CN101098887B - 作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构 - Google Patents

作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构 Download PDF

Info

Publication number
CN101098887B
CN101098887B CN2006800017561A CN200680001756A CN101098887B CN 101098887 B CN101098887 B CN 101098887B CN 2006800017561 A CN2006800017561 A CN 2006800017561A CN 200680001756 A CN200680001756 A CN 200680001756A CN 101098887 B CN101098887 B CN 101098887B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phe
gly
lys
pro
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2006800017561A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101098887A (zh
Inventor
M·兰岑多费尔
M·施拉伊姆尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN101098887A publication Critical patent/CN101098887A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101098887B publication Critical patent/CN101098887B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及用于产生对预定靶分子具有特异结合特性的多肽的方法，其中所述特异结合特性不天然为此多肽固有。同时本发明描述了结合特异性的优化以及产生的方法。本发明还涉及用于在多肽支架中鉴定和修饰特定氨基酸位置的方法。

Description

作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构
本发明涉及用于制备对预定靶分子具有特异结合特性的多肽的方法，其中所述特异结合特性不天然为此多肽固有。同时本发明描述了优化结合特异性的方法以及产生的方法。本发明还涉及用于在多肽支架中鉴定和修饰可改变的氨基酸位置的方法。
技术背景
近年来，与亲和试剂相关的专利申请和公开的数量稳定增加。它们中的大多数涉及抗体，即单克隆或多克隆的免疫球蛋白。仅有一小部分涉及可能的备选方案。这些备选方案之一是蛋白质支架的使用。此概念需要在一级结构水平耐受多个替换或插入的稳定蛋白质架构(Nygren，P-A.，Skerra，A.，J.Immun.Meth.290(2004)3-28)。
经修饰的蛋白质支架可以克服现存的问题并且拓展亲和试剂的应用领域。众多其它问题中唯一问题是抗体在细胞内的应用。这种蛋白质敲除技术的瓶颈在于并非细胞内表达的所有抗体均性能良好。这被称作“二硫键问题”。为了解决该问题，不得不开展费时的实验以优化一系列复杂参数(Visintin，M.等，J.Immun.Meth.290(2004)135-153)。
就此而言，蛋白质具有数种优势。在这些优势中包括低分子量，易于由微生物产生、修饰简单以及应用广泛。已经在本上下文中描述了不同的蛋白质支架，例如用于DNA识别的锌指蛋白(Segal，D.J.等，Biochem.42(2003)2137-2148)；通过在活性中心环内导入可变多肽序列加以修饰的基于硫氧还蛋白的肽适体(Klevenz，B.等，Cell.MoL Life ScL59(2002)1993-1998)；作为“亲和体(affibody)”支架的蛋白A(Sandstrom，K.等，Prot.Eng.16(2003)691-697；Andersson，M.等，J.Immun.Meth.283(2003)225-234)；第十纤连蛋白III型结构域的mRNA-蛋白质分子(Xu，L等，Chem.Biol.9(2002)933-942)或基于α-淀粉酶抑制剂的结合分子(McConnell，S.J.和Hoess，R.H.，J.MoI.Biol.250(1995)460-470)。
两个标准基本上描述了可应用蛋白质支架的特征：首先，蛋白质应当属于显示已充分定义的疏水核心的家族。各个家族成员间的密切关系是有益的(Skerra，A.，J.MoI.Recognit.13(2000)167-187)。其次，蛋白质应当具有空间上分隔且功能独立的可接近的活性中心或结合袋。活性中心或结合袋不应当对核心的内在稳定性有贡献(Predki，P.F.等，Nature Struct.Biol.3(1996)54-58)。理想地，这种蛋白质家族本身参与识别非相关的多个靶标。
如Nygren，P-A.和Skerra，A.，J.Immun.Meth.290(2004)3-28中所述，已经采用数种多肽支架用于开发新的亲和蛋白质。这些支架可以分为三类：(i)单肽环、(ii)工程化的界面和(iii)非连续的超变环。
对于第一类支架，使在暴露的环内的单个氨基酸多样化或者将小的多肽序列插入这个暴露的环内(见例如Roberts，B.L.等，PNAS89(1992)2429-2433和Gene 121(1992)9-16；Rottgen，P.和Collins，J.，Gene164(1995)243；Lu，Z.等，Bio/Technology 13(1995)366-372)。这种方法的一个缺点是难以实现对全新靶标的亲和性，即便有也很低(Klevenz，B.等，Cell.MoI.Life Sci.59(2002)1993-1998)。可以修饰对天然的或密切相关的靶标的内在结合亲和性，但是几乎难以改变靶标或靶标族。另一个缺点是在插入小的随机化多肽时，靶标必须已知并且这些序列必须基于已经得到的知识事先产生。
第二类支架属于例如葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白结合结构域(例如
Figure G200680001756120070705D000021
，K.等，Prot.Eng.16(2003)691-697)、真菌里氏木霉(T.reesei)纤维二糖水解酶I的羧基端纤维素结合结构域(Smith，G.P.等，J.Mol.Biol.277(1998)317-322)和γ-晶态(Fiedler，U.和Rudolph，R.，WO 01/04144).
第三类支架以免疫球蛋白自身和远缘相关的纤连蛋白HI型结构域以及某些类型的神经毒素为代表。
除了作为用于产生对预定靶分子的特异结合特性的支架适合性(suitability)之外，还必须考虑应用条件。其中尤其应考虑亲和多肽的稳定性、选择性、溶解性和功能性产生。例如，已经如上提及，蛋白质敲除技术的瓶颈在于并非细胞内表达作为亲和分子的全部抗体均功能性地产生(“二硫键问题”，Visintin，M.等，J.Immun.Meth.290(2004)135-153)。
因此，本发明的目的是通过提供对预定靶分子具有特异结合特性的备选多肽支架而克服这些缺点，其中所述特异结合特性不天然为多肽固有。这包含氨基酸的随机化、优化结合特性以及产生具有特异结合特性的优化多肽的方法。
发明概述
本发明提供了特异性结合预定靶分子的多肽，其特征是多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：02至SEQ ID NO：61，其中在所述氨基酸序列中改变根据表V的至少一个氨基酸。
本发明还包含用于在原核微生物或真核微生物中产生特异性结合预定靶分子的多肽的方法，其特征是所述微生物含有编码所述多肽的基因并且该多肽得到表达。
本发明还包含用于在原核微生物或真核微生物中表达特异性结合预定靶分子的多肽的载体。
多肽可以通过本领域技术人员已知的方法加以分离和纯化。
在本发明的另一个实施方案中，预定靶分子是刺猬蛋白(hedgehogproteins)、骨形态发生蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细胞介素和干扰素中的一个成员。
本发明还提供用于从DNA文库中鉴定编码特异性结合预定靶分子的多肽的核酸的方法，其中该方法包括步骤
a)从SEQ ID NO：02至SEQID NO：61中选择序列；
b)制备其中至少一个根据表V的氨基酸位置得到改变的所选序列的DNA文库；
c)对制备的DNA文库筛选所编码的特异性结合预定靶分子的多肽；
d)选择编码一种在步骤c)中经鉴定的特异性结合物的核酸；
e)重复步骤b)至d)二到五次；以及
f)分离编码特异性结合预定靶分子的多肽的所述核酸。
在另一实施方案中，用于从DNA文库中鉴定编码特异性结合靶分子的多肽的核酸的方法包括线性表达元件。
在另一实施方案中，多肽文库通过在核糖体上展示表达。
在另一实施方案中，多肽文库通过在噬菌体上展示而表达。
本发明还包括用于在多肽中确定可改变的氨基酸位置的方法，包括步骤
a)收集来自相同和/或不同生物的在结构和/或功能上同源的多肽的多个序列；并且
b)根据共有结构和/或共有序列和/或功能性基序比对序列，和
c)在比对中通过计数在序列每一位置处发现的不同氨基酸的数确定所有氨基酸位置的可变性；以及
d)将可改变的氨基酸位置确定为具有总数为8个或更多个不同氨基酸的氨基酸位置。
发明详述
本发明提供了特异性结合预定靶分子的多肽，其特征是多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：02至SEQ ID NO：61，其中在所述氨基酸序列中改变至少一个根据表V的氨基酸。本发明还提供了用于从DNA文库中鉴定编码特异性结合预定靶分子的多肽的核酸的方法和用于在多肽中确定可改变的氨基酸位置的方法。
多肽可以通过其氨基酸序列和通过衍生自其的DNA序列进行定义。
根据本发明的多肽可以通过重组方法或合成地产生。
使用重组DNA技术能够产生多肽的多种衍生物。此类衍生物例如可以在单个或数个氨基酸位置处通过替换、改变或交换得以修饰。衍生化可以例如通过位点定向诱变方式开展。此类变异可以由本领域技术人员轻易地实施(Sambrook，L等，Molecular Cloning：A laboratorymanual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA；Hames，B.D.和Higgins，S.G.，Nucleic acid Hybridation-a practicalapproach(1985)IRL Press，Oxford，England)。
本发明还包括在原核微生物或真核微生物中产生特异性结合预定靶分子的多肽的方法，其特征是所述微生物含有编码所述多肽的核酸序列以及该多肽得到表达。本发明因此还涉及作为本发明外源核酸分子原核表达产物或真核表达产物的多肽。借助此类核酸，本发明的多肽可以以可重复方式大量得到。对于在原核或真核宿主细胞内的表达，根据本领域技术人员熟悉的方法，将编码多肽的氨基酸序列的核酸整合入适合的表达载体。这类表达载体优选地含有可调节的启动子或诱导型启动子。随后将这些重组载体导入用于表达的合适宿主细胞，如作为原核宿主细胞的大肠杆菌(E.coli)或作为真核宿主细胞的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞或CHO细胞并且将转化或转导的宿主细胞在允许异源基因表达的条件下培养。
多肽可以在重组产生后使用已知的蛋白质纯化技术，通过本领域技术人员已知的方例如通过亲和层析加以分离和纯化，包括免疫沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、层析聚焦、等电聚焦、选择性沉淀、电泳等(见例如Ausubel，L和Frederick，M.，Curr.Prot.MoI.Biol.(1992)John Wiley andSons，New York；Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A laboratorymanual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA；Hames，B.D.和Higgins，S.G.，Neucleic acid hybridization-a practicalapproach(1985)IRL Press，Oxford，England)。
在本发明中使用如下缩写和定义。
“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论其经天然产生或合成地产生。少于大约20个氨基酸残基的多肽可以称作“肽”。多于大约100个氨基酸残基的多肽可以称作“蛋白质”。
术语“血红素结合蛋白样结构域”(PEX)代表对血液蛋白质血红素结合蛋白显示序列同源性和结构同源性的多肽。该结构域具有大约200个氨基酸的平均序列并由四个的重复亚结构域组成。
缩写“PEX2”代表人基质金属蛋白酶2的羧基端结构域，包含全长蛋白质的第466至660位氨基酸位置。
术语“共有序列”代表作为核苷酸序列或氨基酸序列的推导序列。这种序列代表多个相似序列。共有序列中每一位置对应于通过比对三个或多个序列而确定在此位置处最常出现的碱基或氨基酸。
术语“改变”代表在其中序列即核酸序列或氨基酸序列中已定义的位置受到修饰的方法。这包括氨基酸或核酸(核苷酸)以不同的氨基酸或核酸(核苷酸)替代以及缺失或插入。
表述“结合分子的多肽”代表能够结合靶分子的多肽。术语“特异性结合”代表具有大于10E 7(107)升/摩尔的亲和性常数的结合活性。
表述“预定的靶分子”指作为包含刺猬蛋白、骨形态发生蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细胞介素和干扰素、免疫球蛋白、酶、抑制剂、激活剂以及细胞表面蛋白的蛋白质类中一个成员的分子。
术语“表达载体”或“载体”代表包含至少一个编码多肽的氨基酸序列的核酸序列、启动子序列、终止子序列、选择标记和复制起点的天然或人造DNA序列。
术语“核酸分子”或“核酸”代表可以是例如DNA、RNA或其衍生物的多核苷酸分子。由于遗传密码子的简并性，不同的核酸序列可编码相同多肽。本发明也包括这些变异。
术语“氨基酸”代表丙氨酸(三字母编码：ala，单字母编码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
术语“氨基酸多样性数(amino acid diversity number)”代表在氨基酸序列的特定位置处存在的不同氨基酸的数目。此数字通过来自相同和/或不同生物的在结构和/或功能上同源的多个多肽序列集合体的序列与参考或共有序列比对并鉴定在全部所比对序列中特定位置处存在的不同氨基酸的总数加以确定。
术语“比对”代表排列两个或多个序列以实现最大程度同一性和保守的过程。这包括对分子序列确定位置同源性，包括平行排列同源分子中的氨基酸或核苷酸。作为结果，已比较序列以显示具有最大统计相似性的区域的形式得到展示。在此过程期间，发现某些序列不含其它比对序列的全部位置，即可能序列含有一个或多个缺失。为实现最大程度的同一性和保守，可以在这些序列中导入缺口。缺口在比对图中以连字符标注。
术语“重叠延伸连接PCR(OEL-PCR)”和“线性表达元件”(LEE)代表连接DNA片段的方法并描述在此方法中所用的及通过此方法得到的线性DNA片段(见例如Ho，S.N.等，Gene 77(1989)51-59；Kain，K.C.等，Biotechniques 10(1991)366-374；Shuldiner，A.R.等，Anal.Biochem.194(1991)9-15)。基因转录物分为如下模块(module)：“启动子模块”、“基因模块”和“终止子模块”。启动子模块编码T7噬菌体转录启动子序列、翻译控制序列(RBS＝核糖体结合位点)和T7噬菌体增强子序列(g10∈)(Lee，S.S.和Kang，C，Kor.Biochem.J.24(1991)673-679)。这些调节序列在快速翻译系统中使转录和翻译偶联发生，例如来自Roche Applied Sciences，Mannheim，Germany的RTS 100大肠杆菌HY系统。终止子模块编码翻译终止密码子以及T7噬菌体回文终止基序(T7T)。任选地，这些模块包含编码可在随后亲和纯化或标记方法中使用的多肽的DNA序列。线性表达元件(Sykes，K.F.和Johnston，S.A.，Nature Biotechnol.17(1999)355-359)由这些模块通过两步法PCR组装。在使用Pyrococcus woesii DNA聚合酶的第一标准PCR(PWO-PCR)中，无内含子的可读框即基因模块，通过序列特异性的侧翼引物寡核苷酸扩增，该引物寡核苷酸向启动子模块和终止子模块导入重叠互补序列。这些DNA片段的PCR介导连接需要必须低于-25kcal/molΔG的互补序列杂交自由能。这通过平均25bp长度的序列延伸物得以实现。设计引物寡核苷酸以在温度48℃至55℃间与基因模板杂交。这迫使使用具有平均长度45bp至55bp的引物寡核苷酸。在30个PCR循环后，将含有大约50ng已延伸的基因模块DNA的PCR混合物转移入第二PCR混合物。对这个PCR提供50ng至100ng分别的启动子DNA模块和终止子DNA模块以及序列特异性末端引物。在DNA聚合酶存在下，杂交的互补性DNA片段的3′端酶延伸(Barik，S.，Meth.MoL Biol.192(2002)185-196)为包含全部三种模块的全长DNA转录物。
术语“微生物”指原核微生物和真核微生物。“微生物”优选地选自大肠杆菌菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株、克雷伯氏菌(Klebsiella)菌株、沙门氏菌(Salmonella)菌株、假单胞菌(Pseudomonas)菌株或者链霉菌(Streptomyces)菌株以及酵母(yeast)菌株。例如，大肠杆菌菌株包含大肠杆菌K12、UT5600、HB101、XL1、X1776、W3110；酵母菌株例如包含酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
两个标准基本上描述了可应用蛋白质支架的特征：首先，蛋白质应当属于显示已充分定义的疏水核心的家族。各个家族成员间的密切关系是有益的(Skerra，A.，J.MoI.Recognit.13(2000)167-187)。其次，蛋白质应当具有空间上分隔的且功能独立的可接近的活性中心或结合袋。活性中心或结合袋不应当对核心的内在稳定性提供贡献(Predki，P.F.等，Nature Struct.Biol.3(1996)54-58)。理想地，这种蛋白质家族本身参与识别非相关的多个靶标。
血红素结合蛋白样(PEX)蛋白质支架符合这些标准。这种结构性基序存在于多种不同蛋白质和蛋白质家族中，例如血红素结合蛋白(Altruda，F.等，Nucleic Acids Res.13(1985)3841-3859)、玻连蛋白(Jenne，D.和Stanley，K.K.，Biochemistry 26(1987)6735-6742)或豌豆种子白蛋白2(Jenne，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(1991)1000-1006)。
含有血红素结合蛋白样结构域的蛋白质的结晶结构分析表明该结构域采取四叶β螺旋桨拓扑结构(Li，J.等，Structure 3(1995)541-549；Faber，H.R.等，Structure 3(1995)551-559)。每一桨叶由反平行方向的4个β折叠组成。这些桨叶在分子中央共同组成一个空腔。四个桨叶通过从前一桨叶最外侧的第四β链与下一桨叶最内侧的第一β链的环被连接在一起。二硫键将此结构的末端即桨叶4和桨叶1连接。
PEX支架参与不同的，但极为特异的蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-配体相互作用。因此，血红素结合蛋白样结构形成用于分子识别的通用框架(Bode，W.，Structure 3(1995)527-530)。例如，用于离子如钙、钠、和氯离子的结合位点(Libson，A.M.等，Nat.Struct.Biol.2(1995)938-942；Gohlke，U.等，FEBS Lett.378(1996)126-130)以及用于与纤连蛋白、TIMP-1/2(人基质金属蛋白酶的组织灭活物1/2)、整合素和肝素相互作用的结合位点(Wallon，U.M.和Overall，CM.，J.Biol.Chem.272(1997)7473-7481；Willenbrock，F.等，Biochemistry 32(1993)4330-4337；Brooks，P.C.等，Cell92(1998)391-400；Bode，W.，Structure 3(1995)527-530)是已知的。
血红素结合蛋白样蛋白结构域在其蛋白质家族成员中提供了高度的结构同源性。例如已经报道人基质金属蛋白酶1、2和13的血红素结合蛋白结构域的高度结构等效性(Gomis-Ruth，FX等，J.MoI.Biol.264(1996)556-566)。毗邻和垂直方向的β折叠之间占优势的疏水相互作用提供大部分所需的结构稳定性(Gomis-Ruth，F.X.等，J.MoI.Biol.264(1996)556-566；Fulop，V.和Jones，D.T.，Curr.Opin.Struct.Biol.9(1999)715-721)。
最近，将蛋白质数据库如SMART(Schultz，J.等，PNAS95(1998)5857-5864；Letunic，L等，Nuc.Acids Res.30(2002)242-244)用于比较同源序列和蛋白质折叠，以便在合适的蛋白质框架内鉴定非保守的并且因此在理论上可变的，即可随机化的氨基酸位置(Binz，H.K.等，J.MoI.Biol.332(2003)489-503；Forrer，P.等，ChemBioChem 5(2004)183-189)。
为鉴定PEX折叠中潜在可变的，即可随机化的氨基酸位置，使用SMART数据库实施类似方法。在PEX结构域中鉴定了可随机化而不影响蛋白质结构、功能性构象和稳定性的氨基酸位置。
将在如下表I中列出的来自不同种的来自SMART数据库的60个PEX结构域以Pretty生物信息工具(GCG)使用记分矩阵blosum 62进行比对。
表I：含有PEX结构域的60个蛋白质的列表
蛋白质家族   PEX折叠在PDB数据库中的代码   swissprot数据库编号   本发明中所用的血红素结合蛋白的序列身份(SEQ ID NO：)
  过氧化物酶体装配因子   PEX2_小鼠PEX2_大鼠   P55098P24392   0304
  基质金属蛋白酶1   MM01_牛MM01_马MM01_人MM01_猪   P28053Q9XSZ5P03956P21692   06070809
  基质金属蛋白酶2   MM02_鸡(小鸡)MM02_人MM02_兔子   Q90611P08253P50757   021005
  基质金属蛋白酶3   MM03_人MM03_小鼠MM03_兔子MM03_大鼠   P08254P28862P28863P03957   11121314
  基质金属蛋白酶8   MM08_人MM08_小鼠MM08_大鼠   P22894O70138O88766   151617
  基质金属蛋白酶9   MM09_牛MM09_CANFA(犬科，狗)MM09_人MM09_小鼠   P52176O18733P14780P41245   18192021
  基质金属蛋白酶10   MM10_人MM10_小鼠   P09238O55123   2223
  基质金属蛋白酶11   MM11_人MM11_小鼠   P24347Q02853   2425
  基质金属蛋白酶12   MM12_人MM12_小鼠MM12_兔子MM12_大鼠   P39900P34960P79227Q63341   26272829
  基质金属蛋白酶13   MM13_牛MM13_马MM13_人MM13_兔子   O77656O18927P45452O62806   30313233
  基质金属蛋白酶14   MM14_人MM14_小鼠MM14_猪MM14_兔子MM14_大鼠   P50281P53690Q9XT90Q95220Q10739   3435363738
  基质金属蛋白酶15   MM15_人MM15_小鼠   P51511O54732   3940
  基质金属蛋白酶16   MM16_人MM16_小鼠MM16_大鼠   P51512Q9WTR0O35548   414243
蛋白质家族 PEX折叠在PDB数据库中的代码 swissprot数据库编号   本发明中所用的血红素结合蛋白的序列身份(SEQ ID NO：)
  基质金属蛋白酶17 MM17_人MM17_小鼠   Q9ULZ9Q9R0S3   4445
  基质金属蛋白酶18 MM18_XENLA(光滑爪蟾、非洲爪蛙)   O13065   46
  基质金属蛋白酶19 MM19_人MM19_小鼠   Q99542Q9JHI0   4748
  基质金属蛋白酶20 MM20_牛MM20_人MM20_小鼠MM20_猪   O18767O60882P57748P79287   49505152
  基质金属蛋白酶24 MM24_人MM24_小鼠MM24_大鼠   Q9Y5R2Q9R0S2Q99PW6   535455
基质金属蛋白酶25 MM25_人 Q9NPA2 56
  基质金属蛋白酶28 MM28_人   Q9H239   57
  玻连蛋白 VTNC_人VTNC_小鼠VTNC_猪VTNC_兔子   P04004P29788P48819P22458   58596061
(表I结束)。
血红素结合蛋白样结构域仅占全长蛋白质的一小部分。下表列出比对的血红素结合蛋白样结构域在全长蛋白质中的位置。
表II：血红素结合蛋白样结构域在表I蛋白质中的位置。
Figure G200680001756120070705D000111
Figure G200680001756120070705D000131
(表II结束)。
通过比对如上所列的血红素结合蛋白样结构域(SEQ ID NO：01、SEQID NO：88)确定了210个位置的共有序列。
已确定了每一位置处的不同氨基酸数目以便得出氨基酸多样性数(“可变性的确定”；见表III)。序列中的缺口以连字符(-)标出(见比对全部序列的表IV)。对于共有序列的每一位置，给出不同氨基酸的数目(氨基酸多样性数)。最大可能数目是21(20个不同氨基酸+1个缺口)。低多样性数目显示高度保守的位置。高多样性数目显示在此位置处的变动性。
表III：共有序列中210个位置处每一位置的氨基酸多样性数；对于无缺口的共有序列，见SEQ ID NO：01，对于带缺口的共有序列，见SEQ IDNO：88。
Figure G200680001756120070705D000141
Figure G200680001756120070705D000151
(表III结束)。
表IV：序列SEQ ID NO：02至序列SEQ ID NO：61的比对表
Figure G200680001756120070705D000161
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000171
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000181
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000191
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000201
(接上页表IV)
(接上页表IV)
(接上页表IV)
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000241
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000251
(接上页表IV)
Figure G200680001756120070705D000261
(表IV结束)。
用于确定氨基酸多样性数的这个方法是通用方法并且可以广泛使用并且不限于具体的氨基酸序列、多肽、结构域或蛋白质。因而，该方法可以类似并且据此应用于其它序列以确定和鉴定这样的氨基酸位置，其具有高可变性和可用于改变而不强烈影响结构的稳定性和功能性。
根据氨基酸多样性的计算，已经鉴定了具有低多样性数目即小于6的氨基酸位置。这种低多样性数目代表了高度的保守如对于位置编号4处的半胱氨酸残基(见表III)，发现其在所分析60个序列的57个序列中保守(见表IV)。发现位置编号210处的半胱氨酸残基在全部已分析的血红素结合蛋白样序列中保守。这显示了本方法的优异可用性，因为这两个半胱氨酸残基在支架中非常重要。这两个半胱氨酸残基通过连接多肽的第四和第一桨叶构成对血红素结合蛋白样结构形成所必须的二硫键。
从表III汇编并列出的氨基酸多样性数中，可以鉴定共有序列中具有高多样性/可变性的氨基酸位置。因为从共有序列的所鉴定的高多样性氨基酸数中不能直接得到全长多肽中相应的氨基酸数，因此表V列出了SEQID NO：02至SEQ ID NO：61全长多肽中已鉴定的高多样性氨基酸即可变氨基酸的氨基酸数。
表V：序列SEQ ID NO：02至SEQ ID NO：61的每一序列中可改变的氨基酸位置的列表。每一序列中位置的编号与相应的全长蛋白质的氨基酸编号一致。
SEQ ID NO：02：
470  471  475  476  477  484  501  502  503  504
505  506  507  510  514  515  522  529  530  531
534  541  547  549  550  553  558  559  566  567
568  569  570  577  578  579  580  589  590  597
598  600  604  608  611  612  617  618  619  620
626  627  628  629  638  639  645  646  647  648
650  652  654  655  658  663
SEQ ID NO：03：
 98   99  103  104  105  111  128  131  135  136
145  146  153  159  161  162  165  170  171  179
180  181  182  183  190  191  192  193  202  203
210  211  213  217  221  224  225  230  231  232
233  239  240  241  242  251  252  258  259  260
261  266  268  270  271  274  279
SEQ ID NO：04：
 98   99  103  104  105  111  128  131  135  136
145  146  153  159  161  162  165  170  171  179
180  181  182  183  190  191  192  193  202  203
210  211  213  217  221  224  225  230  231  232
233  239  240  241  242  251  252  258  259  260
261  266  268  270  271  274  279
(接上页表V)
SEQ ID NO：05：
469  470  474  475  476  483  500  501  502  503
504  505  506  509  513  514  521  528  529  530
533  540  546  548  549  552  557  558  565  566
567  568  569  576  577  578  579  588  589  596
597  599  603  607  610  611  616  617  618  619
625  626  627  628  637  638  644  645  646  647
649  651  653  654  657  662
SEQ ID NO：06：
276  277  281  282  283  290  307  308  309  310
311  312  315  319  320  327  334  335  336  339
346  352  354  355  358  363  364  372  373  374
375  376  383  384  385  386  395  396  403  404
406  410  414  417  418  423  424  425  426  432
433  442  443  449  450  451  452  456  458  460
461  464  468
SEQ ID NO：07：
276  277  281  282  283  290  307  308  309  310
311  312  315  319  320  327  334  335  336  339
346  352  354  355  358  363  364  372  373  374
375  376  383  384  385  386  395  396  403  404
406  410  414  417  418  423  424  425  426  432
