制剂的溶液剂或混悬剂。也可以用甘油、液体聚乙二醇及其混合物的油溶液来制备分散剂。说明性的油是石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如，花生油、大豆油或矿物油。一般而言，水、盐水、含水葡萄糖和相关糖溶液和二醇类(例如丙二醇或聚乙二醇)都是优选的液体载体，尤其是用于注射液。在通常的贮藏和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以防止微生物生长。

[0067]适于注射用的药物形式包括无菌水溶液剂或分散剂以及临用时制备成无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉针剂。在所有情况下，其形式必须是无菌的，而且其流动性必须易于注射。它在生产和贮存条件下必须稳定，必须防止细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物和植物油。

[0068]本发明的抑制剂也可以气溶胶的形式直接给予呼吸道。对于气溶胶而言，溶液剂或混悬剂中的本发明抑制剂可与合适的抛射剂以及常规辅料一起包装在加压的气溶胶容器中，所述抛射剂例如烃类抛射剂，例如丙烷、丁烷或异丁烷。本发明的抑制剂也可以以非加压形式给予，例如喷雾器或雾化器。

[0069]本发明可用于治疗各种癌症。本文所用的治疗癌症特别是指将治疗药给予经诊断患有癌症的患者(即已确诊患有癌症的患者)，以抑制癌组织中恶性细胞的进一步生长或扩散，和/或引起恶性细胞的死亡。具体地讲，乳癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌和皮肤癌以及许多儿科癌症都适于用本发明的方法进行治疗。癌症治疗也包括治疗患有癌变前病症的患者，以阻止癌变前病症的发展或引起消退。癌变前病症包括增生、发育异常和化生。

[0070]本发明的治疗药可单独使用或与其它癌症疗法(例如化疗药、辐射或其组合)联用。

[0071]化疗药的实例包括烷化剂(例如氮芥、吖丙啶化合物和磺酸烷基酯)；抗代谢药(例如叶酸、嘌呤或嘧啶类拮抗剂)；有丝分裂抑制剂(例如长春花属生物碱和鬼臼毒素衍生物，以及细胞毒性抗生素)；以及破坏或干扰DNA表达的化合物。

[0072]化疗药或化疗的具体实例包括顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(商品名泰素(taxol))、多西他赛(商品名泰索帝(Taxotere))、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉曲滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、亮丙立德、magastrol、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂(oxaloplatin)、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、紫杉醇和它们的组合。

[0073]本发明的抑制剂也可与放疗联用。放射源可以来自待治疗患者外部或内部。当来源是患者外部，该疗法就称为外部束放射疗法(EBRT)。当来源是患者内部，该疗法就称为近距离放射治疗(brachytherapy，BT)。

[0074]按照众所周知的标准技术和供该目的而生产的标准设备(例如AECL Theratron和Varian Clinac)给予放疗。辐射剂量取决于本领域众所周知的诸多因素。这些因素包括待治疗的器官、在辐射途径中可能因疏忽而受到不利影响的健康器官、患者对放射疗法的耐受性和需要治疗的身体部位。剂量通常介于1-100Gy，更特别介于2-80Gy。已经报道的一些剂量包括35Gy(对于脊髓)、15Gy(对于肾脏)、20Gy(对于肝脏)和65-80Gy(对于前列腺)。然而，应该强调的是，本发明不限于任何具体剂量。剂量将由主治医师根据既定情况下的具体因素(包括上述因素)来确定。

[0075]外部放射源和患者进入点之间的距离可以是代表杀伤靶细胞与最小副作用之间可接受的平衡的任何距离。通常外部放射源与患者进入点之间的距离介于70-100cm。

[0076]通常在患者体内放置放射源，进行近距离放射治疗。通常放射源放置在离待治疗组织约0-3cm远处。已知技术包括间质、空腔和表面近距离放射治疗。放射性种子形小管可以永久性或暂时性植入。已用于永久性植入的一些典型的放射性原子包括碘-125和氡。已用于暂时性植入的一些典型的放射性原子包括镭、铯-137和铱-192。已经用于近距离放射治疗的一些放射性原子包括镅-241和金-198。

[0077]用于近距离放射治疗的辐射剂量可以与上述外部束放射治疗所用的剂量相同。确定外部束放射治疗的因素除了上述因素之外，还要考虑放射性原子的性质，以确定近距离放射治疗剂量。

[0078]本发明具体优选的实施方案包括其与辅助治疗方案联合使用。具体地讲，这包括化疗以及在手术之前和/或手术之后、以及在整个常规辅助化疗疗程期间使用其它抗VEGFR1和/或VLA-4的单克隆抗体，或者用基本化疗(没有辅助)疗程(没有手术)。另外，本发明也可用于在基本手术之后、对没有接受其它治疗的患者进行治疗(即这些患者进行了基本的完全切除，没有证据表明残余疾病或一段时间过后才会出现的疾病)，以预防转移扩散。此外，本发明可用作诊断工具，并确定患者是否处于转移扩散的最高危险中。

[0079]本发明的另一方面涉及预防癌症患者肿瘤转移的方法。该方法包括：在有效预防癌症患者肿瘤转移的条件下，给予癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。本发明的该方面包括使用与如上所述的基本相同的治疗药和治疗方式。

[0080]为了实施本发明的该方面，抑制剂预防或减少血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的形成或增殖。这类抑制剂也可预防所述细胞迁移或肿瘤在其它部位的形成或增殖。

[0081]本发明的另一方面涉及用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物的鉴定方法。该方法包括提供试验化合物，将试验化合物与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞一起孵育。鉴定能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的试验化合物，作为用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物。

[0082]本发明的另一方面涉及监测癌症患者肿瘤转移的方法。该方法包括评价患者样品的血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞水平，并将血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的所测水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的其它水平进行比较。这样的其它水平可以是患者先前的水平，其中如果血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞水平增加，则表明未来会有肿瘤转移。或者，其它水平可以是标准或正常水平，其中所测水平高于正常或标准时，则表明有肿瘤转移。

[0083]为了实施本发明的该方面，患者样品可以是组织样品或血液样品。

[0084]尤其希望通过给予治疗药，并根据血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的现有水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的先验水平进行比较的步骤，来实施本发明的该方面。这样的给药包括如上所述的辅助治疗方案。或者，治疗药可以是化疗药，根据血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的现有水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的先验水平进行比较，来选择所述化疗药的规格。

[0085]该方法可以在体外或体内实施。对于本发明的体内方面，评价和比较步骤包括对癌症患者的某一部位进行造影。采用对血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞具有特异性的标记物或标记的血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞，将其中任一种导入癌症患者体内，可以完成该方法。

[0086]本发明的又一方面涉及抑制患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的方法。该方法包括：在有效抑制患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的条件下，给予患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。本发明的该方面包括使用与如上所述的基本相同的治疗药和治疗方式。

实施例

实施例1-骨髓BM移植

[0087]对野生型C57B1/6小鼠进行致死性辐射(950拉德)，然后移植1×10⁶β-半乳糖苷酶⁺或GFP⁺BM细胞(Rosa-26小鼠)(Lyden等，“Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial andHematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth(骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长)，”Nat.Med.7：1194-1201(2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。4周后，给小鼠皮内注射2×10⁶LLC(ATCC)或B-16细胞(ATCC)。

