CN101080497A - 微生物检测与定量 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种半定量或定量检测样品中微生物的存在的方法。该方法采用了在一种或多种微生物的存在下能够发生可检测的颜色变化的试验染料。例如，在一个实施方案中，试验染料是能对微生物各成分(例如细胞膜、细胞质等)与细胞外部环境之间的极性差异作出响应的溶剂化变色染料(例如Reichardt染料)。或者，还可能有其它机制全部或部分上是染料与微生物之间的相互作用的原因，如酸－碱反应、氧化还原反应等等。不管怎样，可将试验染料的颜色与对照染料的颜色进行比较，其中对照染料的颜色对应于已知的微生物浓度。

Description

微生物检测与定量

                    相关申请

本申请是2004年12月16日提交的PCT/US2004/042461号国际申请的部分继续申请，该国际申请要求2003年12月16日提交的美国专利申请第10/737,574号的优先权。

                    发明背景

本发明涉及检测微生物如细菌、酵母、霉菌和病毒的方法和产品。

在我们的日常生活中，我们不知不觉地暴露于受微生物污染的物体表面，这会导致发生疾病。已有研究表明，具体的细菌污染“热点”包括公用电话、门把手、医生候诊室和儿童看护场所中的玩具、干手用热风干燥机、厨房中使用的毛巾和海绵、进行日常患者护理的医护人员的手以及混合生肉和蔬菜的食品制作表面和刀具的交叉污染。

最近单在美国几个地方发生的细菌污染爆发事件，就已导致一些儿童和老年人死亡和其它人得病。食品的微生物污染也是全世界的主要问题。沙门氏菌、大肠杆菌和其它食品传染细菌每年造成数不清的病例。急性症状包括恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻、发烧和头痛。急性症状发作后接着可能就是慢性后果。由于物体表面的交叉污染会引起细菌从肉、鱼和家禽向未煮熟食品如蔬菜的转移，容易地检测出细菌在食品制作表面上的存在的能力将具有极大益处。

同样，食品加工企业中对有害水平的微生物的检测，对于保持各个家庭和消费者的健康是十分重要的。在食品加工工业中，细菌监测是至关重要的。几乎所有的食品的加工，无论从肉类包装到干酪生产，都涉及到监测微生物水平，以确保食品供应的安全性。

微生物污染带来的灾难不仅限于食品工业。最近几十年见证了“超级细菌(superbug)”的急剧增多，这个问题就集中出现在医院和保健机构中。抗生素的过度使用和医院清洁的不足已催生了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)和艰难梭菌(Clostridiumdifficile)以及万古霉素耐药肠球菌和其它革兰氏阴性杆菌(Dancer，2004)。最近英国广播公司(BBC)的报告说到，MRSA每年估计夺走5000条生命。报告文章接着断言“清洁仍然是主要的患者关注问题，MRSA是个越来越严重的问题。”试想医院里的许多患者已经无免疫应答作用，因此发生感染的风险更高，医院环境中的恶毒细菌所造成的威胁会变得越加险恶。

有许多报告和研究在探讨医院清洁和医院传染防治的课题。

同样，已知霉菌如麦角菌能在某些谷物如黑麦中生长，它们由于会产生与麦角酸相似的毒性生物碱而具有潜在的危害性。已知黑曲霉(Aspergillus niger)和其它霉菌产生的孢子会造成过敏反应及加重呼吸道病症如哮喘。如果黑曲霉在潮湿墙壁上或者在家庭或商业建筑中的空调设备中开始生长，就会特别成问题。

某些酵母如白色念珠菌(Candida albicans)可代表另一类讨厌的微生物。已将白色念珠菌与婴儿尿布疹、儿童和无免疫应答成人的鹅口疮以及阴道酵母感染联系起来。酵母还会感染身体的口咽区以及胃肠道。

目前的细菌检测方法涉及到从设备表面采集样品。在食品加工环境中，设备可能是切肉机械，而在食品制作环境如餐馆中或在家庭里，表面可能是桌子、砧板、冰箱内部或工作表面。然后将样品温育过夜以生长出培养物。过夜生长培养是让样品在琼脂平板上于适当的温度和湿度下生长，使细菌生长和繁殖至形成大得足以肉眼可见的菌落。在温育了规定的时间和让细菌菌落生长出来后，由经过训练的技术人员人工检查琼脂平板样品并估计菌落形成单位(CFU)。这个方法花费有些高，且时间上极大滞后；在滞后时间当中污染产品可能已被运输出去或者人们已暴露于所存在的微生物。

由上可知，需要有便于快速检测有害微生物的方法和产品。

                    发明概述

为应对本领域技术人员碰到的前述困难，我们开发出了一种指示组合物，它包括流动相和在微生物存在下会发生明显可检测变化的微生物灵敏色料(colorant)。所述组合物可施加到表面以显示微生物的存在。流动相可以是消毒剂。色料在微生物存在下提供肉眼可见的颜色变化。流动性可以是液体或凝胶，色料可以是染料(dye)。在一些实施方案中，色料改变颜色的程度与微生物的浓度成比例。在其它实施方案中，所存在的微生物的数量与发生颜色变化的色料的量成比例。

合适的染料的实例包括份菁染料、4-[2-N-取代-1，4-氢化吡啶-4-亚基)亚乙基]环己-2，5-二烯-1-酮、红吡唑啉酮染料、偶氮甲碱染料、靛苯胺染料、二氮杂份菁染料、以Reichardt染料为例的两性离子染料和其它染料以及它们的混合物。特别适合的染料是两性离子染料，其中两性离子包含在构成染料色原的毗邻π电子体系当中。另一类似乎特别适用作微生物指示剂的染料是份菁染料。

还可将染料以溶剂基或水基溶液的形式施加到表面并让其干燥，留下所施加染料溶液的干燥残余物。干燥残余物当接触到微生物时会变色，因此可用在包装如擦面纸盒子上、在随身医疗用具如手套上和在其它表面上，这些表面在使用前先与染料一起制作，以便以后可指示微生物污染情况。令人惊讶的是，本发明人发现当将这些染料施加到表面上并让其干燥时，用以制作涂层(coating)的溶剂与所用的添加剂如羟丙基-β-环糊精和表面活性剂都对涂层的微生物检测能力具有显著的影响。

已发现羟丙基-β-环糊精能有效提高色料在其涂敷在纸巾或类似的擦拭材料上后的光亮度。虽然不想受理论的约束，但我们还是认为染料的颜色因所添加的环糊精衍生物抑制染料的结晶而得以改进。可将其它化学药品加入到擦拭物(wipe)中，以帮助防止因漂白剂(已发现它会干扰染料)的存在所导致的假阳性读出结果。

结合了微生物指示色料的侧向流动装置也包括在本发明的教导内容之内。这些装置具有带检测区和对照区的膜，其中检测区对细菌的存在作出响应而变色，对照区仍保持原来的染料颜色以表明测试是正确运行的。

本文还描述检测物体表面上的微生物的方法，这种方法将含有微生物灵敏色料的溶液施加到表面，并观察是否出现表明微生物存在的明显可检测变化。

本发明的其它特征和方面在下文中有更为详细的讨论。

                    附图简述

在本说明书的剩余部分，更加具体地面向本领域普通技术人员阐述本发明的详尽且可实施的公开内容，包括最佳实施方式，阐述中涉及到以下附图：

图1是五种基本的细菌细胞形状的示意图。

图2是细菌细胞排列的示意图。

图3是一种份菁染料的结构。

图4-5说明一种合成份菁染料的方法。

图6A-D是用陈放鸡肉所作的表明微生物污染情况的示意图。

图7A-G是并列对比表明微生物污染情况和清洁情况的示意图。

图8A-D是用不同浓度细菌所作的表明微生物污染情况的示意图。

图9A-E是用细菌和指示染料滴定所作的表明和定量微生物污染情况的示意图。

图10A-C是表明计算机键盘上的微生物污染情况的示意图。

图11A-D是用有和没有表面活性剂的溶液表明微生物污染情况的示意图。

图12A-F是表明取决于溶剂的微生物污染指示速度的示意图。

图13A-C是在色料干燥到基材(substrate)上的情形中表明微生物污染情况的示意图。

图14是实施例30所得结果的图示说明，其中ΔE对已知浓度的金黄色葡萄糖球菌作图。

图15是实施例30所得结果的图示说明，其中ΔE对已知浓度的绿脓杆菌(P.aeuruginosa)作图。

图16是实施例30所得结果的图示说明，其中ΔE对已知浓度的大肠杆菌作图。

图17是可用于本发明的侧向流动测定装置的一个实施方案的顶视图。

在本说明书和附图中多次使用的参引字符意指代表本发明的相同或类似特征或要素。

                    发明详述

本发明涉及细菌和其它微生物的检测，本文所用术语“微生物”应理解为包括细菌、真菌(如酵母和霉菌)以及病毒。

有千千万万种不同种类的细菌存在。有些种类差别很小，需要训练有素的人员才能鉴定它们。还有些种类在生长习性和外观上差别很大，很容易就鉴别出来。如不考虑细小的差别，则大多数细菌可按图1所示的五种基本细胞形状进行分类。图1从左到右，形状分别为圆形或球菌、杆状或杆菌、螺旋状或螺旋状菌、逗号状或弧菌以及丝状。

除形状不同外，它们的细胞排列也不同，图2从左到右分别为双球菌、链球菌和葡萄球菌。例如，一些球菌往往成双聚集(双球菌)。其它则排列成链(链球菌)。还有其它排列成串(葡萄球菌)。双球菌已知会引起肺炎。链球菌则经常与“脓毒性咽炎(strep throat)”有关。葡萄球菌因其在“葡萄球菌感染”和某些类型的食品中毒中的作用而为众人所熟悉。

细菌在大小方面也有一定的不同，但单个细菌平均大小约为1/25,000英寸(1英寸＝2.54cm)。换句话说，25,000个细菌并排在一起也就只占1英寸直线。一立方英寸足以容纳9万亿个平均大小的细菌，即地球上每个人可分摊大约3,000个细菌。

虽然基于现代分子生物学概念对细菌的细致分类的理论基础有很多论述，但对于微生物工程师来说，快速细分方法是以革兰氏反应(对细菌进行分类的染色方法)和形态学为基础的。

革兰氏阳性细菌在酒精或丙酮存在下能保持结晶紫染色。它们包括以下重要的属：放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。一些革兰氏阳性细菌，特别是棒状杆菌属、分枝杆菌属和诺卡氏菌属的细菌，甚至在酸的存在下也能将染料保持。它们被称为抗酸细菌。

革兰氏阴性细菌在酒精或丙酮存在下不能保持结晶紫染色。它们包括以下重要的属：醋杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、包特氏菌属(Bordetella)、布氏杆菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacterium)、军团菌属(Legionella)、奈瑟氏菌属(Nesseria)、硝化杆菌属(Nitrobact)、巴斯德氏菌属(Pasteurelia)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、立克次体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、硫杆菌属(Thiobacilus)、韦荣氏球菌属(Veiellonealla)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和耶耳辛氏菌属(Yersinia)。

