CN101084306B

CN101084306B - 过量表达和纯化的无花果曲霉氧化酶及其编码核酸

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Publication number: CN101084306B
Application number: CN2005800353271A
Authority: CN
Inventors: F·阿尔瑙特; R·孔特雷拉斯; T·多弗林; G·万内斯泰; J·维亚内; J·C·E·若里
Original assignee: Puratos NV
Current assignee: Puratos NV
Priority date: 2004-09-16
Filing date: 2005-09-15
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2025-09-15
Also published as: DE602005014251D1; ATE430191T1; WO2006029485A3; EP1789541B1; CA2579789A1; DK1789541T3; CN101084306A; EP1789541A2; CA2579789C; EP1637595A1; WO2006029485A2; US20090098243A1

Abstract

本发明涉及新的分离的核酸序列，其包含编码新的真菌氧化酶的基因，和其核酸片段。还涉及从无花果曲霉分离和纯化的所述新的真菌氧化酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO 40或41所示，和其功能等同物或衍生物。本发明也涉及包含本发明的核酸分子的构建体、载体和宿主细胞，以及生产本发明的氧化酶的方法。本发明也涉及本发明的氧化酶在工业过程中的应用。

Description

过量表达和纯化的无花果曲霉氧化酶及其编码核酸

发明领域

本发明涉及新的分离的核酸序列，其包含编码新的真菌氧化酶的基因，和其核酸片段。

还涉及从无花果曲霉(Aspergillus ficuum)分离和纯化的所述新的真菌氧化酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO 40或41所示，和其功能等同物或衍生物。

本发明也涉及包含本发明的核酸分子的构建体、载体和宿主细胞，以及生产本发明的氧化酶的方法。

本发明也涉及本发明的氧化酶在工业过程中的应用。

发明背景

氧化酶是催化许多种类的生物氧化的酶。

在这些氧化酶中，例如，漆酶(也称作多酚氧化酶；EC 1.10.3.1.；苯二酚：氧氧化还原酶)是含有多个铜的酶，其催化多种酚类化合物的氧化，伴随将O₂还原成H₂O。这些多酚氧化酶广泛分布，并由许多种以下生物生产：(1)真菌，包括：(a)子囊菌，如曲霉属，链孢霉属或足孢子菌属，(b)半知菌，如葡萄孢属，(c)担子菌，如金钱菌属，层孔菌属，香茹属，灰侧耳菌属，栓菌属，射脉菌属或密孔菌属，(d)有性形式的丝核菌属，还有(2)植物，如漆树，北美鹅掌楸，烟草或桐叶槭，以及(3)细菌，如生脂固氮螺菌。它们也广布于细菌中(Alexandre和Zhulin，2000，Tibtech 18：41)。

考虑到它们的生产者的生物多样性，氧化酶和漆酶表现出广范围的底物特异性，具有不同的氧化酚类底物的能力。因而，漆酶参与色素形成、子实体形成、致病性和木素降解及生物合成。

因为该底物特异性，氧化酶和漆酶表现出在工业应用(纸浆和纸加工，去污剂或酚聚合中的染料转移抑制)、环境应用(环境污染物解毒或废水处理)、食品应用(烘烤，酿造，预防酒变色，基于茶的食品的颜色增强，食物的脱氧，或果汁制造)和制药应用(甾族化合物和抗生素的转化)中的潜力(实例参见：Sariaslani，1989，Critic.Rev.Biotechnol.9：171；Potus et al.，1999，Industries des céreales，115：3；Lopez et al.，2002，J.Biotechnol.，99：249；Duran et al.，2002，Enz.Microbial Technol.，31：907；Minussi et al.，2002，Trends Food Sci.Technol.，13：205；Biotechnology in the pulpand paper industry，2002，Viikari et Lantto eds，Elsevier)。

取决于它们的来源，真菌漆酶具有不同的温度和pH最适条件，不同的氧化还原电位和底物特异性(Xu F.&al.，1996，BiochimBiophys Acta.1292，p.303)。已经分离了大量的真菌漆酶，且已经克隆了它们的对应基因中的大多数。在它们的氨基酸序列之间发现的相似性和强同一性表明，密切相关的序列属于作为同一种系发生群的成员的生物。这些值有时在来自相同属的不同物种的酶之间高于由相同物种生产的不同漆酶之间(Eggert et al.，1998，Appl EnvironMicrobiol.64：1766)。

取决于它们的宽范围的底物特异性，氧化酶和漆酶具有巨大的商业潜力，且以非常高的水平表达这些酶的能力对于商业目的是至关重要的。在异源真菌系统中表达漆酶基因的尝试，经常产生非常低的产率。因而，辐射射脉菌漆酶在Trichoderma reesei中的表达，仅产生20mg/升的活性酶(Saloheimo et al.，Bio/Technology 1991，9：987)，而灰盖鬼伞Lcc1漆酶在米曲霉中的表达，产生8至135mg/升(Yaveret al.，1999，lcc1.Appl Environ Microbiol.，65(11)：4943-8.)，Myceliophtora thermophila漆酶在米曲霉中的表达，产生11至19mg/升(Berka et al.，1997，Appl Environ Microbiol.63：3151)。朱红密孔菌的漆酶已经在曲霉中以约80mg/升的水平表达(SigoillotC.et al.，2004，Appl.Microbiol.Biotechnol.64：346)。

现在，仍然需要可以在本文所述的不同应用中使用的新的氧化酶。

而且，它们的对应基因在工业宿主(如曲霉)中的高水平表达非常令人感兴趣。

发明概述

本发明涉及编码无花果曲霉氧化酶的新基因的分离和表征。

已经从无花果曲霉分离了编码根据本发明的氧化酶的新基因，其长为1,923碱基对，具有2个内含子和与596个氨基酸相对应的可读框。

本发明的一个方面涉及核酸分子，其包含编码无花果曲霉氧化酶的SEQ ID NO 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11，或由其组成。

本发明的另一个方面涉及编码本发明的多肽的核酸分子。

本发明的另一个方面涉及选自下述的多核苷酸：

-核酸分子，其包含与SEQ ID NO 1至39中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、且更优选地至少95％同一性的核苷酸序列，其互补形式和RNA形式，

-编码具有氧化酶活性的蛋白的其任意片段，其互补形式和RNA形式，和

-至少15个核苷酸、优选地至少20个核苷酸、或更优选地至少25个核苷酸的其任意片段，其互补形式和RNA形式。

本发明的另一个方面涉及具有氧化酶活性的蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色显示其为约85kDa。

本发明的另一个方面涉及具有氧化酶活性的蛋白，用PNGaseF去糖基化后，分子量为约70kDa。

本发明也涉及分离的氧化酶多肽，它的氨基酸序列包含SEQ ID NO40或41或由其组成，和其具有氧化酶活性的任意片段。

本发明的另一个方面涉及分离的具有氧化酶活性的多肽，其选自：与SEQ ID NO 40或41具有至少70％、有利地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、且更优选地至少95％同一性的氨基酸序列。

本发明的另一个方面涉及经转化的细胞，例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)2024，其包含在它自己的启动子控制下表达的根据本发明的基因。

本发明的另一个方面涉及经转化的细胞，例如构巢曲霉或无花果曲霉，其包含在构巢曲霉的gpdA启动子(甘油醛-磷酸脱氢酶启动子)控制下表达的根据本发明的基因，导致所述基因的表达的数倍增加。

本发明的另一个目的涉及根据本发明的氧化酶在需要将酚类化合物氧化的食品和非食品工业应用中的用途，例如它在烘烤过程中的应用或它作为增色剂的应用，例如在茶中。

本发明的另一个目的涉及包含本发明的氧化酶多肽的面包改良组合物。

附图简述

图1描绘了来自无花果曲霉(保藏在DSMZ，登录号DSM932)的具有氧化酶活性的纯化的酶的SDS-PAGE和酶谱分析。

图2描绘了随pH而变的酶活性。

图3描绘了编码来自无花果曲霉(DSM932)的具有氧化酶活性的酶的基因的核苷酸序列，和对应的氨基酸序列。

图4描绘了用或不用根据本发明的氧化酶处理的茶溶液的吸收光谱。

图5描绘了增加量的根据本发明从无花果曲霉(DSM932)分离的氧化酶对面包体积的影响。

图6描绘了增加量的根据本发明从无花果曲霉(DSM932)分离的氧化酶对面包粘性的影响。

图7描绘了增加量的根据本发明从无花果曲霉(DSM932)分离的氧化酶对面团稠度的影响。

图8至12描绘了本发明的核苷酸和氨基酸序列。

发明详述

氧化酶编码基因

本发明提供了分离的编码氧化酶的核酸分子。

已经从以登录号DSM932保藏在DSMZ的无花果曲霉(称作无花果曲霉DSM932)分离了由SEQ ID NO 1组成的核酸分子。

也预见到等位基因变体和物种变体，它们称作同源物或同源序列。

在本发明的上下文中，同源物或同源序列是与SEQ ID NO 1至50中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、优选地至少90％、且更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同源性(或同一性)的核苷酸或氨基酸序列。

