CN101085349A - 囊泡导向的免疫细胞及其在制备抗肿瘤药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫活性药物组合物，包含有效量的囊泡导向的免疫细胞以及药用载体。本发明还提供制备这种免疫活性药物组合物的方法，提供囊泡导向的免疫细胞的制备方法。本发明还提供这种免疫活性药物组合物在制备抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。

Description

囊泡导向的免疫细胞及其在制备抗肿瘤药物上的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及免疫调节及疾病防治，更具体涉及提供一种免疫活性药物组合物，包含有效量的囊泡导向的免疫细胞，及其在制备抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。

背景技术

树状细胞(Dentritic cell，DC)在囊泡室中加工外来抗原，如多泡囊泡(1)可以与细胞膜融合，然后释放出抗原提呈小泡称为囊泡(Exosome，EXO)(2-4)。囊泡是直径为50-90nm含有抗原提呈分子(MHCI，MHCII，CD1，hsp70-90)；四聚体分子(CD9，CD63，CD81)；黏附分子(CD11b，CD54)和协同刺激分子CD86等启动潜在免疫应答所必需的元件(5-7)。Zitvogel等第一次报道了树突细胞衍生的囊泡可以成功地用做疫苗来去除动物模型中的肿瘤(4)。来自树突细胞的临床级别囊泡也已获得(8)。然而，用树突衍生的囊泡进行免疫治疗还有他的局限性，其中最大的局限在于识别肿瘤抗原的有效性。后来发现肿瘤细胞衍生的囊泡可以携带肿瘤抗原启动有效的抗肿瘤免疫应答(9-11)。而且，肿瘤衍生的囊泡如那些来自于肿瘤腹水的囊泡可以提供一种新来源的非细胞囊泡作为肿瘤疫苗(12)。最近更多的研究表明囊泡疫苗在不同的动物模型中已确认具有诱导肿瘤免疫的作用(13-16)。然而，在大多数研究中，囊泡疫苗仅是诱导预防型的抗肿瘤免疫应答，而不是治疗已存在的肿瘤。在最近的I期临床实验中使用囊泡疫苗，检测发现在所有15个黑色素瘤病人的外周血中没有发现肿瘤特异型的T细胞应答。只有一个病人表现出对肿瘤生长的部分应答(17)。在另外的I期临床实验中使用囊泡疫苗，在9个后期非小细胞肺癌病人中，只在3个病人中发现对MAGE肽的迟发性超敏反应(18)。所以，囊泡疫苗的免疫途径和效率需要进一步提高。

囊泡的pMHCI和pMHCII复合物具有功能，但可能需要转移到树突细胞中才能提高T细胞的激活，从而导致肿瘤的消除(14，19，20)。而且囊泡在体内介导的抗肿瘤免疫的潜在途径可能是通过不成熟的DC对EXO的摄取，反过来再通过携带有囊泡的树突细胞上的pMHC复合物和协同刺激分子来激活抗原特异性的T淋巴细胞。我们先前发现树突细胞疫苗抗肿瘤免疫的效率依赖于树突细胞的成熟程度，成熟的树突细胞效率高，半成熟的树突细胞效率低(21)。而且囊泡疫苗的效率低可能与囊泡在体内被不成熟的树突细胞所摄取有关。为了提高抗肿瘤免疫的效率，CpG佐剂结合在树突细胞表面的Toll样受体9上，可使树突细胞成熟和激活(22)，这种方法在体内已被应用到结合囊泡，提高囊泡诱导的细胞毒反应(15)。所以，本发明者设想在体外携带囊泡的成熟树突细胞的应用可以成为一种新型的更有效的调整肿瘤特异的免疫应答的途径。

给动物提供弱化的T淋巴细胞显示可刺激免疫抑制，阻止实验中自身免疫疾病的发展(23，24)。囊泡可通过抗原特异性的pMHC/TCR和非特异性的CD54/LFA-1相互作用被T细胞摄取(25，26)。最近研究显示CD4⁺T细胞可以通过APC的激活获得APC膜分子，这些激活的CD4⁺T获得了pMHCI和协同刺激分子CD54和CD80，可进一步激活肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞免疫应答(27)。CD4⁺T细胞获得APC分子的一个潜在机制可能是CD4⁺T细胞摄取了树突细胞释放的囊泡。所以，本发明者设想在体外摄取囊泡的CD4⁺T细胞可能也可以成为一种新的针对肿瘤特异性免疫应答的更有效的途径。

在上述两项设想的启发下，本发明者利用不同来源的树突细胞及其衍生的囊泡与不同来源的T细胞相互作用，制备得到一种免疫活性药物组合物，通过动物实验证实此药物组合物具有免疫活性，从而完成了本发明。

因此，本发明的第一个目的是提供一种免疫活性药物组合物。

本发明的第二个目的是提供获得免疫活性药物组合物的方法。

本发明的第三个目的是提供免疫活性药物组合物在制备抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。

发明概述

本发明第一方面提供的免疫活性药物组合物，包含治疗有效量的囊泡导向的免疫细胞以及药用载体，所述免疫细胞选自树状细胞、T细胞、吞噬细胞、B细胞和血液白细胞，所述囊泡是直径50-90nm的细胞膜囊泡。

本发明第二方面提供的囊泡导向的树状细胞是由树状细胞摄取囊泡而成为具有表达pMHCI，而且还高表达CD40，CD54和CD80重要免疫分子的细胞，所述囊泡是来自于树状细胞或工程化的树状细胞。

本发明第三方面提供的囊泡导向的T细胞是具有Th₁或Th₂特征的T细胞，由CD4⁺T细胞摄取囊泡而成为具有表达pMHCI、CD54和CD80的T细胞，所述囊泡是来自于树状细胞或工程化的肿瘤细胞。

本发明第四方面提供囊泡导向的树状细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)骨髓来源的树突细胞的制备：骨髓细胞在高剂量GM-CSF和IL-4的作用下，产生骨髓来源树突细胞；

2)囊泡的制备：步骤1)所得的树突细胞在含有OVA蛋白的无血清AIM-V培养基中培养，离心所得上清液，得到囊泡沉淀物；

3)骨髓来源的树突细胞对囊泡的摄取：在AIM-V培养基中，将步骤1)所得树突细胞与步骤2)所得囊泡共培养，得到摄取囊泡的树突细胞。

本发明第五方面提供的囊泡导向的T细胞的制备方法，包括以下步骤：

其中包括由树突细胞衍生的囊泡导向的T细胞的制备，包括以下步骤：

1)ConA激活的CD4⁺T细胞的制备：在含有IL-2和ConA的RPMI1640培养基中培养脾脏细胞，分离得到ConA激活的CD4⁺T细胞，

2)囊泡的制备：在高剂量GM-CSF和IL-4的作用下，产生骨髓来源树突细胞，将此树突细胞在含有OVA蛋白的无血清AIM-V培养基中培养，离心所得上清液，得到囊泡沉淀物，

3)ConA激活的CD4⁺T细胞对所述囊泡的摄取：在含有IL-2的AIM-V培养基中，将步骤1)所得的CD4⁺T细胞与步骤2)所得的囊泡共培养，得到摄取所述囊泡的ConA激活的CD4+T细胞；及

包括由工程化肿瘤细胞衍生的囊泡导向的T细胞的制备，包括以下步骤：

1)pcDNA-CD80表达载体的构建：抽提树突细胞的RNA，用RT-PCR法克隆CD80基因，并构造pcDNA-CD80基因表达载体，

2)转染细胞系EG7/CD80的产生：将步骤1)所得表达载体转化到肿瘤细胞EG7中，获得EG7/CD80肿瘤细胞，

3)囊泡的制备：在无FCS的AIM-V培养基中，培养步骤2)所得的肿瘤细胞EG7/CD80，离心培养所得上清液，得到囊泡沉淀物，

4)CD4⁺T的激活：从脾脏中分离得天然CD4+T细胞，将此细胞在含有抗CD3抗体、IL-2的培养基中培养，在培养基中同时加入IL-12和抗IL-4抗体或加入IL-4、IL-10、TGF-β和抗IFN-γ抗体，

5)CD4⁺T对囊泡的摄取：将步骤3)所得囊泡和步骤4)所得CD4⁺T细胞，在含有IL-2的培养中共培养，得到摄取囊泡的CD4+T细胞。

本发明第六方面提供免疫活性药物组合物在制备抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。

本发明显示树状细胞和CD4⁺T细胞能通过获取囊泡而获得囊泡来源的组织相容性复合体(MHC)的I类分子(pMHCI)，CD54和共同刺激分子CD80。本发明还显示以上所获取的分子均具有功能性。这些获取囊泡的(囊泡导向的)树状细胞及T细胞能更有效地刺激体内和体外的免疫反应。

本发明显示由树状细胞衍生的囊泡表达pMHCI，CD40，CD54和CD80。由表达CD80的工程化的肿瘤细胞衍生的囊泡亦表达pMHCI和CD80。

本发明相应地提供了一种制备囊泡导向的树状细胞的方法。其中包括将由装载了抗原的树状细胞或工程化的肿瘤细胞所衍生的囊泡和其他树状细胞在一定的条件下接触以利于囊泡被树状细胞所获取。

本发明相应地提供了一种制备囊泡导向的CD4⁺T细胞的方法。其中包括将由装载了抗原的树状细胞或工程化的肿瘤细胞所衍生的囊泡和CD4⁺T细胞在一定的条件下接触，以利于囊泡被CD4⁺T细胞所获取。

发明详述

本发明显示了树状细胞和T细胞能获取从树状细胞及肿瘤细胞所衍生的囊泡。特别是这些细胞能从囊泡获取组织相容复合体和共同刺激分子。本发明显示了这些从囊泡获取的分子是具有功能性的。这样，囊泡导向的树状细胞及T细胞就能直接地刺激免疫反应。

本发明相应地提供了一种制备囊泡导向的树状细胞的方法。其中包括将由装载了抗原的树状细胞或工程化的肿瘤细胞所衍生的囊泡和其他树状细胞在一定的条件下接触，以利于囊泡被树状细胞所获取。

本发明也相应地提供了一种制备囊泡导向的CD4⁺T细胞的方法。其中包括将由装载了抗体的树状细胞或工程化的肿瘤细胞所衍生的囊泡和CD4⁺T细胞在一定的条件下接触，以利于囊泡被CD4⁺T细胞所获取。

术语“囊泡”是指直径50-90nm的细胞膜囊泡。在本发明中，囊泡是指来源于抗原递呈细胞如树状细胞，或是指来源于肿瘤细胞如肿瘤腹水或表达CD80的工程化肿瘤细胞。这类囊泡具有抗原递呈能力和粘附分子，共同刺激分子。这些包括有组织相容性复合体，CD40，CD54，CD80和CD86等。

