CN101096376B

CN101096376B - 从椰子硬壳酸水解液中分离提纯d-木糖与木寡糖的方法

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Publication number: CN101096376B
Application number: CN2006100939551A
Authority: CN
Inventors: 黄广民; 姚伯元; 刘仁成
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-06-26
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2026-06-26
Also published as: CN101096376A

Abstract

粉碎至80～100目的椰子硬壳粉、加酸浸泡，升温水解，中和、离心分离去渣，活性炭脱色。将含有杂质的混合糖液，泵入离子交换柱脱盐、脱除杂质后，低温真空浓缩，冷冻结晶，再离心分离出结晶D-木糖和木寡糖糖浆。

Description

从椰子硬壳酸水解液中分离提纯D-木糖与木寡糖的方法

本发明所属领域

本发明采用离子交换层析，实现椰子硬壳酸水解液脱盐与除杂、冷冻结晶分离D-木糖与木寡糖。属食品工业和精细化工领域。

发明的技术背景

自然界不存在游离的D-木糖与木寡糖，而多以木聚糖的形式存在于植物细胞中，如玉米芯、甘蔗、秸杆、棉子等。目前生产D-木糖与木寡糖主要采用玉米芯、秸秆等为原料，酸或酶水解方法制备。无论采用哪种方法，水解液化学成分都十分复杂，有D-木糖、木寡糖、低聚木糖、聚木糖、各种有机酸、色素、木质素与盐等。因此分离提纯D-木糖与木寡糖是制备工艺中关键步骤之一。包括脱色、脱盐、除杂等过程。常用的分离提纯方法有凝胶过滤层析法、吸附层析法、生物分离法、膜分离法、离子交换层析法。

凝胶过滤层析分离技术是分离低聚糖最有效的方法之一。例如，以葡聚糖凝胶Sephadex G10层析柱，以蒸馏水为流动相，流速为10mL/h，柱温为30℃，分离低聚木糖溶液7h后，能够很好地分离木二糖和木糖，但不能分离木四糖至木八糖的混合糖液，说明Sephadex G10能分离的低聚木糖相对分子量范围为0～700。Havliceker等研究表明采用聚丙烯酰胺凝胶(BioGel P-4)为吸附介质的层析柱，对木聚糖酶水解玉米芯木聚糖所得的低聚木糖液进行分离提纯，可得到纯度大于98％的低聚木糖单一组分。Jin Sun等将D-木糖和DP值2～15的低聚木糖通过BioGel P-4柱与Toyopearl HW-40F柱组成的双联层析柱、BioGel P-4柱与BioGel P-2柱组成的双联层析柱进行分离，并将其结果进行对比，表明两者都能分离低聚木糖，但后者分离能力略低于前者。Toyopearl HW-50层析柱和Toyopearl HW-40层析柱仅能分离DP值为8的低聚木糖。使用BioGel P-4和Toyopearl HW-40的双层析柱，以蒸馏水为洗脱液分离低聚木糖，可得到令人满意的结果。然而由于凝胶价格昂贵，脱盐和再生困难，目前仅用于实验室研究，很难应用于规模化生产。

吸附层析：采用活性炭、酸性粘土、活性白土、二氧化硅、多孔合成材料等吸附剂的层析柱，分离提纯含低聚木糖液体，可获得低聚木糖的单组分，分离效果良好，但单组分收率不高。Pellerin等用活性炭吸附层析柱，用30％乙醇为洗脱液梯度洗脱，可根据分子量差异、对不同DP值的低聚木糖进行分离，活性炭可再生重复使用。Whistler等采用活性炭-硅藻土或活性炭-Al₂O₃层析柱，以0～15％乙醇溶液梯度洗脱，能分离出D-木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。