“同源性”或“同一性”指当对比2个序列时，给出的百分比值。所述的对比可以使用任何可得到的软件进行，例如Clustalw程序和默认参数值(例如可从http://www.ebi.ac.uk/clustalw得到)。

在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”或“核酸分子”指单链或双链分子，且包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)和类似物，其中核苷酸已经被替换为核苷酸类似物或衍生物。

可以从生产根据本发明的氧化酶的不同微生物中，分离由SEQ IDNO 1至39中任一或任意同源物组成或包含其的核酸，它的互补形式(或互补链)，或它的RNA形式。

所述微生物可以是细菌或真菌，包括酵母，且可以更具体地是其它曲霉物种。

可以使用确立的标准方法来分离本发明的同源序列。

这样的方法的实例包括在合适的载体中从微生物的基因组DNA构建基因文库，然后通过直接表达所述同源序列，筛选该文库。

另一种方法包括与例如本发明核酸分子的至少15个核苷酸、优选地至少20个核苷酸、且更优选地至少50个核苷酸的片段(例如SEQ IDNO 37，38或39的片段)的杂交步骤。

其它方法包括，通过分子技术，例如PCR技术，使用从本发明的核酸序列设计的寡核苷酸引物，扩增所述同源序列。

另外，存在在相对较短的时间段内得到数千个突变的序列以及评估它们的对应多肽序列的酶活性的确立的方法。这些方法包括，例如，随机诱变，高流量筛选等，且经常用于证明单个或多个突变的可能效应。

这样的突变(添加、缺失和/或置换)可以是或不是沉默的，可以产生在对分子的功能至关重要的区域之内或之外，且仍然产生具有氧化酶活性的活性蛋白(也称作功能等同物)，该活性或多或少地(即至少70％、有利地至少80％、优选地至少90％、或更优选地至少95％)类似于SEQ ID NO 40或41的多肽的氧化酶活性。

或者，可以通过本领域已知的方法，合成地制备本发明的核酸分子。本发明的核酸分子可以包括寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸等)，所以它具有例如改变的碱基配对能力或提高的对核酸酶的抗性。

本发明的核酸分子可以包括或不包括间断编码序列的内含子。

本发明的核酸分子可以是混合的基因组的、合成的和/或cDNA来源的，通过本领域已知的包括连接来自不同来源的片段的步骤的方法制备。

优选的本发明的分离的和纯化的核苷酸序列对应于SEQ ID NO 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11或其编码具有氧化酶活性的肽的片段。

所述序列SEQ ID NO 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11的片段优选地具有超过600个核苷酸、更优选地超过900个核苷酸或更优选地超过1200个核苷酸，且编码特征在于氧化酶活性的蛋白(也称作功能等同物)，所述氧化酶活性类似于SEQ ID NO 40或41的完整氨基酸序列的氧化酶活性。

优选地，所述功能等同物具有通过其SEQ ID NO 40或41的氨基酸序列定义的完整酶的初始氧化酶活性的超过70％、或超过80％的氧化酶活性，且与具有SEQ ID NO 40或41的氨基酸序列的酶相比，优选地具有至少90％的氧化酶活性。

本发明的多核苷酸选自：

-(a)核酸分子，其包含与SEQ ID NO 1至39中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、且更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，其互补形式和RNA形式，

-(b)(a)组核酸分子的编码具有氧化酶活性的蛋白的任意片段，其互补形式和RNA形式，和

-(c)(a)或(b)组核酸分子的至少15个核苷酸、优选地至少20，25，或30个核苷酸、或更优选地至少50个核苷酸的任意片段，其互补形式和RNA形式。

换而言之，根据本发明的核酸分子可以包含下述序列或由其组成：

-SEQ ID NO 1至39中任一的核苷酸序列，其互补形式或RNA形式，

-与SEQ ID NO 1至39中任一、或与其互补形式或RNA形式具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、且更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，

-SEQ ID NO 1至11中任一的片段，或它们的同源物中任一的片段，或它们的互补形式和RNA形式中任一的片段，其中所述片段编码具有氧化酶活性的蛋白，或

-SEQ ID NO 1至39中任一、或它们的同源物中任一、或它们的互补形式或RNA形式中任一的至少15个核苷酸、优选地至少20个核苷酸、更优选地至少25个核苷酸的片段。

所述的编码具有氧化酶活性的蛋白的SEQ ID NO 1至11中任一的片段、或它们的同源物中任一的片段、或它们的互补形式或RNA形式中任一的片段，优选地由至少600个核苷酸、优选地至少900个核苷酸、或更优选地至少1200个核苷酸组成。

包含SEQ ID NO 1至39中任一、或它们的同源物中任一、或它们的互补形式或RNA形式中任一的至少15个核苷酸、优选地至少20、25或30个核苷酸、更优选地至少50个核苷酸的片段或由所述片段组成的根据本发明的核酸分子，可以用于例如检测或鉴别目的，作为引物或探针。

氧化酶蛋白

还提供了具有氧化酶活性的蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯蓝染色显示其为约85kDa。

具有氧化酶活性的本发明的蛋白，在用PNGaseF去糖基化后，分子量为约70kDa。

有利地，分离的和纯化的根据本发明的氨基酸序列的非糖基化形式具有介于约60至约70kDa之间、优选地约63kDa或约65.5kDa的分子量。

本发明的分离的氧化酶由本发明的核酸编码的多肽组成。

本发明的分离的氧化酶多肽可以包含下述序列或由其组成：

-SEQ ID NO 40至50中任一的氨基酸序列，

-SEQ ID NO 40、41或45的至少100个氨基酸的片段，或

-呈现与SEQ ID NO 40至50中任一的氨基酸序列、或与所述SEQID NO 40、41或45的至少100个氨基酸的任何片段至少60％同一性的氨基酸序列。

更具体地，本发明的分离的氧化酶由多肽组成，所述多肽由包含下述序列或由其组成的核酸分子编码：

-SEQ ID NO 1至39中任一，

-与SEQ ID NO 1至39中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、且更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列(也称作同源物)，或

-SEQ ID NO 1至11中任一的任何片段，或它们的同源物的任何片段，其编码具有氧化酶活性的蛋白。

本发明的分离的氧化酶多肽包含下述序列或由其组成：SEQ ID NO40至50中任一的氨基酸序列，或其保留了氧化酶活性的任意片段。

本发明的分离的氧化酶多肽包含下述序列或由其组成：呈现与SEQID 40或41的氨基酸序列、或与所述SEQ ID NO 40或41的具有氧化酶活性的任何片段至少60％、优选地至少70％、80％或85％、更优选地至少90％、或更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同源性(或序列同一性)的氨基酸序列。

本发明的氧化酶多肽的优选片段、特别是SEQ ID NO 40或41的优选片段，包含下述序列或由其组成：至少100个氨基酸、优选地至少200个、更优选地至少300个氨基酸、且更优选地至少400个氨基酸的氨基酸序列。

本发明的氧化酶多肽的优选片段具有由SEQ ID NO 40或41的氨基酸序列定义的氧化酶多肽的氧化酶活性的至少70％、有利地至少80％、更有利地至少85％、优选地至少90％、或更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％。

本发明的氧化酶多肽的优选片段、特别是SEQ ID NO 40或41的优选片段，包含下述序列或由其组成：至少100个氨基酸、优选地至少200个、更优选地至少300个氨基酸、且更优选地至少400个氨基酸的氨基酸序列，且具有由SEQ ID NO 40或41的氨基酸序列定义的氧化酶多肽的氧化酶活性的至少70％、有利地至少80％、更有利地至少85％、优选地至少90％、或更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％。