术语“树状细胞衍生的囊泡”是指制备及纯化由树状细胞衍生的囊泡。举例来说，树状细胞的培养液通过离心去除细胞和细胞碎片，然后再离心获得囊泡。囊泡可来源于骨髓来源的树状细胞或其他来源的树状细胞。比如，由末梢血液来源的树状细胞或是工程化的表达某种肿瘤抗原和细胞因子的树状细胞。

术语“肿瘤细胞来源的囊泡”是指制备及纯化由肿瘤细胞衍生的囊泡。举例来说，肿瘤病人的腹水通过离心去除细胞和细胞碎片，然后再离心获得囊泡。再举例，肿瘤细胞可通过工程化而表达一些重要的免疫分子如共同刺激分子CD80。工程化肿瘤细胞的培养液通过离心去除细胞和细胞碎片，然后再离心获得囊泡。

术语“囊泡导向的树状细胞”是指获取囊泡的树状细胞。它们能直接从囊泡获得组织相容性复合体。和共同刺激分子从而能刺激免疫反应。

术语“囊泡导向的T细胞”是指获取囊泡的T细胞。它们能直接从囊泡获取组织相容性复合体和共同刺激分子，从而能刺激免疫反应。

术语“在一定的条件下以利于树状细胞获取囊泡”是指树状细胞或肿瘤细胞衍生的囊泡和另一个树状细胞接触以便另一个树状细胞获取囊泡。同时抗原递呈的功能和共同刺激分子也从囊泡被转移到另一个树状细胞。具体来说，树状细胞(1×10⁶)在含有5-10μg EXO的0.5-1.0ml培养液中，37℃下培养4-6小时。期间每20-30分钟将细胞摇匀一次。应当指出，许多因素包括温度、细胞浓度、囊泡浓度、培养液的成分等均能影响到树状细胞对囊泡的最佳获取。

再具体来说，本发明中所述的树状细胞可以是骨髓或其他来源的，如末梢血液来源。树状细胞可以是成熟的或不成熟的；可以是抗原装载的或是工程化的以表达某种肿瘤抗原或细胞因子的树状细胞。另一个树状细胞可以是在体外不同条件下比如说在有LPS/TNF-α/IFN-γ或IL-10/TGF-β的情况下分化成为成熟的具有免疫原性的或具有免疫抑制性的树状细胞，也可以是一个表达重要免疫分子的工程化的树状细胞。

本发明还包括在本发明的方法中所表达的囊泡导向的树状细胞的分离和纯化的方法。

术语“在一定的条件下以利于T细胞获取囊泡”是指，树状细胞或工程化的肿瘤细胞衍生的囊泡和T细胞接触以便T细胞获取囊泡。同时抗原递呈的功能和共同刺激分子也从囊泡被转移到T细胞。具体来讲，T细胞(1×10⁶)和囊泡(5-10μg)在含有IL-2的培养液，37℃下培养4-6小时。其间每20-30分钟将细胞摇匀一次。应当指出，许多因素包括温度、细胞浓度、囊泡浓度、培养液的成分等匀能影响T细胞对囊泡的最佳获取。

再具体来说，在本发明中所述的树状细胞可以是骨髓或其他来源的，比如从末梢血液来源。树状细胞可以是成熟的或不成熟的；可以是抗原装载的或是工程化的以表达某种肿痛抗原或细胞因子的树状细胞。在本发明中所述的T细胞是末梢血液来源的。T细胞可以是CD4⁺或CD8⁺T细胞，是原生型的或是激活的T细胞或是表达某些重要免疫分子如foxp3和细胞因子的工程化的T细胞。激活的T细胞来源于体外T细胞在不同条件下比如在IL-2/IL-12/抗IL-4抗体的条件下或在IL-4/IL-10/TGB-β/抗IFN-γ抗体的条件下分化成分泌IL-2/IFN-γ的Th₁细胞或分泌IL-4/IL-10的Th₂细胞。

本发明还包括在本发明的方法中所表述的囊泡导向的T细胞的分离和纯化的方法。

术语“a cell”是指一个单个的细胞或是一种细胞群体。

一个有经验的研究人员应当了解到囊泡导向的树状细胞或T细胞也能由DNA重组方法制备。具体来说，本发明中所述的树状细胞即可通过工程化以表达有兴趣的肿瘤抗原，共同刺激分子如CD40 L和细胞因子如GM-CSF和TNF-α；或者，本发明中所述的树状细胞，可以是成熟的或不成熟的树状细胞或可通过工程化以表达有兴趣的肿瘤抗原或共同刺激分子或细胞因子如IL-10和IL-12。在DNA重组方法中所必须的技术可参观“分子科隆：一份实验室常用的目录”，第二版，(Sambrook et al.，1989)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney，ed.1987)；“最近的免疫试验方法”(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)。

术语“应用”是指(但不局限于)免疫组合物应用在肿瘤和免疫疾病，如自身免疫疾病和感染性疾病。

术语“治疗有效量”是指有效的剂量和达到所期望治疗结果所需要的治疗时间。囊泡导向的树状细胞和T细胞的有效剂量可能随如下一些因素而改变。其中包括疾病的临床期，年龄，性别，动物的重量。剂量也可随最佳治疗的反应而调整。举例来说，可将一个剂量分开在同一天里使用，剂量也可根据治疗情况进行适当调整。

术语“动物”是指哺乳动物和人。

术语“增强免疫反应”是指增强在一个动物体内的免疫反应，具体的来说就是细胞毒性的T淋巴细胞的反应。这种免疫反应通常可用免疫检测方法来测试。比如说可用体内和体外的CD₈ ⁺T细胞增殖试验方法来检测。再举例来说可用体内和体外的CD₈ ⁺T细胞毒性试验方法来检测。

具体来说，囊泡导向的树状细胞和T细胞可被单独用来增强机体免疫系统进而治疗或预防一种疾病特别是细胞毒性T淋巴细胞反应。这些囊泡导向的细胞也可以和其他的免疫细胞联合使用去防治疾病。其他的免疫细胞包括(但不局限于)树状细胞、吞噬细胞、B细胞和细胞毒性T细胞。

本发明的方法中还包括使用免疫佐剂。免疫佐剂包括(但不局限于)格兰氏阴性细菌内毒素的类脂质A部分，lrehalose dimycolate或分枝杆菌、溴化磷酯、线形聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物、矿物盐如氢氧化铝、脂质体和细胞因子等。

为了更适合体内的使用，囊泡导向的树状细胞和T细胞还可与其它药物成分组成复合剂。术语“适用体内使用的生物性的剂型”是指其治疗效果远远大于其产生的毒性反应的一种剂型。这种药物可以给予有生命的个体包括人和动物。本发明中所述的有效量是指药物的有效剂量及达到预想结果的时间。举例来说，有效的剂量可能随如下一些因素而改变，其中包括疾病的临床期，年龄，性别和个体的重量。剂量也可随最佳治疗的反应而调整。例如，可将一个剂量分开在同一天使用，剂量也可根据治疗情况进行适当调整。

本发明相应地提供了一种免疫活性药物组合物，包括使用有效量的囊泡导向的免疫细胞，如树状细胞和T细胞，以及可药用的载体和赋形剂。

这些免疫细胞可以用一些简便的方法给予机体。比如用皮下，静脉及肌肉注射的方法，口服，吸入及经皮肤吸收的方法(用霜及油膏等)，或用栓剂的方式。根据不同的给药方式，这些活性细胞可用其它物质所包装以避免囊泡导向的树状细胞和T细胞被酶，酸和其它自然的物质所破坏。

这里所述的添加剂物质和方法都是根据世界上公认的通用方法。这样有效量的药物就能和一些药用的载体混合后使用。这些常用的药用载体可参见Remington’s“药物科学”(2003，第20版)和美国药典：“The National Formulary(USP 24 NF19，1999版)。据此，这些物质可包括一种或多种药用载体，缓冲液和具有合适酸碱度或等渗的生理液体。

附图说明

图1显示树突细胞(DC)和树突细胞衍生的囊泡(EXO)的表型。实线代表待测样品，细虚线代表对照。

图2显示树突细胞(DC)摄取囊泡(EXO)的结果。(A)用流式细胞仪分析CFSE和CD45.1的表达，其中粗实线代表已摄取囊泡的树突细胞，细虚线代表未摄取囊泡的树突细胞；(B)用流式细胞仪分析一系列细胞表面分子，其中粗实线代表摄取囊泡的树突细胞，粗虚线代表未摄取囊泡的树突细胞，细虚线代表对照；(C)树突细胞摄取囊泡的分子机制。

图3显示EXO导向的DC体外刺激天然CD8⁺T细胞增殖的结果。(A)CD8⁺T细胞体外增殖实验；(B)CD8⁺T细胞体外增殖的分子机制。

图4显示EXO导向的DC体内刺激天然CD8⁺T细胞增殖的结果。

图5显示EXO导向的DC刺激CD8⁺T细胞增殖及分化成效应细胞CTL的杀伤功能。

图6显示EXO导向的DC对已形成肿瘤的治疗效果。

图7显示CD4⁺T细胞以抗原特异性和非特异性两种方式摄取EXO的结果。(a)实线代表待测样品，细虚线代表对照；(b)粗实线代表待测样品，细虚线代表对照。

图8显示CD4⁺T细胞通过摄取EXO获得pMHCI和协同刺激分子的结果。(a)粗实线代表已摄取EXO_CFSE，细虚线代表未摄取EXO_CFSE；(b)、(c)、(d)、(e)、(f)表示摄取的分子机制。

图9显示EXO导向的CD4⁺T细胞激活天然CD8⁺T细胞的体外增值结果。(a)CD8⁺细胞体外增殖实验；(b)体外增值的分子机制。

图10显示EXO导向的CD4⁺T细胞体内激活非CD4⁺T细胞依赖的CD8⁺T细胞增殖结果。

图11显示EG7/CD80细胞和EG7/CD80细胞衍生的囊泡的表型分析结果。(a)实线代表EG7和表达CD80的EG7/CD80肿瘤细胞，细虚线代表对照；(b)实线代表EG7/CD80和EG7肿瘤细胞衍生的囊泡，细虚线代表对照。

图12显示EG7/CD80对囊泡的摄取。实线代表激活CD4⁺T细胞(aT)和摄取了EXO_A和EXO_B的aT(aT_EXOA和aT_EXOB)，细虚线代表对照。