实施例2-β-半乳糖苷酶染色

[0088]组织和股骨在4％低聚甲醛(PFA)中固定4小时。样品在X-gal溶液中在37℃染色36小时，参见Tam等，“The Allocation ofEpiblast Cells to the Embryonic Heart and other Mesodermal Lineages：The Role of Ingression and Tissue Movement during Gastrulation(上胚层细胞定位于胚心和其它中胚层谱系：原肠胚形成期间内移和组织运动的作用)，”Development.124：1631-1642(1999)，所述文献通过引用全部结合到本文中。X-gal染色的肿瘤和BM按照以下文献所述进行包埋：Lyden等，“Impaired Recruitment of Bone-marrow-derivedEndothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks TumorAngiogenesis and Growth(骨髓衍生的内皮细胞和造血祖细胞的募集减少能阻断肿瘤血管生成和生长)，”Nat.Med.7：1194-1201(2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中。

实施例3-荧光肿瘤转染

[0089]在转染前24小时，接种B16和LLC细胞(2×10⁵)。然后沉淀细胞并重悬于含有DsRed报道基因或GFP基因的慢病毒载体上清液的无血清培养基中。如前所述，效价为1-2×10⁸感染颗粒/ml的浓缩病毒构建体用于感染2×10⁶细胞/1ml(感染复数为50)。进行流式细胞术分析，证实荧光强度。给C57B1/6小鼠接种2×10⁶LLC/GFP⁺或B16/DsRed⁺细胞。

实施例4-免疫组织化学

[0090]按照先前所述的文献，固定组织并包埋在OCT中或石蜡块中：Lyden等，“Id1 and Id3 are Required for Neurogenesis，Angiogenesis and Vascularization of Tumor Xenografts(Id1和Id3是肿瘤异种移植物神经发生、血管发生和血管形成所必需的)，”Nature.401：670-677(1999)，所述文献通过引用全部结合到本文中。对于所有抗原来说，可使用以下抗体：VEGFR1(Flt-1，克隆mF-1，ImCloneSystems，New York，New York和Flt-1克隆C-17，Santa CruzBiotechnology)、CD31(PECAM，SC-1506，Santa Cruz Biotechnology)、VEGFR2(Flk-1/KDR，dc101，ImClone Systems)、MMP-9(D19557，Oncogene)、Id3(C-20，Santa Cruz Biotechnology)、纤连蛋白(TV-1，Chemicon)、CD11b(CBRM1/5，eBioScience)、CD34(RAM34，BDPharmigen)、ckit(ACK2，eBioScience)、PDGFRα(CD49d，VL-4，PS_2，Southern Biotech)、αV(Chemicon)、CD133(13A4，eBioScience)、α4(CD49d，VLA-4，PS_2，Southern Biotech)、α5(CD49e，5H10-27)、α6(CD49f，GoH3，BD Pharmingen)、β1(9EG7，BD Pharmingen)、β2(M18/2，BD Pharmingen)、β4(Santa Cruz Biotechnology)、β7(M293，BDPharmingen)、SDF-1(79018.111，R+D systems)、CXCR4(2B11，BDPharmingen)。

实施例5-双重免疫荧光

[0091]在OCT中将组织切片，然后用丙酮固定。用0.1％BSA/PBS洗涤，非特异性抗体用抗生物素蛋白和生物素(VectorLaboratories)封闭。将第一基本抗体(如上所述)在4℃孵育过夜。种属特异性生物素化第二抗体(Vectastain ABC Kit，Vector)在室温下孵育30分钟。然后将得克萨斯红抗生物素蛋白D或荧光素抗生物素蛋白D(Vector)孵育30分钟。对第二基本抗体重复该步骤。将切片浸入含有DAPI的荧光封固介质(Vectashield，Vector)中，如上所述进行观察。

实施例6-选择性骨髓移植

[0092]在第0、4和8天，Rosa-26小鼠接受腺病毒-VEGF₁₆₅(AdVEGF)(Avecilla等，“Chemokine-mediated Interaction ofHematopoietic Progenitors with the Bone Marrow Vascular Niche isRequired for Thrombopoiesis(趋化因子介导的造血祖细胞与骨髓血管生态位的相互作用，是血小板生成所必需的)，”Nat.Med.10：64-71(2004)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。在第12天，分离BM并用生物素化鼠VEGFR1抗体和抗生物素磁珠(Miltenyi Biotec)进行标记，用MACS(Miltenyi Biotec)分离。在3个连续步骤后，VEGFR1⁺BM的纯度为95％。负选择群体代表非R1细胞(Hattori等，“Placental Growth Factor Reconstitutes Hematopoiesis by RecruitingVEGFR1(+)Stem Cells from Bone-marrow Microenvironment(胎盘生长因子通过从骨髓微环境募集VEGFR1(+)干细胞而重建血细胞生成)，”Nat.Med. 8：841-9(2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。如上所述，对WT小鼠进行辐射并移植选择性BM。每3天一次经静脉内注射10⁵细胞，给Id3 KO(Id1⁺/⁺Id3^-/-)小鼠移植选择性Id3活性VEGFR1⁺BM，共23天。对照动物接受VEGFR1⁺细胞，没有肿瘤。

实施例7-抗体打靶

[0093]给WT小鼠接种2×10⁷LLC细胞或B-16细胞。为了封闭VEGFR-1，给小鼠腹膜内注射抗VEGFR1的大鼠抗小鼠抗体(mf-1，IgG1，400μg，ImClone)或抗VEGFR2的大鼠抗小鼠抗体(DC101，IgG1，800μg，ImClone)或组合，在第7-22天内每48小时一次，在第24天处死小鼠。为了封闭VLA-4的α4亚基，在第4、8和12天，给小鼠静脉内注射抗CD49d的大鼠抗小鼠抗体(克隆R1-2，IgG2bκ，200μg，BD BioSciences Pharmingen)。在第14天处死动物，评价簇的形成。为了在肿瘤发育后期靶向转移，在第6、10、14、18和22天注射抗α4抗体，在第24天处死动物。所有组都与大鼠抗小鼠IgG2aκ同种型对照(KLH/G2a1-1，Southem Biotech)进行比较，该对照是按照与实验组相同的时间表来给药的。

实施例8-MMP-9 KO

[0094]得自Jackson Laboratory的小鼠具有C57BL6背景。

实施例9-体外聚集测定

[0095]在第14天，从植入B16细胞的小鼠分离出BM衍生的VEGFR1⁺细胞。对R1⁺细胞(5×10⁵)进行荧光红(PKH26-GL，Sigma，St.Louis，MO)染色，并培养在含0.2％明胶的M199培养基(补充10％FCS)中，与rhVEGF(10ng/mL，R&D Systems)、抗VEGFR1(10μg/ml，mf-1，ImClone)或抗α4(CD49，PS_2，20μg/ml，Southern Biotec)一起孵育14小时。同样，将VEGFR1⁺细胞与rhVEGF、抗VEGFR1、抗α4一起孵育1小时，然后与肿瘤细胞一起孵育14小时，进行研究。将R1⁺细胞与B-16肿瘤细胞或LLC肿瘤细胞、标记的荧光绿(PKH2-GL，Sigma)共培养(Lee等，“In Situ Labeling of Adherent Cells with PKH26(贴壁细胞与PKH26的原位标记)，”In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal.36：4-6(2000)，所述文献通过引用全部结合到本文中)，分析聚集和增殖。