细菌细胞膜通常由脂多糖的脂质双层构成。革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的细胞膜之间有差别(即细胞壁)。革兰氏阴性细菌的细胞壁结构较薄，具有明显的几层。外层与典型的三片层结构组合更像细胞质膜。

革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分是脂多糖。另外还存在磷脂、蛋白质、脂蛋白和少量的肽聚糖。脂多糖由核心区和连接于其上的多糖部分(moiety)重复单位组成。大多数革兰氏阴性细菌的细胞壁中有某种成分与内毒性活性有关，而这种内毒性活性则关系到革兰氏阴性细菌感染的热原反应。侧链上携带着这些细菌的菌体抗原特异性的基础物质。这些侧链的化学组成(关系到各成分以及不同糖类排列)决定了菌体抗原或者说O抗原决定簇的性质，这是在血清学上对许多革兰氏阴性细菌种属进行分类的非常重要的手段。在许多情况下，已证实某些细菌归属甚为不同的种却会产生强烈的血清学交叉反应性的原因，就在于它们将化学上类似的碳水化合物部分作为它们的脂多糖侧链的一部分，通常具有约30个重复单位。

革兰氏阳性细菌的特征是它们将肽聚糖以及多糖和/或磷壁酸作为它们的细胞壁结构的一部分。肽聚糖有时也称胞壁质，是多条聚糖链通过短肽交联而成的杂聚物。

胞壁质的基础是交替的N-乙酰葡糖胺残基和N-乙酰胞壁酸残基通过β-1，4键连接而成的多条链。胞壁酸是细菌细胞壁的独特物质。这些链通过L-和D-氨基酸组成的短多肽链交联在一起。在革兰氏阴性细菌中，肽聚糖结构简单，在大多数属中都比较一致，而在革兰氏阳性细菌中，其结构和组成差别很大。一般来说，肽聚糖是多层的。还有记载说，一些微生物类群在组成上有些小的差别。因此，在分支杆菌属和诺卡氏菌属中，胞壁酸的N-乙酰部分被氧化形式N-乙醇酰部分取代。不同类群在交联多肽和主干多肽的氨基酸组成上都可能差别甚大。这些差别构成了这些细菌的分类法的基础。

霉菌和酵母属于真菌届。虽然很多霉菌和真菌对人类有益，但有些具有病原性，能释放出有害真菌毒素而导致中毒或死亡。酵母也会导致发生感染，最广为人知的大概是酵母阴道炎。

接合菌门(Zygomycota)是一类真菌，包括黑面包霉和其它霉菌，与植物和动物存在着共生关系。这些霉菌能够发生融合而形成坚实的“接合孢子”。子囊菌门(Ascomycota)是另一类真菌，包括酵母、白粉菌、黑霉和蓝绿霉以及一些会引起疾病例如荷兰榆病、苹果黑星病和麦角症的种。这些真菌的生活史组合了有性繁殖和无性繁殖，菌丝细分成允许细胞核和细胞质通过的多孔壁。半知菌门(Deuteromycota)是又一类真菌，不能肯定适合上述类别的各种真菌或担子菌纲(Basidiomycota，包括大多数蘑菇、多孔菌和马勃菌)全部包括在此类当中。这些半知菌纲(deuteromycetes)既包括制造干酪和青霉素的种属，也包括致病的种属，如导致香港脚和癣菌病的种属。

近年来，染料在生物医学领域的使用在研究兴趣和技术重要性方面都有非凡的增长。染料在例如分析生物化学、医学诊断学的许多领域，甚至在疾病的治疗和预防上，都得到使用。染料的颜色对于某些应用来说是必需的，所述应用从用于分光检测(美国专利第5,036,000号)和体液分析物测量(欧洲专利第0 250 700号)的简单有机反应到用于肿瘤检测的高清晰度成像技术(Motohashi，Med.Res.Rev.，11，239，1991)。染料还可在临床上用于治疗疾病(美国专利第5,468,469号)。光动力疗法(Sedlacek，“The change in research for the therapy oftumors”，Chimia，45，52，1991)被成功用于治疗某些种类的癌症，如皮肤、头部、颈部、肺和食道的恶性肿瘤。其它治疗性应用涉及到染料的抗病毒和杀细菌性能。染料在组织学、荧光生物标记和荧光生物探针这些重要领域中也是关键的物质。相关的技术非常复杂，需要进行染色、洗涤和交叉染色(Blum，Photodynamic action and diseasecaused by light”Reinhold，New York，3，1941)。

本发明人发现，用特定的色料可制备出微生物指示喷剂及开发出快速微生物定量方法。该技术的潜在应用包括但不限于检测以下固体表面上的微生物：柜台顶面、手、医疗区域、浴室、床栏杆、医疗设备、手术台、器皿、厨房、食品、食品制作表面、食品加工设备、门把手、电话和计算机键盘。该有色染料涂层、喷剂或溶液对有害水平的细菌和其它微生物灵敏，其颜色变化充当着视觉指示工具，用以证实表面的清洁和/或净化是否有效。

对指示技术的要求是相当严格的，因为所用的染料必须对革兰氏阳性细菌株和革兰氏阴性细菌株都灵敏。染料应能快速地与微生物或微生物代谢物发生相互作用。对于最大的多功能性，染料还应对其它微生物如酵母和霉菌灵敏。

如前所述，染料长时间以来已被用作细胞和细菌鉴定的染色剂。染色溶液与细胞或细菌发生反应或者优选被细胞或细菌保持，从而通过提高它和所存在的背景或其它成分之间的反差来帮助进行鉴定(Johnson，1995)。通常，须将染色剂施加到表面，然后通过振动或漂洗除去过量染色剂，以突出显示微生物的存在。本发明人没有听说以前有任何关于在暴露于微生物或与微生物发生相互作用时会变色的色料的报道。

溶剂化变色(solvatochromism)现象可能是造成所看见的颜色变化的原因，不过本发明人不想受到一个具体理论的限制。溶剂化变色染料在分子环境如溶剂极性和/或氢键合倾向出现变化时就会发生颜色变化。举例说，染料在极性环境如水中颜色可能为蓝色，但在非极性环境如富含脂质的溶液中可能是黄色或红色。这种“合适染料”所产生的颜色取决于染料的基态和激发态之间的分子极性差异，这在下文有更为全面的讨论。Reichardt染料被选为研究用模型染料。

本发明人想知道，通过对某些细胞成分(如细胞膜、细胞质等)和细胞外部之间的极性差别作出响应，一些溶剂化变色染料是否可用于检测微生物。本发明人发现，当微生物与某些涂敷在基材(如纸巾)上的这些染料接触时，的确观察到颜色变化——不单单是颜色变化，而且在大多数情况下染料是在被细菌接触到的区域发生脱色。令本发明人惊奇的是，进一步的研究还提示，这当中的机制并不完全归于溶剂化变色现象。事实上，本发明的发明人在此报告，出乎他们意料的是，他们发现以下事实：

i)可将被细菌或其它微生物脱色的染料的量与暴露于染料的微生物的浓度进行关联，提示该方法是定量方法和定性方法，

ii)能被检测的微生物的范围包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母和霉菌，

iii)所试验的染料可作为干膜涂层的形式、或作为添加到含细菌液体中的溶液的形式、或作为喷雾型检测系统的形式使用，

iv)当作为例如纸巾或搪瓷表面上的干涂层的形式使用时，据以施加这种染料的溶剂的性质对检测用染料的性能(脱色时间、脱色区域和非脱色区域之间的反差以及灵敏度)产生显著影响，

v)当以例如纸巾上的干涂层的形式使用时，与染料一起包括在涂层中的添加剂可影响检测用染料的性能(脱色施加、脱色区域和非脱色区域之间的反差以及灵敏度)。例如，羟丙基-β-环糊精可增强检测用染料的性能，

vi)细菌引起的这些染料的脱色可用强碱来逆转。

虽然溶剂化变色现象会促成所观察到的颜色变化，但这些观察结果可能还符合于其它看似有理的机制。例如，这些观察结果可能还符合某种类型酸-碱相互作用或某种类型给质子反应，该反应可促成细菌存在导致的染料颜色变化。本发明人也还没有完全排除这种可能性，即当某些染料暴露于多种微生物时，氧化还原类型的反应也可能促成所察觉到的颜色变化。其它因素可能也会促成所观察到的某些染料在微生物存在下的颜色变化，例如，可能细胞膜的一部分与某些染料存在相互作用而导致颜色变化。还有一种可能性是细菌细胞壁上的高度组织化酸部分(moiety)可能能够使某些指示染料质子化，导致失去颜色。

本发明人发现了一种不寻常且目前还未能解释的现象，并利用这种现象开发出可用于检测和定量多种微生物的方法。

一般来说，就颜色变化的目视检测而言，“颜色”是一种感觉类型，是当人眼机构察觉到视野中的物体所反射或发射的各种波长光线的存在或不存在而产生的。由三种类型的对可见光谱特定区域敏感的视锥细胞对进入眼睛的光线进行光谱分析。来自这些细胞的刺激然后又被视网膜神经元、视神经神经元和视皮质所加工，结果体验到颜色的感觉。虽然存在着数种颜色赋予机制(例如吸收、发射、荧光、磷光、折射、衍射等)，但合适的研究焦点限于吸收性颜色(absorptive color)。换句话说，本发明涉及因吸收某些波长的光线而产生颜色的染料。

由于人眼运作方式的原因，所感知到的颜色通常是物体所吸收光线的波长对应的颜色的互补色。例如在白光下观看时看起来是红色的物体，实际上在选择性吸收490-500nm波长范围的浅蓝色光线。类似地，在白光下看起来黄色的物体实际上在吸收435-480nm范围的蓝光。

分子对可见光的吸收涉及到分子当中的电子跃迁，并导致激发态的产生。根据以下普朗克关系，分子的基态和相应激发态之间能量差异决定着所吸收光线的波长：

E＝hv

式中E＝能量，h＝普朗克常数，v是所吸收光线的光子的频率，与波长λ和光速c的关系如下：

v＝c/λ

可用状态图来绘示电子跃迁：

显然，所吸收的光子的能量与光子的波长成反比。因此，蓝光(435-480nm)的光子具有比黄光(580-595nm)更高的能量。所以，当在白光下观看时，溶液中或物体上的染料的颜色由染料分子的基态和第一容许激发态间的跃迁能所决定。

染料的吸光部分惯常称为染料的色原。色原包括发色团和其所连接的共轭体系。发色团是产生染料的颜色的主要基团，例如偶氮染料中的偶氮基团、胡萝卜素中的多烯基团、蒽醌染料中的羰基基团。还有许多其它发色团。助色团通过作用于共轭色原来影响染料的颜色和强度。助色团可与或可不与色原共轭。例如，通过例如苯环与偶氮基团(发色团)共轭的氨基会形成氨基偶氮色原。共轭氨基助色团可将偶氮基团的吸收谱带偏移向更长的波长，增加吸收谱带的强度。但是，有意将磺酸基团加入氨基偶氮色原中并不发生共轭，不过吸电子效应使吸收偏移向更长的波长。