433  442  443  449  450  451  452  456  458  460
461  464  468
(接上页表V)
SEQ ID NO：08：
276  277  281  282  283  290  307  308  309  310
311  312  315  319  320  327  334  335  336  339
346  352  354  355  358  363  364  372  373  374
375  376  383  384  385  386  395  396  403  404
406  410  414  417  418  423  424  425  426  432
433  442  443  449  450  451  452  456  458  460
461  464  468
SEQ ID NO：09：
276  277  281  282  283  290  307  308  309  310
311  312  315  319  320  327  334  335  336  339
346  352  354  355  358  363  364  372  373  374
375  376  383  384  385  386  395  396  403  404
406  410  414  417  418  423  424  425  426  432
433  442  443  449  450  451  452  456  458  460
461  464  468
SEQ ID NO：10：
467  468  472  473  474  481  498  499  500  501
502  503  504  507  511  512  519  526  527  528
529  531  538  544  546  547  550  555  556  563
564  565  566  567  574  575  576  577  578  586
587  594  595  596  597  601  605  608  609  614
615  616  617  623  624  625  626  635  636  642
643  644  645  647  649  651  652  655  660
(接上页表V)
SEQ ID NO：11：
288  289  293  294  295  302  319  320  321  322
323  324  327  331  332  339  346  347  348  351
358  364  366  367  370  375  376  383  384  385
386  387  394  395  396  397  406  407  414  415
417  421  425  428  429  434  435  436  437  443
444  454  455  461  462  463  464  467  469  471
472  475  479
SEQ ID NO：12：
288  289  293  294  295  302  319  320  321  322
323  324  327  331  332  339  346  347  348  351
358  364  366  367  370  375  376  383  384  385
386  387  394  395  396  397  406  407  414  415
417  421  425  428  429  434  435  436  437  443
444  454  455  461  462  463  464  467  469  471
472  475  479  
SEQ ID NO：13：
289  290  294  295  296  303  320  321  322  323
324  325  328  332  333  340  347  348  349  352
359  365  367  368  371  376  377  384  385  386
387  388  395  396  397  398  407  408  415  416
418  422  426  429  430  435  436  437  438  444
445  455  456  462  463  464  465  468  470  472
473  476  480
(接上页表V)
SEQ ID NO：14：
286  287  291  292  293  300  317  318  319  320
321  322  325  329  330  337  344  345  346  349
356  362  364  365  368  373  374  381  382  383
384  385  392  393  394  395  404  405  412  413
415  419  423  426  427  432  433  434  435  441
442  452  453  459  460  461  462  465  467  469
470  473  477
SEQ ID NO：15：
277  278  282  283  284  291  308  309  310  311
312  313  316  320  321  328  335  336  337  340
347  353  355  356  359  364  365  372  373  374
375  376  383  384  394  395  402  403  405  409
413  416  417  422  423  424  425  431  432  441
442  448  449  450  451  453  455  457  458  461
465
SEQ ID NO：16：
277  278  282  283  284  291  308  309  310  311
312  313  316  320  321  328  335  336  337  340
347  353  355  356  359  364  365  372  373  374
375  376  383  384  394  395  402  403  405  409
413  416  417  422  423  424  425  431  432  441
442  448  449  450  451  453  455  457  458  461
465
(接上页表V)
SEQ ID NO：17：
278  279  283  284  285  292  309  310  311  312
313  314  317  321  322  329  336  337  338  341
348  354  356  357  360  365  366  373  374  375
376  377  384  385  395  396  403  404  406  410
414  417  418  423  424  425  426  432  433  442
443  449  450  451  452  454  456  458  459  462
466
SEQ ID NO：18：
519  520  524  525  532  550  551  552  553  554
555  556  559  563  564  571  578  579  580  583
590  596  597  598  601  605  606  613  614  615
616  617  624  625  626  635  636  643  644  646
650  654  657  658  663  664  665  666  672  673
674  682  683  689  690  691  692  694  696  698
699  702  707
SEQ ID NO：19：
511  512  516  517  524  542  543  544  545  546
547  548  551  555  556  563  570  571  572  575
582  588  589  590  593  597  598  605  606  607
608  609  616  617  618  627  628  635  636  638
642  646  649  650  655  656  657  658  664  665
666  674  675  681  682  683  684  686  688  690
691  694  699
(接上页表V)
SEQ ID NO：20：
514  515  519  520  527  545  546  547  548  549
550  551  554  558  559  566  573  574  575  578
585  591  592  593  596  600  601  608  609  610
611  612  619  620  621  630  631  638  639  641
645  649  652  653  658  659  660  661  667  668
669  677  678  684  685  686  687  695  698  700
701  704  709
SEQ ID NO：21：
532  533  537  538  545  563  564  565  566  567
568  569  572  576  577  584  591  592  593  596
603  609  610  611  614  618  619  626  627  628
629  630  637  638  639  648  649  656  657  659
663  667  670  671  676  677  678  679  685  686
687  695  696  702  703  704  705  707  709  711
712  715  720
SEQ ID NO：22：
287  288  291  294  301  316  317  318  319  320
321  324  328  329  336  343  344  345  348  355
361  363  364  367  372  373  380  381  382  383
384  391  392  393  394  403  404  411  412  414
418  422  425  426  431  432  433  434  440  441
450  451  457  458  459  460  462  464  466  467
470  474
(接上页表V)
SEQ ID NO：23：
287  288  291  294  301  316  317  318  319  320
321  324  328  329  336  343  344  345  348  355
361  363  364  367  372  373  380  381  382  383
384  391  392  393  394  403  404  411  412  414
418  422  425  426  431  432  433  434  440  441
450  451  457  458  459  460  462  464  466  467
470  474
SEQ ID NO：24：
292  293  296  297  304  322  323  324  325  326
327  330  334  335  342  349  350  351  353  360
366  368  369  372  376  377  384  385  386  387
388  395  396  397  406  407  414  415  417  420
424  427  428  433  434  435  436  442  443  444
445  453  454  460  461  462  463  465  467  469
470  473  478
SEQ ID NO：25：
296  297  300  301  308  326  327  328  329  330
331  334  338  339  346  353  354  355  357  364
370  372  373  376  380  381  388  389  390  391
392  399  400  401  410  411  418  419  421  424
428  431  432  437  438  439  440  446  447  448
449  457  458  464  465  466  467  469  471  473
474  477  482
(接上页表V)
SEQ ID NO：26：
280  281  285  286  287  294  311  312  313  314
315  316  319  323  324  331  338  339  340  343
350  356  358  359  362  367  368  375  376  377
378  379  386  387  388  389  398  399  406  407
409  413  417  420  421  426  427  428  429  435
436  437  446  447  453  454  455  456  458  460
462  463  466  470
SEQ ID NO：27：
273  274  278  279  280  287  304  305  306  307
308  309  312  316  317  324  331  332  333  336
343  349  351  352  355  360  361  368  369  370
371  372  379  380  381  382  391  392  399  400
402  406  410  413  414  419  420  421  422  428
429  438  439  445  446  447  448  450  452  454
455  458  462
SEQ ID NO：28：
275  276  280  281  282  289  306  307  308  309
310  311  314  318  319  326  333  334  335  338
345  351  353  354  357  362  363  370  371  372
373  374  381  382  383  384  393  394  401  402
404  408  412  415  416  421  422  423  424  430
431  440  441  447  448  449  450  452  454  456
457  460  464
(接上页表V)
SEQ ID NO：29：
276  277  281  282  283  290  307  308  309  310
311  312  315  319  320  327  334  335  336  339
346  352  354  355  358  363  364  371  372  373
374  375  382  383  384  385  394  395  402  403
405  409  413  416  417  422  423  424  425  431
432  441  442  448  449  450  451  453  455  457
458  461  465
SEQ ID NO：30：
282  283  287  288  289  296  313  314  315  316
317  318  321  325  326  333  340  341  342  345
352  358  360  361  364  369  370  377  378  379
380  381  388  389  390  391  400  401  408  409
411  415  419  422  423  428  429  430  431  437
438  447  448  454  455  456  457  459  461  463
464  467  471
SEQ ID NO：31：
283  284  288  289  290  297  314  315  316  317
318  319  322  326  327  334  341  342  343  346
353  359  361  362  365  370  371  378  379  380
381  382  389  390  391  392  401  402  409  410
412  416  420  423  424  429  430  431  432  438
439  448  449  455  456  457  458  460  462  464
465  468  472
(接上页表V)
SEQ ID NO：32：
282  283  287  288  289  296  313  314  315  316
317  318  321  325  326  333  340  341  342  345
352  358  360  361  364  369  370  377  378  379
380  381  388  389  390  391  400  401  408  409
411  415  419  422  423  428  429  430  431  437
438  447  448  454  455  456  457  459  461  463
464  467  471
SEQ ID NO：33：
282  283  287  288  289  296  313  314  315  316
317  318  321  325  326  333  340  341  342  345
352  358  360  361  364  369  370  377  378  379
380  381  388  389  390  391  400  401  408  409
411  415  419  422  423  428  429  430  431  437
438  447  448  454  455  456  457  459  461  463
464  467  471
SEQ ID NO：34：
317  318  322  329  347  348  349  350  351  352
355  359  360  367  374  375  378  385  391  393
394  397  402  403  411  412  413  414  421  422
423  424  433  434  441  442  444  448  452  454
455  460  461  462  463  469  470  471  472  481
482  488  489  490  491  493  495  497  498  501
506
(接上页表V)
SEQ ID NO：35：
317  318  322  329  347  348  349  350  351  352
355  359  360  367  374  375  378  385  391  393
394  397  402  403  411  412  413  414  421  422
423  424  433  434  441  442  444  448  452  454
455  460  461  462  463  469  470  471  472  481
482  488  489  490  491  493  495  497  498  501
506
SEQ ID NO：36：
315  316  320  327  345  346  347  348  349  350
353  357  358  365  372  373  376  383  389  391
392  395  400  401  409  410  411  412  419  420
421  422  431  432  439  440  442  446  450  452
453  458  459  460  461  467  468  469  470  479
480  486  487  488  489  491  493  495  496  499
504
SEQ ID NO：37：
317  318  322  329  347  348  349  350  351  352
355  359  360  367  374  375  378  385  391  393
394  397  402  403  411  412  413  414  421  422
423  424  433  434  441  442  444  448  452  454
455  460  461  462  463  469  470  471  472  481
482  488  489  490  491  493  495  497  498  501
506
(接上页表V)
SEQ ID NO：38：
317  318  322  329  347  348  349  350  351  352
355  359  360  367  374  375  378  385  391  393
394  397  402  403  411  412  413  414  421  422
423  424  433  434  441  442  444  448  452  454
455  460  461  462  463  469  470  471  472  481
482  488  489  490  491  493  495  497  498  501
506
SEQ ID NO：39：
368  369  373  380  398  399  400  401  402  403
406  410  411  418  425  426  429  436  442  444
445  448  453  454  462  463  464  465  472  473
474  475  484  485  492  493  495  499  503  505
506  511  512  513  514  520  521  522  523  532
533  539  540  541  542  544  546  548  549  552
557
SEQ ID NO：40：
364  365  369  376  394  395  396  397  398  399
402  406  407  415  422  423  426  433  439  441
442  445  450  451  459  460  461  462  469  470
471  472  481  482  489  490  492  496  500  502
503  508  509  510  511  517  518  519  520  529
530  536  537  538  539  541  543  545  546  549
554
(接上页表V)
SEQ ID NO：41：
341  342  346  353  371  372  373  374  375  376
379  383  384  391  398  399  402  409  415  417
418  421  426  427  435  436  437  438  445  446
447  448  457  458  465  466  468  472  476  478
479  484  485  486  487  493  494  495  496  505
506  512  513  514  515  517  519  521  522  525
530
SEQ ID NO：42：
341  342  346  353  371  372  373  374  375  376
379  383  384  391  398  399  402  409  415  417
418  421  426  427  435  436  437  438  445  446
447  448  457  458  465  466  468  472  476  478
479  484  485  486  487  493  494  495  496  505
506  512  513  514  515  517  519  521  522  525
530
SEQ ID NO：43：
341  342  346  353  371  372  373  374  375  376
379  383  384  391  398  399  402  409  415  417
418  421  426  427  435  436  437  438  445  446
447  448  457  458  465  466  468  472  476  478
479  484  485  486  487  493  494  495  496  505
506  512  513  514  515  517  519  521  522  525
530
(接上页表V)
SEQ ID NO：44：
333  334  338  345  363  364  365  366  367  368
369  372  376  377  387  394  395  396  399  406
412  414  415  418  423  424  430  431  432  433
440  441  442  443  452  453  460  461  463  467
471  473  474  479  480  481  482  488  489  490
491  499  500  506  507  508  509  511  513  515
516  519  524
SEQ ID NO：45：
334  335  339  346  364  365  366  367  368  369
370  373  377  378  388  395  396  397  400  407
413  415  416  419  424  425  431  432  433  434
441  442  443  444  453  454  461  462  464  468
472  474  475  480  481  482  483  489  490  491
492  500  501  507  508  509  510  512  514  516
517  520  525
SEQ ID NO：46：
278  279  283  284  285  292  309  310  311  312
313  314  317  321  322  329  336  337  338  341
348  354  356  357  360  365  366  373  374  375
376  377  384  385  386  387  396  397  404  405
407  411  415  418  419  424  425  426  427  433
434  443  444  450  451  452  453  455  457  459
460  463  467
(接上页表V)
SEQ ID NO：47：
287  288  292  293  294  300  318  319  320  321
322  324  328  329  336  343  344  345  348  355
361  363  364  367  372  373  375  376  377  378
379  386  387  388  389  398  399  406  407  409
413  417  420  421  426  427  428  429  435  436
437  437  446  447  453  454  455  456  458  460
462  463  466  471
SEQ ID NO：48：
287  288  292  293  294  300  318  319  320  321
322  324  328  329  336  343  344  345  348  355
361  363  364  367  372  373  375  376  377  378
379  386  387  388  389  398  399  406  407  409
413  417  420  421  426  427  428  429  435  436
437  446  447  453  454  455  456  458  460  462
463  466  471
SEQ ID NO：49：
292  293  297  298  299  306  323  324  325  326
327  328  329  332  336  337  344  351  352  353
356  363  369  371  372  374  379  380  387  388
389  390  391  398  399  400  401  410  411  418
419  421  425  429  432  433  438  439  440  441
447  448  457  458  464  465  466  467  469  471
473  474  477  481
(接上页表V)
SEQ ID NO：50：
294  295  299  300  301  308  325  326  327  328
329  330  331  334  338  339  346  353  354  355
358  365  371  373  374  376  381  382  389  390
391  392  393  400  401  402  403  412  413  420
421  423  427  431  434  435  440  441  442  443
449  450  459  460  466  467  468  469  471  473
475  476  479  483
SEQ ID NO：51：
293  294  298  299  300  307  324  325  326  327
328  329  330  333  337  338  345  352  353  354
357  364  370  372  373  375  380  381  388  389
390  391  392  399  400  401  402  411  412  419
420  422  426  430  433  434  439  440  441  442
448  449  458  459  465  466  467  468  470  472
474  475  478  482
SEQ ID NO：52：
294  295  299  300  301  308  325  326  327  328
329  330  331  334  338  339  346  353  354  355
358  365  371  373  374  376  381  382  389  390
391  392  393  400  401  402  403  412  413  420
421  423  427  431  434  435  440  441  442  443
449  450  459  460  466  467  468  469  471  473
475  476  479  483
(接上页表V)
SEQ ID NO：53：
378  379  383  390  408  409  410  411  412  413
416  420  421  428  435  436  439  446  452  454
455  458  463  464  472  473  474  475  482  483
484  485  494  495  502  503  505  509  513  515
516  521  522  523  524  530  531  532  533  542