实施例10-条件培养基研究

[0096]按照以下文献，从在B-16细胞或LLC细胞上培养18小时的无血清培养基中过滤出条件培养基(0.22μ)：Kessinger等，“Circulating Factors may be Responsible for Murine Strain-specificResponses to Mobilizing Cytokines(循环因子负责针对游动细胞因子的鼠品系特异性反应)，”Exp.Hematology.29：775-778(2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。如上所述，每天将CM(300μl)经腹膜内注射给4周前已经接受Rosa-26 BMT的WT小鼠，共注射9天。对组织的纤连蛋白(TV-1，Chemicon)和β-gal进行染色。对于肿瘤改道研究，腹膜内注射黑素瘤CM(300μl)或PIGF(300μl，Peprotec)，2天后皮内植入LLC细胞，再每日继续注射21天。给予有或无肿瘤的对比对照组无血清培养基。为了抑制肿瘤改道，按照抗体打靶研究所述，将抗VEGFR1抗体注射给具有LLC肿瘤接受MCM的实验组。第22天检查组织。如上所述，有或无肿瘤的以上对比对照组用或不用抗体进行治疗。

[0097]每天给WT动物注射黑素瘤条件培养基(300μL)，共7天，然后尾静脉注射B16黑素瘤肿瘤细胞。将MCM或无血清RPMI给予小鼠，然后每天注射B16，直到它们在给予静脉内肿瘤后24小时或4天被处死。用PBS灌注肺部，然后冷冻包埋在OCT内。

实施例11-迁移测定

[0098]接下来研究了VEGFR1细胞响应条件培养基的迁移。如上所述分离出VEGFR1细胞，将悬浮于无血清培养基中的1×10⁵细胞放入5μm pore transwells(Costar，Corning Incorporated)的上室。让细胞在条件培养基或相应对照培养基中迁移18小时，每6小时将细胞从膜下和下室中刮下并捣碎，并用血球计数器和锥虫蓝对细胞计数进行分析。如先前所述，用12μm pore transwells进行B16肿瘤细胞或LLC肿瘤细胞向VEGFR1⁺细胞的迁移(Redmond等，“Endothelial Cells Inhibit Flow-induced Smooth Muscle Cell Migration：Role of Plasminogen Activator Inhibitor-1(内皮细胞抑制流动诱导的平滑肌细胞迁移：纤溶酶原激活物抑制剂-1的作用)，”Circulation103：597-603(2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。将荧光标记的肿瘤细胞(PKH2-GL，Sigma)以1×10⁵细胞接种在上室中，将1×10⁵VEGFR1细胞接种在下室的无血清培养基中。上下室没有浓度梯度。每6小时进行一次分析，用倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse TE2000-U)进行直接观察和手工统计每200x视野下的细胞数目。

实施例12-多种组织中纤连蛋白的定量PCR分析

[0099]如前所述，用组织匀浆器在TriZol中将肺组织匀浆，抽提RNA(Hashimoto等，“Bone Marrow-derived Progenitor Cells inPulmonary Fibrosis(肺纤维化中的骨髓衍生祖细胞).”The Journal ofClinical Investigation 113：243-252(2004)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。如前所述，用TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)定量测定纤连蛋白基因表达，并归一化至GAPDH(Jensen等，“TheHuman Herpes Virus 8-encoded Chemokine Receptor is Required forAngioproliferation in a Murine Model of Kaposi′s Sarcoma(人疱疹病毒8编码的趋化因子受体是卡波西肉瘤鼠模型中血管增殖所必需的)，”Journal of Immunology 174：3686-94(2005)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。

实施例13-趋化因子测定

[0100]按照各制造商使用说明书，用ELISA(Quantikine，R&DSystems)分析条件培养基和无血清培养基以及肿瘤衍生血浆的VEGF和PlGF浓度。肿瘤衍生血浆得自LLC肿瘤细胞或B16肿瘤细胞后第14天的小鼠。

实施例14-流式细胞术研究

[0101]按照以下文献，将外周血单核细胞与荧光缀合的单克隆抗体CD11b(M1/70，PE抗小鼠，BD Pharmingen)、Sca-1(E13-161.7，PE和FITC抗小鼠Ly-6A/E，Becton Dickinson)和VEGFR1(克隆mf-1，FITC，ImClone Systems)一起孵育：Gill等，“Vascular Trauma InducesRapid But Transient Mobilization of VEGFR2⁺AC133⁺ EndothelialPrecursor Cells(血管创伤诱导VEGFR2⁺AC133⁺内皮祖细胞的快速而瞬时动员)，”Circulation Research 88：167-174(2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中。如前所述，在用PBS通过右心室注射对肺进行灌注后，对整个右肺也进行流式细胞术，再将肺切成小块，用100μm和40μm滤器(BD BioSciences)过滤，形成单细胞悬液。得到单细胞悬液之后，对于cKit流式分析，将细胞用perCP cKit直接染色，无需固定，再放入PBS中，在Coulter FC500细胞计数器上进行分析。

实施例15-人体标本

[0102]人体标本包括肿瘤、近端正常(肿瘤边界之外)、远端正常和淋巴结。如上所述，将组织包埋在石蜡中，冷冻固定，用抗VEGFR1(FB5，ImClone Systems)和Flt-1(Calbiochem)的抗体染色。按照已批准IRB申请获取和处理组织样品。

实施例16-定量免疫组织化学分析

[0103]利用IP Lab和Adobe Photoshop7.0，随机得到100x视野，通过选择标准颜色范围分析β-gal或免疫组织化学染色。一旦描绘该边界，就可求出pixilation直方图下面积，将总染色面积与总组织面积进行比较。

实施例17-统计学分析

[0104]结果用平均值±标准误差表示。采用学生检验分析数据，用GraphPad Prism统计学程序进行方差分析。P值＜0.05为显著。误差条(Error bar)描述了平均值的标准误差。