图13显示EXO导向的CD4⁺T细胞体内激活CD8⁺T细胞增殖结果。

具体实施方案

下面用实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

实施例1囊泡导向的树状细胞的制备

1.材料(试剂、细胞及动物)：

卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司；OVAI多肽(28，29)，针对非相关3LL肺癌特异性的MutI多肽由多肽系统合成(30)；生物素标记和FITC荧光标记的H-2K^b(AF6-88.5)，Ia^b(AF6-120.1)，CD4(GK1.5)，CD8(53-6.7)，CD11c(HL3)，CD40(IC10)，CD54(3E2)，CD80(16-10A1)，CD44(IM7)，MyD88，CCR7(4B12)以及DC特异的ICAM-非整合素(DC-SIGN)(5H-11)均购自Pharmingen公司；抗H-2K^b/OVAI(pMHCI)复合物抗体由NIH的German博士提供(31)；PE批标记H-2K^b/OVAI tetramer抗体来自Backman Coulter；生物素标记的TLR4和TLR9抗体购自eBioscience；抗LFA-1，K^b，Ia^b和DEC205抗体，和细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4/Ig)融合蛋白；重组鼠的IL-4和GM-CSF购自R&D；细胞松弛素，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-海藻糖，D-葡萄糖胺购自Sigma；CFSE从Eugene分子探针获得。高度肺癌转移的BL/6-10和OVA转基因的BL6-10(BL6-10_OVA)黑色素瘤细胞系由本室制备(27)；鼠EL4和OVA转基因的EL4(EG7)胸腺瘤细胞系来自ATCC。雌的C57BL/6(B6；CD45.2⁺)，C57BL/6.1(B6.1；CD45.1⁺)，OVA特异的T细胞受体(TCR)转基因的OTI和OTII转基因小鼠，在C57BL/6背景下H-2K^b，CD4和CD8，基因敲除(knockout)小鼠均从Jackson实验室获得。所有动物按萨斯卡通大学动物管理委员会条理在萨斯卡通癌症研究中心饲养。

2.步骤：

1)骨髓来源树突细胞的获得

骨髓来源的树突细胞，如背景技术所述(21)，不成熟DC(imDC)在低剂量GM-CSF(2ng/ml)下产生，成熟DC(mDC)在高剂量IL-4和GM-CSF(20ng/ml)的条件下产生。DC培养6天后，在无血清的AIM-V培养基中，用0.3mg/ml OVA蛋白培养过夜，获得DC_OVA。来自H-2K^b基因敲除的老鼠获得DC称DC(K^b-/-)。

2)囊泡的纯化与获得

囊泡按背景技术所述方法进行分离(3，4)。简单的说就是将含有OVA(0.3mg/ml)的无血清AIM-V培养基培养mDC_OVA过夜，所得上清液分别进行四级离心。分别为300×g离心5分钟以去除细胞；1,200×g离心20分钟，10,000×g离心30分钟以去除细胞碎片；100,000×g离心1小时以沉淀EXO。所得EXO沉淀用大量的PBS缓冲液洗涤2遍后再于100,000×g离心1小时进行回收。回收所得EXO蛋白用Bradford assay来定量。来自野生的C57BL/6和C57BL/6.1小鼠的EXO分别命名为EXO_OVA和EXO_6.1，来自于H-2K^b基因敲除小鼠mDC_OVA的EXO被命名为(K^b-/-)EXO。在37℃下用0.5μM CFSE染色mDC20分钟后，用PBS缓冲液洗涤3次(32，33)，随后用含有OVA蛋白的无血清AIM-V培养基培养过夜，得到带有CFSE标记的EXO，称为EXO_CFSE。按囊泡分离方法从培养上清液中收集并纯化EXO_CFSE。

3)树突细胞和囊泡的表型特点

为了对树突细胞的表型进行分析，imDC_OVA和mDC_OVA用一系列生物素标记和FITC标记的抗体染色，流式细胞仪分析。为了分析囊泡的表型，EXO_OVA(25-40μg)与一系列的FITC标记的抗体在冰上孵育30分钟，如步骤2)所述，进行流式细胞仪检测。在进行流式细胞仪检测时，为了确定适合分析EXO的最佳电压，以直径为4.5μm的Dynal M450微珠作为大小对照。为了分析细胞间分子如TLR9和MyD88，DC和EXO在抗体染色前用Cytoperm试剂盒按照操作说明进行渗透化处理，同种匹配的生物素标记或FITC标记的抗体作为对照。

DC和EXO的表型特点见图1。其中，骨髓来源的成熟DCs(mDC)，不成熟DCs(imDC)和成熟DCs释放的EXO(EXO_OVA)(实线)用一系列抗体染色后，用流式细胞仪分析。这些树突细胞和EXO也分别被不相关的同型匹配抗体染色，作为对照细胞群(细虚线)。图为2次重复实验中的一次。结果显示，不成熟的DC表现为MHCII(Ia^b)，协同刺激分子CD80，趋化因子受体CCR7的低表达，而且CD40表达也缺陷，而这些分子在T细胞激活中均发挥重要作用。与不成熟DC相比，成熟DC的上述分子表达水平较高。另外，成熟和不成熟的树突细胞都表达CD11c、黏附分子CD54、Toll样受体TLR4、TLR9、MyD88、具有甘露糖特异配体的C型凝集素DEC205和具有甘露聚糖Le^x特异配体的DC-SIGN。经OVA蛋白装载后他们表达pMHCI的量相似。除了以前报道的MHCI，MHCII和CD86外(34)，pMHCI、MHCII(Ia^b)、CD11c、CD40、CD54、CD80、CCR7、TLR4、TLR9、MyDgg、DEC205和DC-SIGN分子也均在EXO_OVA表面表达，但表达水平低于成熟DC_OVA。

4)T细胞的准备

原始的对OVA抗原特异的T细胞分别从具有OVA特异性的TCR转基因小鼠OTI和OTII的脾脏中获得，经过尼龙柱后，OTIICD4⁺和OTICD8⁺的T细胞用抗小鼠CD8或CD4的磁珠(Dynal公司)(27)经阴性选择后得到纯化，所得细胞群的98％分别为CD4⁺/Vα2Vβ5⁺或CD8⁺/Vα2Vβ5⁺。

5)DC对EXO的摄取

成熟DC(mDC)和不成熟DC(imDC)与EXO_OVA(10μg/1×10⁶DC)在0.5-1ml AIM-V培养基中，37℃共培养6小时，其间每20分钟将细胞摇匀一次，然后用PBS缓冲液洗涤2遍后所得的DC分别被命名为mDC_EXO和imDC_EXO。为了估计EXO被吸收情况，成熟DC和不成熟DC分别与EXO_CFSE或EXO_6.1(10μg/1×10⁶DC)共同孵育，然后分别用流式细胞仪检测CFSE染色和CD45.1分子的表达情况。为了研究EXO吸收的分子机制，成熟的不表达自身H-2K^b分子的DC(K^b-/-)在与EXO_OVA共培养前和培养后，分别与一系列抗体：H-2K^b、Ia^b、LFA-1、DEC205、DC-SIGN(15μg/ml)、融合蛋白CTLA-4/IgG(10μg/ml)，肌动蛋白聚合物的抑制剂CCD(15μg/ml)、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-海藻糖、D-葡萄糖胺(5mM)和EDTA(50mM)在冰上孵育30分钟，然后测定EXO摄取后DC表面H-2K^b分子的表达。

DC摄取EXO分子的结果见图2A与图2B。(A)已摄取EXO_CFSE和EXO_6.1的不成熟DCs(imDC)和成熟Dcs((mDC)(粗实线)和未摄取EXO_CFSE和EXO_6.1的不成熟DCs和成熟Dcs(细虚线)用流式细胞仪分析CFSE和CD45.1的表达。(B)已摄取EXO_OVA的不成熟DCs和成熟Dcs(粗实线)和未摄取EXO_OVA的不成熟DCs和成熟Dcs(粗虚线)用流式细胞仪分析一系列细胞表面分子。不相关的同型匹配抗体作为对照(细虚线)。图为2次重复实验中的一次。其中图2A显示，成熟DC和不成熟DC都可检测到CFSE染色，说明DC可以摄取EXO；与EXO6.1孵育后，成熟DC和不成熟DC都获得了CD45.1。其中图2B显示，另外其他EXO分子如：MHCI、MHCII、CD11c、CD40、CD54、CD80也转移到成熟DC和不成熟DC细胞表面。

DC通过LFA-1/CD54和C型凝集素/C型凝集素受体的相互作用来摄取EXO的结果见图2C。(C)为研究DC摄取EXO的分子机制，mDC(K^b-/-)在与EXO_OVA共培养前和培养后，分别加入一系列抗H-2K^b、Ia^b、LFA-1、DC-SIGN和DEC205抗体，融合蛋白CTLA-4/IgG，肌动蛋白聚合物的抑制剂CCD，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-海藻糖，D-葡萄糖胺和EDTA在冰上孵育30分钟。流式细胞仪分析和比较在不同情况下DCs表面H-2K^b分子的表达。并和试剂对照组进行Student′s T检验(40)。结果^*p值小于0.05，说明实验组与对照组有显著性差异。图为2次重复实验中的一次。其中，用抗LFA-1抗体和抗DEC205抗体阻断后，DC对EXO的摄取显著下降(p＜0.05)，但抗H-2K^b、抗Ia^b、抗DC-SIGN抗体和CTLA-4/Ig融合蛋白并没有阻断作用。说明LFA-1/CD54和C型凝集素/甘露糖富集的C型凝集素受体的相互作用与EXO的摄取有关。当用CCD(肌动蛋白聚合抑制剂)处理后，DC对EXO的摄取的能力也显著下降(p＜0.05)，说明肌动蛋白细胞骨架对EXO的摄取非常重要。LFA-1/CD54在DC摄取EXO的过程中的相互作用与以前的报道一致(35)。既然C型凝集素与其受体的相互作用是Ca²⁺依赖的(36)，本发明者使用Ca²⁺敖和剂EDTA，结果显示50mM的EDTA可显著降低DC对EXO的摄取(p＜0.05)，证实了DC对EXO的摄取是通过C型凝集素/C型凝集素受体的相互作用来介导的。为了进一步证实C型凝集素/甘露糖富集的C型凝集素受体在EXO摄取中发挥的作用，本发明者在阻断实验中使用了一系列的单糖，其中D-甘露糖和D-葡萄糖胺可显著抑制EXO的摄取，而D-葡萄糖和D-岩藻糖没有显著作用，说明DC对EXO的摄取是通过C型凝集素和甘露糖/葡萄糖胺富集的C型凝集素受体相互作用介导的。