基态极性比激发态极性更大的染料的实例是如下所示的份菁染料1。左手边的电荷分离的正则结构1是基态的主要促成结构，而右手边的正则结构1′是第一激发态的主要促成结构。

如下所示的靛蓝2是基态极性显著小于激发态极性的染料的实例。左手边的正则结构2是该染料基态的主要促成结构，而右手边的正则结构2′是激发态的主要促成结构。

可供实施本发明的合适染料包括上述染料以及Reichardt染料、份菁染料、两性离子染料(其中形式正电荷和负电荷包含在毗邻π电子体系当中)、4-[2-N-取代-1，4-氢化吡啶-4-亚基)亚乙基]环己-2，5-二烯-1-酮、红吡唑啉酮染料、偶氮甲碱染料、靛苯胺染料、二氮杂份菁染料和它们的混合物。

份菁染料属于“Colour and Constitution of Organic Molecules”Academic Press(London)1976中讨论的供体-简单受体色原Griffiths分类，其中羰基充当电子受体部分。该电子受体共轭到能够供给电子的给电子基团如羟基或氨基。份菁染料是相对较广的一类染料，这类染料包括结构3，其中杂环体系中所包含的氮原子充当供体，n可为包括0在内的任何整数值。份菁染料具有电荷分离的(两性离子)共振形式。

无环份菁染料也是公知的，包括vinylalogous amide。

已研究了份菁染料使卤化银对光的某些波长具有感光性的能力，以便用于照相软片中。许多份菁染料结构已为人所知。结构4-14显示份菁染料的几个非限制性实例。注意对于每种这些染料，可画出电荷分离的共振结构。文献提出，电荷分离的(两性离子)形式是染料基态的重要促成结构。

其中R可以是甲基、烷基、芳基、苯基等。

两性离子色原

可制备永久为两性离子形式的某些染料。也就是说，这些染料具有涉及到π电子体系的永久电荷，不能获得色原的中性共振结构。这种染料包括Reichardt染料15，其符合一般结构16。

除了Reichardt染料外，带适当负电荷的溶剂化变色吡啶N-酚酸甜菜碱(pyridinium N-phenolate)染料的另外其它实例由以下结构16-21给出：

其中R是氢、-C(CH₃)₃、-CF₃或C₆F₁₃。

另外的非限制性结构24-32可包括以下结构，它们符合一般结构23：

染料的量必须足够，使得当与微生物接触时发生颜色的变化，而该变化是肉眼可察觉到的，这取决于染料的灵敏度。发现以无水计，足够的染料量通常在0.001至20重量百分比之间，在一些实施方案中在0.01至10重量百分比之间，在一些实施方案中在0.05至5重量百分比之间，在一些实施方案中在0.1至3重量百分比之间。颜色变化发生得非常快，并不取决于微生物的浓度和类型。

组合物包括如上所述的微生物灵敏色料和流动相。属于“流动相”包括可用作色料载体的液体和气体。虽然可以使用任何有效的载体，但发现乙腈、四氢呋喃、二甲苯、甲醛(例如二甲基甲酰胺)和醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇)是合适的载体。流动相还可以是消毒剂或杀细菌组合物。

色料染料可以是液体的形式，该液体可喷洒或擦拭到表面上，以指示微生物的存在。可将含有染料的液体施加到表面上，并让所施加的液体干燥，形成染料干燥残余物，以便以后暴露于微生物污染。当暴露于微生物时，干燥残余物会变色，从而指示微生物的存在。根据本发明，颜色变化可能发生得很快。例如，色原可在不到约30分钟就开始变色，在一些实施方案中不到约5分钟，在一些实施方案中不到约1分钟，在一些实施方案中不到约30秒，在一些实施方案中不到约10秒。

这种使用溶液施加染料的干燥残余物的指示方法可用于固体表面上，例如包装物如擦面纸盒子、背胶标签(sticker)、纸张、卫生纸、随身医疗用具如手术手套、手术衣和消毒盖布(drape)、面罩、头罩如圆帽(bouffant cap)、手术帽和头巾、检查手套和外科手套、鞋类如鞋套、靴套和拖鞋、伤口敷料、绷带、灭菌围巾(sterilization wrap)、手帕、服装如实验服、连裤的工作服、围裙和夹克、患者被褥、担架和摇篮被单、食品制作围巾、擦碗碟海绵、布料、门把手、电话、计算机键盘、计算机鼠标、钢笔、铅笔、记事本、盥洗室把手、伤口敷料、绷带和玩具(例如在医生候诊室、日托场所)。

因此，溶剂化变色染料可涂敷于其上的基材包括擦拭物以及可能会暴露于例如上述细菌的其它物品。溶剂化变色染料还可掺入到用以检查手的微生物污染的洗液或霜膏中。染料还可掺入到海绵或擦盘巾，以警示污染。

适合用作擦拭物以用色料涂敷的基材包括任何传统上用作擦拭物的基材，包括薄膜、织造布和非织造布、纤维质基材如卫生纸、纸巾和共形成(coform)材料、气流成网材料、粘结梳理纤网(web)等等。有关基材的非排他性实例可在美国专利第4,775,582号、第4,853,281号、第4,833,003号和第4,511,488号中找到，这些专利都转让给了Kimberly-Clark Corporation。

非织造布可按照例如纺粘成网法、熔喷成网法、气流成网法、粘解成网法和梳理成网法等方法进行制造。非织造布可由热塑性树脂，包括但不限于聚酯、尼龙和聚烯烃来制造。烯烃包括乙烯、丙烯、丁烯、异戊二烯等以及它们的组合。

“纺粘纤维”是小直径纤维，其形成方法是将熔融热塑性材料作为细丝从喷丝头的多个微小、通常圆形的毛细管挤出，然后通过例如以下专利使挤出细丝的直径快速降低：Appel等的美国专利第4,340,563号、Dorschner等的美国专利第3,692,618号、Matsuki等的美国专利第3,802,817号、Kinney等的美国专利第3,338,992号和第3,341,394号、Hartman等的美国专利第3,502,763号和Dobo等的美国专利第3,542,615号。纺粘纤维当沉积在收集表面上时通常不具粘着性。纺粘纤维通常是连续的，平均直径(至少10个样品的平均值)大于7微米，更适宜在约10至20微米之间。

“熔吹纤维”是指以下纤维：将熔融热塑性材料作为熔融丝线或细丝通过多个微小的、通常圆形的型模毛细管(die capillary)挤出到会聚、高速、通常热的气体(例如空气)流中，该气体流将熔融热塑性材料的细丝减细，使它们的直径减少，可达到微纤维直径。之后，熔吹纤维被高速气体流携带而沉积在收集表面上，形成随机散布的熔吹纤维纤网。这个方法在例如Butin等的美国专利第3,849,241号中公开。熔吹纤维是微纤维，可连续或不连续，通常平均直径小于10微米，且当沉积在收集表面上时通常具有粘着性。

本文所用术语“共形成”是指这种方法，其将至少一个熔吹模头(diehead)安排在斜槽的旁边，这样纤网当在形成时可通过斜槽加入其它材料。这些其它材料可以是纸浆、高吸收颗粒、天然聚合物(例如人造丝或棉纤维或其它纤维质材料)和/或合成聚合物(例如聚丙烯或聚酯)纤维，其中纤维可以具有短纤维长度。共形成方法在共同受让的美国专利第4,818,464号(Lau)和第4,100,324号(Anderson等)中有说明。通过共形成方法生产的纤网通常被称为共形成材料。

粘结梳理纤网是从短纤维制造的，将短纤维输送通过梳理装置，该装置将短纤维打散并沿机器方向排列，形成通常以机器方向为取向的非织造纤网。纤网一形成，就用数种方法如粉末粘结法、型式粘结法(pattern bonding)、吹风粘结法和超声波粘结法中的一种或多种将它粘结起来。

在气流成网法中，具有约3至约52毫米的典型长度的短纤维束在送气流中分离并被带走，然后通常在抽真空帮助下沉积在成形筛上。随机沉积的纤维然后互相粘结在一起。气流成网方法的教导实例包括Laursen等的美国专利第4,640,810号(转让给了Scan Web ofNorth America Inc)中描述的DanWeb方法、Kroyer等的美国专利第4,494,278号和Soerensen的美国专利第5,527,171号(转让给了NiroSeparation a/s)中描述的Kroyer方法、Appel等的美国专利第4,375,448号(转让给了Kimberly-Clark Corporation)的方法或者其它类似的方法。

本发明人发现，用以清洁物体表面的漂白剂，例如次氯酸钠溶液、氯和亚硫酸氢钠可能会对溶剂化变色染料产生不利影响，即使细菌不存在也会引起颜色变化。因此，本发明的另一个方面包括擦拭物中与溶剂化变色染料一起的漂白剂检测色料。指示剂可例如是2，2′，5，5′-四甲基联苯胺，它正常情况下是无色的，当暴露于氯或次氯酸钠时变红色。指示剂也可是淀粉和碘的组合，其在氯或次氯酸盐存在下变黑色。还另一种指示剂品红可用于检测亚硫酸盐，如焦亚硫酸钠。品红呈粉红色，当暴露于亚硫酸盐时变成无色。这样，可将擦拭物某些区域指定为对细菌灵敏，其它区域指定为对漂白剂和防腐剂灵敏，使得含活性漂白剂的表面会产生颜色变化组合，让使用者能将细菌污染与漂白剂区分开来。漂白剂指示剂可印成隐藏在擦拭物上的“漂白剂”文字拼写图案，使得只要将擦拭物擦过漂白剂，文字“漂白剂”就会显现，同时伴随着漂白剂可能引起溶剂化变色染料发生的任何其它颜色变化。漂白剂指示剂的量只需足以引起可被肉眼察觉的颜色变化，和溶剂化变色染料的数量范围相同。

本发明人还认为，也有可能将例如以下物质的少量样品包含在指示条(indicating strip)上：a)检测细菌的溶剂化变色染料；b)氯/次氯酸盐检测材料，如四甲基联苯胺；c)氧化剂检测剂，如淀粉和碘化钾的混合物；d)亚硫酸氢盐指示剂如品红；e)亚硝酸盐检测试剂。这样，可有多种质量指示剂来给出例如食品的状态或质量。

在本发明的另一个方面，可在基材上使用涂层，以阻止检测染料发生结晶，从而获得对微生物具有更高灵敏度的涂层。理想的是，表面上具有单一染料分子的涂层会对微生物具有更高的灵敏度。每个染料分子都可自由地与微生物细胞膜发生相互作用。相反，染料小晶体首先得溶解，然后才能穿透细胞膜。虽然不想受理论的约束，但我们还是认为羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、γ-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、羟乙基-γ-环糊精(下文统称为“环糊精”，均获自Cerestar International of Hammond，IN，USA)能阻碍染料的结晶化，使基材上得以显现更为鲜艳的染料颜色。发现环糊精的有效量在0.001-2重量百分比之间，适宜0.01-1重量百分比之间，还更适宜在0.025-0.5重量百分比之间。