[0105]申请人分析了在皮内原发性肿瘤注射后β-半乳糖苷酶⁺(β-gal⁺)骨髓(BM)衍生细胞的命运。采用Lewis肺癌(LLC)肿瘤细胞(其通常转移至肺部，很少转移至肝脏)，或B16黑素瘤肿瘤细胞(其具有更广泛的播散性转移潜力)。在皮内注射各肿瘤类型之后，将肺、肝、脾、肾和性腺切片并染色，用于观察β-gal⁺BM细胞是否存在，或者筛选GFP⁺BM细胞。辐射后但在肿瘤植入前，在小鼠肺部极少或未见β-gal⁺(0.01％±0.01 β-gal染色/100x视野)或GFP⁺BM衍生细胞(图1A&1B左图)。到肿瘤植入后第14天、肿瘤细胞到达之前，在终末细支气管和远端肺泡附近检测到β-gal⁺(3.2％±1.2 β-gal染色/100x视野，经学生氏t检验，p＜0.05)或GFP⁺BM衍生细胞的外渗和簇形成，终末细支气管和远端肺泡都是未来转移的常见部位(图1A&1B，左中图&插图)。到第16天，β-gal⁺簇(包含20-100个具有组织化的基质元件的细胞)显示出未来转移性病灶的外廓(图1A，右中图)。在第18天可见各个红色荧光肿瘤细胞，与先前存在的BM衍生簇相结合(图1B，右中图)，到第23天发展成微小转移(图1A&1B，右图)。甚至在已确定肿瘤转移时仍保持β-gal⁺BM细胞的存在(图1A，右图插图)。实施例18-骨髓衍生细胞在肿瘤细胞扩散前到达

[0106]为了进一步确定肿瘤细胞到达的时间，进行流式细胞术研究，以确定GFP⁺骨髓衍生细胞和红色荧光标记的肿瘤细胞的存在。在第8天之前，肺部可见最小GFP⁺BM衍生细胞(图1C左图&表格)。自第12天开始，BM衍生细胞开始迁移到肺部，这与经显微镜观察到的BM衍生簇是一致的(图1C)。这些细胞数增加，在第18天与肿瘤细胞结合(图1C)。在16天之前，经显微镜或流式细胞术都未检出肺部的肿瘤细胞。随时间延长，通过流式细胞术鉴定出肺部肿瘤细胞的数量增加，与显微照片图像中可见的已建立的骨髓衍生簇部位的肿瘤细胞粘附和增殖是相互对应的(图1B&1C)。检出肿瘤细胞与GFP⁺BM衍生簇的共成簇频率大于95％(97％±1.1，图1B，右图)。尽管用该方法可能会漏失少量肿瘤细胞，但是给予来自培养的B16黑素瘤细胞的条件培养基的小鼠，进一步实验表明，条件培养基单用可引起骨髓衍生细胞的动员和转移前生态位的形成。采用尾静脉肿瘤转移模型，用条件培养基刺激后引入肿瘤细胞(图1D)与单用培养基进行比较(图1D)，在注射后1天，增加了肺部肿瘤细胞数(图1D，141.3±10.2肿瘤细胞，对比2.7±0.6肿瘤细胞/肺横切片，经学生氏t检验，p＜0.01)。静脉内肿瘤细胞注射4天后，肺部转移小结的频率和大小增加(207肿瘤细胞±5.6/肺横切片，对比14肿瘤细胞±1.7/肺横切片，经学生氏t检验，p＜0.01)。红色荧光肿瘤细胞针对GFP⁺簇的共定位分析是在各时间点都大于93％，表明这些BM衍生细胞有助于肿瘤细胞粘附和增殖。因此，在原发性肿瘤所释放因子的影响下，BM衍生细胞进入血流并运动到远端特异性转移前部位。实施例19-BM衍生细胞簇位点是肿瘤类型特异性的

[0107]检查了肿瘤细胞类型是否决定BM簇在机体内特异性转移前部位的分布(图1E)。皮内注射LLC肿瘤细胞，导致BM簇的形成仅限于肺部(47.5±2.6/100x视野)和肝(10.8±1.1)，而在睾丸、脾或肾未见簇，这是因为该类肿瘤细胞的转移特异性。相比之下，B16黑素瘤肿瘤细胞导致多器官形成BM簇，例如肺(103.8±6.9)、肝(41.8±2.4)、睾丸(36.6±3.1)、脾(25±3.2)和肾(20.6±1.8)，对应于该肿瘤转移的常见器官(图1E)。此外，与B16黑素瘤细胞更具攻击性转移特性一致的是，它们诱导比LLC肿瘤细胞明显更多的簇(经学生氏t检验，p＜0.01)。

实施例20-这些BM衍生细胞的表征表明造血祖细胞的状况

[0108]接下来表征了BM衍生簇的细胞组成。肿瘤细胞类型所诱导的簇表达VEGFR1(图1F，3.9±0.2，高于野生型)。在单用辐射之后，肺实质中GFP⁺BM衍生簇共表达VEGFR1(图1F)，相比之下，VEGFR1只有极少表达(图1F)。对这些细胞簇进一步表征，显示大多数BM衍生细胞是VEGFR1⁺共表达CD133(图1G)、CD34(图1G)和CD117(cKit)(图1G&图1H)，这表明这些细胞亚类来源于原始造血细胞。BM衍生簇也显示出一定程度的成熟异质性，因为某些细胞上存在骨髓单核细胞标记CD11b。原发性肿瘤植入后，对肺部祖细胞进行分析，概括了先前研究的时间进程。正如流式细胞术所见，CD117⁺细胞先于GFP标记的肿瘤细胞到达肺部(图1H)。早期VEGFR1⁺BM簇缺乏VEGFR2(图5A)和CD31的表达(图5A)。进一步的动力学研究表明，VEGFR2⁺CEP迁移到BM衍生簇，与肿瘤细胞的到达是一致的(图5B)。完全形成的转移前生态位含有骨髓衍生的VEGFR2⁺内皮祖细胞(图5)。这些发现确定，BM衍生的VEGFR1⁺造血细胞促使和维持转移前生态位，并提供允许的微环境，以促使和维持肿瘤转移。

实施例21-在自发肿瘤模型中出现BM衍生簇

[0109]将植入肿瘤的发现与用自发肿瘤模型的发现进行比较。选择过量表达c-Myc的转基因小鼠，用于其早期发作和高侵袭性肿瘤扩散到淋巴系统。在生命的第40天，在肿瘤发作之前，在淋巴结中明显检出VEGFR1⁺簇(145.1±16.4簇/100x视野，图1I，中图和插图)，相比之下，野生型同窝出生幼仔可见缺乏簇(0.4±0.3簇/100x视野，图1I，左图，经学生氏t检验，p＜0.001)。在肺和肝等其它器官中未见这些簇。到生命的第4个月，VEGFR1⁺簇持续扩散到已建立的淋巴瘤中，但比转移前状态的程度更小(c-Myc小鼠中为67.8±9.5簇/1 00x视野，对比同窝出生幼仔中为0.7±0.5簇/100x视野，图1I，右图和插图，经学生氏t检验，p＜0.001)。显然，VEGFR1⁺细胞簇周围的淋巴瘤细胞并不表达VEGFR1(图1I，右图插图)。

实施例22-人体组织中的常见转移部位出现BM衍生细胞簇

[0110]  为了证实在小鼠模型中得到的数据说明VEGFR1⁺细胞簇的肿瘤特异性形成，分析来自原发性实体瘤患者的人体组织。在人原发性肿瘤和肿瘤转移组织中都可见VEGFR1⁺簇(图6A；乳癌-腋窝淋巴结，图6C；肺癌，图6E；食道癌)。肿瘤扩散之前，在转移常见部位细胞簇增加，说明该组织的恶性化潜力(图6，簇/100x视野：图6B；腋窝淋巴结21±5，图6D；肺19±4，图6F；GE连接25±4)。得自没有恶性肿瘤的患者的正常人淋巴结和肺组织不显示形成VEGFR1⁺簇(图6B，6D插图)。