6)T细增殖的体外实验

为评估树突细胞衍生的囊泡的功能，进行CD8⁺T细胞体外增殖实验。EXO_OVA(10μg/ml)和其双倍稀释物与数量恒定的原始OTI CD8⁺T细胞(1×10⁵细胞/孔)培养。为检测被DC摄取的EXO_OVA的pMHCI复合物是否有功能，成熟DC(0.3×10⁵个细胞/孔)和不成熟DC(0.3×10⁵细胞胞/孔)与EXO_OVA及其两倍稀释物共培养4小时，然后将恒定数量的原始OTICD8⁺T细胞(1×10⁵细胞/孔)加入每孔中。为检测分子机制，在OTI CD8⁺T细胞加入之前，一系列试剂：抗-H-2K^b、LFA-1抗体和CTLA-4/Ig融合蛋白(10μg/ml)，上述试剂复合物(作为复合试剂)和同型匹配的非相关抗体复合物(作为对照组)分别加入成熟DC和不成熟DC培养液中，培养48小时后，用³H-thymdine结合法检测(30)。

EXO导向的DC体外刺激天然CD8⁺T细胞增殖的结果见图3。既然EXO包含有免疫分子，它们就有刺激CD8⁺T细胞的潜在功能(35)。(A)CD8⁺T细胞体外增殖实验。EXO_OVA(10μg/ml)、DC_OVA、mDC_EXO和imDC_EXO(0.3×10⁵细胞/孔)和他们两倍稀释物与一定数量的OTI CD8⁺T细胞(1×10⁵细胞/孔)共培养。2天后用³H掺入法测定CD8⁺T细胞的增殖效应。(B)通过加入中和试剂(包括抗H-2K^b和LFA-1抗体、CTLA-4/IgG融合蛋白)，中和试剂混合物和对照抗体和融合蛋白的混合物测定mDC_EXO对OTI CD8⁺T细胞增殖的影响。进行比较并进行Student′s T检验(40)。结果^*p值小于0.05，说明实验组和对照组有显著差异。图为3次重复实验中的一次。图3A显示，EXO_OVA可刺激OTI小鼠CD8⁺T细胞体外增殖，但其效率低于DC_OVA、成熟DC_EXO和不成熟DC_EXO，说明EXO要更有效的激活天然CD8⁺T细胞需要DC的参与。其中，摄取了EXO的成熟DC可称为EXO导向的成熟DC是最有效的刺激物。为了研究CD8⁺T细胞增殖的分子机制，在细胞培养中加入了一系列的试剂，结果如图3B，抗MHCI、抗LFA-1抗体和CTLA-4/Ig融合蛋白在共培养过程中可以显著抑制OTI小鼠CD8⁺T细胞增殖，其抑制率分别为62％、49％和56％(p＜0.05)。其混合试剂组对CD8⁺T细胞增殖的抑制率高达95％(p＜0.05)，说明经由EXO导向的树突细胞对CD8⁺T细胞增殖严格的依赖于pMHCI/TCR的特异性，并且受协同刺激分子(CD80/CD28和CD54/LFA-1)的影响。

7)四聚体(Tetramer)染色

C57BL/6或CD4基因敲除小鼠分别用EXO_OVA(10μg/只老鼠)，4,000rad辐照处理的DC_OVA、mDC_EXO和imDC_EXO(0.5×10⁶细胞/只)静脉注射免疫。6天后从免疫鼠尾收取血样本，血样本与10μl PE-标记的H-2K^b/OVA_257-264Tetramer和FITC标记的抗CD8(PK135)在室温下孵育30min。用裂解缓冲液溶解红细胞后，细胞用流式细胞仪检测。

EXO导向的DC体内刺激CD8⁺T细胞增殖的结果见图4。野生型CD57BL/6(B6)和CD4基因敲除小鼠分别静脉注射EXO_OVA、辐照处理的DC_OVA、mDC_EXO和imDC_EXO，6天后，小鼠断尾取血，做流式细胞仪检测。每组代表tetramer阳性CD8⁺T细胞群占总CD8⁺T细胞群的百分率。结果为每组4个样本中的一个。实验重复3次。为了确认EXO导向的DC在体内也可以刺激CD8⁺T细胞增殖，本发明者使用Tetramer染色进行研究(37)。图4显示，EXO_OVA在免疫6天后只能诱导小鼠1.42％，Tetramer阳性的CD8⁺T细胞(占所有CD8⁺T细胞群的比例)，说明EXO_OVA可在体内激活天然的抗原特异性CD8⁺T细胞应答，但与DC_OVA所产生的2.88％Tetramer阳性的CD8⁺T细胞相比，激活能力较低。然而成熟DC_EXO诱导的CD8⁺T细胞应答最强，Tetramer阳性的CD8⁺T细胞比例最高为3.36％，说明EXO定向的DC可在体内有效的启动天然CD8⁺T细胞增殖。结果也显示DC_OVA、成熟DC_EXO和不成熟DC_EXO，均可在CD4基因敲除的小鼠中刺激OVA特异性的CD8⁺T细胞增殖(Tetramer阳性的CD8⁺T细胞占所有CD8⁺T细胞群的比例分别为0.42％、0.68％和0.32％)，而EXO_OVA无此作用。说明DC_OVA、成熟DC_EXO和不成熟DC_EXO诱导的主要是CD4⁺Th依赖型的CD8⁺细胞反应，同时也诱导一些CD4⁺Th非依赖型的CD8⁺细胞反应。

8)细胞毒性实验

在免疫6天后，上述的免疫小鼠的脾脏细胞和4,000rad辐照处理过的EG7共培养3天，获得CTL作为效应细胞，肿瘤细胞EG7由⁵¹Cr标记后作为靶细胞，而⁵¹Cr标记的EL4细胞作为对照靶细胞，随后进行细胞毒性实验(27)。

EXO导向的DC刺激CD8⁺T细胞增殖成CTL效应细胞的结果见图5。在体外细胞毒性实验中，天然的OTI CD8⁺T细胞(2×10⁵细胞/mL)与分别与EXO_OVA(10μg/mL)或辐照处理的(4,000rads)DC_OVA、mDC_EXO和imDC_EXO(0.6×10⁵cells/ml)孵育激活3天。这些激活的CD8⁺T细胞被用作效应细胞(E)，而⁵¹Cr-标记的EG7或对照EL4肿瘤细胞作为靶细胞(T)，特异性的杀伤按以下公式计算：100×[(实验组cpm-自发cpm)/(最大cpm-自发cpm)]。⁵¹Cr释放量测定中数据表示特异性靶细胞的裂解百分率。每个点代表3次的平均值，实验重复3次。显示，在细胞毒实验中，被EXO_OVA体外激活的CD8⁺T细胞显示出对EG7肿瘤细胞的杀伤活性(25％杀伤，E∶T比例为12∶1)，但远低于被DC_OVA、成熟DC_EXO和不成熟DC_EXO所激活的CD8⁺T细胞的杀伤率(50％、58％和39％，E∶T比例为12∶1)。说明mDC_EXO能最有力地刺激CTL的反应。然而，这些CTL对其亲本细胞EL4肿瘤细胞没有杀伤活性，说明这种CTL的杀伤活性是具有OVA特异性的。

9)动物实验

为检测抗肿瘤免疫的保护效应，野生型的CD57BL/6，CD4基因敲除和CD8基因敲除小鼠(n＝8)分别静脉注射EXO_OVA(10μg/只)，4,000rad辐照处理的DC_OVA(0.05-0.5×10⁶细胞/只)，mDC_EXO(0.05-0.5×10⁶细胞/只)，imDC_EXO(0.5×10⁶细胞/只)。免疫后的小鼠分别在免疫后6天或3个月，静脉注射BL6-10_OVA。动物实验结果见表1。

为检测肿瘤的治疗效果，野生型CD57BL/6小鼠(n＝15)先静脉注射0.5×10⁶BL6-10_OVA肿瘤细胞，5天后小鼠静脉注射辐照的DC_OVA和mDC_EXO(1×10⁶细胞/只)。小鼠在肿瘤细胞注射四周后处死，计数肺部的黑色素瘤的克隆数。转移到健康肺部的肿瘤呈岛状分布，显现出独立分散黑色斑点，很容易与正常的肺组织区分。转移的黑色斑点太多而无法计数的就指定为＞100。动物实验结果见表1。

为进一步证实对已形成肺转移的肿瘤治疗效果，野生型C57BL/6小鼠(n＝15)先静脉注射BL6-10_OVA肿瘤细胞，5天后再分别静脉免疫DC_OVA和mDC_EXO细胞，接踵后4星期，同样处死小鼠。对肺转移肿瘤克隆数进行计数，并用非参数秩和检验(Mann-Whitney Utest)。动物实验结果见表1。

表1  EXO导向的DC有抗肺肿瘤转移的免疫保护

	疫苗	肿瘤细胞攻击	肿瘤生长率(％)	肺部黑色素瘤的平均克隆数
					实验I	DCOVAEXOOVAmDCEXOimDCEXOPBSDCOVAmDCEXODCOVA(CD4KO)mDCEXO(CD4KO)DCOVA(CD8KO)mDCEXO(CD8KO)	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10BL6-10BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVA	0/8(0)3/8(37)0/8(0)2/8(25)8/8(100)8/8(100)8/8(100)2/8(25)1/8(12)8/8(100)8/8(100)	027±6016±5＞100＞100＞10015±713＞100＞100
实验II	0.5×106DCOVA0.2×106DCOVA0.1×106DCOVA0.05×106DCOVA0.5×106mDCEXO0.2×106mDCEXO0.1×106mDCEXO0.05×106mDCEXOPBS	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVA	0/8(0)2/8(25)4/8(50)8/8(100)0/8(0)0/8(0)1/8(12)3/8(37)8/8(100)	015±628±955±140016*17±8*＞100

表1  续

	疫苗	肿瘤细胞攻击	肿瘤生长率(％)	肺部黑色素瘤的平均克隆数
					实验III	DCOVAmDCEXOPBS	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVA	8/15(53)2/15(13)15/15(100)	35±109±7*＞100

在表1实验I中，结果显示，所有注射PBS的小鼠都有大量的肺肿瘤转移灶(＞100)。EXO_OVA免疫组与不成熟DC_EXO免疫组相似，保护率分别为63％(5/8)和75％(6/8)，而DC_OVA和成熟DC_EXO疫苗对BL6-10_OVA肿瘤细胞完全免疫保护，保护率均为100％(8/8)。通过观察成熟DC_EXO对不表达OVA的BL6-10肿瘤细胞没有任何保护。即肿瘤细胞注射后，所有小鼠都有大量的肺肿瘤转移灶(＞100)，说明了所有的免疫保护都具有OVA肿瘤抗原特异性。DC_OVA和成熟DC_EXO的保护性免疫在CD4基因敲除小鼠中仍有保留，但在CD8基因敲除小鼠中则完全丢失，说明成熟DC_EXO抗肿瘤免疫是通过CD8⁺细胞介导的。