543  549  550  551  552  554  556  558  559  562
567
SEQ ID NO：54：
351  352  356  363  381  382  383  384  385  386
389  393  394  401  408  409  412  419  425  427
428  431  436  437  445  446  447  448  455  456
457  458  467  468  475  476  478  482  486  488
489  494  495  496  497  503  504  505  506  515
516  522  523  524  525  527  529  531  532  535
540
SEQ ID NO：55：
351  352  356  363  381  382  383  384  385  386
389  393  394  401  408  409  412  419  425  427
428  431  436  437  445  446  447  448  455  456
457  458  467  468  475  476  478  482  486  488
489  494  495  496  497  503  504  505  506  515
516  522  523  524  525  527  529  531  532  535
540
(接上页表V)
SEQ ID NO：56：
315  316  320  327  345  346  347  348  349  350
351  354  358  359  369  376  377  378  381  388
394  396  397  400  404  405  411  412  413  414
415  422  423  424  425  434  435  442  443  445
449  453  455  456  461  462  463  464  470  471
472  473  481  482  488  489  490  491  493  495
497  498  501  506
SEQ ID NO：57：
327  334  353  354  355  356  357  360  364  365
372  379  380  381  384  391  397  399  400  403
408  409  413  414  415  416  417  424  425  426
427  436  437  444  445  447  451  455  457  458
463  464  465  466  472  473  474  483  484  490
491  492  493  495  497  499  500  503  508
SEQ ID NO：58：
291  292  296  297  298  305  323  324  325  326
327  330  334  335  341  345  346  347  350  357
363  365  366  369  374  375  383  384  385  386
387  390  391  392  393  400  407  408  410  414
418  421  422  427  428  429  430  432  439  440
446  447  448  449  453  456  458  459  462  467
(接上页表V)
SEQ ID NO：59：
290  291  295  296  297  304  322  323  324  325
326  329  333  334  340  344  345  346  349  356
362  364  365  368  373  374  382  383  384  385
386  391  392  393  394  401  408  409  411  415
419  422  423  428  429  430  431  433       440
441  447  448  449  450  454  457  459  460  463
468
SEQ ID NO：60：
268  269  273  274  275  282  300  301  302  303
304  307  311  312  318  322  323  324  327  334
340  342  343  346  351  352  360  361  362  363
364  371  372  373  374  381  388  389  391  395
399  402  403  408  409  410  411  413  420  421
427  428  429  430  434  437  439  440  443  448
SEQ ID NO：61：
291  292  296  297  298  305  323  324  325  326
327  330  334  335  341  345  346  347  350  357
362  364  365  368  373  374  380  381  382  383
384  387  388  389  390  397  404  405  407  411
415  418  419  424  425  426  427  429  436  437
443  444  445  446  450  453  455  456  459  464
(表V结束)
具有高多样性数目，即等于或大于8或甚至10的位置也已经确定。此分析表明这些位置主要位于环区内。这些位置显示了高可变性，即变动性并且因此在空间上将数个暴露于表面的来自桨叶连接环的氨基酸拉近。此结果还提示通道的内表面不能用于随机化实验。每一桨叶的三个内部β折叠也重要，因为它们代表高度的保守性并且对蛋白质的核心稳定性有贡献。因此对于诱变方法而言，暴露于溶剂的氨基酸是令人感兴趣的重点，这些氨基酸对蛋白质疏水核心的稳定没有贡献并显示足够高的多样性数目以及因此显示低的保守性。
借助本方法，有可能同时地对在比对中所采用的全部蛋白质中或对这些蛋白质得到一列可变的，即可改变的氨基酸位置。对于血红素结合蛋白样结构域，如前文例举，已经采用60个蛋白质的血红素结合蛋白样结构域并且因此对于全部60个结构域，已经鉴定了可变的，即可改变的氨基酸位置。这些位置列于表V(编号与全长多肽/蛋白质一致)。
在表V中列出了60个血红素结合蛋白样结构域(SEQ ID NO：02至SEQ ID NO：61)中的可改变的氨基酸位置。氨基酸位置根据含有血红素结合蛋白样结构域的蛋白质的全长序列编号。例如对于根据SEQ ID NO：02的血红素结合蛋白样结构域，这些氨基酸位置是表V中副标题SEQ IDNO：02之后所列的氨基酸位置，并且因而是470、471、475、476、477、484、501、502、503、504、505、506、507、510、514、515、522、529、530、531、534、541、547、549、550、553、558、559、566、567、568、569、570、577、578、579、580、589、590、597、598、600、604、608、611、612、617、618、619、620、626、627、628、629、638、639、645、646、647、648、650、652、654、655、658、663。SEQ ID NO：03至SEQID NO：61的可改变氨基酸位置因此列于表V中各自的副标题之后。
随着获得用于SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：61的可改变氨基酸位置，这些序列中的每一序列均可以作为进一步操作的起点加以利用。
可以使无细胞产生和分析经合理工程化的蛋白质变体自动化，但是合理设计待加工的蛋白质构建体文库的大小仍总是受每一系统的技术性通量限制。因此，大量基因产物的结合特性分析需要额外的努力。
可以得到用于多肽文库的展示和筛选的多种技术，例如噬菌体展示、核糖体展示或细菌展示(Smith，G.P.，Science 228(1985)1315-1317；Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS 94(1997)4937-4942；Stahl，S.和Uhlen，M.，TIBTECH 15(1997)185-192)。
本发明将例举核糖体展示技术(见例如Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS 94(1997)4937-4942；Mattheakis，L.C.等，PNAS 91(1994)9022-9026；He，M.和Taussig，M.J.，Nuc.Acids Res.25(1997)5132-5134)，但是也可应用其它技术。
定向演化技术非常适合于实现高通量蛋白质产生平台的技术能力。基于无细胞蛋白质合成技术的核糖体展示是有待发展为高通量蛋白质产生和分析方法的优秀方法。核糖体展示的目的是产生三元复合体，在其中通过核糖体将复合体的信使RNA(mRNA)所表征的基因型与所编码的表型物理联系，所述的表型通过表达的多肽表征。
为此目的，在体外(in vitro)转录并翻译编码基因文库的线性DNA模板。在基因序列的下游融合间隔序列，其中最明显的特点是缺少翻译终止密码子。这种间隔结构域有助于展示仍然附着于核糖体的已翻译和共翻译折叠的新生多肽。将这些复合体经过淘选过程，在此过程中允许由核糖体展示的多肽结合至预定配体分子。将来自紧密结合的复合体中的mRNA分离，进行逆转录并且通过PCR加以扩增。将PCR产物亚克隆至载体系统并且随后的DNA测序揭示了与所结合多肽表型相关的基因型的信息。在诱变和核糖体展示的反复循环中，可以鉴定来自高达1014个成员的文库中特异性的蛋白质结合物(Mattheakis，L.C.等，PNAS 91(1994)9022-9026；Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS 94(1997)4937-4942；Lamia，T.和Erdmann，V.A.，J.MoI.Biol.329(2003)381-388)。
通常，核糖体展示需要核糖体在抵达mRNA 3′端时终止而核糖体亚基不解离。在核糖体遇到mRNA 3′端后，核糖体的转移-RNA(tRNA)进入位点(A位点)未被占用。在原核生物中，这种状态引起由tmRNA(转移信使RNA；Abo，T.等EMBO J.19(2000)3762-3769；Hayes，C.S.和Sauer，R.T.，MoI.Cell.12(2003)903-911；Keiler，K.C.等，Science 271(1996)990-993)诱导的核糖体拯救机制激活。就核糖体展示选择而言，此机制降低功能性三元复合体的量并且显著减少PCR产物产量(Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS 94(1997)4937-4942)。
若在核糖体遇到mRNA 3′端之前，已经迫使核糖体翻译装置终止，则可以避开tmRNA诱导的核糖体拯救机制。因为翻译停滞的诱导，核糖体A位点仍被占用。核糖体展示构建体的展示间隔区具有如SEQ ID NO：62中所示的序列。借助这个间隔区，翻译可以在全长多肽翻译后和核糖体拯救机制发生前受到停滞。
这可以通过从核糖体展示构建体的DNA间隔序列中除去翻译终止密码子而实现(Mattheakis，L.C.等，PNAS 91(1994)9022-9026；Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS 94(1997)4937-4942)。因此，产生由mRNA、核糖体和翻译中止的多肽(translationally stalled polypeptide)组成的高分子量复合体。
对于文库产生，多种技术对本领域技术人员为已知。在下文概述所例举的技术。
作为DNA文库基础的线性表达元件(LEE)以模块方式产生。为以随机化的DNA片段迅速支持重叠延伸连接PCR(OEL-PCR)，预先产生DNA模块文库。为得到PCR产物的足够产量，前提是使用经HPLC纯化的引物寡核苷酸和具有3′-5′外切核酸酶活性的产生平端DNA片段的DNA聚合酶(Garrity，P.A.和Wold，B.J.，PNAS 89(1992)1021-1025)。
例如，将编码蛋白质PEX2(人基质金属蛋白酶2羧基端的血红素结合蛋白样结构域)、TIMP2(人基质金属蛋白酶的组织抑制物2)、HDAC-I(人组蛋白脱酰基酶I)、BirA(大肠杆菌生物素全酶连接酶)和GFP(绿色荧光蛋白)的基因与DNA模块的不同组合加以融合。PCR产物的浓度使用LUMIImager System(Roche Applied Sciences，Mannheim，Germany)通过比较光密度定量法加以确定。得到的线性表达元件的PCR产物平均产量是大约60ng/μl±20ng/μl(ng每μl PCR混合物)。使用P.woesii DNA聚合酶(PWO)，有可能产生长度达2000bp的LEE。
在一个实例中，产生了其中PEX2多肽的8个氨基酸位置受到随机化的小型文库。为此目的，将这些位置以及因此下列氨基酸从SEQ ID NO：10在表V中所列加以选择：528(Gln)、529(Glu)、550(Arg)、576(Lys)、577(Asn)、578(Lys)、594(VaI)和596(Lys)。文库如实施例2中所述通过无模板PCR合成产生。核糖体展示模板例如由模块T7P-g10∈-ATG(SEQ ID NO：74)、来自所生成的文库中的多肽和核糖体展示间隔区(SEQ ID NO：62)组装。
合适的蛋白质支架的前提是其稳定折叠为活性构象的能力，即便在该蛋白质支架必须携带多个经替换的氨基酸的条件下。这可以通过针对已知的蛋白质结合配偶体(partner)筛选文库进行检验。在一个实例中，PEX2文库得到展示以识别金属蛋白酶的组织抑制物2(TIMP2)蛋白质配体。来自PEX2文库的随机化多肽仍能够在核糖体展示方法中识别其固有的TIMP2结合配偶体。这表明尽管支架受到多个突变，支架的结构-功能仍得以保留。
为制备并优化基于多肽支架的特定结合物对预定靶分子的结合特性，其中所述预定靶分子不被所述支架固有地结合，必须进行数次包含四个主要步骤的循环。这些步骤是(i)改变至少一个根据表V的氨基酸位置、(ii)制备展示构建体、(iii)展示并选择特异性结合的变体以及(iv)分离并对所选变体测序。通常需要2至5轮循环以确定支架中新的特异性结合特征。
预定靶分子不限于多肽的具体类别。预定的多肽可以属于例如刺猬蛋白、骨形态发生蛋白、生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白细胞介素和干扰素之一的类别，以及免疫球蛋白、酶、抑制物、激活物以及细胞表面蛋白之一的类别。
在一个实例中，选择非PEX2结合物IGF-I作为预定靶分子用于产生基于PEX2支架的特定结合物。将靶分子铺板作为生物素化的配体。在以PEX2文库进行第二轮核糖体展示后，可视的PCR产物信号仍保留。这表明此文库充分适合于选择特异性结合预定靶分子的蛋白质/多肽，其中所述预定靶分子不固有地受此蛋白质/多肽结合。
提供如下实施例、参考文献和序列表以辅助理解本发明，本发明的真实范围由附加的权利要求书陈述。可以理解的是可以在不脱离本发明的精神下对所述方法进行修改。
实施例
实施例1重叠延伸连接PCR(OEL-PCR)
线性表达元件利用重叠DNA连接原理，通过两步骤PCR方案以模块方式组装。在标准PWO-PCR中，无内含子的可读框通过序列特异性末端桥接引物进行扩增，产生与侧翼DNA序列重叠的同源序列。将2μl含有大约50ng已延伸基因片段(基因模块)的第一PCR混合物转移至第二PWO-PCR混合物。向该混合物提供50ng至100ng预先产生的DNA片段(启动子模块和终止子模块)以及各自的序列特异性末端引物分别1μM。一般，第二PCR步骤包含30个循环。PCR特性的物理参数根据待连接DNA片段的需要进行调整。
实施例2合成PEX2DNA文库
编码血红素结合蛋白样结构域的氨基酸64、65、86、112、113、114、130和132(等同于全长人基质金属蛋白酶2中的528(Gln)、529(Glu)、550(Arg)、576(Lys)、577(Asn)、578(Lys)、594(VaI)和596(Lys))的PEX2三重密码子通过NNK-基序随机化。人野生型PEX2DNA序列分为三个序列部分。对其提供10ng载体模板pIVEX2.1MCS PEX2和引物PEX2forw(SEQ ID NO：63)和PEXR4(SEQ ID NO：64)各1μM的标准PWO-PCR扩增了1bp-218bp片段。402bp-605bp片段以10ng载体模板pIVEX2.1MCS PEX2和引物PEXF4(SEQ ID NO：65)和PEX2rev(SEQID NO：66)各1μM在标准PWO-PCR中扩增。形成的序列196bp-432bp与DNA片段1bp-218bp和402bp-605bp重叠并以引物PEXF1(SEQ IDNO：67)和PEXR1(SEQ ID NO：68)各1μM以及PEXR3(SEQ ID NO：69)、PEXR2(SEQ ID NO：70)和PEXF2(SEQ ID NO：71)各0.25μM通过无模板PCR进行合成。PCR参数对三个PCR相同：TIM(起始解链温度)：94℃ 1分钟，TM(解链温度)：94℃ 20秒，TA(复性温度)：60℃ 30秒，TE(延伸温度)：72℃ 15秒，25个循环，TFE(终末延伸温度)：72℃ 2分钟。全长的随机化PEX2序列(588bp)在将70ng各DNA序列片段用于带桥接引物T7P_PEX2(SEQ ID NO：72)和PEX2_RD(SEQ ID NO：73)各1μM的标准PWO-PCR时得到。PCR参数为TIM：94℃ 1分钟，TM：94℃ 20秒，TA：60℃ 30秒，TE：72℃ 60秒，25个循环，TFE：72℃ 5分钟。桥接引物导入的同源DNA重叠，用于通过OEL-PCR将PEX2基因文库组装为核糖体展示模板。
实施例3无细胞的蛋白质体外转录和翻译
根据制造商说明书，将线性表达元件在RTS 100HY大肠杆菌系统中转录和翻译。线性DNA模板(100ng-500ng)在30℃温育。任选地添加6μlGroE补充物(Roche)。
实施例4融和蛋白的位点特异性生物素化
调整RTS 100HY大肠杆菌系统用于序列特异性的酶促生物素化。根据制造商说明书组装60μl RTS混合物。该混合物补充以2μl无EDTA的完全蛋白酶抑制剂贮存溶液、2μM d-(+)-生物素、50ng编码大肠杆菌生物素连接酶(BirA，EC 6.3.4.15)的T7P_BirA_T7T线性表达元件(1405bp)和编码底物融合蛋白的100ng至500ng线性模板。底物融合蛋白在氨基端或羧基端融合于生物素接受肽序列(BAP)。在全部实验中，使用如由Schatz鉴定的序列#85(Schatz，P.J.，Biotechnology(NY)11(1993)1138-1143；Beckett，D.等，Protein Sci.8(1999)921-929)的15聚变体(Avitag，AvidityInc.，Denver，Colo.USA)。生物素连接酶从线性模板T7Pg10∈_birA_T7T中共表达。
实施例5a)核糖体展示方案
所有缓冲液放置在冰上。全部装置均无菌、无DNA酶和无RNA酶。工作台以RNA酶-ZAP清洁。
10×贮存洗涤缓冲液(贮存WB)核糖体展示：0.5M TRIS(三(羟甲基)-氨基甲烷)，pH 7.5(4℃)由AcOH(乙酸)调节；1.5M NaCl；0.5M乙酸镁，贮存在-20℃
10×洗脱缓冲液(贮存EB)核糖体展示：0.5M TRIS，pH 7.5(4℃)由AcOH调节；1.5M NaCl；200mM EDTA，贮存在-20℃
10ml核糖体展示洗涤缓冲液(WB)：1200μl 10×贮存WB pH 7.5，0.05％吐温20(50μL 10％吐温20)，5％BSA(5ml封闭剂BSA10％)，5μg/ml t-RNA，670mM KCl(0.5g KCl)，添加PCR级水至10ml
10ml核糖体展示终止缓冲液(SB)：1200μL 10×贮存WB pH 7.5，0.05％吐温20(50μL 10％吐温20)，5％BSA(5ml封闭剂BSA 10％)，5μg/mlt-RNA，670mM KCl(0.5g KCl)，4mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)，25μMcAMP(10μl贮存溶液)，添加PCR级水至10ml
2ml核糖体展示洗脱缓冲液：200μL 10×贮存EB，0.25％BSA(50μl封闭剂BSA 10％)，5000A260单位核糖体r-RNA 16S-23S，5μg/ml t-RNA，添加PCR级水至2ml
封闭剂：5％BSA缓冲液(2.5ml封闭剂BSA 10％)，50％通用缀合缓冲液
10xPBS缓冲液：0.1M NaH2PO4；0.01M KH2PO4(10x pH 7.0；1×pH7.4)；1.37M NaCl；27mM KCl。
b)制备胞外结构域erbB2和erbB3
人受体胞外结构域erbB2和erbB3作为受体嵌合物从R&D Systems得到。受体胞外结构域基因融合至人蛋白质IgG1FC(人IgG1抗体FC片段)。两种分子显示分子量96kDa并且在其羧基端含有六组氨酸肽。由于糖基化，蛋白质的分子量增加至130至140kDa。嵌合蛋白质作为冻干的蛋白质得到并且在含有0.1％BSA的PBS缓冲液中再溶解。将蛋白质贮藏在-80℃直至使用。
c)包被微量滴定板
一个反应体积(RV)的微量滴定(MT)板以通用缀合缓冲液洗涤三次。将2.5μg配体溶解于100μl封闭剂中。将生物素化的配体交替在经链亲和素包被和亲和素包被的MT板的孔中固定。erbB2/FC嵌合物和erbB3/FC嵌合物交替在蛋白A和蛋白G包被的MT板的孔中固定。将配体-溶液在MT板内在每分钟500转振摇的Biorobot 8000机器人振荡平台上室温温育1小时。为测定背景信号，将一个孔以不带配体的100μl封闭剂包被。孔以3RV封闭剂洗涤。将封闭剂(300μl)在每一孔内在4℃在和每分钟200转温育1小时。在实施终止翻译混合物前，孔以3RV冰冷的缓冲液WB洗涤。
d)产生核糖体展示模板
对于标准核糖体展示方法，将单个基因或基因文库以特定桥接引物延伸。延伸的DNA-片段使用末端引物T7Pfor(SEQ ID NO：75)和R1A(SEQID NO：76)5′-AAATCGAAAGGCCCAGTTTTTCG-3′通过OEL-PCR融合至DNA模块T7Pg10∈(SEQ ID NO：74)和核糖体展示间隔序列(SEQ IDNO：62)。用于PCR组装的PCR参数是：TIM：94℃ 1分钟，TM：94℃ 20秒，TA：60℃ 30秒，TE：对于1000bp是72℃ 60秒，30个循环，TFE：72℃ 5分钟
线性表达元件(LEE)T7PAviTagFXa-PEX2-T7T的产生：人PEX2基因使用SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78的桥接引物自10ng质粒模板pDSPEX2(R0che)在标准PWO-PCR中扩增。重叠的基因使用引物T7Pfor(SEQ ID NO：82)和T7Trev(SEQ ID NO：81)通过OEL-PCR融合至DNA模块T7PAviTagFXa(SEQ ID NO：79)和T7T(SEQ ID NO：80)。
e)制备核糖体展示翻译混合物
RTS大肠杆菌100HY系统根据制造商说明书准备。100μl混合物提供以40单位(1μl)RNA酶抑制剂、2μM(2μl)抗ssrA-寡核苷酸5′-TTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCGACTA-3′(SEQID NO：85)、1μL无EDTA的小量完全蛋白酶抑制剂的贮存溶液和在20μlPWO-PCR混合物中的500ng线性核糖体展示DNA模板。核糖体展示DNA模板在每分钟550转振摇下在30℃在1.5ml反应管内转录和翻译40分钟。当反应立即以500μl冰冷的缓冲液SB终止时，由mRNA、核糖体和所展示的多肽组成的复合体被稳定。将混合物在2℃于15.000g离心10分钟。将上清液转移至冰冷却的1.5ml新反应管内。将250μl混合物转移至配体包被的MT板孔(信号)并且将另外250μl混合物转移至无配体包被的孔内(背景)。将混合物在4℃和每分钟300转温育1小时。为除去背景蛋白质和弱结合的三元复合体，孔以冰冷缓冲液WB洗涤。来自结合的三元复合体的信使RNA由100μl冰冷缓冲液EB在4℃和每分钟750转下持续10分钟加以洗脱。
f)制备蛋白G包被的磁珠
蛋白G包被的磁珠用于从蛋白质衍生物中耗尽已停止的核糖体翻译混合物，其非特异性地识别IgG1-FC结合物。100μl磁珠混悬液在500μl缓冲液SB中洗涤磁珠5次而在终止缓冲液SB中平衡。磁珠在含有50μgIgG1-FC蛋白质的500μl缓冲液SB中4℃温育1小时。磁珠以缓冲液SB洗涤三次并贮藏在冰上的100μl缓冲液SB中。在使用前，磁珠以磁性方式分离并储藏在冰上。将已停止的核糖体展示翻译混合物添加至磁珠。混合物在4℃每分钟750转温育30分钟。在使用前，磁珠以磁性方式从混合物中分离。
g)纯化mRNA并除去残留的DNA
信使RNA使用高纯RNA分离试剂盒(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)纯化。洗脱物中残留的DNA模板以Ambion DNA去除试剂盒(ambion Inc.，USA)的改良方案加以去除。50μl洗脱物补充以5.7μlDNA酶I缓冲液和1.3μl含有DNA酶I的溶液。在37℃温育混合物30分钟后，添加6.5μl DNA酶I灭活试剂。将此浆液在消化分析法中室温温育2分钟，随后在11,000g离心1分钟。上清液在逆转录中使用。
h)逆转录和cDNA扩增
为逆转录mRNA，使用了C.therm.RT聚合酶试剂盒(Roche AppliedSciences，Mannheim，Germany)。组建20μl反应体系：4μl 5×RT缓冲液，1μl DTT(二硫苏糖醇)溶液、1.6μl dNTP、1μl DMSO溶液、0.1μM(1μl)RT5′-CAGAGCCTGCACCAGCTCCAGAGCCAGC-3′(SEQ ID NO：86)，40单位(1μl)RNA酶抑制剂、1.5μl C.therm.RNA聚合酶、含有mRNA的9μl洗脱物。转录在70℃进行35分钟。cDNA的进一步扩增在含有10μl带MgSO4的10×PWO-PCR缓冲液、200μM dNTP、12μl转录混合物、2.5单位PWO DNA聚合酶和引物RT5′-CAGAGCCTGCACCAGCTCCAGAGCCAGC-3′(SEQ ID NO：86)和Fl5′-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG-3′(SEQ ID NO：87)各1μM的100μl PWO-PCR中进行。PCR参数是：TIM：94℃ 1分钟，TM：94℃ 20秒，TA：60℃ 30秒，TE：72℃ 60秒，20个循环，TFE：72℃ 5分钟。通过标准PWO-PCR再次进行扩增。将2μl PCR混合物转移至第二标准PWO-PCR。根据需要使用基因特异性桥接引物。PCR参数与基因模板和寡核苷酸引物的物理参数相适应。进行25次PCR循环。基因序列在又一个OEL-PCR中以与DNA模块T7Pg1o∈及核糖体展示间隔区杂交的DNA重叠区加以延伸。核糖体展示DNA模板随后在又一轮核糖体展示循环中再次使用。
i)核糖体展示后基因的亚克隆
以本领域技术人员已知的技术将PCR产物亚克隆至载体系统内。PEX2的文库成员使用引物NdeI-PEX2for(SEQ ID NO：83)和EcoRI-PEX2rev(SEQ ID NO：84)通过Ndel/EcoRI位点亚克隆至载体pUCl8。
参考文献列表
Abo，T.等EMBO J.19(2000)3762-3769
Altruda，F.等，Nucleic Acids Res.13(1985)3841-3859
Andersson，M.等，J.Immunol.Methods 283(2003)225-234
Ausubel，L和Frederick，M.，Curr.Prot.MoI.Biol.(1992)John Wileyand Sons，New York
Beckett，D.等，Protein Sci.8(1999)921-929
Binz，H.K.等，J.MoI.Biol.332(2003)489-503
Bode，W.，Structure 3(1995)527-530
Brooks，P.C.等，Cell 92(1998)391-400
Faber，H.R.等，Structure 3(1995)551-559
Forrer，P.等，ChemBioChem 5(2004)183-189
Fulop，V.和Jones，D.T.，Curr.Opin.Struct.Biol.9(1999)715-721
Garrlty，P.A.和Wold，B.J.，PNAS 89(1992)1021-1025
Gohlke，U.等，FEBS Lett.378(1996)126-130
Gomis-Ruth，F.X.等，J.MoI.Biol.264(1996)556-566
Hames，B.D.和Higgins，S.G.，Nucleic acid Hybridation-a practicalapproach(1985)IRL Press，Oxford，England
Hanes，J.和Pluckthun，A.，PNAS 94(1997)4937-4942
Hayes，C.S.和Sauer，R.T.，MoI.Cell.12(2003)903-911
He，M.和Taussig，M.J.，Nuc.Acids Res.25(1997)5132-5134
Ho，S.N.等，Gene 77(1989)51-59
Jenne，D.和Stanley，K.K.，Biochemistry 26(1987)6735-6742
Jenne，D.，Biochem.Biophys.Res.Commun.176(1991)1000-1006
Kain，K.C.等，Biotechniques 10(1991)366-374
Keiler，K.C.等，Science 271(1996)990-993
Klevenz，B.等，Cell.MoI.Life Sci.59(2002)1993-1998
Lamia，T.和Erdmann，V.A.，J.MoL Biol.329(2003)381-388
Lee，S.S.和Kang，C，Kor.Biochem.J.24(1991)673-679
Letunic，L等，Nuc.Acids Res.30(2002)242-244
Li，J.等，Structure 3(1995)541-549
Libson，A.M.等，Nat.Struct.Biol.2(1995)938-942
Lu，Z.等，Bio/Technology 13(1995)366-372
Mattheakis，L.C.等，PNAS 91(1994)9022-9026
McConnell S.J.和Hoess，R.H.，J.MoL Biol.250(1995)460-470
Nygren，P.-A.和Skerra，A.，J.Immun.Methods 290(2004)3-28
Predki，P.F.等，Nat.Struct.Biol.3(1996)54-58
Roberts，B.L.等，Gene 121(1992)9-15
Roberts，B.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)2429-2433
Rottgen，P.和Collins，J.，Gene 164(1995)243-250
Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A laboratory manual(1999)Cold
Spring Harbor Laboratory Press，New York，USA
Sandstrom，K.等，Protein Eng.16(2003)691-697
Schatz，P.J.，Biotechnology(NY)11(1993)1138-1143
Schultz，J.等，PNAS 95(1998)5857-5864
Segal，DJ.等，Biochemistry 42(2003)2137-2148
Shuldiner，A.R.等，Anal.Biochem.194(1991)9-15
Skerra，A.，J.MoL Recognit.13(2000)167-187
Smith，G.P.等，J.MoL Biol.277(1998)317-332
Smith，G.P.，Science 228(1985)1315-1317
Stahl，S.和Uhlen，M.，TIBTECH 15(1997)185-192
Sykes，K.F.和Johnston，S.A.，Nature Biotechnol.17(1999)355-359
Visintin，M.等，J.Immun.Methods 290(2004)135-153
Wallon，U.M.和Overall，CM.，J.Biol.Chem.272(1997)7473-7481
Willenbrock，F.等，Biochemistry 32(1993)4330-4337
WO 01/04144
Xu，L.等，Chem.Biol.9(2002)933-942
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
 