实施例23-靶向选择性BM群体，揭示肿瘤转移中VEGFR1⁺细胞的功能作用

[0111]通过将纯化VEGFR1⁺BM细胞选择性移植给受过辐射的小鼠，评价这些祖细胞促进转移前簇的潜力。在LLC植入后24天，移植完整BM的对照小鼠(WT)显示出明显的肺转移(图2A，左图)，与良好建立的血管相关(图2A，左图插图)。然而，移植纯化VEGFR1⁺BM群体的小鼠在肺部形成多个由少量肿瘤细胞组成的微小转移(图2A，中图箭头&表格，25±9微小转移/100x视野)并具有异常血管系统(图2A，中图插图)。该结果表明，VEGFR1⁺HPC能够促进转移前簇，其可吸引肿瘤细胞，形成微小转移。相比之下，VEGFR1⁺细胞的BM耗尽，就不能产生转移前簇(图2A右图&表格，经单侧ANOVA，p＜0.01)。

[0112]为了确定破坏VEGFR1⁺细胞簇是否能阻断良好建立的肿瘤的转移，接种LLC或B16肿瘤的小鼠用特异性抗鼠VEGFR1、VEGFR2或这两者的单克隆抗体进行治疗。该方法允许选择性靶向VEGFR1⁺HPC，因为这些肿瘤细胞不表达VEGFR1或VEGFR2。在第24天，对两种肿瘤类型来说，广泛扩散的转移都是明显的，正如在具有LLC的动物肺部所见(图2B，左图&表格)或在具有B16黑素瘤的动物脾脏所见(图2B右图和插图)。单用抗VEGFR1抗体治疗消除了对簇的引发作用并预防转移(图2B&表格，经单侧ANOVA，p＜0.01)，而抗VEGFR2抗体不改变VEGFR1⁺簇的形成，但能预防微小转移的发展(15±11微小转移/簇/100x)(图2B，插图&表格)。两种抗体的组合能阻断簇的建立，与抗VEGFR1治疗类似；然而，在一只动物肺部观察到分离的B16转移性病灶(图2B，插图)。总起来说，这些结果表明，靶向VEGFR1⁺细胞簇形成，可预防肿瘤细胞粘附、增殖和转移扩散。

实施例24-VLA4、MMP-9和Id3参与转移前生态位的形成

[0113]接下来研究了HPC因其与转移前微环境之间相互作用，而从细胞簇迁移的细胞机制和分子机制。整联蛋白α4β1(VLA-4)与其配体纤连蛋白的相互作用对骨髓基质内早期造血细胞的迁移是必不可少的(Burger等，“CXCR4 Chemokine Receptors(CD184)andα4β1 Integrins Mediate Spontaneous Migration of Human CD34⁺Progenitors and Acute Myeloid Leukaemia Cells Beneath MarrowStromal Cells(pseudoemperipolesis)(CXCR4趋化因子受体(CD184)和α4β1整联蛋白介导人CD34⁺祖细胞和急性骨髓性白血病细胞下骨髓基质细胞的自发迁移(假伸入运动))，”British Journal of Haematology122：579-589(2003)和Scott等，“Deletion of α4 Integrins from AdultHematopoietic Cells Reveals Roles in Homeostasis，Regeneration，andHoming(从成体造血细胞中缺失α4整联蛋白，揭示了α4整联蛋白在体内平衡、再生和归巢中的作用)，”Molecular and Cellular Biology23：9349-9360(2003)，所述文献通过引用全部结合到本文中)以及对循环中成熟的白细胞的迁移也是必不可少的(Neeson等，“Lymphocyte-Facilitated Tumour Cell Adhesion to Endothelial Cells：The Role of HighAffinity Leukocyte Integrins(淋巴细胞促进肿瘤细胞粘附到内皮细胞上：高亲和性白细胞整联蛋白的作用)，”Pathology 35：50-55(2003)和Jonjic等，“Molecules Involved in the Adhesion and Cytotoxicity ofActivated Monocytes on Endothelial Cells(参与内皮细胞上活化单核细胞粘附和细胞毒性的分子)，”The Journal of Immunology 148：2080-2083(1992)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。因此，可以评价VEGFR1⁺细胞是否也可表达整联蛋白，因而促进该细胞类型与转移前生态位的相互作用。已经发现，在转移前簇的VEGFR1⁺HPC表达VLA-4(图3A和插图，VEGFR1的共表达)，但对αv整联蛋白却是阴性的。这表明这些细胞上VLA-4的表达允许BM衍生细胞粘附到转移前生态位上。簇形成后，在骨髓细胞及其相关基质内也是重要的α4β7整联蛋白以及α6β4在转移生态位内是明显弥散性分布的。造血细胞所产生的基质金属蛋白酶9(MMP-9)等蛋白酶可通过释放可溶性Kit-配体和VEGF-A用于分解基底膜并改变局部微环境，以支持新引入的细胞表达cKit(Hessig等，“Recruitment of Stem and Progenitor Cellsfrom the Bone Marrow Niche Requires MMP-9 Mediated Release of Kit-ligand(来自骨髓生态位的干细胞和祖细胞的募集需要MMP-9介导的Kit-配体的释放)，”Cell 109：625-37(2002)和Bergers等，“MatrixMetalloproteinase-9 Triggers the Angiogenic Switch DuringCarcinogenesis(在肿瘤发生期间，基质金属蛋白酶-9触发血管生成开关)，”Nat Cell Biol 2：737-744(2000)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。另外，因为纤连蛋白结合，通过α4β1信号转导可增加金属蛋白酶表达(Huhtala等，“Cooperative Signalling by alpha 5 beta 1 andalpha 4 beta 1 Intergrins Regulates Metalloproteinase Gene Expresson inFibroblasts Adhering to Fibronectin(α5β1和α4β1整联蛋白协同信号转导，调节粘附于纤连蛋白的成纤维细胞中的金属蛋白酶基因表达)，”Journal of Cell Biology 129：867-879(1995)和Yakubenko等，“Differential Induction of Gelatinase B(MMP-9)and Gelatinase A(MMP-2)in T Lymphocytes Upon alpha(4)beta(1)-mediated Adhesion toVCAM-1 and the CS-1 Peptide of Fibronectin(在α(4)β(1)介导的与VCAM-1和CS-1纤连蛋白肽的粘附时，T淋巴细胞中的明胶酶B(MMP-9)和明胶酶A(MMP-2)的差异诱导)，”Exp.Cell Res.260：3-84(2000)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。在转移前簇中可见MMP-9的表达以及VLA-4分布，表明MMP-9的产生可能是在这些VEGFR1⁺HPC中的整联蛋白结合和活化的结果(图3A)。这些发现与Hiratsuka等先前的工作是一致的并扩展了该工作，证明在转移前肺部VEGFR1介导的对MMP-9表达的诱导(Hiratsuka等，“MMP9Induction by Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 is Involvedin Lung-specific Metastasis(血管内皮生长因子受体-1对MMP9的诱导，参与肺特异性转移)，”Cancer Cell.2：289-300(2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。