活性炭不仅可分离不同DP值的低聚木糖，还可用于脱色，HAC型活性炭对酶解的低聚木糖液进行吸附脱色，以2.5g/L活性炭吸附16.0g/L酶解的低聚木糖溶液，色素吸附率可达89.9％，低聚木糖的吸附率为14.7％，继续增加活性炭的用量并不能明显提高对色素的吸附，而对低聚木糖的吸附率却持续上升。HAC型活性炭对低聚木糖的吸附能力与分子量呈正相关。优先吸附木五糖、木四糖，活性炭用量较大时，对木二糖、D-木糖也明显吸附。选择合适孔隙分布的活性炭，使其适宜于吸附色素，木五糖、木四糖等分子量较大的糖分，可分离出D-木糖、木二糖、木三糖。然而，活性炭分离效率低，不能脱除其中的盐，再由于采用乙醇梯度洗脱，连续操作困难，酒精消耗量大，成本高。

生物法分离是通过发酵法将功能性低聚糖中的非功效成分选择性除去。Isao等利用酵母(Candida parapsilosis var.komabaensis K-75)在30℃条件下发酵木糖和木二糖的混合液60h后，可除去D-木糖，离心除去酵母后便得到纯化的木二糖溶液。

膜分离技术是一种新兴的高效分离、浓缩和提纯技术，具有常温、无相变、高效、节能、无污染等优点。用于低聚糖分离的膜技术主要有超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)。根据其膜孔径的大小，可用于低聚糖的分级分离。Misturo等利用截留不同分子质量的超滤膜对低聚木糖进行分级处理，分析结果显示：截留分子质量大于500而小于1000的膜所得级分为木四糖和木五木糖，截留分子质量大于1000而小于5000的膜所得的级分主要为木七糖和木八糖。分离效果良好，但设备复杂、投资和维修费用较高。

采用Aminex HPX-42型阳离子交换树脂层析分离低聚木糖，低聚异麦芽糖和纤维寡糖，能分离DP9的低聚糖，与BioGel P-2凝胶过滤层析比较，具有分析时间、单糖分离效果好的优点。Misturo等用强碱性阴离子交换树脂(AG1×8，OAc-，Bio-Rad)用于低聚木糖溶液中酸性低聚糖和中性低聚糖的分离，用蒸馏水洗出中性低聚木糖，再用5mol/L乙酸洗出酸性低聚木糖，其结果表明：离子交换树脂层析可分离低聚木糖。

椰子硬壳酸水解、碱中和、离心分离去渣后，水解液化学成分极其复杂，从椰子硬壳酸水解液中分离提纯D-木糖与木寡糖是制备工艺的难点。

发明内容

本发明采用离子交换层析法，一步实现椰子硬壳酸水解液脱盐与脱除杂质。无色透明的糖液经真空浓缩，冷冻结晶，便分离出D-木糖与木寡糖。工艺过程如下：

1、离子交换树脂装柱和处理

本发明选用国产732强酸型阳离子交换树脂和717强碱型阴离子交换树脂。分别将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂用自来水充分冲洗干净后装柱至柱容积的1/2～2/3处，采用阳-阴-阳-阴…设置。再由柱的底部缓慢通入自来水，使树脂中漂浮的杂质或破碎的树脂从顶部流出，反复通入自来水洗至无杂物，加盖后再进一步冲洗至澄清无色为止。

2、离子交换树脂的再生

离子交换树脂的再生分为阳离子交换树脂再生和阴离子交换树脂再生两部分。732强酸型阳离子交换树脂的再生：先用5倍于树脂体积的4％NaOH溶液处理，以每小时1倍于树脂体积的流速通过，浸泡6～8h，再用自来水洗涤至pH＝7，接着用5倍于树脂体积的3.5％HCl溶液处理，以每小时1倍于树脂体积流速通过，浸泡6～8h，用自来水洗涤至pH＝2，再用去离子水洗涤至pH＝4.0为止。

717强碱型阴离子交换树脂的再生：先用HCl处理，然后用碱活化，酸和碱浓度、用量、流速、处理方法与再生732强酸型阳离子交换树脂相同，最后用去离子水洗涤至pH＝8.0即可。