<120>作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构
 
<130>22953
      
<150>EP 05000013.2
<151>2005-01-03
      
<160>88
 
<170>PatentIn版本3.2
 
<210>1
<211>195
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>共有序列
 
<400>1
 
Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val
            20                  25                  30
Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp
        35                  40                  45
Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu
    50                  55                  60
Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala
65                  70                  75                  80
Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn
            100                     105                 110
Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu
        115                 120                 125
Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala
    130                 135                 140
Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu
                165                 170                 175
Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Gly Cys
        195
 
<210>2
<211>195
<212>PRT
<213>原鸡(Gallus gallus)
 
<400>2
 
Pro Glu Leu Cys Lys His Asp Ile Val Phe Asp Gly Val Ala Gln Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Val
            20                  25                  30
Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp
        35                  40                  45
Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ser Pro Gln Asp
    50                  55                  60
Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Thr Ala
65                  70                  75                  80
Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Pro Pro Asp Val Gln Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn
            100                 105                 110
Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu
        115                 120                 125
Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe Ile Ala Asp Ser
    130                 135                 140
Trp Asn Gly Val Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Leu Gly Leu Thr Asp
145                 150                 155                 160
Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln Tyr Tyr Leu Gln Met Glu
                165                 170                 175
Asp Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Ile Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Gly Cys
        195
 
<210>3
<211>305
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
 
<400>3
 
Met Ala Ala Arg Glu Glu Ser Thr Gln Ser Ala Asn Arg Val Leu Arg
1               5                   10                  15
Ile Ser Gln Leu Asp Ala Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Glu Gln Leu
            20                  25                  30
Val Trp Ser Gln Phe Thr Gln Cys Phe His Gly Phe Lys Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Leu Ala Arg Phe Glu Pro Glu Val Lys Ala Phe Leu Trp Leu Phe Leu
    50                  55                  60
Trp Arg Phe Thr Ile Tyr Ser Lys Asn Ala Thr Val Gly Gln Ser Val
65                  70                  75                  80
Leu Asn Ile Gln His Lys Asn Asp Ser Ser Pro Asn Pro Val Tyr Gln
                85                  90                  95
Pro Pro Ser Lys Asn Gln Lys Leu Leu Tyr Ala Val Cys Thr Ile Gly
            100                 105                 110
Gly Arg Trp Leu Glu Glu Arg Cys Tyr Asp Leu Phe Arg Asn Arg His
        115                 120                 125
Leu Ala Ser Phe Gly Lys Ala Lys Gln Cys Met Asn Phe Val Val Gly
    130                 135                 140
Leu Leu Lys Leu Gly Glu Leu Met Asn Phe Leu Ile Phe Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Gly Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Arg Leu Leu Gly Ile His Ser Val
                165                 170                 175
Phe Cys Lys Pro Gln Asn Met Arg Glu Val Gly Phe Glu Tyr Met Asn
            180                 185                 190
Arg Glu Leu Leu Trp His Gly Phe Ala Glu Phe Leu Ile Phe Leu Leu
        195                 200                 205
Pro Leu Ile Asn Ile Gln Lys Leu Lys Ala Lys Leu Ser Ser Trp Cys
    210                 215                 220
Thr Leu Cys Thr Gly Ala Ala Gly His Asp Ser Thr Leu Gly Ser Ser
225                 230                 235                 240
Gly Lys Glu Cys Ala Leu Cys Gly Glu Trp Pro Thr Met Pro His Thr
                245                 250                 255
Ile Gly Cys Glu His Val Phe Cys Tyr Tyr Cys Val Lys Ser Ser Phe
            260                 265                 270
Leu Phe Asp Ile Tyr Phe Thr Cys Pro Lys Cys Gly Thr Glu Val His
        275                 280                 285
Ser Val Gln Pro Leu Lys Ala Gly Ile Gln Met Ser Glu Val Asn Ala
    290                 295                 300
Leu
305
 