[0114]先前已经知道，Id基因的上调对于原发性肿瘤生长的祖细胞动员是至关重要的(Ruzinova等，“Effect of AngiogenesisInhibition by Id Loss and the Contribution of Bone-marrow-derivedEndothelial Cells in Spontaneous Murine Tumours(自发鼠肿瘤中，Id缺失的血管生成抑制效应和骨髓衍生内皮细胞的贡献)，”Cancer Cell.4：277-289(2003)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。与VLA-4的分布一致，在簇内也可见Id3的表达(图3A和插图，VEGFR1和Id3的共表达)。该结果表明，Id3上调可促进VEGFR1⁺细胞向转移前生态位运动。另外，特异性整联蛋白的表达受到Id基因活化的调节，并可负责BM衍生细胞和基质细胞相互作用、运动性和募集(Ruzinova等，“Effect of Angiogenesis Inhibition by Id Loss and the Contribution ofBone-marrow-derived Endothelial Cells in Spontaneous Murine Tumours(自发鼠肿瘤中，Id缺失的血管生成抑制效应和骨髓衍生内皮细胞的贡献)，”Cancer Cell.4：277-289(2003)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。

[0115]为了证实这些蛋白质在已建立的转移前生态位内的功能作用，在MMP-9和Id3敲除小鼠中抑制VLA-4的表达(用抗α4抗体)或研究VEGFR1⁺细胞簇的形成。这些模型中的每一种都用肿瘤攻击，在肿瘤植入后3周，发现簇的形成减少(图3)，转移扩散也减少。与野生型对照相比(3,283 VEGFR1⁺CD11b⁺细胞/μl)，在响应肿瘤接种后，在Id突变型小鼠循环中的被动员的VEGFR1⁺细胞减少，说明HPC动员减少(654 VEGFR1⁺CD11b⁺细胞/μl)(经学生氏t检验，p＜0.01，图9)。这证明先前在这些动物中所见到的原发性肿瘤生长减少，可用于解释它们的转移性表型减少。

[0116]在Id3-/-小鼠中，为了正式检查野生型VEGFR1⁺细胞恢复转移缺陷的潜力，将Id3活性GFP⁺VEGFR1⁺HPC静脉内注射给带有LLC肿瘤的Id3 KO小鼠。在肿瘤植入后21天，单独引入野生型VEGFR1⁺细胞，重建簇形成和微小转移(图3B)。值得注意的是，LLC转移性病灶与预先设定的GFP⁺BM衍生簇相关(图3B)。这些发现进一步强调了建立簇和转移所需的VEGFR1⁺BM衍生细胞的功能作用。实施例25-组织实质中纤连蛋白以VLA-4⁺BM衍生细胞的趋触性配体的形式存在

[0117]在注射原发性肿瘤之后、BM衍生的VLA-4⁺VEGFR1⁺细胞归巢之前，检查组织实质，以确定组织特异性配体的表达是否可介导粘附和这些BM簇的形成。的确，通过免疫组织化学分析和定量PCR，在LLC注射之后，随时间延长，从第3-14天可见在肺部的未来转移生态位附近纤连蛋白表达增加，相比之下，在WT肺可见基线纤连蛋白表达(图3C和3E)。此外，响应原发性肿瘤而增殖的驻留成纤维细胞样基质细胞(图3)可促进局限性纤连蛋白。对于植入B16的小鼠而言，可见肺部纤连蛋白表达与接种LLC的小鼠的分布类似(图3D)。此外，看来纤连蛋白在VEGFR1⁺簇中表达(图3D)。在暴露给黑素瘤条件培养基的多种组织(例如肠和输卵管)中，纤连蛋白表达明显增加，这与B16肿瘤对这些部位的更具侵袭性的转移特性是一致的(经单侧ANOVA，对于来自给予MCM的小鼠输卵管与LCM处理的或WT组织进行比较，对于第3-5天的纤连蛋白表达，p＜0.05，对于第7-9天的纤连蛋白表达，p＜0.001；经单侧ANOVA，对于来自给予MCM的小鼠肠组织与LCM处理的或WT组织进行比较，对于第7-9天的纤连蛋白表达，p＜0.001，图7A和7B)。

实施例26-VEGFR1⁺细胞促进肿瘤细胞迁移、粘附和增殖

[0118]为了证实VEGFR1⁺祖细胞促进肿瘤细胞的趋化性和附着，分离来自植入肿瘤小鼠的VEGFR1⁺细胞，并进行红色荧光标记(PKH26-G1)(图8)。在与绿色荧光标记的(PKH2-GL)B16或LLC细胞体外共孵育1小时中，造血祖细胞聚集并增殖(升高150％)，促进肿瘤细胞的附着和增殖。相比之下，先前在抗VEGFR1或抗VLA-4抗体存在下培养的VEGFR1⁺HPC阻断该结合亲和性和扩增(图8A)。此外，进行transwell迁移测定，其中与非VEGFR1细胞(11.2±0.4)和单用培养基(9.9±0.9)相比，荧光标记的肿瘤细胞运动性增加，以响应骨髓衍生的VEGFR1⁺细胞(29.6±1.4肿瘤细胞/200x)(图8B，经单侧ANOVA，p＜0.001)。已知SDF-1/CXCR4轴在BM祖细胞归巢和保留在骨髓的某些生态位中起到突出作用(Ratajczak等，“Stem CellPlasticity Revisted：CXCR4-positive Cell Expressing mRNA for EarlyMuscle，Liver and Neural Cells‘Hide Out’in the Bone Marrow(干细胞可塑性Revisted：在骨髓中，CXCR4阳性细胞表达mRNA，用于早期肌肉、肝脏和神经细胞“藏匿”)，”Leukemia.18：29-40(2004)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。在许多生理过程中，类似于来自骨髓的造血干细胞和祖细胞的动员利用该轴，表达CXCR4的特异性肿瘤细胞类型也以此方式迁移，以响应局部趋化因子梯度(Lapidot等，“Current Understanding of Stem Cell Mobilization：The Roles ofChemokines，Proteolytic Enzymes，Adhesion Molecules，Cytokines andStromal Cells(目前对干细胞动员的理解：趋化因子、蛋白水解酶、粘附分子、细胞因子和基质细胞的作用)”Experimental Hematology.30：973-981(2002)，Balkwill，F.，“The Significance of Cancer CellExpression of the Chemokine Receptor CXCR4(癌细胞表达趋化因子受体CXCR4的重要性)，”Seminars in Cancer Biology.14：171-179(2004)和Muller等，“Involvement of Chemokine Receptor in Breast CancerMetastasis(趋化因子受体参与乳癌转移)，”Nature.410：50-56(2001)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。在完全形成的转移前簇内，含有VEGFR1⁺细胞、成纤维细胞和纤连蛋白(参见图1A，左图)，SDF-1(CXCL12)被高表达(图8C)。鉴定了CXCR4以扩散形式遍布于已建立的原发性黑素瘤中，但对于LLC是在“活性”边缘的局部区域(图8D)。起源于转移前生态位的趋化因子梯度的存在，可用于吸引CXCR4⁺肿瘤细胞。这些发现表明，由肿瘤类型决定的纤连蛋白上调，使VLA-4⁺VEGFR1⁺造血簇能够结合，是形成转移前生态位所必需的。另外，这些簇与肿瘤细胞之间通过VEGFR1和VLA-4和SDF-1和CXCR4的表达相互作用，支持转移前生态位发展成为转移。