还发现某些表面活性剂能帮助染料检测微生物。特别适宜的表面活性剂是非离子型表面活性剂，如乙氧基化烷基酚、乙氧基化和丙氧基化脂肪醇、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物、(C₈-C₁₈)脂肪酸的乙氧基化酯、环氧乙烷与长链胺或酰胺的缩合产物、环氧乙烷与醇、炔二醇的缩合产物以及它们的混合物。合适的非离子型表面活性剂的各个具体实例包括但不限于甲基葡糖聚醚-10、PEG-20甲基葡萄糖二硬脂酸酯、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、C_11-15 pareth-20、ceteth-8、ceteth-12、dodoxynol-12、laureth-15、PEG-20蓖麻油、聚山梨醇酯20、steareth-20、聚氧乙烯-10十六烷基醚、聚氧乙烯-10十八烷基醚、聚氧乙烯-20十六烷基醚、聚氧乙烯-10油基醚、聚氧乙烯-20油基醚、乙氧基化壬基酚、乙氧基化辛基酚、乙氧基化十二烷基酚或乙氧基化(C₆-C₂₂)脂肪醇(包括3-20个环氧乙烷部分)、聚氧乙烯-20异十六烷基醚、聚氧乙烯-23甘油月桂酸酯、聚氧乙烯-20甘油月硬脂酸酯、PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚、聚氧乙烯-20脱水山梨糖醇单酯、聚氧乙烯-80蓖麻油、聚氧乙烯-15十三烷基醚、聚氧乙烯-6十三烷基醚、laureth-2、laureth-3、laureth-4、PEG-3蓖麻油、PEG 600二油酸酯、PEG 400二油酸酯以及它们的混合物。市售的非离子型表面活性剂可包括获自Air Products and Chemicals ofAllentown，Pennsylvania的SURFYNOL系列炔二醇表面活性剂和获自Fischer Scientific of Pittsburgh，Pennsylvania的TWEEN系列聚氧乙烯表面活性剂。

还可采用胶粘剂，以促进色料在基材上的固定。例如，可采用水溶性有机聚合物作为胶粘剂。一类合适的水溶性有机聚合物包括多糖及其衍生物。多糖是含有碳水化合物重复单位的聚合物，重复单位可以是阳离子型、阴离子型、非离子型和/或两性离子型重复单位。在一个具体的实施方案中，多糖是非离子型、阳离子型、阴离子型和/或两性离子型纤维素醚。合适的非离子型纤维素醚可包括但不限于烷基纤维素醚如甲基纤维素和乙基纤维素；羟基烷基纤维素醚如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基将丁基纤维素、羟乙基羟丙基纤维素、羟乙基羟丁基纤维素和羟乙基羟丙基羟丁基纤维素；烷基羟基烷基纤维素醚如甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基羟丙基纤维素、甲基乙基羟乙基纤维素和甲基乙基羟丙基纤维素等等。

根据本发明的又一方面，发现染料还可提供其所暴露的微生物的数量信息。例如，Reichardt染料显示强烈的负溶剂化变色现象。即Reichardt染料在一种或多种微生物存在下可发生从蓝色到无色的颜色变化。染料变色的程度可目测检查或用仪器测定，以提供与微生物浓度的半定量和/或定量相关性。例如，可将已反应的试验染料的颜色与对照染料的颜色进行比较(例如目测或借助仪器)，对照染料由在对微生物的响应性方面与试验染料相同或类似的化合物形成。还可采用多种对照染料，它们对应于不同的微生物浓度。例如，可采用五种对照染料，它们分别与每毫升10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷个菌落形成单位(CFU)的微生物浓度发生反应。在进行比较时，可选择一种或多种颜色相同于或基本类似于与试验样品反应的试验染料的对照染料。然后可由选定的对照染料和对应的已知微生物浓度，测定出试验样品当中的微生物浓度(或浓度范围)。用该技术从而可获得定量(即具体的浓度)或半定量(浓度范围)结果。

如有需要，可测量染料的颜色强度，以更好地确定试验样品中存在的一种或多种微生物的实际数量。在一个实施方案中，用光学读数器来测量颜色强度。光学读数器的实际构造和结构一般有多种，本领域技术人员容易理解。通常，光学读数器具有能够发射电磁辐射的照明源和能够记录信号(例如透射光或反射光)的检测器。照明源可以是任何本领域公知的能够提供电磁辐射的装置，所述电磁辐射如可见或近可见范围的光线(例如红外光或紫外光)。例如，可用于本发明的合适照明源包括但不限于发光二极管(LED)、闪光灯、冷阴极荧光灯、电场发光灯等。照明可以是多路传输和/或准直传输。在一些情况下，照明进行脉冲，以减少任何背景干扰。此外，照明可以是连续的，或者可将连续波(CW)和脉冲照明结合，其中多个照明光束多路传输(例如脉冲光束与CW光束多路传输)，使得可以区别CW源所诱导的信号和脉冲源所诱导的信号。例如，在一些实施方案中，将LED(例如砷化铝镓红色二极管、磷化镓绿色二极管、磷化砷化镓绿色二极管或氮化铟镓紫色/蓝色/紫外(UV)二极管)用作脉冲照明源。适用于本发明的合适UV LED激发二极管的一个市售实例是Model NSHU55OE(Nichia Corporation)，它在10毫安(3.5-3.9伏)的正向电流下将750-1000微瓦的光功率发射成半峰全宽为10度、峰值波长为370-375纳米和光谱半宽度为12纳米的光束。

在一些情况下，照明源可给染料提供漫射照明。例如，可简单地采用多点光源阵列(例如LED)，来提供相对漫射的照明。另一种能够以相对廉价的方式提供漫射照明的特别适宜的照明源是电场发光(EL)装置。EL装置通常是电容器结构，它利用了夹入电极之间的发光材料(例如磷颗粒)，至少一个电极是透明的，以让光线射出。在电极间施加电压，就会在发光材料当中产生变化的电场，引起发光材料发射光线。

检测器通常可以是任何本领域公知的能够感测信号的装置。例如，检测器可以是配置成可进行空间辨别的电子成像检测器。这种电子成像传感检测器的一些实例包括高速线性电荷耦合器件(CCD)、电荷注入器件(CID)、互补型金属氧化物半导体(CMOS)器件等等。这种成像检测器例如通常是电子光传感器的二维阵列，不过也可使用包括单线探测器象素或光传感器的线性成像检测器(例如线性CCD检测器)，例如用于扫描图像的检测器。每个阵列包括一套已知的独特位置，可将其称为“地址”。图像检测器中的每个地址由覆盖一定区域(例如通常定形为正方形或长方形的区域)的传感器所占据。这个区域通常被称为“象素”或象素区。检测器象素例如可以是CCD、CID或CMOS传感器，或者任何其它能检测或测量光线的器件或传感器。各检测象素的尺寸可大为不同，在一些情况下直径或长度可低至0.2微米。

在其它实施方案中，检测器可以是缺乏空间辨别能力的光传感器。例如，这种光传感器的实例可包括光电倍增器件、光电二极管如雪崩光电二极管或硅光电二极管等等。硅光电二极管有时比较有利，因为它们既价廉又灵敏，能够高速运行(上升时间短/带宽高)，容易整合到大多数的其它半导体技术和单片电路中。另外，硅光电二极管形体微小，这能使它们容易地整合到各种类型的检测系统中。如果使用硅光电二极管，那么发射信号的波长范围可在它们的灵敏度范围内，为400-1100纳米。

光学读数器通常可采用任何公知的检测技术，包括例如发光(例如荧光、磷光等)、吸收(例如荧光吸收或非荧光吸收)、衍射等。在本发明的一个具体实施方案中，光学读数器将颜色强度作为吸光度的函数来测量。在一个实施方案中，吸光度读数是用DynexTechnologies of Chantilly，Virginia的Model#MRX微量滴度板读数器测量的。在另一个实施方案中，吸光度读数是用称之为“CIELAB”的常规试验测量的，所述试验在F.Cost著 Pocket Guide to Digital Printing，Delmar Publishers，Albany，NY.ISBN 0-8273-7592-1的第144和145页中有讨论。这个方法定义了三个变量L^*、a^*和b^*，它们对应于基于颜色感知相对论(opponent theory of color perception)的感知颜色的三个特性。三个变量的含义如下：

L^*＝光亮度(或发光度)，范围从0至100，其中0＝黑暗，100＝光亮；

a^*＝红/绿轴，大约从-100至100；正值为红色，负值为绿色；

b^*＝黄/蓝轴，大约从-100至100；正值为黄色，负值为蓝色。

由于CIELAB颜色空间在一定程度上具有视觉均匀性，可计算出单个数值，这个数值代表人所感知到的两种颜色之间的差别。该差别称为ΔE，通过对两种颜色之间的三个差值(ΔL^*、Δa^*和Δb^*)的平方和取平方根来计算。在CIELAB颜色空间中，每个ΔE单位大约等于两种颜色之间“刚好可察觉的”差别。CIELAB因此是客观的不依赖于仪器装置的表色系统的良好度量，可用作参考颜色空间用于颜色管理和颜色变化表达的目的。使用该试验法，颜色强度(L^*、a^*和b^*)就可例如用日本大阪Minolta Co.Ltd.的手提式分光光度计(型号CM2600d)进行测量。该仪器采用符合CIE No.15、ISO 7724/1、ASTME1164和JIS Z8722-1982(漫射照明/8度角观察系统)的D/8几何形状。样品表面以偏离该表面的法线8度的角度反射的D65光线由样品测量光学系统接受。又一个合适的光学读数器是Kaylor等的美国专利申请出版物第2003/0119202号中描述的反射式分光光度计，为了所有目的将所述专利申请通过引用整体结合到本文中。同样，也可将透射式检测系统用于本发明中。

不管颜色强度用何种方式测量，在一些实施方案中可将结果与预先确定的检测曲线进行比较。检测曲线是通过将各种已知微生物浓度下的染料强度进行绘图产生的。这样，就可以测量出发生反应的试验染料的颜色，并容易地用检测曲线将其与微生物浓度相关联，以给使用者提供定量或半定量结果。虽然可针对广泛的微生物制作检测曲线，但还设想可针对单一类型的微生物制作检测曲线。因此，可将颜色强度与针对特定应用的目的微生物的检测曲线相关联。例如，可选择出显示对大肠杆菌的特殊反应性的染料。一旦发生颜色变化，然后就可将颜色的强度与预先确定的大肠杆菌检测曲线相关联。另外，还可针对多种类型的微生物制作多个检测曲线。

关联方法如上述的关联方法可自动和/或手工执行。例如，可任选采用微处理器来自动选择所需的关联技术，并将得自检测器的测量值转换成定量或半定量指示微生物浓度的结果。微处理器可包括存储能力，以让使用者能召回最后几个结果。本领域技术人员会认识到，可使用任何合适的计算机可读存储设备，如RAM、ROM、EPROM、EEPROM、闪存卡、数字视频光、Bernoulli磁带机等等。如有需要，可用液晶显示(LCD)或LED显示将结果传送给使用者。