<210>4
<211>305
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
 
<400>4
 
Met Ala Ala Arg Glu Glu Ser Thr Gln Ser Ala Asn Arg Val Leu Arg
1               5                   10                  15
Ile Ser Gln Leu Asp Ala Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Glu Gln Leu
            20                  25                  30
Val Trp Ser Gln Phe Thr Gln Cys Phe His Gly Phe Lys Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Leu Ala Arg Phe Glu Pro Glu Val Lys Ala Phe Leu Trp Leu Phe Leu
    50                  55                  60
Trp Arg Phe Thr Ile Tyr Ser Lys Asn Ala Thr Val Gly Gln Ser Val
65                  70                  75                  80
Leu Asn Ile Gln Tyr Lys Asn Asp Ser Ser Pro Asn Pro Val Tyr Gln
                85                  90                  95
Pro Pro Ser Lys Asn Gln Lys Leu Leu Tyr Ala Val Cys Thr Ile Gly
            100                 105                 110
Gly Arg Trp Leu Glu Glu Arg Cys Tyr Asp Leu Phe Arg Asn Arg His
        115                 120                 125
Leu Ala Ser Phe Gly Lys Ala Lys Gln Cys Met Asn Phe Val Val Gly
    130                 135                 140
Leu Leu Lys Leu Gly Glu Leu Met Asn Phe Leu Ile Phe Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Gly Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Arg Leu Leu Gly Ile His Ser Val
                165                 170                 175
Phe Cys Lys Pro Gln Ser Met Arg Glu Val Gly Phe Glu Tyr Met Asn
            180                 185                 190
Arg Glu Leu Leu Trp His Gly Phe Ala Glu Phe Leu Val Phe Leu Leu
        195                 200                 205
Pro Leu Ile Asn Ile Gln Lys Leu Lys Ala Lys Leu Ser Ser Trp Cys
    210                 215                 220
Ile Pro Leu Thr Ser Thr Ala Gly Ser Asp Ser Thr Leu Gly Ser Ser
225                 230                 235                 240
Gly Lys Glu Cys Ala Leu Cys Gly Glu Trp Pro Thr Met Pro His Thr
                245                 250                 255
Ile Gly Cys Glu His Val Phe Cys Tyr Tyr Cys Val Lys Ser Ser Phe
            260                 265                 270
Leu Phe Asp Met Tyr Phe Thr Cys Pro Lys Cys Gly Thr Glu Val His
        275                 280                 285
Ser Val Gln Pro Leu Lys Ser Gly Ile Glu Met Ser Glu Val Asn Ala
    290                 295                 300
Leu
305
 
<210>5
<211>195
<212>PRT
<213>西班牙野兔(Oryctolagus cuniculus)
 
<400>5
 
Pro Glu Ile Cys Thr Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val
            20                  25                  30
Thr Pro Gly Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp
        35                  40                  45
Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu
    50                  55                  60
Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Val Tyr Ser Ala
65                  70                  75                  80
Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn
            100                 105                 110
Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu
        115                 120                 125
Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Arg Leu Ile Ala Asp Ala
    130                 135                 140
Trp Asn Ala Ile Pro Asp His Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly
145                 150                 155                 160
Ser Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Thr Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu
                165                 170                 175
Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Val Gly Ser Ile Lys Thr Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Gly Cys
        195
 
<210>6
<211>195
<212>PRT
<213>普通牛(Bos taurus)
 
<400>6
 
Pro Glu Val Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Thr Asn
            20                  25                  30
Pro Leu Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Gln Leu Pro Asn Gly Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Val Ala Asp Arg Asp
    50                  55                  60
Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Lys Gly Gln
65                  70                  75                  80
Asp Val Leu Arg Gly Tyr Pro Arg Asp Ile Tyr Arg Ser Phe Gly Phe
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Val Lys Ser Ile Asp Ala Ala Val Ser Glu Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Cys Trp Arg Tyr Asp Glu
        115                 120                 125
Tyr Lys Gln Ser Met Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala Glu Asp
    130                 135                 140
Phe Pro Gly Ile Gly Asn Lys Val Asp Ala Val Phe Gln Lys Gly Gly
145                 150                 155                 160
Phe Phe Tyr Phe Phe His Gly Arg Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Gln
                165                 170                 175
Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Leu Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys
            180                 185                 190
Arg Lys Asn
        195
 
<210>7
<211>195
<212>PRT
<213>家马(Equus caballus)
 
<400>7
 
Pro Glu Val Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Ile Asn
            20                  25                  30
Pro Tyr Tyr Pro Glu Ala Glu Leu Asn Phe Ile Ser Ile Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Gln Leu Pro Asn Gly Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Val Ser His Arg Asp
    50                  55                  60
Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Lys Gly Gln
65                  70                  75                  80
Asp Val Leu Tyr Gly Tyr Pro Lys Asp Ile His Arg Ser Phe Gly Phe
                85                  90                  95
Pro Ser Thr Val Lys Asn Ile Asp Ala Ala Val Ser Glu Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asp Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu
        115                 120                 125
Tyr Lys Arg Ser Met Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala Asp Asp
    130                 135                 140
Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Phe Gln Lys Asp Gly
145                 150                 155                 160
Phe Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Lys
                165                 170                 175
Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys
            180                 185                 190
Arg Lys Asn
        195
 
<210>8
<211>195
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
 
<400>8
 
Pro Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Thr Asn
            20                  25                  30
Pro Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Gln Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Phe Ala Asp Arg Asp
    50                  55                  60
Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln Gly Gln
65                  70                  75                  80
Asn Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe Gly Phe
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu Asn Thr
            100                 105                 110
Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu
        115                 120                 125
Tyr Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala His Asp
    130                 135                 140
Phe Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys Asp Gly
145                 150                 155                 160
Phe Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Lys
                165                 170                 175
Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys
            180                 185                 190
Arg Lys Asn
        195
 
<210>9
<211>195
<212>PRT
<213>家猪(Sus scrofa)
<400>9
 
Pro Gln Val Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Leu Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Thr Asn
            20                  25                  30
Ser Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Gln Val Pro Asn Gly Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Ile Ala Asp Arg Asp
    50                  55                  60
Glu Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Arg Gly Gln
65                  70                  75                  80
Asp Val Leu Tyr Gly Tyr Pro Lys Asp Ile His Arg Ser Phe Gly Phe
                85                  90                  95
Pro Ser Thr Val Lys Asn Ile Asp Ala Ala Val Phe Glu Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala His Glu Cys Trp Arg Tyr Asp Glu
        115                 120                 125
Tyr Lys Gln Ser Met Asp Thr Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala Glu Glu
    130                 135                 140
Phe Pro Gly Ile Gly Asn Lys Val Asp Ala Val Phe Gln Lys Asp Gly
145                 150                 155                 160
Phe Leu Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Lys
                165                 170                 175
Thr Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys
            180                 185                 190
Arg Lys Asn
        195
<210>10
<211>195
<212>PRT
<213>人
 
<400>10
 
Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Val
            20                  25                  30
Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr Phe Trp
        35                  40                  45
Pro Glu Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr Glu Ala Pro Gln Glu
    50                  55                  60
Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala
65                  70                  75                  80
Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu
                85                  90                  95
Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn
            100                 105                 110
Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu
        115                 120                 125
Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala
    130                 135                 140
Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu
                165                 170                 175
Asn Gln Ser Leu Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Gly Cys
        195
 
<210>11
<211>191
<212>PRT
<213>人
 
<400>11
 
Pro Ala Asn Cys Asp Pro Ala Leu Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Leu Ile Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser
    20                          25                  30
Leu Arg Lys Leu Glu Pro Glu Leu His Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Ser Gly Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Ser Lys Asp
    50                  55                  60
Leu Val Phe Ile Phe Lys Gly Asn Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn
65                  70                  75                  80
Glu Val Arg Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Pro Thr Val Arg Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Asp Lys Glu Lys Asn
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys
        115                 120                 125
Arg Asn Ser Met Glu Pro Gly Phe Pro Lys Gln Ile Ala Glu Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Asp Ser Lys Ile Asp Ala Val Phe Glu Glu Phe Gly Phe
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Phe Phe Thr Gly Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Lys Val Thr His Thr Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu Asn Cys
            180                 185                 190
 
<210>12
<211>191
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>12
 
Ser Pro Met Cys Ser Ser Thr Leu Phe Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Val Leu Phe Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser
            20                  25                  30
Leu Arg Thr Pro Glu Pro Glu Phe Tyr Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Ser Asn Met Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Asn Arg Asp
    50                  55                  60
Thr Val Phe Ile Phe Lys Gly Asn Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly His
65                  70                  75                  80
Glu Glu Leu Ala Gly Tyr Pro Lys Ser Ile His Thr Leu Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Ala Thr Val Lys Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Asn Lys Glu Lys Arg
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys
        115                 120                 125
Lys Gln Ser Met Glu Pro Gly Phe Pro Arg Lys Ile Ala Glu Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Val Asp Ser Arg Val Asp Ala Val Phe Glu Ala Phe Gly Phe
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Phe Phe Ser Gly Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Lys Val Thr His Ile Leu Lys Ser Asn Ser Trp Phe Asn Cys
            180                 185                 190
 
<210>13
<211>191
<212>PRT
<213>西班牙野兔
 
<400>13
 
Pro Val Met Cys Asp Pro Asp Leu Ser Phe Asp Ala Ile Ser Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Leu Phe Phe Lys Asp Arg Tyr Phe Trp Arg Lys Ser
            20                  25                  30
Leu Arg Ile Leu Glu Pro Glu Phe His Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Ser Ala Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Ile Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Thr Val Phe Ile Phe Lys Gly Thr Gln Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn
65                  70                  75                  80
Glu Val Gln Ala Gly Tyr Pro Arg Ser Ile His Thr Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Ser Thr Ile Arg Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Asp Lys Glu Arg Lys
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Lys
        115                 120                 125
Arg Gln Ser Leu Glu Pro Gly Phe Pro Arg His Ile Ala Glu Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Asn Pro Lys Ile Asp Ala Val Phe Glu Ala Phe Gly Phe
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Phe Phe Ser GIy Ser Ser Gln Ser Glu Phe Asp Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Lys Val Thr His Val Leu Lys Ser Asn Ser Trp Phe Gln Cys
            180                 185                 190
 
<210>14
<211>191
<212>PRT
<213>褐家鼠
 
<400>14
 
Leu Pro Met Cys Ser Ser Ala Leu Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Val Leu Phe Phe Lys Asp Arg His Phe Trp Arg Lys Ser
            20                  25                  30
Leu Arg Thr Pro Glu Pro Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Ser Asn Met Asp Ala Ala Tyr Glu Val Thr Asn Arg Asp
    50                  55                  60
Thr Val Phe Ile Leu Lys Gly Asn Gln Ile Trp Ala Ile Arg Gly His
65                  70                  75                  80
Glu Glu Leu Ala Gly Tyr Pro Lys Ser Ile His Thr Leu Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Glu Thr Val Gln Lys Ile Asp Ala Ala Ile Ser Leu Lys Asp Gln Lys
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Glu Asp Lys Phe Trp Arg Phe Asp Glu Lys
        115                 120                 125
Lys Gln Ser Met Asp Pro Glu Phe Pro Arg Lys Ile Ala Glu Asn Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Gly Thr Lys Val Asp Ala Val Phe Glu Ala Phe Gly Phe
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Phe Phe Ser Gly Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Gly Lys Val Thr His Ile Leu Lys Ser Asn Ser Trp Phe Asn Cys
            180                 185                 190
 
<210>15
<211>192
<212>PRT
<213>人
 
<400>15
 
Pro Lys Pro Cys Asp Pro Ser Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Leu Phe Phe Lys Asp Arg Tyr Phe Trp Arg Arg His
            20                  25                  30
Pro Gln Leu Gln Arg Val Glu Met Asn Phe Ile Ser Leu Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Thr Gly Ile Gln Ala Ala Tyr Glu Asp Phe Asp Arg Asp
    50                  55                  60
Leu Ile Phe Leu Phe Lys Gly Asn Gln Tyr Trp Ala Leu Ser Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Ile Leu Gln Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Ser Asn Tyr Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Ser Ser Val Gln Ala Ile Asp Ala Ala Val Phe Tyr Arg Ser Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Val Asn Asp Gln Phe Trp Arg Tyr Asp Asn Gln Arg Gln
        115                 120                 125
Phe Met Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ile Ser Gly Ala Phe Pro Gly
    130                 135                 140
Ile Glu Ser Lys Val Asp Ala Val Phe Gln Gln Glu His Phe Phe His
145                 150                 155                 160
Val Phe Ser Gly Pro Arg Tyr Tyr Ala Phe Asp Leu Ile Ala Gln Arg
                165                 170                 175
Val Thr Arg Val Ala Arg Gly Asn Lys Trp Leu Asn Cys Arg Tyr Gly
            180                 185                 190
 
<210>16
<211>190
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>16
 
Pro Lys Ala Cys Asp Pro His Leu Arg Phe Asp Ala Thr Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Tyr Phe Phe Lys Glu Lys Tyr Phe Trp Arg Arg His
            20                  25                  30
Pro Gln Leu Arg Thr Val Asp Leu Asn Phe Ile Ser Leu Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Gly Leu Pro Asn Gly Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Asp Phe Asp Arg Asp
    50                  55                  60
Leu Val Phe Leu Phe Lys Gly Arg Gln Tyr Trp Ala Leu Ser Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Leu Gln Gln Gly Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Asn Tyr Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg Ser Val Gln Ala Ile Asp Ala Ala Val Ser Tyr Asn Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Ile Asn Asn Gln Cys Trp Arg Tyr Asp Asn Glu Arg Arg
        115                 120                 125
Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ile Pro Ser Met Phe Pro Gly
    130                 135                 140
Val Asn Cys Arg Val Asp Ala Val Phe Leu Gln Asp Ser Phe Phe Leu
145                 150                 155                 160
Phe Phe Ser Gly Pro Gln Tyr Phe Ala Phe Asn Phe Val Ser His Arg
                165                 170                 175
Val Thr Arg Val Ala Arg Ser Asn Leu Trp Leu Asn Cys Ser
            180                 185                 190
 
<210>17
<211>190
<212>PRT
<213>褐家鼠
 
<400>17
Pro Thr Ala Cys Asp Pro His Leu Arg Phe Asp Ala Ala Thr Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Ile Tyr Phe Phe Lys Asp Lys Tyr Phe Trp Arg Arg His
            20                  25                  30
Pro Gln Leu Arg Thr Val Asp Leu Asn Phe Ile Ser Leu Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Phe Leu Pro Asn Gly Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Asp Phe Asp Arg Asp
    50                  55                  60
Leu Val Phe Leu Phe Lys Gly Arg Gln Tyr Trp Ala Leu Ser Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Leu Gln Gln Gly Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Asn Tyr Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg Ser Val Gln Ala Ile Asp Ala Ala Val Ser Tyr Asn Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Val Asn Asn Gln Cys Trp Arg Tyr Asp Asn Gln Arg Arg
        115                 120                 125
Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Ile Ala Ser Val Phe Pro Gly
    130                 135                 140
Ile Asn Cys Arg Ile Asp Ala Val Phe Gln Gln Asp Ser Phe Phe Leu
145                 150                 155                 160
Phe Phe Ser Gly Pro Gln Tyr Phe Ala Phe Asn Leu Val Ser Arg Arg
                165                 170                 175
Val Thr Arg Val Ala Arg Ser Asn Leu Trp Leu Asn Cys Pro
            180                 185                 190
 
<210>18
<211>195
<212>PRT
<213>普通牛
 
<400>18
 
Glu Asp Val Cys Asn Val Asp Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Arg
1               5                   10                  15
Asn Arg Leu His Phe Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Trp Arg Leu Ser Glu
            20                  25                  30
Gly Gly Gly Arg Arg Val Gln Gly Pro Phe Leu Val Lys Ser Lys Trp
        35                  40                  45
Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Ala Phe Glu Asp Pro Leu Thr
    50                  55                  60
Lys Lys Ile Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Ser Leu Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Pro
                85                  90                  95
Glu Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Pro Arg Pro Glu Gly Lys Val
            100                 105                 110
Leu Leu Phe Ser Gly Gln Ser Phe Trp Arg Phe Asp Val Lys Thr Gln
        115                 120                 125
Lys Val Asp Pro Gln Ser Val Thr Pro Val Asp Gln Met Phe Pro Gly
    130                 135                 140
Val Pro Ile Ser Thr His Asp Ile Phe Gln Tyr Gln Glu Lys Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Cys Gln Asp His Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Gln Asn Glu Val
                165                 170                 175
Asn Gln Val Asp Tyr Val Gly Tyr Val Thr Phe Asp Leu Leu Lys Cys
            180                 185                 190
Pro Glu Asp
        195
 
<210>19
<211>195
<212>PRT
<213>犬(Canis familiaris)
 
<400>19
 
Glu Asp Ile Cys Lys Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Arg
1               5                   10                  15
Asn Tyr Leu His Phe Phe Lys Glu Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Lys
            20                  25                  30
Gly Lys Gly Arg Arg Val Gln Gly Pro Phe Leu Ser Pro Ser Thr Trp
        35                  40                  45
Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Ala Phe Glu Asp Gly Leu Thr
    50                  55                  60
Lys Lys Thr Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly
65                  70                  75                  80
Thr Ser Val Val Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Pro
                85                  90                  95
Glu Val Thr Gln Val Thr Gly Ala Leu Pro Gln Gly Gly Gly Lys Val
            100                 105                 110
Leu Leu Phe Ser Arg Gln Arg Phe Trp Ser Phe Asp Val Lys Thr Gln
        115                 120                 125
Thr Val Asp Pro Arg Ser Ala Gly Ser Val Glu Gln Met Tyr Pro Gly
    130                 135                 140
Val Pro Leu Asn Thr His Asp Ile Phe Gln Tyr Gln Glu Lys Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Asn Ser Arg Asn Glu Val
                165                 170                 175
Asn Gln Val Asp Glu Val Gly Tyr Val Thr Phe Asp Ile Leu Gln Cys
            180                 185                 190
Pro Glu Asp
        195
 
<210>20
<211>195
<212>PRT
<213>人
 
<400>20
 
Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu
            20                  25                  30
Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp
        35                  40                  45
Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val  Phe Glu Glu Pro Leu Ser
    50                  55                  60
Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly
65                  70                  75                  80
Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala
                85                  90                  95
Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met
            100                 105                 110
Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln
        115                 120                 125
Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly
    130                 135                 140
Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu
                165                 170                 175
Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys
            180                 185                 190
Pro Glu Asp
        195
 
<210>21
<211>200
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>21
 
Asp Asn Pro Cys Asn Val Asp Val Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gln
1               5                   10                  15
Gly Ala Leu His Phe Phe Lys Asp Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Leu Asn
            20                  25                  30
His Arg Gly Ser Pro Leu Gln Gly Pro Phe Leu Thr Ala Arg Thr Trp
        35                  40                  45
Pro Ala Leu Pro Ala Thr Leu Asp Ser Ala Phe Glu Asp Pro Gln Thr
    50                  55                  60
Lys Arg Val Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Met Trp Val Tyr Thr Gly
65                  70                  75                   80
Lys Thr Val Leu Gly Pro Arg Ser Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Pro
                85                  90                  95
Glu Val Thr His Val Ser Gly Leu Leu Pro Arg Arg Pro Gly Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Leu Phe Ser Lys Gly Arg Val Trp Arg Phe Asp Leu Lys Ser Gln
        115                 120                 125
Lys Val Asp Pro Gln Ser Val Ile Arg Val Asp Lys Glu Phe Ser Gly
    130                 135                 140
Val Pro Trp Asn Ser His Asp Ile Phe Gln Tyr Gln Asp Lys Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Cys His Gly Lys Phe Phe Trp Arg Val Ser Phe Gln Asn Glu Val
                165                 170                 175
Asn Lys Val Asp Pro Glu Val Asn Gln Val Asp Asp Val Gly Tyr Val
            180                 185                 190
Thr Tyr Asp Leu Leu Gln Cys Pro
        195                 200
 