实施例27-肿瘤衍生的条件培养基有助于决定肿瘤转移扩散的具体模式

[0119]为了进一步研究LLC细胞和B16细胞的选择性转移潜力，从这两类培养中的肿瘤细胞中得到条件培养基。腹膜内注射LLC条件培养基(LCM)，使得可能从驻留的成纤维细胞表达纤连蛋白并形成BM衍生簇(图4A)，与单用培养基相比(图4)，以类似方式，但比原发性皮内LLC更快。相当于皮内B16肿瘤效果，但是更快；黑素瘤条件培养基(MCM)决定了肝脏中纤连蛋白表达比LCM更高(图4B)。与单用培养基相比(图4B)，MCM也引起成纤维细胞增殖和纤连蛋白表达增加，同时在许多器官中形成簇，正如在肠中所见的一样(图4B和图7A和7B)。与带有LLC的动物相比，在带有B16肿瘤的动物中，观察到增加的簇(图1)。假如MCM以比LCM更普遍的方式促进簇的形成，随后研究生长因子的不同是否有助于解释这两种条件培养基的转移潜力和特性(图4C)。在这两组条件培养基中都发现高水平的VEGF，比来自荷瘤动物的血浆更高。然而，对于两种条件培养基，检出胎盘生长因子(PlGF)水平的明显差异，其信号转导仅通过VEGFR1。MCM和黑素瘤衍生的血浆含有显著较高水平的PlGF，相比之下，在LCM和LLC衍生血浆中发现极少或没有PlGF(图4C)。此外，在低转移性变异体LLC中，与其更具侵袭性的对应物相比，对于条件培养基和血浆来说VEGF和PlGF都低得多。在transwell测定中，与其它生长因子条件相比，LCM和MCM最有效地增加VEGFR1⁺骨髓衍生细胞的迁移(LCM 55％±0.4，MCM 68.1％±5，培养基10.8％±1.7，图4D，经单侧ANOVA，p＜0.001)。考虑到这些结果，有个疑问就是：在MCM中细胞因子(例如PlGF)是否能将LLC转移改到非常规转移部位。在LLC皮内肿瘤植入之前，通过腹膜内注射给予MCM，此后每天注射，结果LLC转移从肝和肺改为B16黑素瘤中常见的部位，例如肾、脾、肠和输卵管(图4E)。在带有LLC肿瘤植入物和进行MCM注射的小鼠中，VEGFR1抗体阻断簇的形成并阻止LLC转移的改道。这些结果证明，条件培养基中存在的肿瘤特异性趋化因子和/或细胞因子以及VEGFR1细胞簇在肿瘤扩散的复杂的多维生物化学和细胞程序中形成另一决定子。

[0120]决定具体肿瘤转移到预定转移位置的精确的细胞和分子机制尚不知道。许多肿瘤偏好转移到特定部位。根据目前的知识，相信转移倾向反映了肿瘤细胞本身固有的分子差异，并受周围基质细胞的潜在影响，其包括血管结构、结缔组织和免疫细胞(Hynes，R.O.，“Metastatic Potential：Generic Predisposition of the Primary Tumour orRare，Metastatic Variants-or Both？(转移潜力：原发性肿瘤或稀有转移变异体或这两者的普遍倾向？)，”Cell.113：821-3(2003)，Bergers等，“Benefits of Targeting Both Pericytes and Endothelial Cells in theTumour Vasculature with Kinase Inhibitors(在肿瘤血管系统中，用激酶抑制剂靶向周细胞和内皮细胞的益处，”J Clin Invest.111：1287-95(2003)，Fidler，I.，“The Organ Microenvironment and Cancer Metastasis(器官微环境与癌转移)，”Differentiation.70：498-505(2002)，Duda等，“Differential Transplantability of Tumour-associated Stromal Cells(肿瘤相关基质细胞的不同移植力).”Cancer Research 64：5920-5924(2004)和Folkman，J.，“Role of Anigiogenesis in Tumour Growth and Metastasis(血管生成在肿瘤生长和转移中的作用)，”Semin.Oncol.29：515-8(2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。以上结果导出新概念：肿瘤转移按明确定义的事件顺序启动，依赖于分子书签(molecularbookmarking)，即通过将VEGFR1⁺细胞发送以在靶器官中形成特异性允许的生态位。以上数据进一步表明，肿瘤分泌体液因子的区别促进转移扩散到特定远端器官中。在肿瘤植入后几天内，在某些位置，纤连蛋白受到靶器官内驻留的成纤维细胞和成纤维细胞样细胞的上调，所述靶器官已知是对应于特定原发性肿瘤的未来转移部位。同时，造血祖细胞从骨髓被动员进入外周循环中，参见Hessig等，“Recruitment of Stem and Progenitor Cells from the Bone Marrow NicheRequires MMP-9 Mediated Release of Kit-ligand(募集骨髓生态位中的干细胞和祖细胞，需要MMP-9介导的Kit配体的释放)，”Cell.109：625-37(2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。作为来自纤连蛋白的生态位特异性方向的提示，表达VLA-4并产生MMP-9的VEGFR1⁺HPC可穿过已建立的内皮，以便在肿瘤和VEGFR2⁺内皮细胞到达之前形成转移前生态位。随着MMP-9的产生并改变微环境，这些簇增加了SDF-1表达，产生趋化因子梯度，而Id3活化导致整联蛋白上调，允许吸引肿瘤细胞，它们结合到生态位上，因而发展成完整转移性病灶。正如所见到的，由VEGFR1抗体造成的抑制或将VEGFR1⁺细胞从骨髓中去除，会阻止转移前簇的形成并因此转移。此外，阻断VEGFR1或VLA-4，可防止造血簇细胞和肿瘤细胞的结合和建立。将野生型VEGFR1⁺细胞引入Id3敲除小鼠中，恢复转移前生态位和转移，表明Id3的表达诱导包括MMP-9、整联蛋白和可能的趋化因子在内的必要元件的表达，其提供VEGFR1⁺细胞归巢的路径图，这是建立转移前生态位必不可少的。