3、椰子硬壳水解液脱色

离心除去固体残渣后的椰子硬壳酸水解液呈咖啡色或茶色，须首先进行脱色与除杂处理。本发明采用占糖液体积3～5％活性炭进行脱色。脱色时间为40min，脱色温度80℃，采用板框压滤机过滤，过滤压力为0.25MPa。过滤后的糖液呈浅黄色或无色透明。活性炭虽然可吸附脱除色素等，但无法脱除大部分杂质和盐，致使糖液在真空浓缩过程色泽加深，且呈苦味，不利于分离和提纯D-木糖与木寡糖。糖液脱色后经凝胶色谱仪检测糖液组成，表明含有D-木糖、木寡糖、聚木糖等，见图1。[检测仪器：凝胶渗透色谱仪(GPC)，Waters-1515泵，Waters-2414示差检测器，色谱条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TMpp120A(7.8×300mm)柱；进样量：20uL。流动相：超纯水，流速：1.0mL/min。]

4、离子交换脱盐与除杂

糖液脱色后，常温下泵入离子交换层析柱，用去离子水常温下洗涤。控制流速为50～70mL/min，用HD-3型紫外吸收光谱仪测定洗脱液中糖含量。测定条件：选择流动吸收池，紫外吸收波长λ＝254nm，灵敏度0.1A。用pHB-3/pH便携式_pH计测定洗脱液的pH值，采用WZS-1型阿贝折光仪测定洗脱液中可溶性固形物含量，结合托伦试剂作定性检验。收集紫外吸收光谱仪读数≥153、6≤pH≤7、阿贝折光仪读数≥0.5°Bx′的洗脱液。洗脱液无色透明，pH＝6～7，可溶性固形物含量为8～12°Bx′。离子交换层析阳离子交换树脂吸附糖液中有带正电荷、阳极性的有机杂质和阳离子；阴离子交换树脂吸附带负电荷、阴极性的杂质和阴离子，同时也是吸附木聚糖，使D-木糖与木寡糖很好地分离。离子交换层析分离后的糖液经凝胶色谱仪检测其组成，表明含有D-木糖、木二糖、木三糖等，见图2。(检测仪器：凝胶渗透色谱仪(GPC)，Waters-1515泵，Waters-2414示差检测器，色谱条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TMpp120A(7.8×300mm)色谱柱；进样量：20uL。流动相：超纯水，流速：1.0mL/min。)该法设备简单，流动相是去离子水，操作简便、成本低、可连续化操作，能实现规模化生产。

5、糖液真空浓缩和结晶分离

将离子交换分离提纯得到的无色透明混合糖液，瞬间预热到70～80℃，泵入一效不锈钢真空蒸发罐，在50～60℃温度，真空度-0.09MPa条件下，瞬时蒸发浓缩到72～75°Bx′。糖浆出口温度≤50℃，输送至结晶罐，进一步冷却至室温后，加入20～30％的D-木糖晶种，在缓慢搅拌(10rpm)，2～8℃条件下冷冻结晶4～5h后，流入糖用篮式离心机，离心分离出结晶D-木糖和浓度为68～72°Bx′的D-木糖、木二糖、木三糖混合糖浆。结晶D-木糖进一步重结晶即可得到高纯度D-木糖。混合糖浆可重复上述过程，继续结晶分离出D-木糖和混合糖浆。

6、检测

分离出的结晶D-木糖经高效液相色谱仪检测，其保留时间与分析纯标准D-木糖的保留时间完全一致，其纯度≥99％。见图3至图4。(检测仪器：Jasco-1560型高效液相色谱仪，Waters-1515泵，Waters-2414示差检测器，色谱条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TMpp120A(7.8×300mm)色谱柱；进样量：20uL。流动相：超纯水，流速：1.0mL/min。)

分离出的结晶D-木糖分别用红外光谱仪、核磁共振谱仪、液质联用仪检测，其结果与分析纯标准D-木糖的谱图相当吻合，见图5至图9。同一批样品经中国科学院上海药物研究所检测，其红外光谱、核磁共振、质谱等谱图与分析纯标准D-木糖的谱图一致。该所检测结论：“以上波谱数据与文献报道D-木糖的数据一致，与标准品测定图谱数据也一致，说明样品成分即D-木糖，并含有两种构型，即α，β构型”，见图10至图15。