实际上，包含SEQ ID NO 40至50中任一的氨基酸序列或由其组成的本发明的分离的氧化酶多肽可以部分地缺失，同时维持它的酶活性。通过本领域熟知的方法，可以测量所述酶活性。

通过重组技术，也可以制备根据本发明的蛋白片段。

根据本发明的分离的氧化酶多肽也可以得自，在SEQ ID NO 40至50中任一的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的置换、缺失和/或插入。

所述置换可以是保守的，这是指一个氨基酸被一个具有类似侧链的氨基酸替代，与由SEQ ID NO 40或41的氨基酸序列组成的氧化酶多肽相比，其不显著影响所述多肽的酶活性。这些家族是本领域已知的，包括具有碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)、β分支的侧链(苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。

而且，所述置换、缺失或插入可以涉及非必需氨基酸，与由SEQ IDNO 40或41的氨基酸序列组成的氧化酶多肽相比，也不导致显著改变所述多肽的氧化酶活性。

根据本发明的分离的和纯化的氧化酶特征还在于约5.5的最适pH。更大体地，最大活性是在pH约5至pH约6.5之间(见图2)。

根据本发明的分离的氧化酶多肽特征还在于下述事实，即除了别的以外，它可以特别使用N，N-二甲基-对苯二胺和2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为底物。

因此，根据本发明的分离的氧化酶多肽也可以称作漆酶。

酶的表达和/或纯化

本发明的另一个方面涉及重组核苷酸序列，其包含与根据本发明的核苷酸序列可操作地连接的一个或多个邻近调节序列。所述邻近调节序列优选地源自同源微生物。

但是，所述邻近调节序列也可以源自异源微生物。

所述邻近调节序列是特定的序列，如启动子、增强子、分泌信号序列和/或终止子。

本发明的优选的邻近调节序列能指导本发明的核苷酸序列在重组宿主细胞中的过量表达。根据本发明的优选的邻近调节序列是构巢曲霉的组成型gpdA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子。

本发明的另一个方面涉及载体，其包含本发明的核酸分子，后者可能可操作地连接到一个或多个源自同源或异源微生物的邻近调节序列上。

在本上下文中，将“载体”定义为可以用于将核苷酸序列导入(通过转导，转染，转化，感染，缀合等)细胞中的任何生物化学构建体。

有利地，根据本发明的载体选自：质粒(包括复制型和整合型质粒)，病毒，噬菌粒，染色体，转座子，脂质体，阳离子小泡，或其混合物。所述载体可能已经包含一个或多个邻近调节序列，允许所述核酸分子的表达和它向本发明的多肽的转录。优选地，所述载体是质粒。

本发明也涉及经转化的宿主细胞或重组的宿主细胞，其含有(或已掺入了)一个或多个根据本发明的核苷酸序列和/或载体。

在本上下文中，“经转化的宿主细胞”或“重组细胞”也称作“转化体”，是已掺入了一个或多个根据本发明的核苷酸序列和/或载体的细胞。经转化的宿主细胞可以是这样的细胞，其中所述载体和/或所述核苷酸序列通过遗传转化的方式导入，优选地通过同源重组的方式，或通过任何其它熟知的用于得到重组生物的方法导入。

所述用于转化的宿主细胞可以已经具有或不具有本发明的核苷酸序列和/或载体。包括原核生物细胞和真核生物细胞，例如细菌、真菌、酵母等。

优选的宿主细胞是构巢曲霉，特别是构巢曲霉2024，黑曲霉(A.niger)，更具体地黑曲霉N402，或无花果曲霉，更特别是无花果曲霉DSM 932。

所述宿主细胞也可以是原始细胞，例如无花果曲霉，其已经含有本发明的核苷酸序列，并被遗传地修饰成过量表达或更有效地表达本发明的氧化酶多肽(更好的pH或温度特征，更高的细胞外表达等)。

本发明的经转化的宿主细胞可以在它的基因组中已经整合入根据本发明的分离的核酸分子，和/或可以含有包含本发明的分离的核酸分子的附加型载体。

优选的本发明的经转化的宿主细胞能过量表达(即比在原始或野生型微生物中观察到的表达更高的表达)本发明的核苷酸序列和/或载体，有利地允许大量生产由所述核苷酸序列和/或所述载体编码的多肽。

优选地，所述重组宿主细胞含有邻近根据本发明的核酸分子的调节序列，其能指导所述核酸分子的过量表达。

本发明的氧化酶的过量表达，也可源自根据本发明的核酸序列在所述重组宿主细胞中的增加的拷贝数。

为了最佳表达根据本发明的氧化酶，原始生产种，例如无花果曲霉，和/或合适的经转化的宿主细胞，例如经转化的黑曲霉或经转化的构巢曲霉，是在合适的生长培养基和/或表达培养基中。在实施例部分描述了最佳条件的一些实例，如培养基，温度和pH条件等。

根据本发明，可以如下得到本发明的具有氧化酶活性的多肽：首先在适合表达所述氧化酶的培养基中/上培养菌株，然后可通过常规方法，包括但不限于，离心，微滤，超滤，喷雾干燥，蒸发或沉淀，从培养基回收。使用例如电泳方法、提取或多种色谱方法，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等，可以进一步纯化所述根据本发明的氧化酶。所有这些技术都记载在科学文献中，且是众所周知的技术。

所述氧化酶可以在胞外或胞内表达，和/或由生产所述氧化酶的微生物或根据本发明的重组宿主分泌。

所述本发明的多肽可以以修饰的形式表达，如融合蛋白，且可以包括一个或多个分泌信号和/或一个或多个附加的异源功能区域。所述区域可以由添加到所述多肽的N_t上的带特定电荷的氨基酸组成，以提高在纯化过程中或在随后的处理和储存过程中在宿主细胞中的稳定性和持久性。它们也可以由添加到所述本发明的多肽上以促进纯化的短肽组成。

本发明的氧化酶的不同应用

根据本发明的氧化酶可以用于不同种类的工业中。

根据本发明的具有氧化酶活性的多肽，经进一步纯化或不经纯化，特别适合用作面包改良剂。面包改良剂或面包改良组合物是能改良和/或增加面团和/或最终的烘烤产品的质地、风味、保鲜作用、柔软性、储存后的碎屑(crumb)柔软性、新鲜度、面团加工性和/或体积的产品。

根据本发明的具有氧化酶活性的多肽优选地用于改善面团处理和/或增加最终的烘烤产品的比体积。根据本发明的具有氧化酶活性的多肽有利地用于面包改良剂配方或面包改良组合物中。

本发明也涉及面包改良组合物，其包含本发明的氧化酶多肽。

术语“烘烤产品”包括从面团制备且在烘烤面团后得到的任何产品，更具体地包括酵母发起的烘烤产品。

面团从任意类型的面粉或粗粉(例如基于小麦、黑麦、大麦、燕麦或玉米)得到。优选地，用小麦和/或包括小麦的混合物制备面团。

根据本发明的面包改良组合物也可以包含其它的面包改良剂，例如但不限于，酶，乳化剂，氧化剂，奶粉，脂肪，糖，氨基酸和/或蛋白(谷蛋白，纤维素结合位点)。

这样的酶的实例包括但不限于，α-淀粉酶，β-淀粉酶，形成麦芽糖的(maltogenic)淀粉酶，木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化还原酶，葡聚糖酶，纤维素酶，转谷氨酰胺酶，异构酶，脂肪酶，磷脂酶，果胶酶等。

优选的根据本发明的面包改良组合物包含本发明的氧化酶多肽和α-淀粉酶、优选来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶。

在本发明的另一个方面，本发明的氧化酶多肽特别适用于改进或增强基于茶的食品的颜色。

本发明的氧化酶多肽可以用于食品应用，如烘烤、面粉糕饼、蛋糕、酿造、预防酒变色、食物的脱氧、果汁制造等，或用于饲料应用。

在本发明的另一个方面，本发明的氧化酶多肽可以用于工业应用，如纸浆和纸加工、去污剂或酚聚合中的染料转移抑制等，环境应用，如环境污染物解毒、废水处理等，或制药应用(甾族化合物和抗生素的转化等)。

通过添加其它酶，可以进一步改进本发明的氧化酶多肽的作用。这样的酶可以属于，但不限于，水解酶家族，如葡聚糖酶，蛋白酶，纤维素酶，半纤维素酶，和果胶酶。其它酶是转谷氨酰胺酶，氧化还原酶，异构酶等。