在表1实验II中，结果显示，用在mDC_EXO免疫组小鼠的肺部平均肿瘤克隆数和在DC_OVA免疫组的相比，并用非参数秩和检验(Mann-Whitney U test)，^*p值小于0.05，说明和同类DC_OVA免疫组相比，在mDC_EXO免疫组所见肺部平均肿瘤克隆数的减少是有统计学上显著性意义的。同时，结果显示，成熟DC_EXO在较低剂量时(每只小鼠0.05-0.2×10⁶)比DC_OVA保护率高，尽管两者在高剂量时(0.5×10⁶)对BL6-10_OVA肿瘤都具有100％的免疫保护，说明成熟DC_EXO比DC_OVA诱导的抗肿瘤免疫更强。

在表1实验III中与免疫组47％(7/15)相比，mDC_EXO免疫组87％(13/15)的小鼠，肺转移肿瘤完全消失，mDC_EXO免疫组所见肺部平均肿瘤克隆数也远比在DC_OVA免疫组中的为少(p＜0.05)。以上结果说明，EXO导向的成熟的mDC_EXO比DC_OVA更有效地清除已存在的肺转移肿瘤。

为进一步证实对已有皮下肿瘤的治疗效果，C57BL/6小鼠(n＝10)皮下注射0.3×10⁶BL6-10_OVA肿瘤细胞。4天后当肿瘤形成可触及的小块(直径约3mm)，小鼠皮下免疫辐照处理的DC_OVA和mDC_EXO(1.0×10⁶细胞/只老鼠)。监每天观察瘤生长状况，用游标卡尺测量肿瘤大小直到4周。出于人道主义考虑，所有带有1.5cm直径肿瘤的小鼠均处死。

EXO导向的DC清除肿瘤结果见图6。C57BL/6小鼠(n＝10)皮下接种0.3×10⁶BL6-10_OVA肿瘤细胞，4天后，当肿瘤可触及(直径3mm)，小鼠皮下免疫经辐照处理的DC_OVA和mDC_EXO，监测动物死亡率，并进行组间比较和用Log秩检验(40)。结果^*p值小于0.05，说明在对已形成肿瘤的治疗中，mDC_EXO优于DC_OVA组的差别有显著性意义。实验重复2次，结果相似。结果显示，PBS对照组的所有小鼠肿瘤细胞接种后16天全部死亡，DC_OVA免疫组肿瘤生长延缓，但不能免疫抑制已有肿瘤生长，所有小鼠在肿瘤细胞接种后3周全部死亡(10/10)。而成熟DC_EXO免疫组成功地治愈30％(3/10)已带有肿瘤生长的小鼠，说明成熟DC_EXO不但可以诱导比DC_OVA更强的抗肿瘤免疫保护，还可以诱导对已有肿瘤的治疗效应。

实施例2囊泡导向的T细胞的制备

1.材料(材料、细胞和动物)

卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司；OVAI(SIINFEKL)和OVAII(ISQAVHAAHAEINEA-GR)分别是针对H-2K^b和Ia^b特异性多肽(28，29)；MutI多肽是针对非相关3LL肺癌特异性的多肽，所有的肽均由多肽系统合成；生物素标记和FITC荧光标记的H-2K^b(AF6-88.5)，Ia^b(AF6-120.1)，CD3(145-2C11)，CD4(GK1.5)，CD8(53-6.7)，CD11c(HL3)，CD25(7D4)，CD40(IC10)，CD44(IM7)，CD54(3E2)，CD62L(MEL-14)，CD69(H1.2F3)，CD80(16-10A1)，IL-7R(4G3)和Vα2Vβ5⁺TCR(MR9-4)以及FITC结合的生物素均购自Pharmingen公司；抗H-2K^b/OVAI(pMHCI)复合物抗体由NIH的German博士提供(31)；抗LFA-1，IL-2，IFN-γ，TNF-α抗体，和细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4/Ig)融合蛋白；重组鼠的IL-4和GM-CSF购自R&D；CFSE从molecular Probe公司获得。高度肺癌转移的BL/6-10和OVA转基因的BL6-10(BL6-10_OVA)黑色素瘤细胞系由本室制备(27)；鼠EL4和OVA转基因的EL4(EG7)胸腺瘤细胞系来自ATCC。雌的C57BL/6(B6；CD45.2⁺)，C57BL/6.1(B6.1；CD45.1⁺)，OVA特异的T细胞受体(TCR)转基因的OTI和OTII小鼠，在C57BL/6背景下H-2K^b，Ia^b-，IL-2，IFN-γ，TNF-α，CD54和CD80基因敲除小鼠均从Jackson实验室获得。纯合子的OT II/H-2K^b-/-，OT II/CD54^-/-，OTII/CD80^-/-，OT II/IL-2^-/-，OTII/IFN-γ^-/-和OTII/TNF-α^-/-小鼠由相应的基因敲除小鼠与OTII小鼠回交三代所得。所有动物按萨斯卡通大学动物管理委员会条理饲养。

2.步骤

1)脾脏DC的获得

小鼠脾脏来源的DC，按前面实验所述(37)，简之，脾脏细胞用含有5mMEDTA的洗涤，在含有7％FCS的培养液中37℃孵育2小时，轻轻摇晃后去除未贴壁细胞，贴壁细胞继续在1％正常鼠血清，GM-CSF(1ng/ml)，OVA(0.2mg/ml)的培养基中培养过夜。这些DC被称为脾DC_OVA。来源于H-2K^b，CD54和CD80基因敲除小鼠的DC分别被命名为(K^b-/-)DC_OVA，(CD54^-/-)DC_OVA和(CD80^-/-)DC_OVA。

2)EXO的准备

骨髓来源和OVA装载的DC_OVA释放的囊泡(EXO_OVA)和CFSE标记的EXO_CFSE的准备与纯化按照实施例1所述。

3)CD4⁺T细胞的准备

从具有对OVA有特异性的T细胞受体的转基因小鼠OTI和OTII的脾脏中分离天然的OVA特异性自然T细胞(nT)。通过尼龙柱后，用抗小鼠CD8或CD4的微珠(Dynal Inc)(27)进行阴性选择，分别获得纯度＞98％的CD4⁺/Vα2Vβ5⁺或CD8⁺/Vα2Vβ5⁺细胞群。为了得到激活的OTII CD4⁺T细胞，来自OTII小鼠的脾脏细胞在含有IL-2(20U/ml)和ConA(1μg/ml)的RPMI1640培养基中培养3天(27)，ConA激活的CD4⁺T细胞(aT)按上述程序纯化。

4)CD4⁺T细胞对EXO分子的摄取

首先，将CD4⁺nT和aT细胞与EXO_CFSE(10μg/1×10⁶T细胞)在0.5-1ml含有IL-2(10U/ml)的AIM-V细胞培养液中，37℃孵育4小时，其间每20分钟将细胞摇匀一次。用PBS洗涤2遍后，用流式细胞仪分析CFSE染色。另外一组实验，用CD4⁺的nT和aT细胞与EXO_6.1共培养，然后分析CD45.1分子的表达。

为了进一步测定EXO分子向T细胞的转移，来源于OTII小鼠或不同基因敲除的OTII小鼠的CD4⁺nT和aT细胞与EXO_OVA孵育，流式细胞仪分析H-2K^b，CD54，CD80和pMHCI的表达。阻断实验是用来自于H-2K^b基因敲除小鼠的CD4⁺T细胞分别在冰上与抗-H-2K^b和Ia^b抗体(12μg/ml)或CTLA-4/Ig(12μg/ml)孵育30分钟，然后与EXO_OVA37℃共培养4小时。收获细胞，流式细胞仪分析H-2K^b的表达。CD4⁺nT和aT细胞与EXO_OVA共培养后得到的T细胞分别命名为nT_EXO和aT_EXO。来自H-2K^b、CD54、CD80、IL-2、IFN-γ和TNF-α基因敲除小鼠的CD4⁺aT细胞与EXO_OVA共培养后分别被命名为CD4⁺aT_EXO(K^b-/-)、aT_EXO(CD54^-/-)、aT_EXO(CD80^-/-)、aT_EXO(IL-2^-/-)、aT_EXO(IFN-γ^-/-)、aT_EXO(TNF-α^-/-)；aT_EXO(K^b-/-)、aT_EXO(CD54^-/-)和aT_EXO(CD80^-/-)细胞的细胞因子表达谱与aT_EXO细胞相似，aT_EXO(IL-2^-/-)，aT_EXO(IFN-γ^-/-)和aT_EXO(TNF-α^-/-)细胞的细胞因子表达谱除了特定的细胞因子(IL-2或IFN-γ或TNF-α)缺陷外，其他的细胞特征也与aT_EXO细胞相似。

CD4⁺T细胞以抗原特异性和非特异性两种方式摄取EXO的结果见图7。流式细胞仪分析(a)OVA装载(pulsed)的DC_OVA和DC_OVA衍生的EXO(EXO_OVA)被一系列抗体染色(实线)，然后用流式细胞仪分析，说明实验组与对照组(control reagent)有显著差异。同时用同型匹配的无关抗原染色作为对照(细虚线)。(b)来源于OT II小鼠的天然型CD4⁺T(nT)和激活型的T(aT)细胞被一系列抗体染色(粗实线)或用同型匹配的无关抗体染色作为对照(细虚线)后流式细胞仪分析。实验重复2次，结果相似。结果显示，与有OVA装载(pulsing)的DC_OVA相似，DC_OVA释放的EXO_OVA表面也检测到MHCI(Kb)和class II(Ia^b)，CD11c，CD40，CD54，CD80和pMHCI复合物，只是表达量比DC_OVA低(图7a)。来自转OTII基因小鼠的nT和aT细胞也表达CD4和TCR分子(图7b)。CD4+aT细胞表达激活T细胞的标记分子(CD25和CD69)，但CD4⁺nT细胞不表达，而且他们分泌IL-2(～2.4ng/ml每10⁶细胞/24小时)，IFN-γ(～2.0ng/ml每10⁶个细胞/24小时)和TNF-α(～1.7ng/ml每10⁶个细胞/24小时)，但不分泌IL-4和IL-10，说明这些细胞属于Th1细胞。