上述关联技术按照本发明可用多种方式来执行。例如，可采用具有检测区的基材，检测区提供任何数量的独立检测区域(例如线条、点等)，这使得使用者可更好地测定试验样品当中的一种或多种微生物的浓度。每个区域可含有相同的试验染料，或者可含有不同的染料以与不同类型的微生物反应。比如说，一些染料对革兰氏阳性细菌更为灵敏，而一些染料则对革兰氏阴性细菌更为灵敏。这样，就可检测到不止一种类型的微生物。还可对试验染料浓度进行选择性控制，以提供所需水平的检测灵敏度。例如，当怀疑微生物水平较低时，用较高的浓度可提供较高水平的检测灵敏度。如有需要，基材还可具有施加了对照染料的对照区，对照染料与试验染料相同或相似。对照区在试验过程中通常不变色，这样它可用于进行定量和/或半定量比较。与检测区相似，对照区也可提供任何数量的独立区域。例如，对照区可具有对应于不同的预定微生物浓度(例如如上所述的浓度)的区域。另外，所述区域可含有对不同类型的微生物有不同灵敏度水平的染料。

基材可由能够施加染料的任何各种材料来形成。例如，基材可由薄膜、纸张、非织造布、针织物、织造布、泡沫等形成。在一个具体的实施方案中，基材是通常用于标签制造的面纸材料，如纸张、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚酰胺等。可将胶粘剂如压敏胶粘剂、热激活胶粘剂、热熔胶粘剂等应用于面纸材料的一个或多个表面上，以帮助将它粘附到所需的物品上。压敏胶粘剂的合适实例包括例如丙烯酸基胶粘剂和弹性体胶粘剂。在一个实施方案中，压敏胶粘剂是基于丙烯酸酯(例如丙烯酸2-乙基己酯)与极性共聚单体(例如丙烯酸)的共聚物。胶粘剂的厚度可在约0.1至约2密耳(2.5-50微米)的范围。还可采用在胶粘剂使用前与其接触的隔离衬垫。隔离衬垫可包括本领域技术人员公知的任何各种材料，如硅酮涂料纸或薄膜基材。在使用过程中，将受处理的基材和胶粘剂从隔离衬垫上剥离下来。随后，将胶粘剂放在所需的位置近邻，以使受处理的基材暴露于环境。

参考图17说明本发明的另一个实施方案，其中基材是侧向流动装置20。更具体的说，装置20具有充当流体介质的多孔膜23，它任选由刚性材料(未显示)支撑着。一般来说，多孔膜23可由试验样品能够通过其中的任何各种材料来制作。例如，用以形成多孔膜23的材料可包括但不限于天然材料、合成材料或经过合成修饰的天然材料，如多糖(例如纤维素材料如纸和纤维素衍生物如乙酸纤维素和硝基纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；无机材料如失活氧化铝、硅藻土、MgSO₄，或其它无机微细材料，所述无机材料均匀分布在多孔聚合物基质中，所述聚合物为氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；布料，天然出现的(例如棉花)和合成的(例如尼龙或人造丝)；多孔凝胶如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；高分子膜如聚丙烯酰胺等等。在一个具体的实施方案中，多孔膜23由硝基纤维素和/或聚醚砜材料形成。应认识到，术语“硝基纤维素”指纤维素的硝酸酯，可以单单是硝基纤维素，或者也可以是硝酸和其它酸(如具有1-7个碳原子的脂族羧酸)的混合酯。装置20也可具有吸收垫28。吸收垫28通常接收已迁移通过整个多孔膜23的流体。本领域公知，吸收垫28可帮助促进穿过膜23的毛细管作用和流体流动。

使用者在开始检测试验样品中的微生物时，可直接将试验样品施加到多孔膜23的一部分上，然后试验样品就可移动通过该部分。或者，可首先将试验样品施加到与多孔膜23成流体连通的取样垫(未显示)和/或配合垫(未显示)。可用于形成取样垫和配合垫的一些合适材料包括但不限于硝基纤维素、纤维素、多孔聚乙烯垫和玻璃纤维滤纸。不管试验样品施加到哪里，它都会迁移到由多孔膜23所界定的检测区31，检测区能够发出信号显示微生物的存在。具体的说，如图17所示，检测区31包括当与一种或多种微生物接触时显示可检测颜色变化的试验染料。测定装置20还采用了对照区32，它施加有对照染料，任选放置在检测区31的下游。对照区20在试验过程中通常不变色，因此它可用于半定量和/或定量比较。

有时试验染料和对照染料的施加方式使得它们基本上不会扩散通过多孔膜23的基质。这使得使用者能容易地在所需的反应时间后检测染料的颜色。例如，染料可与多孔膜23的表面上存在的官能团形成离子键和/或共价键，这样它们就固定保持在膜上。在一个实施方案中，带正电荷的染料可与一些多孔膜(例如硝基纤维素)表面上存在的带负电荷羧基基团形成离子键。或者，可将某些可基本阻止染料向多孔膜23的基质扩散的成分加入到染料溶液中。在其它情况下，可能不需要固定化，相反染料可扩散到多孔膜23的基质中与试验样品发生反应。

以下实施例帮助说明本发明的各个实施方案。

实施例材料

除非另有指明，所有试剂和溶剂均获自Aldrich ChemicalCompany Inc.(Milwaukee，WI)，且不经进一步纯化即使用。研究中使用的微生物是：

1.革兰氏阴性(活)

大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC#8739)

绿脓假单胞菌(Psuedomonas aeruginosa)(ATCC#9027)

猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)

阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)

2.革兰氏阳性(活)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC#6538)

木糖葡萄球菌(S.Xylosis)

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

3.革兰氏阳性(死)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC#6538)

木糖葡萄球菌(S.Xylosis)

4.酵母(活)

白色念珠菌(Candida Albicans)

5.霉菌(活)

黑曲霉(Aspergillus Niger)

6.病毒

-1型脊髓灰质炎病毒

-1型单纯疱疹病毒(HSV-1)

-鼻病毒

-麻疹病毒

-痘苗病毒

-A型流感病毒

所有的病毒均获自美国新泽西州Fairfield市的GibraltarLaboratories，Inc.。Reichardt染料(酚酸2，6-二苯基-4-(2，4，6-三苯基-1-吡啶))和溴化1-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)-吡啶购自美国威斯康星州Milwaukee市的Aldrich Chemical Company。本研究所用的其它份菁在公司内合成，下文详细描述。

份菁染料的合成

溴化1-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)-吡啶市售获自AldrichChemical Co.(Milwaukee，WI)，直接使用。

份菁染料的另外的实例在实验室用两步反应合成。

用合成方法合成制备得到的染料在图3中显示。

如图4所示，将甲基碘慢慢加入到冰浴中搅拌下的δ-甲基吡啶的50ml异丙醇溶液中。加入完毕后，将反应加热至回流并继续回流2小时。接着在冰浴中冷却溶液，将沉淀过滤出，在布氏漏斗中用冷酒精洗涤。然后将粉末在通风橱中干燥2小时。粗产物的收率是18.6克。粗产物不作进一步纯化，直接用于下一步。

如图5所示，将N-甲基-δ-甲基吡啶(9.4g，0.04摩尔)和香兰素(6.1g，0.04摩尔)在搅拌下全部溶于50ml乙醇中。向此溶液加入哌啶(3.4g，0.04mole)，所得混合物回流16小时。接着将反应混合物在冰浴中冷却，用布氏漏斗滤出产物，用冷乙醇洗涤。

然后将上述结构13的粗染料(其中R＝甲基)的250ml 0.2摩尔浓度氢氧化钾溶液搅拌60分钟，形成两性离子，用布氏漏斗滤出。然后将染料从最低量的1∶1水/甲醇混合物中结晶。收率为9.4g(98％)。

其它染料从相应的烷基碘出发按类似的方式进行合成。下表1显示所获得的三种不同R基团的染料结构13的化合物和收率。

表1.所合成的烷基衍生物和所获得的收率

烷基	收率
		R＝甲基	98
R＝己基	92
		R＝十二烷基	87

实施例1：Reichardt染料(乙腈溶剂中)施加到预先污染的表面

为研究这些染料作为喷剂的用途，制备Reichardt染料的溶液(160mg于10mL乙腈中)。利用带气溶胶推进剂的喷雾瓶产生喷雾机制。

将生鸡腿在室温下陈放几天，以确保高细菌水平。如图6所示，将鸡腿放在陶瓷板的表面上几秒钟后撤去(6A)，然后将该表面吸干以除去任何鸡汁痕迹(6B)。接着，用喷雾瓶将Reichardt染料溶液喷到该表面上(6C)。用另一块鸡肉重复试验以确证可重复性，得出了类似的结果。

将指示染料溶液喷到该表面上后，整个接触过鸡肉的区域脱色(也就是说，指示喷剂的颜色从蓝色变成非常暗淡或无色)，产生鸡肉的轮廓(6D)。染料在该表面上放过鸡肉的准确位置被快速脱色。

实施例2：Reichardt染料(异丙醇中)施加到污染的表面

对作为载体的异丙醇进行研究，异丙醇因其消毒能力可能会具有另外的好处。将Reichardt染料溶于异丙醇中(160mg染料溶于10mL异丙醇)。用塑料门把手作为“实际”表面，试验其上的细菌污染情况。用陈放鸡肉的汁液沾污其中一个门把手的表面。其它门把手保持未受污染，以作对照。对两种门把手都加以擦拭。将染料的异丙醇溶液喷在两种表面上。由Reichardt染料从蓝色脱色成无色，就容易观察出门把手的污染区域。

实施例3：指示喷剂试验中异丙醇中的Reichardt染料在污染表面上的假阳性

已证实Reichardt染料指示剂对来自鸡肉的细菌具有很高的灵敏度。为试验指示剂的假阳性情况，使用了鸡汁的其它成分如脂质和蛋白质。采用了鸡汤，目的是利用其无细菌的特性和含潜在干扰物质的高度可能性。

将刚打开的罐头中的Swanson鸡汤(Campbell Soup Co.，NJ，可从零售杂货店市售获得)用移液管吸取到陶瓷表面上，用SCOTT纸巾擦干。还将陈化鸡肉的汁液用移液管吸取到陶瓷表面的不同位置上，擦干，用作已知的阳性对照。将Reichardt染料指示剂(160mg于10ml异丙醇中)喷在陶瓷表面上，清楚看到只有含陈放鸡汁(并因此含细菌)的一边被脱色。从这个实验可得出结论，在鸡肉的情况下，的确是细菌引发了脱色响应，而不是一些二级成分如鸡肉脂肪或蛋白质。

实施例4：Reichardt染料指示喷剂作为污染表面上的清洁助剂

还试验了Reichardt染料在异丙醇喷剂中作为清洁助剂的用途。如图7所示，将陈放鸡汁纵向施加到正方形陶瓷表面的左右两半边上(7A)。A半边除了用SCOTT纸巾大力擦拭表面外，不进行清洁。对于B半边，则将Kimberly-Clark Professional Moisturizing Instant HandAntiseptic(60％乙醇溶液，Roswell GA)施加到毛巾上，用以清洁该表面(7B)。然后施加Reichardt染料喷剂，以确定清洁是否产生差别(7C)。清楚发现，虽然清洁剂所有帮助，但还是有些区域“被错过”(7D)。接着，再次用K-C Professional Antiseptic大力清洁两个条纹区域的底部半部分。再喷这些区域时(7F)，没有发生脱色，这证实了表面被清洁(7G)。