根据应用，可以以几种形式使用本发明的氧化酶多肽。表达本发明的氧化酶多肽的微生物(重组或非重组)，如酵母、真菌、古细菌或细菌，可以直接用于工艺过程中。

本发明的氧化酶多肽可以作为细胞提取物、无细胞的提取物(即已经经受一个或多个破碎、离心和/或提取步骤的宿主细胞的部分)和/或作为纯化的蛋白使用。

一种或多种所述形式可以与任何上述形式的一种或多种酶联合使用。

可以将所述全细胞、细胞提取物、无细胞的提取物、或所述纯化的本发明的氧化酶多肽通过任何常规方法固定化到固体支持物上，例如以允许保护本发明的氧化酶多肽，或允许连续水解底物，和/或允许酶制品的再循环。

所述细胞、细胞提取物(包括粗提取物和部分纯化的提取物)、无细胞的提取物和/或所述纯化的本发明的氧化酶多肽可以与不同的成分相混合，例如以干燥粉末或颗粒(特别是无粉尘颗粒)形式，或以液体形式，例如与根据确立的方法的稳定剂(如多元醇、糖、有机酸、糖醇)相混合。

在下面的实施例中，进一步详述了本发明，所述实施例仅用于解释目的，不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

A)材料和方法

实施例1：菌株和培养基.

使用的细菌菌株是大肠杆菌菌株RR1ΔM15(F′lacIQ lacZΔM15hsdS20 supE44 ara-14 proA2 rspL20(strR)lacY1 galK2 xy1-5 mt1-1)和MC1061(hsdR mcrB araD139Δ(araABC-leu)7697ΔlacX74 galUgalK rpsL thi)。真菌菌株是无花果曲霉DSM932，构巢曲霉2024(biA1argB3)和黑曲霉N402(ATCC菌株9029的cspA1衍生物)。

细菌在37℃生长在LB(0.5％酵母提取物，1％Bacto蛋白胨，1％NaCl)或TB培养基(Terrific Broth，Gibco BRL Life TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)中，真菌在28℃以250rpm生长在曲霉基本培养基(Ponteverco & al，1953，Adv.Genet.，5：.141)中。

实施例2：发酵

在151 Biostat E发酵罐(B.Braun Biotech-工作体积10升)中培养曲霉菌株。培养基组成如下：Maldex 15：40g/l；盐溶液：50ml/l；微量元素溶液：1ml/l；CuSO₄溶液(1.6g/l)：1ml/l。盐溶液含有120g/l NaNO₃，10.40g/l KCl，10.40g/l MgSO₄·7H₂O和30.40g/lKH₂PO₄。微量元素溶液(pH 6.5)含有22g/l ZnSO₄·7H₂O，11g/l H₃BO₃，4.1g/l MnCl₂·2H₂O，5g/l FeSO₄·7H₂0，1.7g/l CoCl₂·6H₂O，1.6g/lCuSO₄·5H₂O，1.5g/l Na₂MoO₄·2H₂O和50g/l乙二胺四乙酸二钠盐二水合物。灭菌后加入1mg/l维生素H(biotine)。

发酵的起始pH是6.0，温度固定在30℃。发酵持续时间是约60至70小时。

实施例3：基因组DNA的分离

基于Blin和Stafford的方案(Nucl.Ac.Res.，1976，3：.2303)，从无花果曲霉的菌丝体制备基因组DNA。

用100％乙醇洗涤菌丝体，在真空干燥器中干燥，在液氮下磨碎成粉末。将粉末重悬于提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4，10mM MgCl₂，50mM NaCl，1％SDS)，并在55℃温育15min。

加入苯酚/氯仿(1/1v/v)，将溶液在室温在摇动平台上放置30min。以3,000rpm离心混合物15min。用苯酚/氯仿再次提取DNA相，然后用氯仿提取。

在室温加入0.1体积的3M NaAc和0.5体积的异丙醇，沉淀DNA。

离心后，用70％乙醇洗涤沉淀，简短地干燥，并溶于TE-缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)。

为了去除残余的RNA，加入100μg无DNA酶的RNA酶A，将溶液在37℃温育30min。在50℃，向DNA溶液加入SDS至终浓度0.5％和预消化的蛋白酶K至终浓度50μg/ml 1小时。

用等体积的苯酚/氯仿提取一次，用氯仿提取一次。再次沉淀DNA，离心，用70％乙醇洗涤，并重新溶于TE-缓冲液。

实施例4：对基因组DNA的PCR扩增

基于氨基末端序列(SEQ ID NO 46)和内部肽(1)的序列(SEQ ID NO47)，合成了一组简并的寡核苷酸引物。

NH₂-末端序列(SEQ ID NO 46)：

A V V Q F Q L D L T

正向PCR-引物(SEQ ID NO 37)：

5′GTI GTI CAG TTT CAG YTI GAT YTI AC 3′

内部序列1(SEQ ID NO 47)：

S E D Q A G D Y T I

R反向PCR-引物(SEQ ID NO 38)

3′CTY CTR GTY CGI CCI CTG ATG TGI TA 5′

这两种引物用于PCR扩增。对100ng无花果曲霉DSM932的基因组DNA进行PCR。

将DNA悬浮于100μl耐热缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl pH9.0，0.1％Triton X-100；Promega Corporation，Madison，WI)，其中添加了0.2mM dNTP，3mM MgCl₂，50pmol每种引物和1.5单位Taq DNA聚合酶(Promega Corporation)。

扩增的温度方案如下：在95℃变性10min，Taq DNA聚合酶在80℃热启动，降落2个循环，始于95℃30sec，和67℃2min。重复这一方案，逐渐下降至65、63和61℃代替67℃。最后的循环参数是：95℃30sec，60℃30sec和72℃1min(35个循环)。在Biometra″Trio-Thermoblock″循环变温器(Biometra，

，Germany)中进行反应。

实施例5：PCR产物的序列分析

将PCR产物克隆进pUC18载体(Yanisch-Perron&al，1985，Gene，33：103)。用SmaI(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)消化该质粒(在Qiagen柱(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上纯化)，产生平端。

用苯酚/氯仿提取后，在37℃，用在50mM Tris-HCl-0.1mM EDTA-缓冲液(pH 8.5)中的小牛肠碱性磷酸酶(Boehringer)将平端去磷酸化30分钟。通过1％琼脂糖凝胶进行电泳，通过Geneclean方法(Bio101，La Jolla，CA)洗脱和纯化去磷酸化的载体条带。

在Qiagen柱上初步纯化PCR反应混合物。在37℃，使用在Pfu-缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.75，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄，0.1％Triton X-100，0.1mg/ml牛血清白蛋白；Stratagene)中的Pfu-DNA-聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和T4-DNA-聚合酶(Boehringer)，用0.2mM dNTP补充PCR DNA片段的末端45min。

新的Qiagen纯化后，使用在添加了6％聚乙二醇8,000和8mM MgCl₂的激酶缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，10mM MgCl₂，10mM β-巯基乙醇)中的T4-多核苷酸激酶(Amersham，Buckinghamshire，England)，在37℃，用0.2mM rATP磷酸化PCR片段的平端30min。

经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，通过Geneclean方法洗脱和纯化1,150bp DNA片段。

使用在连接酶缓冲液(66mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl₂，1mMDTE，1mM ATP；Boehringer)中的T4-DNA-连接酶(Boehringer)，在18℃，将洗脱的DNA片段连接进pUC18载体16小时。

将连接混合物转化进大肠杆菌菌株RR1ΔM15。遵循Birnboim方法(Birnboim & al，1979，Nucl.Ac.Res，7：1513)，将得到的菌落进行DNA提取。通过EcoRI-HindIII消化和经1.2％琼脂糖凝胶电泳，分析DNA。

遵循ABI Taq DyeDeoxy Terminator循环测序方案(ABI，FosterCity，CA)，对阳性克隆的质粒DNA(Qiagen纯化的)测序。将样品在自动化的ABI373A测序系统(ABI)上运行。将得到的DNA序列转化成ASCII格式，并转移到HIBIO DNASIS软件包(Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)进行汇编。