下面的实例将有助于描述和理解本发明：

实例：称取粉碎至80目的新鲜椰子硬壳粉40kg，置于内衬有搪瓷的不锈钢水解反应釜(200L)，加入0.08mol/L的稀盐酸或稀硫酸120kg，水解温度125～145℃，压力0.4～0.6MPa，水解时间为1～2h，利用压力差将料液压入中和罐，加入固体氢氧化钠中和，离心分离出固体残渣，得水解液总重量约120kg。水解液中加入6kg粉状活性炭，在80℃下脱色30～40min，板框过滤，过滤压力≥0.25MPa，得无色透明或浅黄色透明糖液，糖液总重约100kg。

糖液脱色后，常温下泵入离子交换层析柱，用去离子水常温下洗涤。控制流速为50～70mL/min，用HD-3型紫外吸收光谱仪测定洗脱液中糖的含量。测定条件：选择流动吸收池，紫外吸收波长λ＝254nm，灵敏度0.1A。用pHB-3/pH便携式pH计测定洗脱液的pH值，采用WZS-1型阿贝折光仪测定洗脱液中可溶性固形物含量，结合托伦试剂作定性检验。收集紫外吸收光谱仪读数≥153、6≤pH≤7、阿贝折光仪读数≥0.5°Bx′的洗脱液。洗脱液无色透明，pH＝6～7，可溶性固形物含量为8～12°Bx′。

将离子交换层析分离提纯得到的无色透明混合糖液，瞬间预热到70～80℃，泵入一效不锈钢真空蒸发罐，在50～60℃温度，真空度-0.09MPa条件下，瞬时蒸发浓缩到72～75°Bx′。糖浆出口温度≤50℃，输送至结晶罐，进一步冷却至室温后，加入20～30％的D-木糖晶种，缓慢搅拌(10rpm)，在2～8℃下冷冻结晶4～5h后，流入糖用篮式离心机，离心分离出结晶D-木糖和浓度为68～72°Bx′的D-木糖、木二糖、木三糖混合糖浆。结晶D-木糖进一步重结晶即可得到高纯度D-木糖。混合糖浆可重复上述过程，继续结晶分离出D-木糖和混合糖浆。总糖(以干椰子硬壳计)产率≥12％，其中D-木糖产率≥8％，可溶性固形物大于85°Bx′的混合糖浆≥4％。其工艺流程见图16与图17。

附图说明部分：

图、1椰子硬壳酸水解液凝胶色谱图：色谱峰值151：指D-木糖与木寡糖混合物峰、1718、3400、5095：分别指分子量大于10个木糖单位以上的多聚木糖峰。检测仪器：凝胶渗透色谱仪(GPC)，Waters-1515泵，Waters-2414示差检测器，色谱条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TMpp120A(7.8×300mm)柱；进样量：20μL。流动相：超纯水，流速：1.0mL/min。

图2、椰子硬壳离子交换层析分离后糖液凝胶色谱图：色谱峰值159、261：D-木糖峰及混合物峰、337、531分别为木二糖、木三糖及混合物峰。检测仪器：凝胶渗透色谱仪(GPC)，Waters-1515泵，Waters-2414示差检测器，色谱条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TMpp120A(7.8×300mm)柱；进样量：20μL。流动相：超纯水，流速：1.0mL/min。

图3、分析纯结晶D-木糖标样高效液相色谱图；图4、椰子硬壳结晶D-木糖样品高效液相色谱图：椰子硬壳结晶D-木糖与分析纯结晶D-木糖保留时间完全相同。检测仪器：Jasco-1560型高效液相色谱仪，Waters-1515泵，Waters-2414示差检测器，色谱条件：色谱柱：Ultrahydrogel^TMpp120A(7.8×300mm)色谱柱；进样量：20μL。流动相：超纯水，流速：1.0mL/min。

图5、分析纯结晶D-木糖样品红外光谱图；图6、椰子硬壳结晶D-木糖样品红外光谱图：检测仪器：BRUKER TENSOR27型红外光谱仪，溴化钾晶片。两者峰值完全相同。

图7、分析纯D-木糖标样氢核磁共振谱谱图；图8、椰子硬壳D-木糖氢核磁共振谱谱图：椰子硬壳结晶D-木糖与分析纯结晶D-木糖核磁共振谱图峰值几乎完全相同。检测仪器：瑞士Bruker 400MHz-型核磁共振谱仪。