<210>22
<211>191
<212>PRT
<213>人
 
<400>22
 
Pro Ala Lys Cys Asp Pro Ala Leu Ser Phe Asp Ala Ile Ser Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Tyr Leu Phe Phe Lys Asp Arg Tyr Phe Trp Arg Arg Ser
            20                  25                  30
His Trp Asn Pro Glu Pro Glu Phe His Leu Ile Ser Ala Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Ser Tyr Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Val Asn Ser Arg Asp
    50                  55                  60
Thr Val Phe Ile Phe Lys Gly Asn Glu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Asn
65                  70                  75                  80
Glu Val Gln Ala Gly Tyr Pro Arg Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Pro Thr Ile Arg Lys Ile Asp Ala Ala Val Ser Asp Lys Glu Lys Lys
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Ala Ala Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Asn
        115                 120                 125
Ser Gln Ser Met Glu Gln Gly Phe Pro Arg Leu Ile Ala Asp Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Val Glu Pro Lys Val Asp Ala Val Leu Gln Ala Phe Gly Phe
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Phe Phe Ser Gly Ser Ser Gln Phe Glu Phe Asp Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Arg Met Val Thr His Ile Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu His Cys
            180                 185                 190
 
<210>23
<211>191
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>23
 
Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ala Leu Ser Phe Asp Ser Val Ser Thr Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Val Leu Phe Phe Lys Asp Arg Tyr Phe Trp Arg Arg Ser
            20                  25                  30
His Trp Asn Pro Glu Pro Glu Phe His Leu Ile Ser Ala Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Thr Leu Pro Ser Asp Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ala His Asn Thr Asp
    50                  55                  60
Ser Val Leu Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Trp Ala Val Arg Gly Asn
65                  70                  75                  80
Glu Val Gln Ala Gly Tyr Pro Lys Gly Ile His Thr Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Pro Thr Val Lys Lys Ile Asp Ala Ala Val Phe Glu Lys Glu Lys Lys
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Gly Asp Lys Tyr Trp Arg Phe Asp Glu Thr
        115                 120                 125
Arg His Val Met Asp Lys Gly Phe Pro Arg Gln Ile Thr Asp Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Glu Pro Gln Val Asp Ala Val Leu His Glu Phe Gly Phe
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Phe Phe Arg Gly Ser Ser Gln Phe Glu Phe Asp Pro Asn Ala
                165                 170                 175
Arg Thr Val Thr His Ile Leu Lys Ser Asn Ser Trp Leu Leu Cys
            180                 185                 190
 
<210>24
<211>198
<212>PRT
<213>人
<400>24
 
Pro Asp Ala Cys Glu Ala Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Ile Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Leu Phe Phe Phe Lys Ala Gly Phe Val Trp Arg Leu Arg Gly Gly
            20                  25                  30
Gln Leu Gln Pro Gly Tyr Pro Ala Leu Ala Ser Arg His Trp Gln Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ser Pro Val Asp Ala Ala Phe Glu Asp Ala Gln Gly His Ile
    50                  55                  60
Trp Phe Phe Gln Gly Ala Gln Tyr Trp Val Tyr Asp Gly Glu Lys Pro
65                  70                  75                  80
Val Leu Gly Pro Ala Pro Leu Thr Glu Leu Gly Leu Val Arg Phe Pro
                85                  90                  95
Val His Ala Ala Leu Val Trp Gly Pro Glu Lys Asn Lys Ile Tyr Phe
            100                 105                 110
Phe Arg Gly Arg Asp Tyr Trp Arg Phe His Pro Ser Thr Arg Arg Val
        115                 120                 125
Asp Ser Pro Val Pro Arg Arg Ala Thr Asp Trp Arg Gly Val Pro Ser
    130                 135                 140
Glu Ile Asp Ala Ala Phe Gln Asp Ala Asp Gly Tyr Ala Tyr Phe Leu
145                 150                 155                 160
Arg Gly Arg Leu Tyr Trp Lys Phe Asp Pro Val Lys Val Lys Ala Leu
                165                 170                 175
Glu Gly Phe Pro Arg Leu Val Gly Pro Asp Phe Phe Gly Cys Ala Glu
            180                 185                 190
Pro Ala Asn Thr Phe Leu
        195
 
<210>25
<211>198
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>25
 
Pro Asp Val Cys Glu Thr Ser Phe Asp Ala Val Ser Thr Ile Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Leu Phe Phe Phe Lys Ala Gly Phe Val Trp Arg Leu Arg Ser Gly
            20                  25                  30
Arg Leu Gln Pro Gly Tyr Pro Ala Leu Ala Ser Arg His Trp Gln Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ser Pro Val Asp Ala Ala Phe Glu Asp Ala Gln Gly Gln Ile
    50                  55                  60
Trp Phe Phe Gln Gly Ala Gln Tyr Trp Val Tyr Asp Gly Glu Lys Pro
65                  70                  75                  80
Val Leu Gly Pro Ala Pro Leu Ser Lys Leu Gly Leu Gln Gly Ser Pro
                85                  90                  95
Val His Ala Ala Leu Val Trp Gly Pro Glu Lys Asn Lys Ile Tyr Phe
            100                 105                 110
Phe Arg Gly Gly Asp Tyr Trp Arg Phe His Pro Arg Thr Gln Arg Val
        115                 120                 125
Asp Asn Pro Val Pro Arg Arg Ser Thr Asp Trp Arg Gly Val Pro Ser
    130                 135                 140
Glu Ile Asp Ala Ala Phe Gln Asp Ala Glu Gly Tyr Ala Tyr Phe Leu
145                 150                 155                 160
Arg Gly His Leu Tyr Trp Lys Phe Asp Pro Val Lys Val Lys Val Leu
                165                 170                 175
Glu Gly Phe Pro Arg Pro Val Gly Pro Asp Phe Phe Asp Cys Ala Glu
            180                 185                 190
Pro Ala Asn Thr Phe Arg
        195
 
<210>26
<211>192
<212>PRT
<213>人
 
<400>26
 
Pro Ala Leu Cys Asp Pro Asn Leu Ser Phe Asp Ala Val Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Asn Lys Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Leu Lys Val
            20                  25                  30
Ser Glu Arg Pro Lys Thr Ser Val Asn Leu Ile Ser Ser Leu Trp Pro
        35                  40                  45
Thr Leu Pro Ser Gly Ile Glu Ala Ala Tyr Glu Ile Glu Ala Arg Asn
    50                  55                  60
Gln Val Phe Leu Phe Lys Asp Asp Lys Tyr Trp Leu Ile Ser Asn Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Glu Pro Asn Tyr Pro Lys Ser Ile His Ser Phe Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Asn Phe Val Lys Lys Ile Asp Ala Ala Val Phe Asn Pro Arg Phe Tyr
            100                 105                 110
Arg Thr Tyr Phe Phe Val Asp Asn Gln Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Arg
        115                 120                 125
Arg Gln Met Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Leu Ile Thr Lys Asn Phe
    130                 135                 140
Gln Gly Ile Gly Pro Lys Ile Asp Ala Val Phe Tyr Ser Lys Asn Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Tyr Phe Phe Gln Gly Ser Asn Gln Phe Glu Tyr Asp Phe Leu
                165                 170                 175
Leu Gln Arg Ile Thr Lys Thr Leu Lys Ser Asn Ser Trp Phe Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>27
<211>191
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>27
 
Ser Thr Phe Cys His Gln Ser Leu Ser Phe Asp Ala Val Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Glu Lys Ile Leu Phe Phe Lys Asp Trp Phe Phe Trp Trp Lys Leu
            20                  25                  30
Pro Gly Ser Pro Ala Thr Asn Ile Thr Ser Ile Ser Ser Ile Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Ile Pro Ser Ala Ile Gln Ala Ala Tyr Glu Ile Glu Ser Arg Asn
    50                  55                  60
Gln Leu Phe Leu Phe Lys Asp Glu Lys Tyr Trp Leu Ile Asn Asn Leu
65                  70                  75                  80
Val Pro Glu Pro His Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Phe Ser
                85                  90                  95
Ala Ser Val Lys Lys Val Asp Ala Ala Val Phe Asp Pro Leu Arg Gln
            100                 105                 110
Lys Val Tyr Phe Phe Val Asp Lys His Tyr Trp Arg Tyr Asp Val Arg
        115                 120                 125
Gln Glu Leu Met Asp Pro Ala Tyr Pro Lys Leu Ile Ser Thr His Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Lys Pro Lys Ile Asp Ala Val Leu Tyr Phe Lys Arg His
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Ile Phe Gln Gly Ala Tyr Gln Leu Glu Tyr Asp Pro Leu Phe
                165                 170                 175
Arg Arg Val Thr Lys Thr Leu Lys Ser Thr Ser Trp Phe Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>28
<211>191
<212>PRT
<213>西班牙野兔
 
<400>28
 
Pro Thr Ala Cys Asp His Asn Leu Lys Phe Asp Ala Val Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Asn Lys Ile Phe Phe Phe Lys Asp Ser Phe Phe Trp Trp Lys Ile
            20                  25                  30
Pro Lys Ser Ser Thr Thr Ser Val Arg Leu Ile Ser Ser Leu Trp Pro
        35                  40                  45
Thr Leu Pro Ser Gly Ile Glu Ala Ala Tyr Glu Ile Gly Asp Arg His
    50                  55                  60
Gln Val Phe Leu Phe Lys Gly Asp Lys Phe Trp Leu Ile Ser His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Leu Gln Pro Asn Tyr Pro Lys Ser Ile His Ser Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Asp Phe Val Lys Lys Ile Asp Ala Ala Val Phe Asn Pro Ser Leu Arg
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Asp Asn Leu Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Arg
        115                 120                 125
Arg Glu Val Met Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Leu Ile Thr Lys His Phe
    130                 1351                 40
Pro Gly Ile Gly Pro Lys Ile Asp Ala Val Phe Tyr Phe Gln Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Phe Phe Gln Gly Pro Asn Gln Leu Glu Tyr Asp Thr Phe Ser
                165                 170                 175
Ser Arg Val Thr Lys Lys Leu Lys Ser Asn Ser Trp Phe Asp Cys
            180                 185                 190
 
<210>29
<211>191
<212>PRT
<213>褐家鼠
 
<400>29
 
Ser Thr Val Cys His Gln Ser Leu Ser Phe Asp Ala Val Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Gly Asp Lys Ile Phe Phe Phe Lys Asp Trp Phe Phe Trp Trp Arg Leu
            20                  25                  30
Pro Gly Ser Pro Ala Thr Asn Ile Thr Ser Ile Ser Ser Met Trp Pro
        35                  40                  45
Thr Ile Pro Ser Gly Ile Gln Ala Ala Tyr Glu Ile Gly Gly Arg Asn
    50                  55                  60
Gln Leu Phe Leu Phe Lys Asp Glu Lys Tyr Trp Leu Ile Asn Asn Leu
65                  70                  75                  80
Val Pro Glu Pro His Tyr Pro Arg Ser Ile His Ser Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Ala Ser Val Lys Lys Ile Asp Ala Ala Val Phe Asp Pro Leu Arg Gln
            100                 105                 110
Lys Val Tyr Phe Phe Val Asp Lys Gln Tyr Trp Arg Tyr Asp Val Arg
        115                 120                 125
Gln Glu Leu Met Asp Ala Ala Tyr Pro Lys Leu Ile Ser Thr His Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Arg Pro Lys Ile Asp Ala Val Leu Tyr Phe Lys Arg His
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Ile Phe Gln Gly Ala Tyr Gln Leu Glu Tyr Asp Pro Leu Leu
                165                 170                 175
Asp Arg Val Thr Lys Thr Leu Ser Ser Thr Ser Trp Phe Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>30
<211>191
<212>PRT
<213>普通牛
 
<400>30
 
Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Thr Leu Ile Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His
            20                  25                  30
Pro Gln Gln Val Glu Ala Glu Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Gly Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp
    50                  55                  60
Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg Lys Phe Trp Ala Leu Ser Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Ile Leu Glu Asp Tyr Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Lys His Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Leu His Phe Glu Asp Ser Gly
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Ser Glu Asn Gln Val Trp Ser Tyr Asp Asp Thr
        115                 120                 125
Asn His Val Met Asp Lys Asp Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Val Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Tyr Gln Lys Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser
                165                 170                 175
Asn Arg Ile Val Arg Val Met Thr Thr Asn Ser Leu Leu Trp Cys
            180                 185                 190
 
<210>31
<211>191
<212>PRT
<213>家马
 
<400>31
 
Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Thr Met Val Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His
            20                  25                  30
Pro Gln Leu Val Asp Ala Glu Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser Lys Asp
    50                  55                  60
Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Gln Lys Ile Ser Glu Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Lys Asp Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Ser Gly Asn Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr
        115                 120                 125
Asn Arg Met Met Asp Lys Asp Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser
                165                 170                 175
Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro Thr Asn Ser Leu Leu Trp Cys
            180                 185                 190
 
<210>32
<211>191
<212>PRT
<213>人
 
<400>32
Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His
            20                  25                  30
Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser His Asp
    50                  55                  60
Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg Lys Phe Trp Ala Leu Asn Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Lys Lys Ile Ser Glu Leu Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Leu Phe Ser Gly Asn Gln Val Trp Arg Tyr Asp Asp Thr
        115                 120                 125
Asn His Ile Met Asp Lys Asp Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser
                165                 170                 175
Asn Arg Ile Val Arg Val Met Pro Ala Asn Ser Ile Leu Trp Cys
            180                 185                 190
 
<210>33
<211>191
<212>PRT
<213>西班牙野兔
 
<400>33
 
Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu His
            20                  25                  30
Pro Gln Gln Val AspAla Glu Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His Pro Ala Arg Asp
    50                  55                  60
Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Lys Lys Phe Trp Ala Pro Asn Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Gln Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Val His Phe Glu Asp Thr Gly
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Ser Gly Asn Gln Val Trp Ser Tyr Asp Asp Thr
        115                 120                 125
Asn His Thr Met Asp Gln Asp Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Glu Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Gly Gly Lys Val Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr Ser Ile Trp Ser
                165                 170                 175
Lys Arg Ile Val Arg Val Met Pro Thr Asn Ser Leu Leu Trp Cys
           180                  185                 190
 
<210>34
<211>196
<212>PRT
<213>人
 
<400>34
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Met Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Lys Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Gln Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Thr Asp Lys Ile Asp Ala Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Arg Gly Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Ala Val Asp Ser Glu Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Arg Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ala Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Pro Ser Gly
        195
 
<210>35
<211>196
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>35
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Met Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Glu Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Gln Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Thr Asp Lys Ile Asp Ala Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Arg Gly Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Phe Arg
        115                 120                 125
Ala Val Asp Ser Glu Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Arg Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ala Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Pro Ser Gly
        195
 
<210>36
<211>196
<212>PRT
<213>家猪
 
<400>36
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Met Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Glu Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg Lys Asn
            20                  25                  30
Gln Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Arg Leu Pro
                85                  90                  95
Thr Asp Lys Ile Asp Ala Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Asp
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Arg Gly Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Ala Val Asp Ser Glu Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Arg Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ala Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Pro Ser Gly
        195
 
<210>37
<211>196
<212>PRT
<213>西班牙野兔
 
<400>37
 
Pro Lys Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Val Phe Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Glu Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Gln Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Leu Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Lys Phe
    50                  5                  560
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Thr Asp Lys Ile Asp Ala Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Arg Gly Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Ala Val Asp Ser Glu Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Arg Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ala Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Pro Ala Gly
        195
 
<210>38
<211>196
<212>PRT
<213>褐家鼠
 
<400>38
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Met Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Glu Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Gln Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Lys Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Gly Leu Pro
                85                  90                  95
Thr Asp Lys Ile Asp Ala Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Arg Gly Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Phe Arg
        115                 120                 125
Ala Val Asp Ser Glu Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Arg Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ala Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Pro Ser Gly
        195
 
<210>39
<211>196
<212>PRT
<213>人
 
<400>39
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asp Phe Asp Thr Val Ala Met Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Gly Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg His Asn
            20                  25                  30
Arg Val Leu Asp Asn Tyr Pro Met Pro Ile Gly His Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Asp Ile Ser Ala Ala Tyr Glu Arg Gln Asp Gly Arg Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Leu Phe Arg Glu Ala Asn Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Gln Pro Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Gly Ile Pro
                85                  90                  95
Tyr Asp Arg Ile Asp Thr Ala Ile Trp Trp Glu Pro Thr Gly His Thr
            100                 105                 110
Phe Phe Phe Gln Glu Asp Arg Tyr Trp Arg Phe Asn Glu Glu Thr Gln
        115                 120                 125
Arg Gly Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Ser Val Trp Gln Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Ala Ser Pro Lys Gly Ala Phe Leu Ser Asn Asp Ala Ala Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Thr Lys Tyr Trp Lys Phe Asp Asn Glu Arg Leu
                165                 170                 175
Arg Met Glu Pro Gly Tyr Pro Lys Ser Ile Leu Arg Asp Phe Met Gly
            180                 185                 190
Cys Gln Glu His
        195
 
<210>40
<211>196
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>40
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Val Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Gly Arg Trp Phe Trp Arg Val Arg His Asn
            20                  25                  30
Arg Val Leu Asp Asn Tyr Pro Met Pro Ile Gly His Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Gly Asn Ile Ser Ala Ala Tyr Glu Arg Gln Asp Gly His Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asn Arg Tyr Trp Leu Phe Arg Glu Ala Asn Leu
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro Gln Pro Leu Ser Ser Tyr Gly Thr Asp Ile Pro
                85                  90                  95
Tyr Asp Arg Ile Asp Thr Ala Ile Trp Trp Glu Pro Thr Gly His Thr
            100                 105                 110
Phe Phe Phe Gln Ala Asp Arg Tyr Trp Arg Phe Asn Glu Glu Thr Gln
        115                 120                 125
His Gly Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Ser Val Trp Gln Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Thr Ser Pro Lys Gly Ala Phe Leu Ser Asn Asp Ala Ala Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Thr Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Glu Arg Leu
                165                 170                 175
Arg Met Glu Pro Gly His Pro Lys Ser Ile Leu Arg Asp Phe Met Gly
            180                 185                 190
Cys Gln Glu His
        195
 
<210>41
<211>196
<212>PRT
<213>人
 
<400>41
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Leu Ala Ile Leu Arg Arg
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Gln Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Arg Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Gln Ile Thr Tyr Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Pro Ser Ile Asp Ala Val Tyr Glu Asn Ser Asp Gly Asn Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Val Phe Lys Asp Thr Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Gly Tyr Pro His Asp Leu Ile Thr Leu Gly Ser Gly Ile Pro
                85                  90                  95
Pro His Gly Ile Asp Ser Ala Ile Trp Trp Glu Asp Val Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Met Lys
        115                 120                 125
Thr Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Gln Gly Ala Phe Val His Lys Glu Asn Gly Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Lys Glu Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Ile Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg Ser Ile Leu Lys Asp Phe Met Gly
            180                 185                 190
Cys Asp Gly Pro
        195
 
<210>42
<211>196
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>42
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Leu Ala Ile Leu Arg Arg
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Gln Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Arg Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Gln Ile Thr Tyr Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Pro Ser Ile Asp Ala Val Tyr Glu Asn Ser Asp Gly Asn Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Val Phe Lys Asp Thr Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Gly Tyr Pro His Asp Leu Ile Thr Leu Gly Asn Gly Ile Pro
                85                  90                  95
Pro His Gly Ile Asp Ser Ala Ile Trp Trp Glu Asp Val Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Met Lys
        115                 120                 125
Thr Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Ile Trp Lys Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Gln Gly Ala Phe Val His Lys Glu Asn Gly Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Lys Glu Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Ile Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg Ser Ile Leu Lys Asp Phe Met Gly
            180                 185                 190
Cys Asp Gly Pro
        195
 