实施例6：构建无花果曲霉DSM932的基因组DNA文库

用限制酶AluI(7.5单位)部分地消化无花果曲霉DSM932的基因组DNA(5μg)15min。在37℃，用T4-DNA-聚合酶(1单位)和dNTP核苷酸(各自的终浓度为100μM)进一步补齐所得到的DNA末端5min。然后用苯酚/氯仿提取部分消化物，并在0.7％琼脂糖凝胶上按大小分级分离。

通过离心过滤(Zhu&al，1985，Bio/Technology，9：1014；膜类型GV，0.22μm，Millipore Intertech，Bedford，MA)，从凝胶洗脱长度为9,000至23,000bp的基因组DNA片段，用苯酚/氯仿提取，并通过乙醇沉淀浓缩。

将Sfi I衔接头(5′-GTTGGCCTTTT)(SEQ ID NO 52)连接到DNA末端。在含有24单位T4DNA连接酶和250pmol磷酸化的SfiI衔接头，体积为50μl的PEG缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl₂，2.5％(w/v)PEG 8,000，0.5mM DTT，0.4mM ATP)中，在12℃，进行连接反应过夜。

用苯酚/氯仿提取后，再次在0.7％琼脂糖凝胶上纯化和分离SfiI-SfiI基因组DNA片段。切出含有10至20kb长度的片段的凝胶部分，膜洗脱，并通过乙醇沉淀浓缩。将这些片段(100ng)最终克隆进SfiI-消化的YCp50SfiI-SfiI载体(源自携带EcoRI-HindIII片段的质粒YCp50(Trash&al，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，82：4374)的大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体，其含有反向的侧接2个SfiI位点的hIFNβ基因)。

用8单位T4DNA连接酶(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)，在12℃，在20μl体积中进行连接4小时，用苯酚/氯仿进一步提取，最后在新鲜制备的MC1061细胞中电穿孔。

将细菌涂布到LB琼脂糖上，以1,000个克隆的组，将得到的菌落刮离平板。文库大小是约100,000个克隆，平均插入物大小是±16kb。

实施例7：通过菌落杂交筛选基因组DNA文库

通过EcoRI-HindIII消化、琼脂糖凝胶电泳、通过Geneclean方法的洗脱和纯化，从pUC18载体分离1,150bp片段。

使用Feinberg和Vogelstein的方法(Anal.Biochem，1984，137：.266)，用α32P-dCTP随机地标记片段。将75ng 1,150bp片段煮沸10分钟，立即在冰上冷却。使用6单位克列诺聚合酶，dGTP、dATP和dTTP(各25μM)，六核苷酸混合物(来自Boehringer的RandomPrimed DNA标记试剂盒)和45pmol α32P-dCTP(Amersham，Buckinghamshire，England)，在37℃，在60μl总体积中，进行标记反应30分钟。然后，使用膜滤器(型号VS，0.025mm；MilliporeIntertech，Bedford，MA)，在双蒸水中透析反应混合物90分钟。

将无花果曲霉DSM932的基因组DNA文库的克隆组涂布到LB平板上，在37℃温育过夜，每个平板产生2,000至6,000个菌落。将这些菌落进行菌落转移到尼龙膜(Hybond N，Amersham)上，并紫外交联(来自Stratagene的UV StratalinkerTM 1800)，然后与放射性标记的探针杂交。在62℃，在7％SDS-磷酸盐缓冲液(1mM EDTA，0.5MNaHPO₄ pH 7.2和7％SDS)中，进行预杂交和杂交步骤，在62℃，在5％SDS-磷酸盐缓冲液(1mM EDTA，40mM NaHPO₄ pH 7.2，5％SDS)中进行洗涤步骤。将滤器最后曝光于X-射线片。

实施例8：基因组DNA的亚克隆

在冰上，在超声处理缓冲液(1M氯化四甲基铵，2mM EDTA，50mM Tris-HCl pH 7.6)中，超声处理(Vibra Cell VC500；Sonics &Materials，Danbury，CT)筛选基因组DNA文库后得到的阳性克隆的质粒DNA(±10μg；Qiagen纯化的)30秒(50％工作循环)。

用异丙醇沉淀后，使用在添加了1mM dNTP的T4 DNA聚合酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.5，15mM(NH₄)₂SO₄，7mM MgCl₂，0.1mMEDTA，10mM β-巯基乙醇；Boehringer)中的T4-和克列诺-DNA聚合酶(Boehringer)各5单位，在37℃使DNA平端化30min。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳，将片段按大小分级分离，使用Geneclean方法，洗脱和纯化包含800至1,200bp的片段的凝胶部分的DNA。

将平端化的片段导入pUC18的去磷酸化的SmaI位点。使用在平端缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl₂，2.5％(w/v)PEG 8,000，0.5mM DTT，0.4mM ATP)中的T4 DNA连接酶(Pharmacia LKBBiotechnology)，在23℃，进行连接(载体/插入物的摩尔比是1/3)4小时。将连接混合物转化进大肠杆菌MC1061，建立2个亚克隆文库。

实施例9：用于曲霉转化的DNA制备

通过基于Kahn&al.(Meth.Enzymol.，1979，68：268)的“澄清裂解液”方法的改进方案，分离质粒，并通过在氯化铯-溴化乙锭梯度中平衡离心，进行纯化。

以5,000rpm，在GSA Sorvall转子中离心1升培养物(TB培养基)10分钟。将沉淀重悬于15ml裂解缓冲液(25％蔗糖，50mMTris-HCl pH 8，20mM EDTA)，并加入0.6ml溶菌酶悬浮液(10mg溶菌酶/ml H₂O；Boehringer)。

在冰上温育30min后，将15ml 2％Triton X-100与悬浮液相混合，再在冰上温育30min。

然后，以20,000rpm，在SS34 Sorvall转子中离心悬浮液30分钟。加入氯化铯(1.1g氯化铯/ml上清液)以及1500μl溴化乙锭(5mg/ml)。在25℃和55,000rpm，超速离心该悬浮液16小时。

分离质粒DNA条带后，通过用1/1体积的异丁醇提取几次(以10,000rpm离心10min)，去除剩余的溴化乙锭，用0.6体积的异丙醇进一步沉淀DNA(几次)，用70％乙醇洗涤，最后重悬于200μl H₂O中。

实施例10：构巢曲霉的转化

构巢曲霉的转化是基于Yelton等的方法(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81：.1470)，且包括，首先用水解酶(20mg/g菌丝体；SigmaChemical，St.Louis，MO)使菌丝体原生质体化，其次使用聚乙二醇处理，进行转化本身。

用1μg pSa123选择质粒的DNA和19μg目标质粒的DNA，转化10⁷个原生质体。将原生质体涂布到包含在顶层琼脂(与平板的组成相同，但是含有0.8％琼脂)中的曲霉基本培养基平板[含有1.2M山梨醇，1.5％纯净琼脂(Difco Laboratories，Detroit，MI)和维生素H(1μg/ml)，但是不含精氨酸]上。在37℃温育平板，直到出现形成孢子的菌落(±3天)。将这些转化体的孢子在相同的选择培养基上重划线数次，以得到单个菌落。

实施例11：小规模基因组DNA制备

将10⁸个孢子接种到20ml添加了维生素H(1μg/ml)的曲霉基本培养基中，并在37℃和240rpm温育过夜。

使用基于Raeder和Broda的方法(Lett.Appl.Microbiol.，1985，1：.17)的改进方案，分离基因组DNA。使用折叠过滤器(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)，通过过滤收获菌丝体，并用H₂O、用0.5M EDTA pH 8、最后用100％乙醇洗涤。在真空下干燥菌丝体沉淀数小时，然后在液氮下磨成粉末。将100mg菌丝体重悬于500μl裂解缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.5，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)，并用1体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1-v/v/v)提取2次，用氯仿/异戊醇(24/1-v/v)提取1次。用0.6体积的异丙醇沉淀DNA(加入0.1体积的3M醋酸钾pH 4.8后)，用70％乙醇洗涤，重悬于含有RNA酶A(50μg/ml；Sigma Chemical)的H₂O中。在37℃温育30min后，将DNA贮存在-20℃。

实施例12：DNA印迹分析

在37℃，在适当的EcoRI缓冲液(总体积的200μl)中，用120单位Eco RI(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)过夜消化10μg曲霉基因组DNA。上0.8％琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色。