实施例5：Reichardt染料涂敷的纸材料的脱色

这个实验测试Reichardt染料的表面涂层响应细菌污染的能力。如图8所示，用Reichardt染料溶液(80mg/10mL乙腈)涂刷一张纸。向这张纸加入10⁷、10⁶、10⁵和10⁴CFU/mL大肠杆菌或金黄色葡萄球菌溶液的100μL等分试样(8B)。水用作阴性对照。当被这两种类型的细菌污染时，染料颜色快速消除，对于金黄色葡萄球菌来说更快(8D)。后来确定，虽然两种细菌溶液的确是10⁷CFU/mL浓度，但金黄色葡萄球菌溶液的实际浓度是7×10⁷CFU/mL，相比之下大肠杆菌溶液是1×10⁷CFU/mL。与细菌溶液所观察到的快速脱色(不到1分钟)相比，水在几分钟后才引起染料稍微脱色。

将一张自粘背胶标签纸(Avery-Dennison)也用两种不同浓度的Reichardt染料溶液(160mg/10mL乙腈，80mg/10mL乙腈)涂刷。将背胶标签施加到Huggies湿巾盒的盖闩机构(lid and latchmechanism)。戴上手套将10⁷CFU/mL金黄色葡萄球菌转移到背胶标签的表面上。虽然两种浓度都被快速脱色，但染料浓度较低的表面上颜色消失得更为明显，表明存在提供检测和强烈视觉对比的最佳涂敷浓度。背胶标签可为多种应用提供容易和快速检测细菌污染的手段。

实施例6：用Reichardt染料进行细菌浓度的定量

通过用Reichardt染料液体测试基材上的细菌，而不是让结合到基材上的染料接触液体中的细菌(实施例5)，认识到基于Reichardt染料的细菌指示剂的潜在新用途。这个实验的焦点在于确定染料溶液如何响应位于表面上的已知浓度的细菌。将100μl的10⁸CFU/ml革兰氏阳性细菌点滴SCOTT毛巾上(图9A)。向此斑点加入一滴溶于乙腈的Reichardt染料(160mg于10ml乙腈中)(9B)。

为进行比较，在毛巾上点滴一染料斑点并干燥，加入相同量的细菌。一加到细菌斑点Reichardt染料就立即脱色。与此对比，置于含染料的纤维质毛巾上的细菌的反应要数分钟才发生脱色。向该细菌斑点再加入数滴染料(9C)，脱色现象继续到第四滴，此时就一直是紫色(9D)。试图通过用移液管添加乙腈来恢复涂布染料的SCOTT毛巾上的染料颜色，但未能成功(9E)。

实施例7：用Reichardt染料进行细菌指示剂滴定试验

粘附于基材的细菌使染料溶液快速脱色的该发现，以及反应会达到终点的该事实，激发我们探究染料给出细菌CFU/ml定量信息的能力。这个实验的目的是用染料滴定各种浓度的粘附于基材的细菌，确定为稳定颜色所需的染料的量是否随细菌CFU/ml而变化。

在SCOTT纸巾上点滴各100μl的金黄色葡萄球菌系列稀释悬浮液。然后用移液管将数滴(10μl)Reichardt染料的乙腈溶液((40mg/10ml)吸取到点滴有细菌的每个斑点上。染料溶液一开始还有颜色，但差不多即刻(不到一秒钟)就脱色，再向同一斑点点滴几滴染料，直到染料不再脱色和紫色/蓝色不减弱。在对应于有不同浓度细菌的每个斑点上重复进行这种操作。

结果显示与表面或基材上的细菌污染水平的良好相关性。

实施例8：老年妇女尿液的细菌滴定

为说明这种新方法的实际用途，将汇集的老年妇女尿液取样品(100μl)点滴在纤维质毛巾上，产生几个斑点，每个斑点有100μl体积的尿液。滴定研究中使用了两种染料溶液：40mg染料/10ml乙腈和160mg染料/10ml乙腈。然后将染料溶液以10μl等分试样点滴到尿液斑点上，继续点滴至蓝色/紫色染料颜色得以保持(即将染料加入到尿液，直到颜色持续保持)。表2给出了每种染料溶液为使染料颜色保持稳定(即不再脱色)所需的体积。已知老年妇女尿液具有高细菌污染水平，该初步研究证实该具体样品中的高污染水平。

表2：汇集的妇女尿液的细菌定量

样品	4mg/ml染料溶液	16mg/ml染料溶液
			尿液	120μL	30μL

值得注意的是，使用的较稀(四倍稀释)的染料溶液是较浓(浓四倍)的染料溶液的四倍。这样，通过使用最大染料浓度以使达到饱和所需的量最小，可让指示系统适应不同行业(食品、保健等)中所见的不同CFU水平。例如，视时间和保藏条件而定，鸡块无论在哪里都可产生10²-10⁹细菌水平。但是，出于对发生疾病的担忧，食品制作者和处理者可能只关心10⁷及以上的细菌水平。另一方面，医院通常治疗因疾病、病患或手术可能已经在某种程度上免疫受损的患者。因此，医院工作人员可能比大多数其它行业关心低得多的细菌水平，可潜在地受益于适应他们的特定需要的指示染料浓度，以便减少易感患者的感染风险。

实施例9：用包括细菌、霉菌和酵母的多种微生物试验细菌指示剂

按前文描述的相同方式，将纤维质毛巾用作基材，用移液管吸取细菌和其它微生物于其上。用移液管将10⁷CFU/ml的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌(酵母)、阴道加德纳菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和嗜酸乳杆菌吸取到毛巾上(各100μl)。另外，还用移液管将10⁵的黑曲霉(一种普通霉菌)吸取到毛巾上。然后将Reichardt染料溶液(160mg于10ml乙腈中)以10μl等分试样加入到每个斑点，计数引起持久颜色所需的滴数。

表3给出对于每种微生物为保持持续紫色所需的染料的量。用嗜酸乳杆菌观察到最强的反应，其次是金黄色葡萄球菌、阴道加德纳菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、白色念珠菌，最后是黑曲霉。虽然看起来革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性阴道加德纳菌的反应一样强，但对于各种类型的细菌和病原体来说，为达到稳态反应所需的数量是不同的。

表3：用Reichardt染料对各种微生物的滴定

微生物	类型	持续颜色所需的染料数量(μl)
			乳杆菌	革兰氏阳性	110
金黄色葡萄球菌	革兰氏阳性	90
			阴道加德纳菌	革兰氏阴性	90
大肠杆菌	革兰氏阴性	80
			绿脓假单胞菌	革兰氏阴性	80
白色念珠菌	酵母	70
			黑曲霉	霉菌	50

实施例10.用细菌细胞壁成分试验Reichardt染料指示剂

利用常见于细菌细胞壁的分子，可洞悉这种指示剂技术是如何起作用的。虽然构成革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的表面的化合物具有一定的共性，但它们的排列和化学组成各不相同。革兰氏阴性细菌的外膜包被着脂多糖(LPS)。LPS给革兰氏阴性细菌的表面带来净负电荷，有助于其发病机制。革兰氏阳性细菌包被着厚厚的肽聚糖或者说胞壁质片状层。这种片层是由交替相连的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸分子形成的。在革兰氏阳性细菌中还存在磷壁酸，它可连接到N-乙酰胞壁酸。虽然革兰氏阴性细菌也有肽聚糖，但革兰氏阳性细菌上的肽聚糖层要厚得多。此外，革兰氏阴性细菌的肽聚糖层位于LPS层的下面，这使得它不易从表面接近。

将大肠杆菌来源的脱毒脂多糖(除去脂质A成分)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)来源的脂磷壁酸、大肠杆菌来源的脂多糖和胞壁酸的溶液点滴到SCOTT纸巾上。除了纯LPS之外，所有的溶液都制备成5％(wt/wt)、1％(wt/wt)和0.2％(wt/wt)浓度。为安全起见，LPS制备成0.1％(wt/wt)、0.02％(wt/wt)和0.004％(wt/wt)浓度。然后将Reichardt染料(160mg于10ml乙腈中)以10μl等分试样加入到每个斑点，记录产生持久颜色所需的染料数量。同时进行反转实验，即将细胞壁成分点滴到纸巾上的染料斑点上。

胞壁酸产生最强的反应，在两种实验情况下都导致染料几乎即刻脱色。其它化合物的确也最终引起染料脱色，但似乎反应不如胞壁酸强烈。由于胞壁酸在革兰氏阳性细菌中存在的浓度更高，这些结果不仅证明了这种染料给出CFU/mL数据的潜力，而且证明了根据反应的强度和速度区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的潜力。

实施例11：鸡肉相关成分的试验

已证实Reichardt染料指示剂对生长于已在室温下保藏过的生鸡肉上的微生物具有高灵敏度。但是，考虑到存在假阳性的潜在可能，有必要试验指示剂对鸡汁的其它成分如脂质和蛋白质的响应情况。将含有鸡肉衍生产物如脂质、蛋白质等的罐装鸡汤用作对照，以核查这些天然出现的材料所引起的潜在干扰。

用移液管将刚开罐的Swanson鸡汤吸取到电烤盘表面上，用SCOTT毛巾擦干。也用移液管将来自常温下保藏数天的生鸡肉的汁液吸取到电烤盘上并擦干，作为阳性对照。将Reichardt染料指示剂(160mg于10ml异丙醇中)喷在表面上，清楚看到只有含陈放鸡汁(从而含细菌)的那一边脱色。从这个试验可以得出结论，在鸡肉的情况下，的确是微生物的存在引发了脱色响应，而不是其它一些成分如鸡肉脂肪或蛋白质。

实施例12：强碱对Reichardt染料脱色的影响

Reichardt染料与细胞壁成分如胞壁酸的相互作用的初步结果，以及旨在鉴定潜在的假阳性的工作，提示可能是与酸发生的反应促发了Reichardt染料的脱色。这导致这种推测，即酸-碱反应可能在所观察到的颜色变化中起到作用。故计划进行实验以测试强碱对脱色的Reichardt染料的影响。

用移液管吸取数滴Reichardt染料(160mg于10ml乙腈中)到SCOTT毛巾上，让其变干。将两种已知会引起颜色变化的化合物(乙酸和Aldrich缓冲液pH2.0)分别点滴在这些斑点中的两个上，这导致染料快速脱色。用移液管各吸取一滴1N NaOH到每个斑点上，造成快速再着色(re-colorization)。加入1N NaOH后Reichardt染料的蓝色/紫色恢复。

用指示喷剂进行第二个实验，以确证这些结果。用移液管将陈放生鸡肉汁吸取到电烤盘表面上，点滴的式样要易于辨认。将表面吸干，喷上Reichardt染料指示喷剂(160mg于10ml乙腈中)，造成染料脱色，表面外形为鸡汁的式样。然后将一滴1N NaOH点滴在脱色的区域，导致该小斑点再着色。对另一区域也重复这种操作。