T细胞摄取EXO的结果及CD4⁺T细胞通过摄取EXO获得pMHCI和协同刺激分子的结果见图8。为证实T细胞对EXO的摄取，来自OTII和C57BL/6小鼠的CD4⁺nT和aT细胞与EXO_CFSE共同孵育，然后用流式细胞仪检测。(a)已摄取EXO_CFSE(粗实线)和不摄取EXO_CFSE(细虚线)的天然和激活OTII和C57BL/6 CD4⁺T细胞，流式细胞分析CFSE的表达。(b)阻断实验，激活的OTII CD4⁺aT细胞与分别抗Ia^b，LFA-1抗体和CTLA-4/Ig融合蛋白，这些试剂混合物或匹配同型的抗体在冰上孵育30min，在和EXO_CFSE 37℃孵育4小时后，分析CFSE阳性T细胞，和在不同情况下T细胞的CFSE的表达进行比较并用Student′s T检验。结果^*p值小于0.05，说明抗Ia^b和LFA-1抗体对阻断T细胞摄取EXO有显著意义。已摄取(粗实线)和未摄取(细实线)EXO_OVA的天然的(c)和激活的(e)OTII D4⁺T细胞，用一系列抗体染色或用不相关的同型匹配的抗体作为对照(细虚线)进行流式细胞仪分析H-2K^b，CD54，CD80和pMHCI的表达。天然的(d)和激活的(f)OTII CD4⁺T细胞来源于具有相应基因缺陷的OTII小鼠，也进行相同的染色及流式细胞仪分析。实验重复2遍。结果相似。如图8a所示，和野生型的B6小鼠CD4⁺aT细胞一样，转基因OTII小鼠的CD4⁺nT和aT细胞均可检测到染色的CFSE，但B6小鼠CD4⁺nT细胞则检测不到。为探究摄取EXO的分子机制，我们用一系列的试剂来进行阻断实验。结果如图8b，抗Iab和LFA-1抗体可以阻断EXO的摄取，而CTLA-4/Ig融合蛋白和抗H-2Kb抗体则无此功能，说明CD4⁺T细胞对EXO的摄取是通过OVA特异的Iab/TCR和非特异的CD54/LFA-1相互作用共同介导的，这与以前的报道一致(25，26)。

图8c和8e显示，与上述转移CFSE染色相似，其他的EXO分子如MHCI，CD54和CD80也转移到OTII CD4⁺nT和aT细胞上。另外，OVA特异性的CD8⁺CTL激活的关键因子pMHCI复合物也转移到CD4⁺T细胞表面。因为原来的CD4⁺T细胞，特别是CD4⁺aT细胞也表达上述一些囊泡上的分子，那么首先要确定这些分子表达的提高是否是内源性的上调还是外源性的摄取。因此本发明者用带有不同基因敲除的OTII CD4⁺T细胞与EXO孵育，然后用流式细胞仪分析。结果如图8d和8f所示，原来的带有不同基因敲除的OTIICD4⁺nT和aT细胞分别不表达其内源性的H-2K^b，CD54和CD80。而在摄取了EXO_OVA后，每种细胞都表达外源的H-2K^b，CD54和CD80分子，说明CD4⁺T细胞表达上述分子的升高与摄取EXO相关。

通过使用带有不同基因敲除的aT_EXO去观察其对OVA特异的CD8⁺T细胞的刺激作用。本发明者发现aT_EXO(IL-2^-/-)(0.24％)和aT_EXO(CD80^-/-)(0.31％)细胞的CD8⁺T细胞应答基本丢失，但aT_EXO(IFN-γ^-/-)(2.15％)，aT_EXO(TNF-α^-/-)(2.13％)和aT_EXO(CD54^-/-)(2.31％)的变化不大。说明aT_EXO对CD8⁺T细胞应答刺激效应是通过IL-2介导的并通过囊泡来源的CD80协同刺激而获得。同时结果显示，aT_EXO(K^b-/-)细胞与其具有相同的细胞因子谱的aT_EXO细胞相比，由于它并没有如aT_EXO具有所获得的pMHCI复合物，它也完全失去了协同刺激功能(0.11％)。这说明aT_EXO的协同刺激功能是通过获得囊泡来源的pMHCI复合物在体内能特异性的将aT_EXO的刺激功能传递给CD8⁺T细胞。以上这些结果可以说明，EXO导向的CD4⁺T细胞的刺激效应是通过IL-2介导并由囊泡来源CD80协同刺激而获得，并且这种刺激效应是通过获得囊泡来源的pMHCI复合体使其在体内能特异性传递给CD8⁺T细胞。

5)T细胞增殖实验

为了确定CD4⁺nT_EXO和aT_EXO细胞的功能，我们进行了CD8⁺T细胞增殖实验。将CD4⁺nT_EXO和aT_EXO细胞(0.3×10⁵个细胞/孔)及其两倍的稀释物与OTI CD8⁺T细胞(1×10⁵个细胞/孔)共培养。为了检测分子机制，用抗H-2K^b，I-A^b和LFA-1抗体和CTLA-4/Ig融合蛋白(10μg/ml)和这些试剂的混合物，以及同型匹配的不相关的抗体混合物作为对照试剂分别加入细胞培养液中。培养3天后，用³H-thymdine结合法检测(27)。

EXO导向的CD4⁺T细胞激活天然CD8⁺T细胞的体外增殖见图9。(a)CD8⁺细胞体外增殖实验EXO_OVA(10μg/ml)、DC_OVA、nT_EXO、aT_EXO和Con A-activated OTII T(aT)细胞以及他们的2倍稀释物与定量的OT I CD8⁺T细胞共培养3天，³H掺入法分分析CD8⁺T细胞的增殖。(b)通过加入单种中和试剂(包括抗K^b、I-A^b、LFA-1、IL-2、IFN、TNF-α抗体及CTLA-4/Ig融合蛋白，中和试剂混合物，对照抗体和融合蛋白混合物测定其对aT_EXO刺激OTI CD8⁺T细胞增殖的影响，比较并用Student′s T检验(40)，结果^*，p＜0.05，说明实验组与对照组有显著差异。图9a所示，EXO_OVA可以激活CD8⁺T细胞在体外增殖，但与DC_OVA相比激活程度低，这与Hwang等的先前报道一致(25，26)。然而，EXO导向的aT_EXO与DC_OVA相比，可更强的激活CD8⁺T细胞增殖，而天然的nT_EXO刺激效果相对较弱。为研究CD8⁺T细胞增殖的分子机制，将一系列的试剂加入细胞培养基中，结果如图9b所示，与抗Ia^b，IFN-γ和TNF-α抗体没有显著影响相比，抗H-2K^b，LFA-1，IL-2抗体和CTLA-4/Ig，均可显著抑制CD8⁺T细胞增殖，抑制率分别为49％，52％，62％和49％(p＜0.05)。结果说明CD8⁺T细胞增殖严格依赖OVA特异的pMHCI/TCR相互作用，并受非特异性协同刺激分子(CD80/CD28和CD54/LFA-1)的影响。

6)Tetramer染色

C57BL/6小鼠分别静脉注射4000rad辐照处理的DC_OVA，nT_EXO，aT_EXO(3×10⁶细胞/只老鼠)。在免疫后6天，对上述小鼠断尾取血100μl。血样本与PE-H-2K^b/OVA_257-264Tetramer和FITC-标记的抗CD8抗体在室温结合30分钟，用裂解/固定缓冲液裂解红细胞，细胞用PBS缓冲液洗涤两次，流式细胞仪分析。免疫三个月后，再断尾取血，用PE-Tetramer，和FITC-标记的抗CD8抗体进行染色，然后用流式细胞仪检测OVA特异型的CD8⁺Tm免疫记忆细胞。

EXO导向的CD4⁺T细胞在C57BL/6小鼠体内激活非CD4⁺T细胞依赖的CD8⁺T细胞增殖见图10。野生型或Ia^b-/-基因敲除小鼠分别静脉注射辐照处理的(a)DC_OVA、nT_EXO、aT_EXO和(b)各种基因敲除的aT_EXO。免疫6天后，断尾取血与PE-H-2K^b/OVAI tetramer和FITC-anti-CD8抗体孵育，用流式细胞仪检测。实验值表示tetramer阳性CD8⁺T细胞占总CD8⁺T细胞的百分率。括号内的值表示标准差。实验重复2遍。结果相似。野生型或MHCII(Ia^b)基因敲除小鼠在免疫6天后，用Tetramer染色来检测小鼠体内OVA特异的CD8⁺T细胞应答反应。图10a所示，DC_OVA，aT_EXO和nT_EXO细胞刺激H-2K^b/OVA_257-264 Tetramer阳性CD8⁺T细胞数分别占野生型C57BL/6小鼠脾脏总CD8⁺T细胞的1.03％，2.24％和0.86％。说明aT_EXO在三种刺激物中效果最强。图10b所示，在缺少CD4⁺T细胞的Ia^b基因敲除小鼠中，只有aT_EXO仍然可以刺激OVA特异的CD8⁺T细胞应答(2.01％)，说明aT_EXO诱导的CD8⁺T细胞应答是非CD4⁺T细胞依赖的，反之那些DC_OVA和nT_EXO是CD4⁺T细胞依赖的。

7)动物实验

为检测EXO导向的CD4⁺T细胞的抗肿瘤免疫保护作用，对野生型C57BL/6，缺少CD4⁺或CD8⁺T细胞的Ia^b或K^b基因敲除小鼠(n＝8)，分别静脉注射EXO_OVA(10ug/只老鼠)，4000rad辐照处理的DC_OVA，nT_EXO，和aT_EXO或aT_EXO(1×10⁶/只老鼠)，对照组注射PBS。野生型C57BL/6小鼠也分别静脉注射4000rad辐照处理的来自不同基因敲除小鼠的aT_EXO细胞(1×10⁶/只老鼠)免疫，免疫后6天，小鼠静脉注射0.5×10⁶BL6-10_OVA或BL6-10肿瘤细胞来检测抗肿瘤免疫反应。小鼠在注射肿瘤细胞后4周处死，计数肺部的黑色素瘤的克隆数。转移到健康肺部的肿瘤呈岛状分布，显现出独立分散黑色斑点，很容易与正常的肺组织区分。转移的黑色斑点太多而无法计数的就指定为＞100(27)。实验结果见表2。

为阐明基因缺陷的aT_EXO细胞用于免疫的分子机制。我们用带有不同基因敲除的aT_EXO去免疫小鼠，野生型C57BL/6小鼠(n＝8)用具有不同基因缺陷的aT_EXO免疫。6天后，每只小鼠静脉接种BL6-10_OVA肿瘤细胞。肿瘤细胞接种后4周，处死小鼠，对肺转移肿瘤克隆数进行计数。实验数据为重复三次中有代表性的一次。实验结果见表2。