电泳后，将凝胶在0.25M HCl中温育15min。使用Amersham的“碱印迹”方案，进行DNA片段到Hybond N+滤膜上的转移。

将滤膜与用α32P-dCTP标记的上述1,150bp DNA片段杂交。在68℃，在7％SDS-磷酸盐缓冲液(1mM EDTA，0.5M NaHPO₄ pH 7.2和7％SDS)中，进行预杂交和杂交步骤。在68℃，用5％SDS-磷酸盐缓冲液(1mM EDTA，40mM NaHPO₄ pH 7.2，5％SDS)洗涤滤膜2次，用1％SDS-磷酸盐缓冲液(1mM EDTA，40mM NaHPO₄ pH 7.2，1％SDS)洗涤1次，最后曝光于X-射线片。

实施例13：酶测定

使用N，N-二甲基-对苯二胺作为底物，在微量滴定平板中进行酶测定。将100μl底物溶液(0.4mg N，N-二甲基-对苯二胺/ml 40mM醋酸钠pH 5.3)加入25μl适当稀释度的样品，在室温避光温育。在550nm测量光密度。

将活性任意地表达为ΔAbs/sec。

关于茶颜色改变研究，用2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS-Sigma-Aldrich Chemie，Germany)作为底物，测定漆酶活性。氧化后，在415nm，用光度计测量它的绿蓝颜色。使用在100mM柠檬酸盐缓冲液pH 4中的75μl 1.66mM ABTS，其与25μl上清液相混合，并在50℃温育10min，在微量滴定平板中进行酶测定。

1漆酶单位(LACU)是在这些条件下，每分钟催化1μmol ABTS转化的酶量。

实施例14：用PNGase F去糖基化

向浓缩的蛋白悬浮液(终体积90μl)中，加入10μl变性缓冲液(5％SDS，10％β-巯基乙醇)，并在100℃煮沸混合物10min。

加入12μl NP40(10％)和12μl 0.5M磷酸钠pH 7.5后，将样品分成2等分试样。将3000单位PNGase F(肽N-糖苷酶F；NewEngland Biolabs Inc.)加入第一份样品。另一份用作阴性对照。

在37℃温育过夜。加入2x Laemmli缓冲液(Nature，227：680(1970))并煮沸5min后，将样品上样于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

通过考马斯蓝染色，观察蛋白条带。

实施例15：用构巢曲霉的gpdA启动子调换无花果曲霉DSM932氧化酶基因启动子

通过BamHI-SspI消化，从YCp50 SfiI/SfiI载体分离编码氧化酶蛋白的基因，并连接到以下述方式制备的质粒pMa58(Stanssens&al，1989，Nucl.Ac.Res.，17：4411)：用Hind III消化pMa58质粒，通过T4DNA聚合酶用dNTP补齐粘性末端，并用BamHI和PvuI进一步消化。得到的质粒称作pMa58Afic。然后，基于Deng和Nickoloff的方法(Anal.Biochem，200：81(1992)；Clontech Inc.，CA，USA的TransformerTM定点诱变试剂盒)，通过定点诱变，在氧化酶基因的ATG密码子的位置创建BspHI位点，产生质粒pMac58Aficm。

通过XbaI对pMac58Aficm的消化，然后通过T4DNA聚合酶用dNTP使粘性末端变成平端，和BspHI消化，分离氧化酶基因并连接进pFGPDGLAT2载体。pFGPDLAT2质粒含有构巢曲霉的甘油醛-3-P脱氢酶启动子，其允许位于它下游的基因的强组成型转录(Punt&al，1990，Gene，93：.101；Punt&al，1991，J.Biotechnol.17：.19)。

首先用HindIII消化pFGPDGLAT2，用T4DNA聚合酶处理，最后用NcoI消化。然后，将pMac58Aficm的BspHI-XbaI片段连接到该载体以生成质粒pFGPDAfic。

实施例16：曲霉转化体的PCR分析

如所述，从转化体分离基因组DNA。用于PCR反应的寡核苷酸如下：5′GAA GTG GAA AGG CTG GTG TGC(SEQ ID NO 51)，其对应于gpdA启动子的部分序列，和5′CAA CCC AGG TAC CGT ACT CC(SEQ IDNO 39)，其对应于氧化酶基因的部分序列。

将50ng基因组DNA悬浮于50μl耐热缓冲液(50mM KCl，10mMTris-HCl pH 9.0，0.1％Triton X-100；Promega Corporation)，后者中添加了0.2mM dNTP，3mM MgCl₂，25pmol每种引物和1.5单位Taq DNA聚合酶(Promega Corporation)。扩增的温度方案如下：在95℃变性10min后，将80℃热启动用于Taq DNA聚合酶。进行30个循环[95℃30sec，65℃30sec，72℃2min]。在Biometra″Trio-Thermoblock″循环变温器(Biometra)中进行反应。通过在0.8％琼脂糖凝胶上的电泳，分析PCR产物。

实施例17：从无花果曲霉DSM932纯化具有氧化酶活性的酶

1.脱盐的无细胞的上清液的获得

如实施例2所述，将10l无花果曲霉DSM932菌株发酵68小时。

通过离心，将培养上清液与菌丝体分离。使它通过在10mMTris-HCl，pH 7.0缓冲液(缓冲液A)中平衡的6升Sephadex G-25柱(Amersham Biosciences)而脱盐。使用相同的缓冲液从柱中洗脱蛋白。含有氧化酶的样品的终体积是25升。

2.在DEAE Macro Prep上的色谱

将步骤1的样品应用到用缓冲液A平衡的11DEAE Macro Prep(Bio-Rad)柱上。流速是145ml/min。用相同的缓冲液洗涤后，通过逐步增加缓冲液A中的NaCl浓度，洗脱结合的蛋白，得到下述级分：用1.5l缓冲液A+50mM NaCl洗脱的级分1，用1.5l缓冲液+60mM NaCl洗脱的级分2，用1.5l缓冲液A+110mM NaCl洗脱的级分3，用1.5l缓冲液1+200mM NaCl洗脱的级分4，和用1.8l缓冲液A+500mM NaCl洗脱的级分5。在级分5中检测到氧化酶活性。

3.在S-Sepharose上的色谱

将200ml来自步骤2的级分5的缓冲液交换成缓冲液B(15mM醋酸铵，pH 4.0)，这是通过使其通过在相同缓冲液中平衡的SepharoseG-25(Amersham Biosciences)柱实现的。

将260ml G-25柱洗脱液应用到在缓冲液B中平衡的20ml HiloadS-Sepharose HP 16/10柱(Amersham Biosciences)上。

用缓冲液B洗涤后，用在缓冲液B中的NaCl线性梯度(250ml从0至250mM NaCl，以5ml/min)洗脱蛋白。收集5ml级分，并测试氧化酶活性。

合并活性级分(10ml)，用Centriprep YM-30离心式过滤器单元(Millipore)浓缩。将缓冲液交换成缓冲液C(50mM MES-用NaOH调成pH 5.5)。终体积是400μl。

4.在Resource Q上的色谱

将来自步骤3的200μl应用到在缓冲液C中平衡的1mlResource Q柱(Amersham Biosciences)上。

用缓冲液C洗涤后，用在缓冲液C中的NaCl线性梯度(15ml从0至175mM NaCl，以1ml/min)洗脱蛋白。

5.在TSKG3000SW和TSKG2000SW上的色谱

通过在Centriprep YM-30离心式过滤器单元(Millipore)上离心至400μl，浓缩来自步骤4的具有氧化酶活性的级分(3.5ml)。此后，将100μl应用到连续设置的且在缓冲液D(20磷酸钠，200mM NaCl，pH 6.5)中平衡的TSKG3000SW和TSKG2000SW柱(Tosohaas)上。以0.5ml/min，用缓冲液D洗脱蛋白。合并活性级分(1.5ml)。使用MicroconYM-10离心式过滤器单元，将1ml脱盐，并浓缩至200μl的体积。

6.SDS-PAGE电泳

将来自步骤5的纯化的样品上样到10-15％SDs聚丙烯酰胺凝胶(PhastGel Gradient-10-15；Amersham Biosciences)上，并根据生产商的推荐跑胶。使用PhastGel Silver染色试剂盒(AmershamBiosciences)将一半凝胶染色，将另一半进行酶谱分析。

为此目的，在室温，在N，N-二甲基-对苯二胺溶液(SigmaChemicals；0.4mg/ml 40mM醋酸钠pH 5.3)中温育凝胶。具有氧化酶活性的蛋白表现为黑色。