<210>43
<211>196
<212>PRT
<213>褐家鼠
 
<400>43
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Leu Ala Ile Leu Arg Arg
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Gln Trp Phe Trp Arg Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Arg Val Met Asp Gly Tyr Pro Met Gln Ile Thr Tyr Phe Trp Arg Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Pro Ser Ile Asp Ala Val Tyr Glu Asn Ser Asp Gly Asn Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Val Phe Lys Asp Thr Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Gly Tyr Pro His Asp Leu Ile Thr Leu Gly Asn Gly Ile Pro
                85                  90                  95
Pro His Gly Ile Asp Ser Ala Ile Trp Trp Glu Asp Val Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Met Lys
        115                 120                 125
Thr Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Ile Trp Lys Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Glu Ser Pro Gln Gly Ala Phe Val His Lys Glu Asn Gly Phe Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Lys Glu Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Ile Leu
                165                 170                 175
Lys Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg Ser Ile Leu Lys Asp Phe Met Gly
            180                 185                 190
Cys Asp Gly Pro
        195
 
<210>44
<211>198
<212>PRT
<213>人
 
<400>44
Pro His Arg Cys Ser Thr His Phe Asp Ala Val Ala Gln Ile Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Ala Phe Phe Phe Lys Gly Lys Tyr Phe Trp Arg Leu Thr Arg Asp
            20                  25                  30
Arg His Leu Val Ser Leu Gln Pro Ala Gln Met His Arg Phe Trp Arg
        35                  40                  45
Gly Leu Pro Leu His Leu Asp Ser Val Asp Ala Val Tyr Glu Arg Thr
    50                  55                  60
Ser Asp His Lys Ile Val Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Val Phe
65                  70                  75                  80
Lys Asp Asn Asn Val Glu Glu Gly Tyr Pro Arg Pro Val Ser Asp Phe
                85                  90                  95
Ser Leu Pro Pro Gly Gly Ile Asp Ala Ala Phe Ser Trp Ala His Asn
            100                 105                 110
Asp Arg Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln Leu Tyr Trp Arg Tyr Asp Asp
        115                 120                 125
His Thr Arg His Met Asp Pro Gly Tyr Pro Ala Gln Ser Pro Leu Trp
    130                 135                 140
Arg Gly Val Pro Ser Thr Leu Asp Asp Ala Met Arg Trp Ser Asp Gly
145                 150                 155                 160
Ala Ser Tyr Phe Phe Arg Gly Gln Glu Tyr Trp Lys Val Leu Asp Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Glu Val Ala Pro Gly Tyr Pro Gln Ser Thr Ala Arg Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Val Cys Gly Asp Ser
        195
<210>45
<211>198
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>45
 
Pro His Arg Cys Thr Ala His Phe Asp Ala Val Ala Gln Ile Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Ala Phe Phe Phe Lys Gly Lys Tyr Phe Trp Arg Leu Thr Arg Asp
            20                  25                  30
Arg His Leu Val Ser Leu Gln Pro Ala Gln Met His Arg Phe Trp Arg
        35                  40                  45
Gly Leu Pro Leu His Leu Asp Ser Val Asp Ala Val Tyr Glu Arg Thr
    50                  55                  60
Ser Asp His Lys Ile Val Phe Phe Lys Gly Asp Arg Tyr Trp Val Phe
65                  70                  75                  80
Lys Asp Asn Asn Val Glu Glu Gly Tyr Pro Arg Pro Val Ser Asp Phe
                85                  90                  95
Ser Leu Pro Pro Gly Gly Ile Asp Ala Val Phe Ser Trp Ala His Asn
            100                 105                 110
Asp Arg Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gln Leu Tyr Trp Arg Tyr Asp Asp
        115                 120                 125
His Thr Arg Arg Met Asp Pro Gly Tyr Pro Ala Gln Gly Pro Leu Trp
    130                 135                 140
Arg Gly Val Pro Ser Met Leu Asp Asp Ala Met Arg Trp Ser Asp Gly
145                 150                 155                 160
Ala Ser Tyr Phe Phe Arg Gly Gln Glu Tyr Trp Lys Val Leu Asp Gly
                155                 170                 175
Glu Leu Glu Ala Ala Pro Gly Tyr Pro Gln Ser Thr Ala Arg Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Val Cys Gly Glu Pro
        195
 
<210>46
<211>191
<212>PRT
<213>光滑爪蟾(Xenopus laevis)
 
<400>46
 
Pro Ser Arg Cys Asp Pro Asn Val Val Phe Asn Ala Val Thr Thr Met
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Leu Ile Phe Phe Val Lys Arg Phe Leu Trp Arg Lys His
            20                  25                  30
Pro Gln Ala Ser Glu Ala Glu Leu Met Phe Val Gln Ala Phe Trp Pro
        35                  40                  45
Ser Leu Pro Thr Asn Ile Asp Ala Ala Tyr Glu Asn Pro Ile Thr Glu
    50                  55                  60
Gln Ile Leu Val Phe Lys Gly Ser Lys Tyr Thr Ala Leu Asp Gly Phe
65                  70                  75                  80
Asp Val Val Gln Gly Tyr Pro Arg Ash Ile Tyr Ser Leu Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Lys Thr Val Lys Arg Ile Asp Ala Ala Val His Ile Glu Gln Leu Gly
            100                 105                 110
Lys Thr Tyr Phe Phe Ala Ala Lys Lys Tyr Trp Ser Tyr Asp Glu Asp
        115                 120                 125
Lys Lys Gln Met Asp Lys Gly Phe Pro Lys Gln Ile Ser Asn Asp Phe
    130                 135                 140
Pro Gly Ile Pro Asp Lys Ile Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Gly Arg
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Phe Phe Ile Gly Arg Ser Gln Phe Glu Tyr Asn Ile Asn Ser
                165                 170                 175
Lys Arg Ile Val Gln Val Leu Arg Ser Asn Ser Trp Leu Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>47
<211>190
<212>PRT
<213>人
 
<400>47
 
Pro Asp Pro Cys Ser Ser Glu Leu Asp Ala Met Met Leu Gly Pro Arg
1               5                   10                  15
Gly Lys Thr Tyr Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Ser Asp
            20                  25                  30
Ser Gly Pro Gly Pro Leu Phe Arg Val Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu
        35                  40                  45
Pro Gly Asn Leu Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Gln Trp Ile
    50                  55                  60
His Phe Phe Lys Gly Asp Lys Val Trp Arg Tyr Ile Asn Phe Lys Met
65                  70                  75                  80
Ser Pro Gly Phe Pro Lys Lys Leu Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp
                85                  90                  95
Ala Ala Leu Tyr Trp Pro Leu Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Tyr Trp Gln Trp Asp Glu Leu Ala Arg Thr Asp Phe Ser Ser
        115                 120                 125
Tyr Pro Lys Pro Ile Lys Gly Leu Phe Thr Gly Val Pro Asn Gln Pro
    130                 135                 140
Ser Ala Ala Met Ser Trp Gln Asp Gly Arg Val Tyr Phe Phe Lys Gly
145                 150                 155                 160
Lys Val Tyr Trp Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Glu Lys Gly Tyr
                165                 170                 175
Pro Arg Asn Ile Ser His Asn Trp Met His Cys Arg Pro Arg
            180                 185                 190
 
<210>48
<211>189
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>48
 
Pro Asn Pro Cys Ser Gly Glu Val Asp Ala Met Val Leu Gly Pro Arg
1               5                   10                  15
Gly Lys Thr Tyr Ala Phe Lys Gly Asp Tyr Val Trp Thr Val Thr Asp
            20                  25                  30
Ser Gly Pro Gly Pro Leu Phe Gln Ile Ser Ala Leu Trp Glu Gly Leu
        35                  40                  45
Pro Gly Asn Leu Asp Ala Ala Val Tyr Ser Pro Arg Thr Arg Arg Thr
    50                  55                  60
His Phe Phe Lys Gly Asn Lys Val Trp Arg Tyr Val Asp Phe Lys Met
65                  70                  75                  80
Ser Pro Gly Phe Pro Met Lys Phe Asn Arg Val Glu Pro Asn Leu Asp
                85                  90                  95
Ala Ala Leu Tyr Trp Pro Val Asn Gln Lys Val Phe Leu Phe Lys Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Tyr Trp Gln Trp Asp Glu Leu Ala Arg Thr Asp Leu Ser Arg
        115                 120                 125
Tyr Pro Lys Pro Ile Lys Glu Leu Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Pro
    1301                 35                 140
Ser Ala Ala Met Ser Trp Gln Asp Gly Gln Val Tyr Phe Phe Lys Gly
145                 150                 155                 160
Lys Glu Tyr Trp Arg Leu Asn Gln Gln Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr
                165                 170                 175
Pro Arg Asn Thr Thr His Trp Met His Cys Gly Ser Gln
            180                 185
 
<210>49
<211>191
<212>PRT
<213>普通牛
 
<400>49
 
Pro Asp Leu Cys Asp Ser Asn Leu Ser Phe Asp Ala Val Thr Met Leu
1               5                   10                  15
Gly Lys Glu Leu Leu Leu Phe Arg Asp Arg Ile Phe Trp Arg Arg Gln
            20                  25                  30
Val His Leu Met Ser Gly Ile Arg Pro Ser Thr Ile Thr Ser Ser Phe
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Met Ser Asn Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Ala Glu Arg
    50                  55                  60
Gly Thr Ala Tyr Phe Phe Lys Gly Pro His Tyr Trp Ile Thr Arg Gly
65                  70                  75                  80
Phe Gln Met Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ile Tyr Asp Phe Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg Tyr Val Gln Arg Ile Asp Ala Ala Val Tyr Leu Lys Asp Ala Gln
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Val Gly Asp Glu Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Arg
        115                 120                 125
Lys Arg Lys Met Glu Lys Asp Tyr Pro Lys Ser Thr Glu Glu Glu Phe
    130                 135                 140
Ser Gly Val Asn Gly Gln Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Ser Gly Pro Lys Ala Tyr Lys Ser Asp Thr Glu Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Val Val Ser Glu Leu Lys Ser Ser Ser Trp Ile Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>50
<211>191
<212>PRT
<213>人
 
<400>50
 
Pro Asp Leu Cys Asp Ser Ser Ser Ser Phe Asp Ala Val Thr Met Leu
1               5                   10                  15
Gly Lys Glu Leu Leu Leu Phe Lys Asp Arg Ile Phe Trp Arg Arg Gln
                20              25                  30
Val His Leu Arg Thr Gly Ile Arg Pro Ser Thr Ile Thr Ser Ser Phe
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Met Ser Asn Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Ala Glu Arg
    50                  55                  60
Gly Thr Ala Tyr Phe Phe Lys Gly Pro His Tyr Trp Ile Thr Arg Gly
65                  70                  75                  80
Phe Gln Met Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ile Tyr Asp Phe Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg His Val Gln Gln Ile Asp Ala Ala Val Tyr Leu Arg Glu Pro Gln
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Val Gly Asp Glu Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Arg
        115                 120                 125
Lys Arg Lys Met Glu Lys Asp Tyr Pro Lys Asn Thr Glu Glu Glu Phe
    130                 135                 140
Ser Gly Val Asn Gly Gln Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Ser Gly Pro Lys Thr Tyr Lys Tyr Asp Thr Glu Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Val Val Ser Val Val Lys Ser Ser Ser Trp Ile Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>51
<211>191
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>51
 
Pro Asp Leu Cys Asp Ser Ser Ser Ser Phe Asp Ala Val Thr Met Leu
1               5                   10                  15
Gly Lys Glu Leu Leu Phe Phe Lys Asp Arg Ile Phe Trp Arg Arg Gln
            20                  25                  30
Val His Leu Pro Thr Gly Ile Arg Pro Ser Thr Ile Thr Ser Ser Phe
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Met Ser Asn Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Ala Glu Arg
    50                  55                  60
Gly Ile Ala Phe Phe Phe Lys Gly Pro His Tyr Trp Val Thr Arg Gly
65                  70                  75                  80
Phe His Met Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ile Tyr Asp Phe Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg His Val Gln Arg Ile Asp Ala Ala Val Tyr Leu Lys Glu Pro Gln
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Val Gly Glu Glu Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Arg
        115                 120                 125
Lys Lys Lys Met Glu Lys Asp Tyr Pro Lys Asn Thr Glu Glu Glu Phe
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Gly His Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Ser Gly Arg Lys Thr Phe Lys Tyr Asp Thr Glu Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Val Val Ser Val Val Lys Ser Ser Ser Trp Ile Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>52
<211>191
<212>PRT
<213>家猪
 
<400>52
 
Pro Asp Ile Cys Asp Ser Ser Ser Ser Phe Asp Ala Val Thr Met Leu
1               5                   10                  15
Gly Lys Glu Leu Leu Phe Phe Arg Asp Arg Ile Phe Trp Arg Arg Gln
            20                  25                  30
Val His Leu Met Ser Gly Ile Arg Pro Ser Thr Ile Thr Ser Ser Phe
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Met Ser Asn Val Asp Ala Ala Tyr Glu Val Ala Asp Arg
    50                  55                  60
Gly Met Ala Tyr Phe Phe Lys Gly Pro His Tyr Trp Ile Thr Arg Gly
65                  70                  75                  80
Phe Gln Met Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ile Tyr Asp Phe Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Arg Tyr Val Gln Arg Ile Asp Ala Ala Val His Leu Lys Asp Thr Gln
            100                 105                 110
Lys Thr Leu Phe Phe Val Gly Asp Glu Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Arg
        115                 120                 125
Lys Arg Lys Met Asp Lys Asp Tyr Pro Lys Asn Thr Glu Glu Glu Phe
    130                 135                 140
Ser Gly Val Asn Gly Gln Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Asn Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Phe Phe Ser Gly Pro Lys Ala Tyr Lys Tyr Asp Thr Glu Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Val Val Ser Val Leu Lys Ser Asn Ser Trp Ile Gly Cys
            180                 185                 190
 
<210>53
<211>196
<212>PRT
<213>人
<400>53
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Val Ala Leu Phe Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Arg Trp Phe Trp Arg Leu Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Arg Val Gln Glu Gly Tyr Pro Met Gln Ile Glu Gln Phe Trp Lys Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu Arg Ala Asp Gly Arg Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys Tyr Trp Val Phe Lys Glu Val Thr Val
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro His Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ser Cys Leu Pro
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Ile Asp Thr Ala Leu Arg Trp Glu Pro Val Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Lys Gly Glu Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Arg Arg
        115                 120                 125
Ala Thr Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Gln Ala Pro Gln Gly Ala Phe Ile Ser Lys Glu Gly Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Arg Asp Tyr Trp Lys Phe Asp Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Ser Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg Asn Ile Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Asn Gln Lys
        195
 
<210>54
<211>196
<212>PRT
<213>小家鼠
 
<400>54
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Val Ala Leu Phe Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Arg Trp Phe Trp Arg Leu Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Arg Val Gln Glu Gly Tyr Pro Met Gln Ile Glu Gln Phe Trp Lys Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu Arg Ala Asp Gly Arg Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys Tyr Trp Val Phe Lys Glu Val Thr Val
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro His Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ser Cys Leu Pro
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Ile Asp Thr Ala Leu Arg Trp Glu Pro Val Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Lys Gly Glu Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Arg Arg
        115                 120                 125
Ala Thr Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Gln Ala Pro Gln Gly Ala Phe Ile Ser Lys Glu Gly Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Arg Asp Tyr Trp Lys Phe Asp Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Ser Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg Asn Ile Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Lys Gln Lys
        195
 
<210>55
<211>196
<212>PRT
<213>褐家鼠
 
<400>55
 
Pro Asn Ile Cys Asp Gly Asn Phe Asn Thr Val Ala Leu Phe Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Phe Val Phe Lys Asp Arg Trp Phe Trp Arg Leu Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Arg Val Gln Glu Gly Tyr Pro Met Gln Ile Glu Gln Phe Trp Lys Gly
        35                  40                  45
Leu Pro Ala Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu Arg Ala Asp Gly Arg Phe
    50                  55                  60
Val Phe Phe Lys Gly Asp Lys Tyr Trp Val Phe Lys Glu Val Thr Val
65                  70                  75                  80
Glu Pro Gly Tyr Pro His Ser Leu Gly Glu Leu Gly Ser Cys Leu Pro
                85                  90                  95
Arg Glu Gly Ile Asp Thr Ala Leu Arg Trp Glu Pro Val Gly Lys Thr
            100                 105                 110
Tyr Phe Phe Lys Gly Glu Arg Tyr Trp Arg Tyr Ser Glu Glu Arg Arg
        115                 120                 125
Ala Thr Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Gly Ile
    130                 135                 140
Pro Gln Ala Pro Gln Gly Ala Phe Ile Ser Lys Glu Gly Tyr Tyr Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Tyr Lys Gly Arg Asp Tyr Trp Lys Phe Asp Asn Gln Lys Leu
                165                 170                 175
Ser Val Glu Pro Gly Tyr Pro Arg Asn Ile Leu Arg Asp Trp Met Gly
            180                 185                 190
Cys Lys Gln Lys
        195
 
<210>56
<211>198
<212>PRT
<213>人
 
<400>56
 
Pro Asp Arg Cys Glu Gly Asn Phe Asp Ala Ile Ala Asn Ile Arg Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Phe Phe Phe Lys Gly Pro Trp Phe Trp Arg Leu Gln Pro Ser
            20                  25                  30
Gly Gln Leu Val Ser Pro Arg Pro Ala Arg Leu His Arg Phe Trp Glu
        35                  40                  45
Gly Leu Pro Ala Gln Val Arg Val Val Gln Ala Ala Tyr Ala Arg His
    50                  55                  60
Arg Asp Gly Arg Ile Leu Leu Phe Ser Gly Pro Gln Phe Trp Val Phe
65                  70                  75                  80
Gln Asp Arg Gln Leu Glu Gly Gly Ala Arg Pro Leu Thr Glu Leu Gly
                85                  90                  95
Leu Pro Pro Gly Glu Glu Val Asp Ala Val Phe Ser Trp Pro Gln Asn
            100                 105                 110
Gly Lys Thr Tyr Leu Val Arg Gly Arg Gln Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Arg Pro Asp Pro Gly Tyr Pro Arg Asp Leu Ser Leu Trp
    130                 135                 140
Glu Gly Ala Pro Pro Ser Pro Asp Asp Val Thr Val Ser Asn Ala Gly
145                 150                 155                 160
Asp Thr Tyr Phe Phe Lys Gly Ala His Tyr Trp Arg Phe Pro Lys Asn
                165                 170                 175
Ser Ile Lys Thr Glu Pro Asp Ala Pro Gln Pro Met Gly Pro Asn Trp
            180                 185                 190
Leu Asp Cys Pro Ala Pro
        195
 