[0121]目前，许多关注都集中在炎性细胞在辅助肿瘤粘附和侵袭远端器官中的作用方面(Coussens等，“Inflammation and Cancer(炎症与癌症)，”Nature.420：860-867(2002)，Borsig等，“Synergistic Effectsof L-and P-selectin in Facilitating Tumour Metastasis can Involve Non-mucin Ligands and Implicate Leukocytes as Enhancers of Metastasis(L-选择蛋白和P-选择蛋白在促进肿瘤转移上的协同效应，可包括非粘蛋白配体并暗示白细胞作为转移的促进剂)，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：2193-2198(2000)，Lin等，“Colony Stimulating Factor 1 PromotedProgression of Mammary Tumours to Malignancy(集落刺激因子1促进乳腺肿瘤发展成为恶性肿瘤)，”J.Exp.Med.139：727-740(2001)和Qian等，“L-selectin can Facilitate Metastasis to Lymph Nodes in a TransgenicMouse Model Model of Carcinogenesis(在转基因小鼠致癌模型中，L-选择蛋白可促进肿瘤转移到淋巴结)，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：3976-3981(2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。该研究中鉴定的VEGFR1⁺HPC表达的特性为炎症生理途径所共有，即通过提供必要的粘附分子、蛋白酶、趋化因子和生长条件，以产生对肿瘤细胞移植有利的微环境(Bergers等，“Matrix Metalloproteinase-9Triggers the Angiogenic Switch During Carcinogenesis(在肿瘤发生期间，基质金属蛋白酶-9触发血管生成开关)，”Nat Cell Biol.2：737-744(2000)，Muller等，“Involvement of Chemokine Receptor in BreastCancer Metastasis(趋化因子受体参与乳癌转移)，”Nature.410：50-56(2001)和Schoppman等，“Tumour-associated Macrophages ExpressLymphatic Endothelial Growth Growth Factors and are Related toPeritumoural Lymphaniogenesis(肿瘤相关巨噬细胞表达淋巴内皮生长因子，并与肿瘤周围的淋巴发生相关)，”Am.J.Pathol.161：947-956(2002)，所述文献通过引用全部结合到本文中)。尽管与炎症相似，但转移前生态位保持未分化状态，当观察VEGFR1⁺祖细胞群体时。这是第一个直接证据，表明非肿瘤细胞群体可预示未来的转移部位。此外，人体组织中造血簇的鉴定先于肿瘤扩散的证据，这清楚表明，使用抗VEGFR1和VLA-4，在临床环境下鉴定和预防转移。该概念将对肿瘤分期产生巨大影响，并将改变辅助化疗的前景。

[0122]本文尽管已经详细说明了优选的实施方案，但是对于所属领域的技术人员显而易见的是，只要不偏离本发明的精神，就可以对本发明进行各种修改、添加、取代等，因此这样的修改、添加、取代也被视为落入本发明所附权利要求书限定的范围之内。

Claims (56)

1.一种抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的方法，所述方法包括：

在有效抑制癌症患者远离肿瘤原先形成部位的部位肿瘤形成的条件下，给予所述癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述给予是在刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。

3.权利要求2的方法，其中通过化疗、应激、手术、炎症、辐射或生长因子刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

4.权利要求3的方法，其中通过化疗来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

5.权利要求3的方法，其中通过应激来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

6.权利要求3的方法，其中通过手术来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

7.权利要求3的方法，其中通过炎性细胞的动员来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

8.权利要求3的方法，其中通过辐射来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

9.权利要求3的方法，其中通过生长因子来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

10.权利要求9的方法，其中所述生长因子选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子和刺激骨髓细胞生长的生长激素。

11.权利要求1的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞。

12.权利要求1的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂能预防或减少血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的形成。

13.权利要求1的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂是血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞特异性抗体或其结合部分。

14.权利要求13的方法，其中给予多克隆抗体。

15.权利要求13的方法，其中给予单克隆抗体。

16.权利要求13的方法，其中给予抗体的结合部分。

17.权利要求13的方法，其中所述抑制剂是能结合VLA-4(α4β1)整联蛋白的抗体。

18.权利要求1的方法，其中所述给予是辅助治疗方案的组成部分。

19.一种预防癌症患者肿瘤转移的方法，所述方法包括：

在有效预防癌症患者肿瘤转移的条件下，给予所述癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。

20.权利要求19的方法，其中所述给予是在刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。

21.权利要求20的方法，其中通过化疗、应激、手术、炎症、辐射或生长因子刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

22.权利要求21的方法，其中通过化疗来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

23.权利要求21的方法，其中通过应激来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

24.权利要求21的方法，其中通过手术来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

25.权利要求21的方法，其中通过炎性细胞的动员来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

26.权利要求21的方法，其中通过辐射来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

27.权利要求21的方法，其中通过生长因子来刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员。

28.权利要求27的方法，其中所述生长因子选自粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞刺激因子和刺激骨髓细胞生长的生长激素。

29.权利要求19的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞。

30.权利要求19的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂能预防或减少血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的形成。

31.权利要求19的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂是血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞特异性抗体或其结合部分。

32.权利要求31的方法，其中给予多克隆抗体。

33.权利要求31的方法，其中给予单克隆抗体。

34.权利要求31的方法，其中给予抗体的结合部分。

35.权利要求31的方法，其中所述抑制剂是能结合VLA-4(α4β1)整联蛋白的抗体。

36.权利要求19的方法，其中所述给予是辅助治疗方案的组成部分。

37.一种用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物的鉴定方法，所述方法包括：

提供试验化合物；

将所述试验化合物与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞一起孵育；和

鉴定能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的试验化合物，作为用于抑制癌症患者肿瘤形成或预防癌症患者肿瘤转移的候选化合物。

38.一种监测癌症患者肿瘤转移的方法，所述方法包括：

评价患者样品的血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞水平，和

将血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的上述水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的其它水平进行比较，从而监测癌症患者的肿瘤转移。

39.权利要求38的方法，其中所述其它水平是癌症患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的先验水平，其中血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的水平增加了，就表明未来会有肿瘤转移。

40.权利要求38的方法，其中所述其它水平是标准水平或正常水平，其中血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的水平超出标准或正常水平，就表明有肿瘤转移。

41.权利要求38的方法，其中所述患者样品是组织样品。

42.权利要求38的方法，其中所述患者样品是血液样品。

43.权利要求38的方法，所述方法还包括：

根据血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的所测水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的其它水平进行的所述比较，给予治疗药。

44.权利要求43的方法，其中所述给予包括辅助治疗方案。

45.权利要求43的方法，其中所述治疗药是化疗药，根据血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的所测水平与血管内皮生长因子受体1⁺骨髓限定细胞的其它水平进行的所述比较，来选择所述化疗药的规格。

46.权利要求38的方法，其中所述方法在体外实施。

47.权利要求38的方法，其中所述方法在体内实施。

48.权利要求47的方法，其中所述评价和所述比较包括对癌症患者的某一部位进行造影。

49.权利要求48的方法，其中所述方法是用对血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞具有特异性的标记物来进行的。

50.权利要求48的方法，其中所述方法是将标记的血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞导入癌症患者体内来进行的。

51.一种抑制患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的方法，所述方法包括：

在有效抑制所述患者的远离肿瘤原先形成部位的部位纤连蛋白表达的条件下，给予所述患者血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂。

52.权利要求51的方法，其中所述给予是在刺激血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞动员的相应时间周期内进行的。

53.权利要求51的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂能结合血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞。

54.权利要求51的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂能预防或减少血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的形成。

55.权利要求54的方法，其中所述血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞抑制剂是血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞特异性抗体或其结合部分。

56.一种抗血管内皮生长因子受体1⁺骨髓衍生细胞的抗体。

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