表2.EXO导向的CD4+T细胞有抗肺肿瘤转移的免疫保护

	疫苗	肿瘤细胞攻击	肿瘤生长发生率(％)	肺部黑色素瘤的平均克隆数
					实验I	DCOVAnTEXOaTEXOEXOOVAPBSnTEXOaTEXOPBS	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10BL6-10BL6-10	2/8(25)3/8(37)0/8(0)3/8(37)8/8(100)8/8(100)8/8(100)8/8(100)	17±619±10027±6＞100＞100＞100＞100
实验II	aTEXO(B6)aTEXO(IabKO)aTEXO(KbKO)	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVA	0/8(0)1/8(12)8/8(100)	08＞100
					实验III	aTEXO(IL-2-/-)aTEXO(IFN-γ-/-)aTEXO(TNF-α-/-)aTEXO(CD80-/-)aTEXO(CD54-/-)aTEXO(Kb-/-)	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVA	7/8(88)0/8(0)0/8(0)5/8(63)0/8(0)7/8(88)	38±200027±13034±19

在表2实验I中，结果显示EXO导向的CD4⁺T细胞在C57BL/6小鼠体内诱导强的抗肿瘤免疫显示所有接种PBS的小鼠都有大量的肺肿瘤转移灶(＞100)。aT_EXO免疫组对BL6-10_OVA肿瘤细胞(0.5×10⁶个细胞/只老鼠)完全免疫保护，保护率为100％(8/8)，而DC_OVA和nT_EXO免疫组或EXO_OVA的保护率分别为75％(6/8)和63％(5/8)，说明CD4⁺aT_EXO可以诱导比脾DC_OVA或骨髓来源的DC释放的囊泡EXO_OVA更强的抗肿瘤免疫应答。保护的特异性通过观察aT_EXO对不表达OVA的肿瘤细胞BL6-10没有免疫保护作用而确认。所有的小鼠都有大量的肺肿瘤转移灶(＞100)。

在表2实验II中，结果显示大部分缺失CD4⁺T细胞的Ia^b基因敲除小鼠仍被免疫保护(7/8)，而所有缺失CD8⁺T细胞的H-2K^b基因敲除小鼠都有大量的肺肿瘤转移灶(8/8)，这样就肯定了aT_EXO诱导的抗肿瘤免疫是不依赖CD4⁺Th细胞的结论。

在表2实验III中，我们发现用aT_EXO(IEN-γ^-/-)-，aT_EXO(TNF-α^-/-)-和或aT_EXO(CD54^-/-)免疫的小鼠(8/8)均没有肺转移肿瘤，而用aT_EXO(IL-2^-/-)-(7/8)和aT_EXO(CD80^-/-)(5/8)免疫小鼠，有时会有免疫遗漏(如表2实验II所示)。说明在体内刺激CD8⁺T细胞应答时aT_EXO分泌IL-2并获得CD80协同刺激发挥重要作用，而IFN-γ，TNF-α和CD54则不是必须的，这与本发明者在图10中所示的数据是一致的。同时结果显示大多数缺陷pMHCI的aT_EXO(pMHCI^-/-)细胞免疫的小鼠(7/8)都有大量的肺肿瘤转移灶(＞100)，这进一步说明aT_EXO细胞的刺激效应是通过获得囊泡来源的pMHCI复合体使其在体内能特异性的将aT_EXO的刺激功能传递给CD8⁺T细胞。

实施例3工程化的囊泡导向的T细胞的制备

1.材料(试剂、细胞和动物)

卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司；OVAI(SIINFEKL)和OVAII(ISQAVHAAHAEINEA-GR)分别是针对H-2K^b和Ia^b特异性多肽(28，29)；MutI多肽是针对非相关3LL肺癌特异性的多肽(30)，所有的肽均由多肽系统合成；生物素标记和FITC荧光标记的H-2K^b(AF6-88.5)，CD4(GK1.5)，CD25(7D4)，CD80(16-10A1)和抗OVA抗体均购自Pharmingen公司；抗H-2K^b/OVAI(pMHCI)复合物抗体由NIH的German博士提供(31)；抗IL-4和IFN-γ抗体以及重组鼠的IL-4，IL-12和GM-CSF购自R&D；OVA转基因的EG7细胞系和表达Ia^b的BL27肿瘤细胞系均购自ATCC，在10％FCS和G418(0.5mg/ml)的DMEM培养基中培养；高度肺癌转移的BL/6-10和OVA转基因的BL6-10(BL6-10_OVA)黑色素瘤细胞系由本室制备(27)；雌的C57BL/6小鼠从Jackson实验室获得；所有动物按萨斯卡通大学动物管理委员会条理饲养。

2.步骤

1)DC的获得

按实施例1实施例2所述，骨髓来源的成熟DC准备获得后，用0.2mg/mlOVA蛋白激活过夜。这些DC被称为DC_OVA。

2)pcDNA-CD80表达载体的构建

用RNA试剂盒从DC中抽提总RNA，利用RT-PCR法从DC细胞的cDNA文库中用PFU酶克隆一段1000bp的鼠CD80分子开放可译框架的cDNA片段。PCR的上下游引物分别为；上游引物：5-ctcca ttggc tctag attcc-3；下游引物：5-cctca tgagc cacat aatac-3。克隆的CD80 cDNA片段连接到pCR2.1载体上，形成pCR2.1/CD80，cDNA片段用双脱氧核苷酸法测序后将CD80基因酶切后(HindIII/XbaI)克隆到pcDNA3.1质粒上，形成表达载体pcDNA-CD80(38)。

3)转染细胞系EG7/CD80的产生

20×10⁶个EG7细胞重悬在0.7ml的PBS中和0.3ml含有10ug pcDNA-CD80 DNA的PBS中。用300V 125uF将pcDNA-CD80或pcDNA对照电转化到肿瘤细胞中(38)。转化的细胞在含有4mg/ml潮霉素和0.5mg/mlG418的培养基中进行筛选，筛选的EG7/CD80细胞在含有10％FCS，0.5mg/ml潮霉素和0.5mg/mlG418的DMEM培养基培养，用流式细胞仪分析CD80的表达。

4)囊泡的准备

肿瘤细胞来源的囊泡的准备和纯化按照实验I所述准备。简之，在含有0.5mg/ml潮霉素和0.5mg/mlG418的无FCS的AIM-V培养基在培养EG7细胞或EG7/CD80细胞过夜后的上清，经过1,200g离心20分钟，10,000g离心30分钟去除细胞碎片，再100,000g离心1小时沉淀囊泡。EXO沉淀用大量的PBS洗涤两次，并用100,000g离心1小时沉淀囊泡蛋白。用Bradford分析来自EG7细胞和EG7/CD80细胞的囊泡(分别命名为EXO_A和EXO_B)的蛋白浓度。

5)激活CD4⁺T细胞的准备

从C57BL/6小鼠脾脏中分离天然CD4⁺T细胞，经过尼龙柱和抗鼠CD8磁珠的阴性选择纯化。为了得到激活CD4⁺T细胞，将纯化的天然CD4⁺T细胞在含有抗CD3抗体(1ug/ml)，IL-2(20U/ml)的培养基中培养3天。为得到不同类型的T细胞，上述的天然CD4⁺T细胞在培养基中另外加IL-12(5ng/ml)/anti-IL-4抗体(5ug/ml)或IL-4/IL-10/TGF-β(10ng/ml)/抗IFN-γ抗体(5ug/ml)培养3天(39)，然后用流式细胞仪分析。激活的CD4⁺T细胞用4,000rad辐照处理过的装载有OVAII多肽的BL27肿瘤细胞重新激活，经24小时重新激活的CD4+T细胞的上清用ELISA试剂盒分析细胞因子的表达(27)。在含有IL-12(5ng/ml)/anti-IL-4抗体(5ug/ml)或IL-4/IL-10/TGF-β(10ng/ml)/抗IFN-γ抗体(5ug/ml)培养基中的CD4⁺T细胞被命名为Th₁或Th₂因为他们分别分泌IL-2(1.5ng/ml/每10⁶细胞/24小时)/IFN-rI(1.2ng/ml/每106细胞/24小时)/无IL-4/IL-10和IL-4(1.6ng/ml/每10⁶细胞/24小时)/IL-10(1.3ng/ml/每10⁶个细胞/24小时)/无IFN-γ。

6)CD4⁺T细胞对囊泡的摄取

激活的CD4⁺T细胞与EXO(10μg/l×10⁶T细胞/0.5ml AIM-V培养基)在含有IL-2(10U/ml)的培养基中培养4小时，每20分钟请轻轻摇动一次，用PBS洗涤2次，按实施例2所述用流式细胞仪分析。

EG7/CD80细胞和EG7/CD80细胞衍生的囊泡的表型分析结果见图11。EG7和改造过的EG7/CD80肿瘤细胞用一系列抗体染色，流式细胞仪分析。(A)EG7和表达CD80的EG7/CD80肿瘤细胞(实线)，(B)EG7/CD80和EG7肿瘤细胞衍生的囊泡(EXO_A and EXO_B)(实线)被一系列抗体染色，流式细胞仪分析。这些细胞和囊泡也被同源匹配的无关抗体染色，以作为对照(细虚线)。实验重复2遍。结果相似。结果显示，EG7和EG7/CD80肿瘤细胞表达相似数量的MHCI、OVA和pMHCI复合物。但EG7/CD80细胞表达CD80，而EG7细胞不表达CD80。图11B显示，MHCI(K^b)，OVA，pMHCI复合物和CD80在EG7/CD80肿瘤细胞衍生的EXO表面表达，而与EG7/CD80衍生的EXO相比，EG7细胞衍生的EXO表达的浓度较低，而且与EG7细胞相同，都不表达CD80。

CD4⁺T细胞通过摄取EXOA来获得pMHCI复合物和CD80协同刺激分子的结果见图12。激活CD4⁺T细胞(aT)和摄取了EXOA和EXOB的aT(aTEXOA and aTEXOB)(实线)分别用一系列抗体染色。这些细胞和囊泡也被同源匹配的无关抗体染色，以作为对照(细虚线)。实验重复2遍。结果相似。为研究CD4⁺aT细胞是否可摄取EXO，本发明者用aT细胞与EXO孵育4小时，然后用流式细胞仪分析这些T细胞。结果显示，原来的aT细胞表达CD4和CD25，但不表达pMHCI复合物和CD80，说明这些是活化的CD4⁺aT细胞。与EG7/CD80细胞衍生的EXO孵育后，这些aT细胞特命名为aT_EXOA的细胞表达pMHCI复合物和CD80协同刺激分子。与EG7细胞衍生的EXO孵育后，这些aT细胞特命名为aT_EXOB表达pMHCI复合物但不表达CD80协同刺激分子。既然pMHCI复合物和CD80协同刺激分子在激活OVA特异性的CD8⁺T细胞应答中发挥重要作用，那些摄取了EXO_A并表达这两个分子的aT_EXOA就可以激活CTL应答。激活的CD4⁺Th₁(分泌IL-2/IFN-γ)和Th₂(分泌IL-4/IL-10)细胞摄取了EG7/CD80细胞衍生的EXO_A或EG7细胞衍生的EXO_B分别被命名为EXO导向的aT_EXOA1和aT_EXOA2或aT_EXOB1和aT_EXOB2。