<210>57
<211>193
<212>PRT
<213>人
 
<400>57
 
Phe Asp Ala Ile Thr Val Asp Arg Gln Gln Gln Leu Tyr Ile Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly Ser His Phe Trp Glu Val Ala Ala Asp Gly Asn Val Ser Glu Pro
            20                  25                  30
Arg Pro Leu Gln Glu Arg Trp Val Gly Leu Pro Pro Asn Ile Glu Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Val Ser Leu Asn Asp Gly Asp Phe Tyr Phe Phe Lys Gly Gly
    50                  55                  60
Arg Cys Trp Arg Phe Arg Gly Pro Lys Pro Val Trp Gly Leu Pro Gln
65                  70                  75                  80
Leu Cys Arg Ala Gly Gly Leu Pro Arg His Pro Asp Ala Ala Leu Phe
                85                  90                  95
Phe Pro Pro Leu Arg Arg Leu Ile Leu Phe Lys Gly Ala Arg Tyr Tyr
            100                 105                 110
Val Leu Ala Arg Gly Gly Leu Gln Val Glu Pro Tyr Tyr Pro Arg Ser
        115                 120                 125
Leu Gln Asp Trp Gly Gly Ile Pro Glu Glu Val Ser Gly Ala Leu Pro
    130                 135                 140
Arg Pro Asp Gly Ser Ile Ile Phe Phe Arg Asp Asp Arg Tyr Trp Arg
145                 150                 155                 160
Leu Asp Gln Ala Lys Leu Gln Ala Thr Thr Ser Gly Arg Trp Ala Thr
                165                 170                 175
Glu Leu Pro Trp Met Gly Cys Trp His Ala Asn Ser Gly Ser Ala Leu
            180                 185                 190
Phe
 
<210>58
<211>191
<212>PRT
<213>人
 
<400>58
 
Pro Ser Gln Glu Glu Cys Glu Gly Ser Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu
1               5                   10                  15
His Phe Ala Met Met Gln Arg Asp Ser Trp Glu Asp Ile Phe Glu Leu
            20                  25                  30
Leu Phe Trp Gly Arg Thr Ser Ala Gly Thr Arg Gln Pro Gln Phe Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Gln Val Asp Ala Ala Met Ala
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Met Ala Pro Arg Pro Ser Leu Ala Lys
65                  70                  75                  80
Lys Gln Arg Phe Arg His Arg Asn Arg Lys Gly Tyr Arg Ser Gln Arg
                85                  90                  95
Gly His Ser Arg Gly Arg Asn Gln Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala
            100                 105                 110
Thr Trp Leu Ser Leu Phe Ser Ser Glu Glu Ser Asn Leu Gly Ala Asn
        115                 120                 125
Asn Tyr Asp Asp Tyr Arg Met Asp Trp Leu Val Pro Ala Thr Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Ile Gln Ser Val Phe Phe Phe Ser Gly Asp Lys Tyr Tyr Arg Val
145                 150                 155                 160
Asn Leu Arg Thr Arg Arg Val Asp Thr Val Asp Pro Pro Tyr Pro Arg
                165                 170                 175
Ser Ile Ala Gln Tyr Trp Leu Gly Cys Pro Ala Pro Gly His Leu
            180                 185                 190
 
<210>59
<211>192
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>59
 
Pro Ser Gln Glu Glu Cys Glu Gly Ser Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu
1               5                   10                  15
His Phe Ala Leu Leu Gln Arg Asp Ser Trp Glu Asn Ile Phe Glu Leu
            20                  25                  30
Leu Phe Trp Gly Arg Ser Ser Asp Gly Ala Arg Glu Pro Gln Phe Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Asn Trp His Gly Val Pro Gly Lys Val Asp Ala Ala Met Ala
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Tyr Val Thr Gly Ser Leu Ser His Ser Ala Gln Ala Lys
65                  70                  75                  80
Lys Gln Lys Ser Lys Arg Arg Ser Arg Lys Arg Tyr Arg Ser Arg Arg
                85                  90                  95
Gly Arg Gly His Arg Arg Ser Gln Ser Ser Asn Ser Arg Arg Ser Ser
            100                 105                 110
Arg Ser Ile Trp Phe Ser Leu Phe Ser Ser Glu Glu Ser Gly Leu Gly
        115                 120                 125
Thr Tyr Asn Asn Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Trp Leu Val Pro Ala Thr
    130                 135                 140
Cys Glu Pro Ile Gln Ser Val Tyr Phe Phe Ser Gly Asp Lys Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Val Asn Leu Arg Thr Arg Arg Val Asp Ser Val Asn Pro Pro Tyr
                165                 170                 175
Pro Arg Ser Ile Ala Gln Tyr Trp Leu Gly Cys Pro Thr Ser Glu Lys
            180                 185                 190
<210>60
<211>195
<212>PRT
<213>家猪
 
<400>60
 
Pro Ser Arg Glu Glu Cys Glu Gly Ser Ser Pro Ser Asp Val Phe Ala
1               5                   10                  15
His Phe Ala Leu Met Gln Arg Asp Ser Trp Glu Asp Ile Phe Arg Leu
            20                  25                  30
Leu Phe Trp Ser His Ser Phe Gly Gly Ala Ile Glu Pro Arg Val Ile
        35                  40                  45
Ser Gln Asp Trp Leu Gly Leu Pro Glu Gln Val Asp Ala Ala Met Ala
    50                  55                  60
Gly Gln Ile Tyr Ile Ser Gly Ser Ala Leu Lys Pro Ser Gln Pro Lys
65                  70                  75                  80
Met Thr Lys Ser Ala Arg Arg Ser Gly Lys Arg Tyr Arg Ser Arg Arg
                85                  90                  95
Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly His Ser Arg Ser Gln Lys Ser His Arg
            100                 105                 110
Gln Ser Arg Ser Thr Trp Leu Pro Trp Phe Ser Ser Glu Glu Thr Gly
        115                 120                 125
Pro Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Tyr Lys Met Asp Trp Leu Val Pro
    130                 135                 140
Ala Thr Cys Glu Pro Ile Gln Ser Val Tyr Phe Phe Ser Gly Glu Glu
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Arg Thr Gln Arg Val Asp Thr Val Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Tyr Pro Arg Ser Ile Ala Gln Tyr Trp Leu Gly Cys Pro Val Pro
            180                 185                 190
Asp Gln Lys
        195
 
<210>61
<211>188
<212>PRT
<213>西班牙野兔
 
<400>61
 
Pro Ser Gln Glu Glu Cys Glu Gly Ser Ser Leu Ser Ala Val Phe Glu
1                5                  10                  15
His Phe Ala Met Leu His Arg Asp Ser Trp Glu Asp Ile Phe Lys Leu
            20                  25                  30
Leu Phe Trp Gly Arg Pro Ser Gly Gly Ala Arg Gln Pro Gln Phe Ile
        35                  40                  45
Ser Arg Asp Trp His Gly Val Pro Gly Lys Val Asp Ala Ala Met Ala
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Thr Pro Ser Pro Ser Ala Lys Lys
65                  70                  75                  80
Gln Lys Ser Arg Arg Arg Ser Arg Lys Arg Tyr Arg Ser Arg Tyr Gly
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Ser Gln Asn Ser Arg Arg Leu Ser Arg Ser Ile Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Trp Phe Ser Ser Glu Glu Val Ser Leu Gly Pro Tyr Asn Tyr Glu
        115                 120                 125
Asp Tyr Glu Thr Ser Trp Leu Lys Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ile Gln
    130                 135                 140
Ser Val Tyr Phe Phe Ser Gly Asp Lys Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gln Arg Val Asp Thr Val Asn Pro Pro Tyr Pro Arg Ser Ile Ala
                165                 170                 175
Gln Tyr Trp Leu Gly Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gln
            180                 185
 
<210>62
<211>345
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>核糖体展示间隔序列
 
<400>62
gctggctctg gagctggtgc aggctctggt gctggcgcag gttctggcgc tggtgctggt   60
tctggcactg gtgcttctcc ggcagctgtt ccggcagcgg ttccagcagc ggtgccggca  120
gcagttcctg ctgcggtggg cgaaggagaa ggagaaggcg agggagaggg cgaaggatac  180
ccgtacgacg taccggacta cgccgaaggt ggtggtggct ccgagcagaa gctcatctcc  240
gaagaagacc tggagggtgg tggtggctcc acagactaca aggacgacga cgacaaatcc  300
caaatcaaac gaaaggccca gtcgaaaaac tgggcctttc gattt                  345
 
<210>63
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEX2forw
 
<400>63
atgcctgaaa tctgcaaaca gg                                            22
 
<210>64
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEXR4
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(26)
<223>n为a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(29)
<223>n为a，c，g，或t
 
<400>64
cctgcaaaga acacagcttt ctcmnnmnnt ggggcctcgt ataccgcatc aatc    54
 
<210>65
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEXF4
 
<400>65
ggaccctggc ttccccaagc tcatcgcaga tgcctggaat gc                 42
 
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEX2rev
 
<400>66
ggagctcgct cgagtcagc                                           19
 
<210>67
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PEXF1
 
<400>67
gagaaagctg tgttctttgc agggaatgaa tactggatct actcagcgag caccttggag    60
 
<210>68
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEXR1
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>n为a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(36)
<223>n为a，c，g，或t
 
<400>68
gagcttgggg aagccagggt ccattttmnn cttmnnctcg ttgtacctcc agaacttgtc    60
 
<210>69
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEXR3
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(38)
<223>n为a，c，g，或t
 
<400>69
ggcagtccga ggctagtcag tggtttggga taaccmnnct ccaaggtgct cgctgag       57
 
<210>70
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEXR2
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(24)
<223>n为a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(27)
<223>n为a，c，g，或t
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>n为a，c，g，或t
 
<400>70
gccagcgaag atgtatgtct tmnnmnnmnn gctccagtta aaggctgcat cc            52
 
<210>71
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEXF2
 
<400>71
ctgactagcc tcggactgcc ccctgatgtt caacgtgtgg atgcagcctt taactggagc    60
 
<210>72
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7P_PEX2
 
<400>72
gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg cctgaaatct gcaaacagga tatcg         55
<210>73
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>PEX2_RD
 
<400>73
cctgcaccag ctccagagcc agcgcagcct agccagtcgg atttgatgc                 49
 
<210>74
<211>186
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7Pg10e
 
<400>74
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac     60
gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata    120
gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata    180
catatg
                                                                     186
<210>75
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7Pfor
 
<400>75
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagc                                         27
 
<210>76
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>R1A
<400>76
aaatcgaaag gcccagtttt tcg                                           23
 
<210>77
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>桥连引物
 
<400>77
gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg cctgaaatct gcaaacagga tatcg        55
 
<210>78
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>桥连引物
 
<400>78
gtcgttcaga ccacgaccct cgatgcagcc tagccagtcg gatttgatgc              50
 
<210>79
<211>243
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7PAviTagFXa
 
<400>79
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac   60
gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata  120
gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata  180
catatgggtc ttaatgatat ttttgaagct cagaaaatcg aatggcacga aatcgagggt  240
cgt                                                                243
 
<210>80
<211>332
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7T
 
<400>80
taggaagctc agaaaatcga atggcacgaa taatgagctc ccgggagcgc ttggagccac   60
ccgcagttcg aaaaataata agggcctccc actgactgct cttctgtcag tgggctactc  120
ctggactcgg caccagattg cctcattttt ctcctctggc attttgtata aatccacctt  180
gactggggaa attctcctgg ggtcaggtgg caccagcctg gatccggctg ctaacaaagc  240
ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg  300
ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gc                                332
 
<210>81
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7Trev
 
<400>81
gcaaaaaacc cctcaagacc cgtttagagg                                    30
 
<210>82
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>T7Pfor
 
<400>82
ggtgatgtcg gcgatatagg cg                                            22
 
<210>83
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NdeI-PEX2for
 
<400>83
ctgagagtgc accatatgcc tgaaatctgc aaacagg     37
 
<210>84
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>EcoRI-PEX2rev
 
<400>84
ccatgattac gaattcgcag cctagccagt cgg         33
 
<210>85
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>抗ssrA-寡核苷酸
 
<400>85
ttaagctgct aaagcgtagt tttcgtcgtt tgcgacta    38
 
<210>86
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物RT
 
<400>86
cagagcctgc accagctcca gagccagc               28
 
<210>87
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物F1
<400>87
gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg                            30
 
<210>88
<211>210
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>共有序列-Xaa表示连字符(-)
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(55)..(57)
<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(97)..(97)
<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(119)..(120)
<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(189)..(195)
<223>Xaa可为任一天然存在的氨基酸
 
<400>88
 
Pro Glu Ile Cys Lys Gln Asp Ile Val Phe Asp Gly Ile Ala Gln Ile
1               5                   10                  15
Arg Gly Glu Xaa Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr
            20                  25                  30
Val Xaa Thr Pro Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Val Ala Thr
        35                  40                  45
Phe Trp Pro Glu Leu Pro Xaa Xaa Xaa Glu Lys Ile Asp Ala Val Tyr
    50                  55                  60
Glu Ala Pro Gln Glu Glu Lys Ala Val Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu
                85                  90                  95
Xaa Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Val Asp Ala Ala
            100                 105                 110
Phe Asn Trp Ser Lys Asn Xaa Xaa Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly
        115                 120                 125
Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Val Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly
    130                 135                 140
Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu
145                 150                 155                 160
Asp Ala Val Val Asp Leu Gln Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys
                165                 170                 175
Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gln Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
            180                 185                 190
Xaa Xaa Xaa Lys Ser Val Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu
        195                 200                 205
Gly Cys
    210

Claims (4)

1.用于从DNA文库鉴定编码特异性结合预定靶分子的多肽的核酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)选择序列SEQ ID NO：10；
b)制备其中在氨基酸位置第64、65、86、112、113、114、130和132得到改变的所选序列的DNA文库；
c)对制备的DNA文库筛选所编码的特异性结合预定靶分子IGF-I的多肽；
d)选择编码步骤c)中经鉴定的一种特异性结合物的核酸；
e)重复步骤b)至d)二至五次；以及
f)分离编码特异性结合预定靶分子的多肽的所述核酸。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于DNA文库包含线性表达元件。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于DNA文库的成员通过在核糖体上展示而表达。
4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于DNA文库的成员通过在噬菌体上展示而表达。
CN2006800017561A 2005-01-03 2006-01-02 作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构 Expired - Fee Related CN101098887B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05000013.2 2005-01-03
EP05000013 2005-01-03
PCT/EP2006/000004 WO2006072563A2 (en) 2005-01-03 2006-01-02 Hemopexin-like structure as polypeptide-scaffold

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101098887A CN101098887A (zh) 2008-01-02
CN101098887B true CN101098887B (zh) 2011-05-04

Family

ID=34933192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800017561A Expired - Fee Related CN101098887B (zh) 2005-01-03 2006-01-02 作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20090054252A1 (zh)
EP (2) EP2261243A3 (zh)
JP (2) JP2008526186A (zh)
CN (1) CN101098887B (zh)
AT (1) ATE534662T1 (zh)
CA (1) CA2589060A1 (zh)
ES (1) ES2376586T3 (zh)
SG (1) SG171481A1 (zh)
WO (1) WO2006072563A2 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013200275B2 (en) * 2006-12-04 2014-08-14 Centre National De La Recherche Scientifique OB-fold used as scaffold for engineering new specific binders
EP1930342B1 (en) * 2006-12-04 2012-01-25 Institut Pasteur OB-fold used as scaffold for engineering new specific binders
WO2012048291A2 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Proteapex Therapeutics Llc Compositions and methods for inhibition of mmp:mmp-substrate interactions
RU2482856C2 (ru) 2011-08-05 2013-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Оксигон" Комплексное соединение 2-хлорпропионата цинка и 2-хлорпропионовой кислоты, фармацевтическая композиция для лечения заболеваний кожи, способ ее получения и способ лечения поражений кожи, ногтей и видимых слизистых
US10106582B2 (en) 2012-11-22 2018-10-23 Factor Therapeutics Limited Complex-formation-modulating agents and uses therefor

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6500924B1 (en) * 1996-05-31 2002-12-31 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8091694A (en) * 1993-10-26 1995-05-22 United Biomedical Inc. Structured synthetic antigen libraries as diagnostics, vaccines and therapeutics
CA2347214A1 (en) * 1998-10-16 2000-04-27 Klaus M. Fiebig Protein design automation for protein libraries
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
AU5168701A (en) * 2000-02-10 2001-08-20 Xencor Protein design automation for protein libraries
US20030082630A1 (en) * 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
WO2003014325A2 (en) * 2001-08-10 2003-02-20 Xencor Protein design automation for protein libraries

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6500924B1 (en) * 1996-05-31 2002-12-31 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Patrik Forrer et al..A novel strategy to design binding molecules harnessing themodular nature of repeat proteins.FEBS Letters539 1.2003,539(1),2-6.
Patrik Forrer et al..A novel strategy to design binding molecules harnessing themodular nature of repeat proteins.FEBS Letters539 1.2003,539(1),2-6. *
Patrik Forrer et al..Consensus Design of Repeat Proteins.ChemBioChem5 2.2004,5(2),183-189.
Patrik Forrer et al..Consensus Design of Repeat Proteins.ChemBioChem5 2.2004,5(2),183-189. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006072563A3 (en) 2006-08-31
US20090054252A1 (en) 2009-02-26
EP2261243A2 (en) 2010-12-15
CA2589060A1 (en) 2006-07-13
SG171481A1 (en) 2011-06-29
WO2006072563A2 (en) 2006-07-13
ES2376586T3 (es) 2012-03-15
JP2008526186A (ja) 2008-07-24
JP2012143235A (ja) 2012-08-02
EP1836223A2 (en) 2007-09-26
EP1836223B1 (en) 2011-11-23
ATE534662T1 (de) 2011-12-15
EP2261243A3 (en) 2011-08-10
CN101098887A (zh) 2008-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Roche et al. Identification of endogenous SsrA-tagged proteins reveals tagging at positions corresponding to stop codons
CN101098887B (zh) 作为多肽支架的血红素结合蛋白样结构
US20150065382A1 (en) Method for Producing and Identifying Soluble Protein Domains
US20210108191A1 (en) Methods of Production of Biologically Active Lasso Peptides
Mousavi et al. In silico analysis of several signal peptides for the excretory production of reteplase in Escherichia coli
Glassey et al. Functional expression of diverse post-translational peptide-modifying enzymes in Escherichia coli under uniform expression and purification conditions
AU2002341204A1 (en) Method for producing and identifying soluble protein domains
US20070224662A1 (en) Post-translational modification of proteins in cell-free expression systems
JP6332965B2 (ja) アゾリン化合物及びアゾール化合物のライブラリー、並びにその製造方法
US11535834B2 (en) Recombinant nucleoside-specific ribonuclease and method of producing and using same
US20030049619A1 (en) Methods for the synthesis of polynucleotides and combinatorial libraries of polynucleotides
US20210139920A1 (en) Solubility enhancing protein expression systems
KR20070035499A (ko) 폴리펩티드의 제조방법
AU2012216424B2 (en) Modified proteins and methods of making and using same
Mo PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS OF ARABIDOPSIS HOMOLOGUES OF POLYADENYLATION FACTORS CLP1P AND PCF11P
WO2005007886A2 (en) Method for displaying and selecting a protease molecule
AU2002252462A1 (en) Methods for the synthesis of polynucleotides and combinatorial libraries of polynucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110504

Termination date: 20120102