为验证是否可能是1N NaOH仅仅作用于细菌而不是作用于染料，将陈放鸡汁和1摩尔浓度的NaOH等比例混合，并让混合物静置30秒钟。然后用该混合物点滴出另一个完全相同(不过小一点)的式样。该溶液也造成Reichardt染料的快速脱色，但是在加入1N NaOH时颜色恢复。

实施例13：用正常的和细菌性阴道病(BV)感染的阴道液测试Reichardt染料涂敷的背胶标签

鉴于细菌性阴道感染的广泛流行，进行实验以研究Reichardt染料包覆的背胶标签对健康(低pH，无细菌感染)、pH阳性/细菌性阴道病(BV)阴性(无细菌感染，但pH高出正常)和pH阳性/BV阳性(pH高出正常，已知有细菌感染)的阴道液样品的响应情况。一张背胶标签涂刷上两种不同浓度的Reichardt染料溶液(160mg/10mL乙腈，80mg/10mL乙腈，40mg/10mL乙腈，20mg/10mL乙腈)。用正常、BV阳性/pH阳性和BV阴性/pH阳性的阴道液样品测试每个浓度的背胶标签。

正常阴道液产生最明显的染料脱色，推测起来是由于乳酸杆菌和低pH这两个因素组合所致。BV阳性/pH阳性样品的脱色情况其次，可能是因为存在着大量的BV细菌。BV阴性/pH阳性样品只使染料微弱脱色，可能是因为乳酸杆菌的数量比正常样品少。三种脱色状态很容易区别，提示这种技术在阴道健康领域具有诊断潜力。

实施例14：用Reichardt染料指示喷剂测试普通表面

众所周知，细菌能在干燥表面上存活数小时，甚至数天。鉴定普通表面上的细菌和其它微生物并提醒消费者或工人注意污染情况的能力，将有助于清洁和消毒工作，有助于使传染扩散减至最低。

如图10所示，用旧计算机键盘作为模型“实际”表面来测试微生物指示喷剂(10A)。将Reichardt染料溶于异丙醇(160mg于10mL异丙醇中)，添加到基于气溶胶的喷雾装置。然后将键盘喷以指示溶液(10B)。

键盘喷以Reichardt染料指示溶液导致在某些区域染料快速脱色(10C)。有趣的是，只有一些按键或区域显示有污染，这使得可以具体鉴别出高度沾污的按键，如数字键盘。由于键盘经常使用而又很少清洁，该表面的确让人瞥见实际表面上的微生物水平。

实施例15：用表面活性剂提高细菌指示剂的灵敏度

制备Reichardt染料(80mg/10mL乙腈)和TWEEN80(200μL)聚氧乙烯表面活性剂(获自Fischer Scientific，Pittsburgh，PA)的溶液。然后用此溶液涂敷陶瓷表面(图11)，让其风干。将不含表面活性剂的另一Reichardt染料(80mg/10mL乙腈)溶液点滴在表面上，同样让其风干(11A)。干燥后，在每个涂敷区域上点滴一滴已知具有很高细菌数的陈放鸡汁(11B)。含TWEEN80表面活性剂的区域(11C)与不含TWEEN表面活性剂的区域(11D)相比，脱色速度要快得多(＞20-30秒)。此外，加入TWEEN表面活性剂还使染料容易从表面上除去。加入少量的水可使从表面上完全除去，而加水到不含表面活性剂的斑点并不使从表面上的除去变得容易。

实施例16：溶剂选择的重要性

对用各种不同溶剂制得的Reichardt染料涂层的性能进行评估。

制备Reichardt染料在乙腈、异丙醇和二甲苯中的溶液，用这些溶液涂敷SCOTT厨房用卷毛巾，让其风干(图12A和12D)。在受处理的毛巾上点滴100μl金黄色葡萄球菌等分试样(12B，E)，观察涂层的颜色变化。只有基于乙腈溶液的涂层在点滴细菌悬浮液处快速脱色(12C)。观察到Reichardt染料当溶于乙腈时颜色均匀。其它两种溶剂涂层没有观察到可见的颜色变化(12F)。

本发明人发现，可对Reichardt染料的浓度加以调整，使得异丙醇可用作染料的溶剂。虽然此时染料的颜色不如乙腈时那么强烈，但还是快速容易地观察到响应微生物污染而发生的脱色。

实施例17：N-二十二烷基份菁染料涂敷在棉织物上

将聚苯乙烯盘上覆盖着透明薄膜的半只新鲜鸡(获自超市)在室温下保藏三周。用移液管收集聚苯乙烯盘中汇集的浅黄色汁液，用于试验。

将47mg的溴化1-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)吡啶(获自Aldrich Chemical)与10g的二甲基甲酰胺混合。振摇后有少量的固形物剩余，让其沉淀下来。将橙色的上清液点滴到定量(29.2cm×20.3cm＝6.888g)的棉织物上，形成橙黄色圆圈。将一滴1N氢氧化钠溶液加入到棉织物上的一个橙黄色斑点，使颜色从橙黄色变成桃红橙色。

将陈放鸡汁点滴到棉织物上的橙黄色斑点上，使颜色变成很浅的黄色。颜色变化在棉织物上很快。同样，将陈放鸡汁点滴到棉织物上的桃红橙色区域(染料+NaOH溶液)，造成的颜色变化类似，即从桃红橙色变成很浅的黄色。

实施例18：N-甲基份菁涂敷在厨房用纸巾和陈放尿液上

收集女性尿液，在玻璃瓶中室温下保藏8天。如上所述合成以下结构的N-甲基份菁染料。将0.5g溶于20ml去离子水中，涂敷到SCOTT厨房用卷纸巾上(通过将纸巾浸入溶液)，让过量的溶液沥掉，然后让涂敷的纸巾在环境条件下干燥。用染料将纸巾染成深橙色。

将陈放尿液点滴到橙色纸巾上，立即产生颜色变化，从深橙色变成浅黄色。作为对照，将陈放尿液滤过0.2微米过滤器，以除去细菌和其它微生物。陈放尿液过滤后点滴到纸巾上并不引起颜色变化，这提示是陈放尿液中的微生物而不是其它成分造成颜色变化。

实施例19：N-甲基份菁涂敷在厨房用纸巾和陈放尿液上

收集女性尿液，在37℃下保藏24小时。汇集的女性尿液在这些条件下保藏后预计细菌负荷大约为1×10⁵CFU/ml。如上所述合成以下结构33的N-甲基份菁染料。将0.5g溶于20ml去离子水中，涂敷到SCOTT厨房用卷纸巾上(通过将纸巾浸入溶液)，让过量的溶液沥掉，然后让涂敷的纸巾在环境条件下干燥。用染料将纸巾染成深橙色。

将陈放尿液点滴到橙色纸巾上，立即产生颜色变化，从深橙色变成浅黄色。作为对照，将陈放尿液滤过0.2微米过滤器，以除去细菌和其它微生物。陈放尿液过滤后点滴到纸巾上并不引起颜色变化，这提示是陈放尿液中的微生物而不是其它成分造成颜色变化。

实施例20：N-甲基份菁涂敷在厨房用纸巾和宠物鸟大便上

由鸟笼里的相思鹦鹉收集粪便，放入大约10ml亚特兰大市家用自来水中振摇。如上所述合成以上结构33的N-甲基份菁染料。将0.5g溶于20ml ml去离子水中，涂敷到SCOTT厨房用卷纸巾上(通过将纸巾浸入溶液)，让过量的溶液沥掉，然后让涂敷的纸巾在环境条件下干燥。用染料将纸巾染成深橙色(图13A)。

将数滴相思鹦鹉粪便于自来水中的悬浮液点滴到涂敷纸巾上(13B)，在加入悬浮液的地方立即产生颜色变化，从深橙色变成浅黄色。作为对照，将亚特兰大市的家用自来水点滴到纸巾的不同区域，虽然颜色被水稍微稀释，但该区域仍为橙色。

实施例21(预示性)：用于涂层的指示染料

在良好搅拌下，1克羟丙基甲基纤维素、0.5克结构33的N-甲基份菁可溶于10克水和10克异丙醇的混合物中。可将此溶液涂敷到聚酯膜上并让其在室温下干燥，以产生能够检测微生物存在的涂敷柔韧性薄膜。

实施例22(预示性)：涂层中的指示染料

可将1g乙基纤维素、0.25g结构33的N-甲基份菁溶于20克四氢呋喃中。可将此溶液涂敷到聚酯膜上并让其在室温下干燥，以产生能够检测微生物存在的涂敷柔韧性薄膜。

实施例23：侧向流动装置

将Millipore硝基纤维素HF75膜(获自Millipore Corporation ofBillerica，MA，USA)叠覆在长度大约30厘米的塑料支持卡片(获自Millipore Corp.)上。用手将5重量百分比Reichardt染料的异丙醇溶液在检测区和对照区上划条纹。将薄膜在实验室烘箱中37.5°下干燥1小时。从烘箱取出薄膜卡片后，将纤维质芯材料垫(获自MilliporeCorp.，目录号CFSP203000)联结到薄膜上靠近对照区的一端。将卡片用以联结样品垫的另一端切下。然后将卡片切成4mm条带，形成半条状物(half stick)。

制作出半条状物后，将细菌溶液施加到检测薄膜的末端。毛细管作用将溶液和细菌吸到检测区中，在检测区可看到颜色变化。对照线条的颜色在整个试验过程中保持一样。

实施例24：环糊精增强

首先将SCOTT纸巾浸蘸涂敷羟丙基-β-环糊精(获自CerestarInternational，Hammond，IN，USA)的水溶液(1克于20ml中)，并在环境温度下风干。涂敷纸巾干后，用Reichardt染料的异丙醇溶液(1重量百分比)处理，让其风干。干燥的纸巾颜色为紫色/蓝色。正是环糊精阻碍了染料的结晶，使染料颜色更为鲜艳地显现在纸巾上。用该涂敷纸巾与革兰氏阴性细菌(大肠杆菌)进行试验，当将含10,000CFU/ml的培养基的100微升等分试样施加到纸巾时，发现不到5秒钟就变成无色。发现细菌浓度低至500CFU/ml也会出现该脱色现象，当然这需要长达15秒的时间。因此，据认为通过阻碍染料结晶，染料就会以单分子存在于基材上，从而染料对细菌水平的灵敏度提高。本发明人认为，在纸巾上仔细应用涂料(例如环糊精)，就会在基材表面上产生染料的单分子涂层，就会获得最大的灵敏度。

实施例25：干样品试验

用Reichardt染料涂敷的纸巾与“干”细菌样品(不在溶液中)进行试验。从含有一系列大肠杆菌生长培养物的琼脂培养皿中挑取菌落，制成干样品来使用。将此干样品擦涂到预润湿的染料涂敷SCOTT纸巾上。擦涂有菌落的区域在1-5秒内变成无色。这与湿擦巾的使用方式类似，且表现很好。

实施例26：漂白指示剂试验

将Reichardt染料和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)的混合物涂敷在SCOTT纸巾上，让其风干。将稀释的漂白溶液施加到纸巾上，导致Reichardt染料脱色和TMB变成橙色/黄色。这表明可将漂白指示剂组合到细菌指示擦拭物中。