7)Tetramer染色分析

分别对C57BL/6小鼠静脉注射4000rad辐照处理过DC_OVA(1×10⁶细胞)，aT_EXOA1，aT_EXOB1，aT_EXOA2细胞(3×10⁶细胞/只)。另外，小鼠也静脉注射4,000rad辐照处理过DC_OVA(1×10⁶细胞/只)和aT_EXOA2细胞(3×10⁶细胞/只)。免疫6天后，小鼠尾部取血100μl，血液样本用PE-H-2Kb/OVA257-264 Tetramer和FITC-抗CD8抗体染色，在室温下孵育30分钟，用裂解/固定缓冲液裂解红细胞，细胞洗涤后用流式细胞仪分析。

EXO导向的CD4⁺T细胞在野生型小鼠体内激活CD4⁺T细胞依赖的CD8⁺T细胞增殖的结果见图13。小鼠分别静脉注射免疫辐照处理的DC_OVA，aTEXOA1(摄取EXOA的aTh₁细胞)，aT_EXOB1(摄取EXO_B的Th₁细胞)和aT_EXOA2(摄取EXO_A的aTh₂细胞)或DC_OVA和aT_EXOA2，免疫后7天，尾部取血，流式细胞仪分析，每组数据代表tetramer阳性CD8⁺T细胞占总CD8⁺T细胞数的百分比。结果是每组8只小鼠中代表性的数据。比较并用Student′s T检验(40)，结果*，p＜0.05，说明实验组与对照组有显著差异。实验重复3次，结果相似。DC_OVA、aT_EXO1和aT_EXO2细胞分别免疫小鼠后6天，本发明者用Tetramer染色检测OVA特异性的CD8⁺T细胞。结果显示，DC_OVA刺激H-2Kb/OVA257-26阳性CD8⁺T细胞的增殖占野生型小鼠脾CD8⁺T细胞总数的1.12％。只表达pMHCI而不表达CD80的aT_EXOB1，刺激H-2K^b/OVA257-26阳性CD8⁺T细胞失败(0.03％)。而既表达pMHCI又表达CD80的aT_EXOA1刺激H-2K^b/OVA257-26阳性CD8⁺T细胞的增殖占野生型小鼠脾CD8⁺T细胞总数的1.92％，说明由于提供包括OVA特异性的pMHCI/TCR和非特异性的协同刺激分子CD80/CD28两个信号，EXOA导向的aT_EXOA是强刺激物。其次，同样表达pMHCI又表达CD80的aT_EXOA2，因为同时分泌免疫抑制因子IL-10而不能刺激任何H-2Kb/OVA257-26阳性CD8⁺T细胞(0.02％)。而且当小鼠用DC_OVA和aT_EXOA2同时免疫后，DC_OVA刺激的CD8⁺T细胞应答(1.12％)明显被抑制(0.34％)(p＜0.05)，说明aT_EXOA2能诱导OVA特异性的免疫抑制。

8)动物实验

为检测EXO导向的CD4⁺T细胞的抗肿瘤免疫保护，野生型的C57BL/6小鼠(n＝8)分别静脉注射EXO_A或EXO_B(10ug/只)或4,000rad辐照处理过DC_OVA(1×10⁶细胞)，aT_EXOA1，aT_EXOB1，aT_EXOA2或aT细胞(3×10⁶细胞/只)。另外，小鼠也同时静脉注射4,000rad辐照处理过DC_OVA(1×10⁶细胞/只)和aT_EXOA2细胞(3×10⁶细胞/只)，注射PBS的小鼠作为对照。免疫6天后小鼠再静脉注射0.5×10⁶BL6-10_OVA或BL6-10细胞来验证抗肿瘤免疫。小鼠在注射肿瘤细胞后4周处死，计数肺部的黑色素瘤的克隆数。转移到健康肺部的肿瘤呈岛状分布，显现出独立分散黑色斑点，很容易与正常的肺组织区分。转移的黑色斑点太多而无法计数的就指定为＞100(27)。结果见表3。

表3.工程化的肿瘤细胞所衍生的EXO所导向的CD4⁺Th₁和Th₂细胞分别诱导免疫应答和免疫抑制

疫苗	肿瘤细胞攻击	肿瘤生长发生率(％)	肺部黑色素瘤的平均克隆数
				DCOVAaTEXOA1aTEXOB1aTEXOA2EXOAEXOBPBSDCOVA/aTEXOA2DCOVAaTEXOA1PBS	BL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10OVABL6-10BL6-10BL6-10	0(0)0(0)10/10(100)10/10(100)6/10(60)10/10(100)10/10(100)3/10(30)10/10(100)10/10(100)10/10(100)	00＞100＞10057±16*＞100＞10036±13*＞100＞100＞100

表3结果显示所有注射PBS的或表达pMHCI而不表达CD80的EXO_B小鼠都有大量的肺转移肿瘤灶(＞100)。既表达pMHCI又表达CD80的EXO_A的免疫组中，只有4/10(40％)的小鼠获得了抗肿瘤免疫。然而骨髓来源的DC_OVA和aT_EXOA1疫苗可诱导完全抗BL6-10OVA的免疫保护8/8(100％)，说明aT_EXOA1疫苗可诱导比EXOA更强的免疫。但是，aT_EXOA1疫苗并不能诱导不表达OVA的BL6-10肿瘤的免疫保护，说明了免疫保护的特异性。该小组所有小鼠均有大量的肺转移肿瘤灶(＞100)。然而，不表达CD80的aT_EXOB1也不能诱导保护性抗肿瘤免疫。所有小鼠均有大量的肺转移肿瘤灶(＞100)，说明CD80在抗肿瘤免疫保护中的重要作用。aT_EXOA2免疫的小鼠也没有得到任何的保护性免疫。而且，DC_OVA诱导的保护性免疫在用DC_OVA和aT_EXOA2同时免疫的小鼠中被明显抑制(p＜0.05)，说明aT_EXOA2分泌的免疫抑制因子IL-10可以诱导OVA特异性免疫抑制，这与先前报道一致(40)。本发明者所得数据清楚说明体外培养的CD4⁺的Th₁和Th₂细胞当摄取改造过的肿瘤细胞产生的表达pMHCI和CD80协同刺激分子的EXO分子后，可以诱导免疫应答和免疫抑制。而且这种途径将可以被应用到肿瘤治疗，自身免疫病和器官移植中。

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Claims (10)

1.一种免疫活性药物组合物，包含治疗有效量的囊泡导向的免疫细胞以及药用载体，所述免疫细胞选自树状细胞、T细胞、吞噬细胞、B细胞和血液白细胞，所述囊泡是直径50-90nm的细胞膜囊泡。

2.如权利要求1所述的免疫活性药物组合物，其中所述囊泡导向的树状细胞是由树状细胞摄取囊泡而形成的具有表达pMHCI及高表达CD40，CD54和CD80重要免疫分子的细胞。

3.如权利要求2所述的免疫活性药物组合物，其中所述囊泡是来自于树状细胞或工程化的树状细胞。

4.如权利要求1所述的免疫活性药物组合物，其中所述囊泡导向的T细胞是具有Th₁或Th₂特征、由CD4⁺T细胞摄取囊泡而形成的具有表达pMHCI、CD54和CD80的T细胞。

5.如权利要求4所述的免疫活性药物组合物，其中所述囊泡是来自于树状细胞或工程化的肿瘤细胞。

6.如权利要求1所述的免疫活性药物组合物，其中还包含免疫佐剂。

7.如权利要求6所述的免疫活性药物组合物，其中所述免疫佐剂包括格兰氏阴性细菌内毒素的类脂质A部分，lrehalose dimycolate或分枝杆菌、溴化磷酯、线形聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物、矿物盐如氢氧化铝、脂质体和细胞因子。

8.权利要求1所述免疫活性药物组合物的制备方法，所述免疫活性药物组合物包含囊泡导向的树状细胞，所述方法包括以下步骤：

1)骨髓来源的树突细胞的制备：骨髓细胞在高剂量GM-CSF和IL-4的作用下，产生骨髓来源树突细胞；

2)囊泡的制备：步骤1)所得的树突细胞在含有OVA蛋白的无血清AIM-V培养基中培养，离心所得上清液，得到囊泡沉淀物；

3)骨髓来源的树突细胞对囊泡的摄取：在AIM-V培养基中，将步骤1)所得树突细胞与步骤2)所得囊泡共培养，得到摄取囊泡的树突细胞。

9.权利要求1所述免疫活性药物组合物的制备方法，所述免疫活性药物组合物包含囊泡导向的T细胞，所述方法包括以下步骤：

其中由树突细胞衍生的囊泡导向的T细胞的制备，包括以下步骤：

1)ConA激活的CD4⁺T细胞的制备：在含有IL-2和ConA的RPMI1640培养基中培养脾脏细胞，分离得到ConA激活的CD4⁺T细胞，

2)囊泡的制备：在高剂量GM-CSF和IL-4的作用下，产生骨髓来源树突细胞，将此树突细胞在含有OVA蛋白的无血清AIM-V培养基中培养，离心所得上清液，得到囊泡沉淀物，

3)ConA激活的CD4⁺T细胞对所述囊泡的摄取：在含有IL-2的AIM-V培养基中，将步骤1)所得的CD4⁺T细胞与步骤2)所得的囊泡共培养，得到摄取所述囊泡的ConA激活的CD4⁺T细胞；及

由工程化肿瘤细胞衍生的囊泡导向的T细胞的制备，包括以下步骤：

1)pcDNA-CD80表达载体的构建：抽提树突细胞的RNA，用RT-PCR法克隆CD80基因，并构造pcDNA-CD80基因表达载体，

2)转染细胞系EG7/CD80的产生：将步骤1)所得表达载体转化到肿瘤细胞EG7中，获得EG7/CD80肿瘤细胞，

3)囊泡的制备：在无FCS的AIM-V培养基中，培养步骤2)所得的肿瘤细胞EG7/CD80，离心培养所得上清液，得到囊泡沉淀物，

4)CD4⁺T的激活：从脾脏中分离得天然CD4⁺T细胞，将此细胞在含有抗CD3抗体、IL-2的培养基中培养，所述培养基还包含IL-12和抗IL-4抗体，或IL-4、IL-10、TGF-β和抗IFN-γ抗体，

5)CD4⁺T对囊泡的摄取：将步骤3)所得囊泡和步骤4)所得CD4⁺T细胞，在含有IL-2的培养基中共培养，得到摄取囊泡的CD4⁺T细胞。

10.如权利要求1所述的免疫活性药物组合物在制备抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。

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