该分析的结果表现在图1中。它表明，具有氧化酶活性的酶是纯的，且它表现出氧化酶活性。纯化的氧化酶的表观分子量是约90kDa。

实施例18：确定具有漆酶活性的酶的氨基酸序列

按照一般方法，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并在PVDFImmobilon-P膜(Millipore)上电印迹后，进行蛋白的N-末端测序。使用与HPLC 120A分析仪(Applied Biosystem)相偶联的自动化477A蛋白测序仪。

为了确定内部片段的序列，首先用胰蛋白酶在膜上消化蛋白。通过HPLC上的反相色谱，分离所得到的肽，并如上进行N-末端测序。

已经得到了下面的序列：

-N-末端：A V V Q F Q L D L T Y E D V S V A G X V X K A IV L N G X I(SEQ ID NO 48)

-内部肽1：S E D Q A G D Y T I R(SEQ ID NO 47)

-内部肽2：A S Q Y X S Y I Y H S H T R(SEQ ID NO 50)

实施例19：从无花果曲霉DSM932克隆氧化酶编码基因

从无花果曲霉DSM932部分克隆氧化酶基因

基于已知的由氧化酶基因编码的部分蛋白序列，使用聚合酶链式反应(PCR)来分离DNA片段，其然后用作筛选无花果曲霉DSM932的基因组DNA文库的探针。基于纯化的蛋白的氨基-末端序列和内部肽的序列，合成一组简并的引物(寡核苷酸)。

这些核苷酸引物是：

-正向PCR-引物5′GTI GTI CAG TTT CAG YTI GAT YTI AC 3′(SEQ ID NO 37)；

-反向PCR-引物3′CTY CTR GTY CGI CCI CTG ATG TGI TA 5′(SEQ ID NO 38)。

这2种引物用于在无花果曲霉DSM932的基因组DNA上进行的PCR扩增。通过1.3％琼脂糖凝胶电泳，然后进行溴化乙锭染色，直接分析PCR反应混合物。

产生±550和700bp的2个弱DNA条带和1,150bp的1个强DNA条带。

核苷酸序列分析揭示了1,150bp PCR产物和纯化的具有氧化酶活性的酶之间的关系。

为此，将PCR产物克隆进如实施例5所述的pUC18载体。用“通用的”正向和反向寡核苷酸引物(与载体的插入物侧翼区相容)进行测序，导致插入物两侧约400个核苷酸的序列确定。将这些核苷酸序列翻译成肽序列。这些肽序列包括与实施例18中确定的氨基末端序列的一部分(氨基酸11至28，SEQ ID NO 48)相对应的序列YEDVSVAGKVXXAIVLNG(SEQ ID NO 49)，和与实施例18所述的内部肽2的序列相对应的序列ASQYXSYIYHSHTR(SEQ ID NO 50)。

克隆无花果曲霉DSM932的整个氧化酶编码基因

使用PCR扩增，发现了含有具有氧化酶基因的质粒的基因组DNA文库的克隆组。

对通过Birnboim方法从文库的20个库集(pool)(每个库集约1,000个克隆)提取的质粒DNA(80ng)，进行PCR反应。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳，分析得到的PCR产物。

6组克隆产生了预期大小1,150bp的PCR产物，该长度与从对无花果曲霉DSM932的基因组DNA进行的原始PCR扩增得到的长度相同。使用放射性标记的1,150bp DNA片段作为探针，通过菌落杂交，进一步筛选这些阳性库集中的3个。放射自显影检测后，得到5个阳性信号。

通过新一个循环的菌落杂交，并通过从纯化的质粒PCR扩增该1150bp片段，进一步纯化阳性克隆。这最终导致2个单独的阳性克隆的分离。

通过SfiI消化，导致从YCp50载体释放基因组插入物，分析阳性克隆的DNA。

在0.8％琼脂糖凝胶上电泳后，一个克隆表现出长度为11,000bp的基因组插入物，另一个表现出超过12,000bp的插入物。2个插入物都含有内部SfiI切割位点。具有12,000bp插入物的质粒称作pAFLAC，且已经作为大肠杆菌MC1061转化体保藏在LMBP中心，参考号为LMBP4366。

BELDEM S.A.，其注册营业地在B-5300Andenne(Belgium)RueBourrie，12，已经于2001年5月11日(under the expert solution)将根据本发明的微生物大肠杆菌MC1061(pAFLAC)保藏在BCCM/LMBP培养物保藏中心(Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，｀Fiers-Schell-Van Montagu′building，Technologiepark 927，B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium)。该保藏已经收到登录号LMBP 4366。

无花果曲霉DSM932氧化酶基因的序列分析

剪切来自pAFLAC的基因组DNA插入物，并亚克隆进pUC18质粒载体。将连接混合物转化进大肠杆菌MC1061，得到2个亚克隆文库。使用放射性标记的1,150bp PCR片段作为探针进行菌落杂交后，选择含有部分目标基因的亚克隆。

将12个阳性亚克隆的纯化(Qiagen)的质粒DNA进一步测序，并分析得到的DNA序列。

该随机测序得到该基因的前1,100bp以及启动子区域的500bp的核苷酸序列。为了得到整个基因序列，进行引物步移，以对基因的3′末端测序。使用定制引物，分辨剩余的模糊处。2个阳性基因组克隆中仅一个(具有超过12,000bp的基因组DNA插入物的那个)看起来含有整个基因。

图3显示了核苷酸序列和对应的氨基酸序列(SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 40)。该基因是1,923个碱基对。它含有分别为85个(始于碱基对245)和49个(始于碱基对808)碱基对的2个内含子，并编码计算分子量为65,476Da的596个氨基酸的可读框。

使用BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul&al，1990，J.Mol.Biol.，215，p.403)，进行对得到的序列和数据库中的序列之间的相似性的搜索。最接近的同源基因产物是来自构巢曲霉FGSC A4的一种假定蛋白(AN 0878.2-登录号EAA65907)。使用默认参数用Clustalw程序分析(http://www.ebi.ac.uk.clustalw)发现，总体同源性是56.7％。

实施例20：氧化酶基因的异源表达

选择对维生素H和精氨酸营养缺陷型的真菌菌株构巢曲霉2024作为表达分离的无花果曲霉氧化酶基因的宿主菌株。

进行阳性克隆(具有超过12,000bp的基因组DNA插入物的YCp50载体)与含有argB-基因的选择质粒pSa123(John&al，1984，EnzymeMicrobiol.Technol.，6：.386)的共转化。

使用PCR扩增和DNA印迹分析，检查得到的转化体(在没有精氨酸的平板上得到)是否也整合了阳性克隆。

从转化体的培养物，分离基因组DNA。对该基因组DNA进行PCR扩增反应。分别使用无花果曲霉DSM932的DNA和未转化的构巢曲霉2024的DNA作为阳性和阴性对照。

通过在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，分析PCR产物。

用无花果曲霉DSM932的DNA或来自有些转化体的DNA进行的PCR反应，如预期的那样产生了1,150bp DNA片段，指示着无花果曲霉基因整合在这些转化体的基因组中。对未转化的构巢曲霉的PCR反应没有产生扩增信号。DNA印迹分析证实了这些结果。

共转化体在印迹上表现出一个或多个信号，指示着一个或多个整合的无花果曲霉基因拷贝。

得到了60％的共转化效率。

对阳性转化体观察到的另一个现象是孢子颜色的变化。未转化的和pSa123-转化的构巢曲霉菌落表现出墨绿色孢子，而整合了氧化酶基因的转化体产生黄色孢子。

对构巢曲霉转化体的分析

检查转化体是否建立了整合的无花果曲霉基因的表达，和合成的蛋白是否有酶活性。

转化体生长在曲霉基本培养基中。使用无花果曲霉作为阳性对照，未转化的和pSa123-转化的构巢曲霉作为阴性对照。

通过在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳，分析分泌在培养基中的蛋白。通过脱氧胆酸盐-三氯醋酸沉淀，预先浓缩培养基样品。在凝胶上用考马斯蓝对蛋白染色。非常大的85kDa蛋白条带(其大小与无花果曲霉氧化酶的大小接近)仅仅出现在构巢曲霉转化体的样品中。构巢曲霉分泌的蛋白比无花果曲霉分泌的蛋白小约5kDa。这是由于糖基化模式的差异，如下所示。