图9、分析纯D-木糖标样质谱图；图10、椰子硬壳D-木糖质谱图：椰子硬壳结晶D-木糖质谱图峰值与分析纯结晶D-木糖质谱图峰值完全相同。检测仪器：美国惠普公司HP5973MSD-型气相色谱-质谱联用仪

图11、椰子硬壳D-木糖C-NMR谱谱图；图12、分析纯D-木糖标样C-NMR谱谱图：椰子硬壳D-木糖与分析纯标准D-木糖C-NMR谱完全一致(注：中国科学院上海药物研究所检测结果)。

图13、分析纯D-木糖标样H-NMR谱谱图；图14、椰子硬壳D-木糖H-NMR谱谱图：H-NMR(D₂O，400M Hz)：5.23(d，J＝3.6Hz，H-α-1)，4.61(d，J＝8.4Hz，H-β-1).C-NMR(D₂O，100M Hz)：94.7(C-α-1)，74.0(C-α-2)，75.3(C-α-3)，71.9(C-α-4)，63.4(C-α-5).99.1(C-β-1)，76.5(C-β-2)，78.3(C-β-3)，71.7(C-β-4)，67.7(C-β-5)。椰子硬壳D-木糖与分析纯标准D-木糖H-NMR谱完全相同。(注：中国科学院上海药物研究所检测结果)。

图15、椰子硬壳D-木糖和分析纯D-木糖标样红外光谱图比较：上一谱图为椰子硬壳D-木糖红外光谱谱图，下一谱图为分析纯D-木糖标样红外光谱图。(注：中国科学院上海药物研究所检测结果)。

图16、椰子硬壳D-木糖质谱图：EI-MS：150，149，133，119，91，73(100％)。(注：中国科学院上海药物研究所检测结果)。

中国科学院上海药物研究所结论：以上波谱数据与文献报道D-木糖的数据一致，与标准品测定图谱数据也一致，说明样品成分即D-木糖，并含有两种构型，即α，β构型。

图17、椰子硬壳制备D-木糖，木寡糖主要工艺框图；图18、椰子硬壳制备D-木糖，木寡糖主要设备与流程图：

注：1、椰子硬壳；2、28、输送带；3、锤片式粉碎机；4椰子硬壳料槽；5、水解反应釜；6、盐酸槽；7、中和罐；8、碱槽；9、11、14、16、19、21、23、泵；10、22、离心机；12、夹层锅；13、板框压滤机；15、离子交换柱；17、盘管预热器；17、24、一效真空降膜蒸发器；20、结晶罐；25、灌装机；26、封口机；27、滚筒干燥机；29、结晶D-木糖包装机。

Claims

1.一种从椰子硬壳酸水解液中分离提纯D-木糖与混合糖浆的方法，包括以下步骤：

(1)、离子交换树脂装柱和处理：选用国产732强酸型阳离子交换树脂和717强碱型阴离子交换树脂，分别将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂用自来水充分冲洗干净后装柱至柱容积的1/2～2/3处，采用阳-阴-阳-阴...设置，再由柱的底部缓慢通入自来水，使树脂中漂浮的杂质或破碎的树脂从顶部流出，反复通入自来水洗至无杂物，加盖后再进一步冲洗至澄清无色为止；

(2)、离子交换层析脱盐与除杂：椰子硬壳酸水解液脱色后的糖液泵入离子交换层析柱，用去离子水常温洗脱；控制流速为：50～70mL/min，收集紫外吸收光谱仪读数≥153，酸度：6≤pH≤7、阿贝折光仪读数≥0.5°Bx′的洗脱液为混合糖液；

(3)、真空浓缩和结晶分离：将混合糖液，瞬间预热到70～80℃，泵入一效不锈钢真空蒸发罐，在50～60℃温度，真空度-0.09MPa条件下，真空浓缩到72～75％；结晶罐中加入20～30％的D-木糖晶种，控制结晶温度2～8℃，在10rpm的搅拌速度下缓慢搅拌冷冻结晶，经离心分离后得到结晶D-木糖和浓度为68～72％的由D-木糖、木二糖和木三糖组成的混合糖浆；结晶D-木糖经重结晶即为高纯度椰子硬壳D-木糖。