这些结果表明，分离的无花果曲霉氧化酶基因在构巢曲霉中在它自己的启动子控制下表达。更令人惊奇地，构巢曲霉转化体中的表达水平甚至高于在野生型无花果曲霉DSM932菌株中的水平。

进行酶谱来研究表达的蛋白的酶活性。浓缩培养基中的蛋白，并在半变性条件下(没有β-巯基乙醇；在上样前不煮沸样品)上样到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，在N，N-二甲基-对苯二胺底物溶液中温育凝胶。观察到的无花果曲霉DSM932的蛋白条带和构巢曲霉转化体的蛋白条带首先为粉红色，在更长的温育时间后变成黑色，证实该蛋白能氧化底物，且有酶活性。在用相同底物N，N-二甲基-对苯二胺进行的氧化测定中，在溶液中也得到了相同的结果。未转化的构巢曲霉的培养基完全没有表现出活性。

上面得到的结果证实，构巢曲霉转化体中整合的无花果曲霉基因编码有酶活性的氧化酶。有些转化体由于更高的基因表达，表现出比原始无花果曲霉菌株更高的活性。

实施例21：具有氧化酶活性的酶的糖基化

无花果曲霉DSM932和一种构巢曲霉转化体生长在曲霉基本培养基中。浓缩培养基中的分泌蛋白，进一步进行PNGase F处理。然后，将去糖基化的样品上样到聚丙烯酰胺凝胶上，并进行考马斯蓝染色。

可看到清楚的蛋白带型移位。用PNGase F去糖基化，将2种氧化酶的分子量降低至约70kDa。该实验显示，观察到的无花果曲霉和构巢曲霉转化体的非去糖基化氧化酶的5kDa大小差异，确实是由于糖基化的差异，因为去糖基化产生相同大小的蛋白。

实施例22：在gpdA启动子控制下在多种不同曲霉物种中表达具有氧化酶活性的酶

将分离的无花果曲霉氧化酶基因的启动子替换为构巢曲霉的组成型gpdA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶A)启动子，已知后者为强真菌启动子(Deng&al，1992，Anal.Biochem.，200：p.81)。

将该质粒转化进构巢曲霉2024，黑曲霉N402和无花果曲霉DSM932。

转化方法是基于与pSa123(精氨酸选择)的共转化。

为了转化黑曲霉和无花果曲霉，使用了另一种基于乙酰胺酶编码基因的选择方法(Kelly&al，1985，EMBO J.，4：475)。在这些情况中，使用含有构巢曲霉的amdS基因(编码乙酰胺酶)的质粒p3SR2进行共转化，产生可以以乙酰胺作为唯一氮源生长的菌落。

使用一组2种引物，通过PCR扩增，分析得到的转化体(对于构巢曲霉是146个，黑曲霉是89个，且无花果曲霉是326个)。上游引物与gpdA启动子中的序列杂交，下游引物与氧化酶基因中的序列杂交。在有些转化体的PCR混合物中，检测到2281bp的DNA条带(与gpdA启动子和氧化酶基因的序列中的寡核苷酸引物序列之间的预期大小相对应)。这证实了，这些转化体被共转化，且从而不但整合了选择质粒，而且还整合了质粒pFGPDAfic。

黑曲霉和无花果曲霉的这些共转化体表现出相同的孢子颜色变化，如上面关于构巢曲霉转化体所提到的(灰色至浅棕色孢子，而不是黑色-实施例4)。

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和用底物N，N-二甲基-对苯二胺进行的酶测定，进一步分析转化体。转化体在曲霉基本培养基(5ml，在50ml塑料管中)中生长3天，将培养上清液进行酶测定和电泳。

最好的构巢曲霉转化体表现出比用原始氧化酶启动子在构巢曲霉中得到的表达高5.5倍的表达水平。

该观察结果显示，启动子交换导致构巢曲霉中氧化酶的更高的表达水平。

与由它自己的启动子控制的氧化酶转化的构巢曲霉相比，最好的无花果曲霉转化体也表现出4倍增加。

黑曲霉转化体分泌出大约相同的量。

实施例23：氧化酶的表征

氧化酶样品的获得

选择在实施例22中得到的一种无花果曲霉转化体用于进一步的实验。如实施例2所述，进行10l发酵。

以与实施例17所述相同的条件，将发酵上清液脱盐，并通过超滤浓缩。

2.最适pH的确定

使用磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液，通过测定氧化酶在不同pH的活性，确定它的最适pH。该实验的结果如图3所示。

最适pH在pH 5.5附近。

实施例24：漆酶引起的茶颜色改变

通过将商品茶(Pickwick Green Tea，Douwe Egberts N.V.，Belgium)在温水(1g/100ml)中预温育15min，制备30ml绿茶溶液，在40℃，将其与不同量的无花果曲霉氧化酶(0，1和10U/ml绿茶)搅拌。

1小时后，与氧化酶一起温育的茶溶液变成红褐色，在350至680nm记录它们的吸收光谱，并与没有酶的对照品相比较。

图4中的结果清楚地表明，使用无花果曲霉的氧化酶，与未处理的样品相比，增强茶溶液的颜色。

实施例25：氧化酶在烘烤中的作用

进行烘烤试验来证实本发明的氧化酶在烘烤中的积极作用。通过与不含有该酶的参照相比面包体积的增加，评价积极作用。

在用100g面粉制备面团的小烘烤实验中，评价来自实施例23的氧化酶。

所述方法已经充分确立，本领域的技术人员会容易地明白，使用其它方案或来自其它供应商的装置，可以得到相同的结果。

下面的表1中列出了使用的成分：

表1

成分(g)	配方
		面粉(Surbi-Molens van Deinze)	100
水	57
		速效(Instant)酵母(Bruggeman-Belgium)	2
氯化钠	1.5
		葡萄糖	6
脂肪(Solix(Puratos-Belgium)80％/大豆油20％)	3
		氧化酶	见表2

在松下(National)混合器中，将成分混合3.5min。称量150g面团块，在25℃在塑料盒中放置20min。

重新揉和面团，再放置20min。最后检验(proofing)时间是在36℃60min。然后将面团块在220℃烘烤24min。

使用常用的油菜籽置换方法，测量面包的体积。

在下面的表2和图5中，呈现了用氧化酶进行的烘烤试验的结果。

表2

氧化酶单位/100g面粉(*)	与没有氧化酶的对照相比，面包卷体积增加(％)
		1225	2
2450	5
		4900	9
12250	8

(*)酶测定见实施例13

上面的结果表明，本发明的氧化酶对面包体积有积极作用。

实施例26：氧化酶对黑麦面粉面团粘性的影响

通过在30℃，在Farinograph混合器中混合下述成分2min，制备一系列的面团。

表3

黑麦面粉Werhahn	200g
		小麦面粉Duo Ceres	20g
水(自来水，37℃)	125g
		盐溶液(100g NaCl/1000ml水)	50ml
基本改良剂RB14120(Puratos)*	8g
		氧化酶	见表4

*基本面包改良剂RB14120含有α-淀粉酶，木聚糖酶，抗坏血酸和柠檬酸.

混合后5分钟，使用配备Chen-Hoseney面团粘性cel的StableMicro Systems TA-XT2i质地分析器，测量面团粘性。

在表4和图6中呈现了结果。

表4

组成	粘性(g)	标准偏差(g)
			参照	51.5	3.0
1360u/100g黑麦面粉	46.1	1.2
			2720u/100g黑麦面粉	45.2	3.7
4080u/100g黑麦面粉	46.7	0.9
			5440u/100g黑麦面粉	44.7	3.5

从这些数据可以看出，通过添加根据本发明的氧化酶，显著降低了面团粘性。

实施例27：氧化酶对黑麦面粉面团稠度的影响

制备与实施例10所述相同的面团。

使用Physica UDS 200流变仪，以下述参数，测量面团稠度：

●振动模式

●温度＝30℃

●板-板系统，d＝2mm

●扫频：γ＝0.02％、F从1线性增加至50Hz。

在表5和图7中呈现了在10Hz得到的结果。

表5：

组成	G′(*10^E4)	G″(*10^E4)
			参照	3.88	1.23
1360u/100g黑麦面粉	3.52	1.14
			2720u/100g黑麦面粉	4.73	1.63
5440u/100g黑麦面粉	4.90	1.60

这些数据表明，通过添加本发明的氧化酶，显著增加了面团稠度。另外，面团变得更硬，且允许对面团更好的处理和成形。