在最后的试验中，向具有Reichardt染料和TMB涂层的SCOTT纸巾滴加大肠杆菌悬浮液，而使其暴露于细菌。纸巾接触到细菌的区域不到10秒钟就脱色成白色斑点。没有观察到橙色/黄色产生。

实施例27：份菁和两性离子染料的紫外-可见光吸收光谱

Reichardt染料不经进一步纯化即使用。N-正己基和N-正十二烷基份菁染料按有关上述合成。所用的溶剂获自Aldrich Chemical，为HPLC级。用Shimadzu UV-1601紫外-可见光分光光度计(ShimadzuCorporation)测量染料在400-800nm范围的最长波长峰吸收，所述染料溶于三种不同的溶剂中，装在适应比色皿里。下表是左边的溶剂与上方的染料进行试验的结果。

	己基份菁	十二烷基份菁	Reichardt染料
				丙酮	617.5nm(绿色)	617nm(绿色)	674nm(蓝绿色)
甲醇	514nm(橙色)	522nm(橙色)	509nm(红色)
				乙腈	582nm(浅绿色-蓝色)	600nm(蓝色)	623nm(蓝色)

份菁染料除较长波长吸收外，在近400nm处也显示有吸收，这会改变所感知到的颜色。

明显地，根据分光光度测量结果，这些微生物检测染料当溶于不同的溶剂中时，它们显示出最大波长峰吸收有大的偏移(＞10nm)。

实施例28：病毒检测

证实色原根据本发明检测病毒存在的能力。制备1型脊髓灰质炎病毒、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、鼻病毒、麻疹病毒、痘苗病毒和A型流感病毒，并将它们接种到用补加胎牛血清至5％浓度的Dulbecco′s Modified Ealge培养基(DMEM)繁殖饲养的MA-104胎猴肾细胞，在37℃±1℃、5％CO₂下温育6天。通过显微镜观察感染细胞片层(cell sheet)的细胞蜕变情况(致细胞病变效应，CPE)，如在至少50％的细胞片层中观察到变圆、皱缩、裂解、固缩等，检测病毒繁殖。细胞毒性测量为无病毒时物质所产生的细胞蜕变的程度。用十倍DMEM系列稀释液进行病毒的滴定，每个稀释4个重复MA 104培养物，每个重复样用0.1毫升病毒稀释液接种。按Reed和Muench的方法测定，病毒复制的程度计算为半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)。

用Reichardt染料涂敷的背胶标签(160毫克/10毫升乙腈、80毫克/10毫升乙腈、40毫克/10毫升乙腈和20毫克/10毫升乙腈)作为试验表面。将50毫升于培养基中的未稀释病毒(TCID₅₀10^-8脊髓灰质炎病毒/mL；TCID₅₀10^-7HSV-1/mL；TCID₅₀10^-7鼻病毒/mL；TCID₅₀10^-6麻疹病毒/mL；TCID₅₀10^-6痘苗病毒/mL和TCID₅₀10^-7流感病毒/mL)滴加到每张背胶标签上，让其静止3分钟，然后用棉签拭去液滴。对于稀释于培养基和盐水中的鼻病毒和脊髓灰质炎病毒，将单独培养基、无病毒细胞培养基和无病毒细胞培养盐水的等分试样用作对照样品，同样让其静止3分钟，然后拭去。对于其余的病毒(在其原始培养基中不加稀释进行使用)，只采用培养基对照。

对于脊髓灰质炎病毒，盐水对照似乎会干扰染料，而培养基则不引起颜色变化。因此实验的其余部分使用脊髓灰质炎病毒于培养基中的稀释液。将该病毒在培养基中作十倍系列稀释，取50微升等分试样施加到每张背胶标签。让液滴静止3分钟后，将其从背胶标签拭去。对于鼻病毒，发现培养基对照会产生干扰，而盐水对照则不导致染料颜色变化。因此，将该病毒于盐水中的十倍系列稀释液以50微升等分试样施加到背胶标签，3分钟后拭去。对于脊髓灰质炎病毒和鼻病毒，低至10^-6(十倍系列稀释的第六次稀释)时背胶标签都会变色，这表明染料涂敷背胶标签具有检测这些病毒的灵敏度(脊髓灰质炎病毒所致脱色稍强)。对于HSV-1、A型流感病毒、麻疹病毒和痘苗病毒，只将50微升的(未稀释)病毒液滴点滴在背胶标签上。将随后所观察到的脱色情况与无病毒对照培养基和沙门氏菌(10⁸CFU/mL)阳性对照所观察到的脱色情况进行比较。虽然暴露于未稀释的HSV-1病毒时脱色不如沙门氏菌所观察到的脱色那么强烈，但所导致的背胶标签脱色比鼻病毒和脊髓灰质炎病毒所观察到的脱色强烈。响应A型流感病毒、痘苗病毒和麻疹病毒而发生的脱色比其它病毒所观察到的脱色要弱。

还制备了两种Reichardt染料溶液(80毫克/10毫升乙腈，加或不加400毫升TWEEN 80表面活性剂)。用移液管吸取脊髓灰质炎病毒或鼻病毒(均在培养基中未稀释)100微升液滴到折叠的SCOTT纸巾上，并向每个含病毒斑点加入Reichardt染料液滴。对于含表面活性剂和不含表面活性剂的两种溶液，颜色都是快速消失。继续加入染料至颜色持续(大约9滴)。还对前述的相同培养基和盐水对照进行试验。培养基的确显示出一定的染料脱色能力，而盐水所呈现的滴定行为与前述用水所观察到的一样。

实施例29：细菌污染的半定量

对Reichardt染料提供细菌浓度半定量信息的能力进行证实。将纸类基材(Neenah Bond^TM)(获自美国乔治亚州Alpharetta市的NeenahPaper，Inc.)先用Reichardt染料溶液(80毫克/10毫升乙腈)如下进行处理：将纸浸蘸到涂料中或者在纸上涂刷涂料，然后将纸晾干。将七滴已知浓度的金黄色葡萄球菌(10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷CFU/毫升)点滴在每张纸的顶部。大约2分钟后，将液滴吸去，显示在金黄色葡萄球菌浓度为10⁵CFU/mL或以上时颜色变化明显。较低浓度时颜色差异不是那么明显，特别是对于涂刷的纸张。

然后进行盲研究。出于试验目的，将100微升浓度为10⁶CFU/mL的第一液滴点滴在浸蘸涂敷纸张含Reichardt染料的部分上。将100微升浓度为10⁵CFU/mL的第二液滴点滴在涂刷纸张含Reichardt染料的部分上。最后，将含10⁴CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌的第三液滴点滴在浸蘸涂敷纸张含Reichardt染料的部分上。两名实验参与者不知道这三个液滴的浓度。大约2分钟后，将液滴吸去。使用对照区域，这两名实验参与者各自目测估计每个样品的浓度。两个人都正确地估计到第一样品的浓度为10⁶CFU/mL。他们还正确地猜测到第二样品的浓度为10⁵CFU/mL。但他们都不正确地将第三样品的浓度估计为10³CFU/mL。据认为该错误至少部分是由于在低于10⁵CFU/mL的浓度下对照区域的颜色差异相对较低所致。不过本发明人认为，可容易地选定色原的浓度和涂层的均匀性，以在这种低浓度下获得准确结果。在任何情况下，由于对照区域在较高浓度下(例如10⁵CFU/mL或以上)可提供更为明显的颜色差异，因此认为在临床更相关的高浓度下会获得准确的结果。

实施例30：细菌污染的定量

对Reichardt染料提供细菌浓度定量信息的能力进行证实。将纸类基材(Neenah Bond^TM)(获自美国乔治亚州Alpharetta市的NeenahPaper，Inc.)和标签(获自Avery-Dennison)先用Reichardt染料溶液(80毫克/10毫升乙腈)进行涂敷并晾干。使用金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和大肠杆菌的已知浓度等分试样(100微升)，制作各种细菌的对照曲线。更具体地说，将涂敷Reichardt染料的指示条暴露于数量渐减的细菌等分试样。在施加每个等分试样后，用手提式分光光度计测定每个CFU/mL浓度的ΔE值(用L^*、A^*和B^*值计算)。结果在下表4(对纸)和表5(对标签)中给出。

表4：纸类基材的结果

log CFU/ml	ΔE(金黄色葡萄球菌)	ΔE(大肠杆菌)	ΔE(绿脓假单胞菌)
				8	-	9.3642	-
7	11.73368	4.3483	4.9569
				6	3.876455	3.2574	1.3193
5	2.447325	2.3320	1.7151
				4	2.074175	3.0123	2.2358
3	1.866789	3.8228	1.7900

表5：标签基材的结果

log CFU/ml	ΔE(金黄色葡萄球菌)	ΔE(大肠杆菌)	ΔE(绿脓假单胞菌)
				7	18.62321	7.778702	6.9567
6	6.908263	4.866590	4.2419
				5	6.919863	4.643888	4.6519
4	4.791472	5.200596	4.9473
				3	5.413890	5.130312	3.8787

由以上数据分别产生金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌和大肠杆菌的标准检测曲线，如图5-7所示。图中可见，每种类型细菌以稍不相同的方式改变染料处理过的基材的颜色，产生独特的标准曲线。之后，将未知细菌浓度的液滴点滴在背胶标签上，用分光光度计测量所产生颜色的ΔE值。每个未知样品所获得的数值在下表6-7中给出。

表6：纸类基材的结果

金黄色葡萄球菌			大肠杆菌			绿脓假单胞菌
									logCFU/ml(实际)	ΔE	logCFU/ml(估计)	logCFU/ml(实际)	ΔE	logCFU/ml(估计)	logCFU/ml(实际)	ΔE	logCFU/ml(估计)
5	3.16136	5	3	1.3605	5	3	1.0267	5

表7：标签基材的结果

金黄色葡萄球菌			大肠杆菌			绿脓假单胞菌
									logCFU/ml(实际)	ΔE	logCFU/ml(估计)	logCFU/ml(实际)	ΔE	logCFU/ml(估计)	logCFU/ml(实际)	ΔE	logCFU/ml(估计)
6	6.869068	5-6	7	7.1157	7	6	4.4954	5-6
									6	4.228215	3	-	-	-	6	4.1002	3-6

从数据可以看出，通过确定未知浓度的ΔE值最接近哪个已知ΔE值，可预测出该未知浓度。虽然一些结果不完全准确，但本发明人认为改进涂层的均匀性会进一步提高检测准确度。

比较实施例(非本发明实施例)

将陈放鸡肉用作比较实施例的细菌来源。将聚苯乙烯盘上覆盖着透明薄膜的半只新鲜鸡肉(获自超市)在室温下保藏三周。用移液管收集聚苯乙烯盘中汇集的浅黄色汁液，用于试验。

比较实施例1：

将陈放鸡汁点到SCOTT纸巾上。将以下结构34的CI Acid Green41(获自Aldrich Chemical)溶液(0.008mol/l)(羟基蒽醌染料的实例)点滴到陈放鸡汁上。没有观察到颜色变化。作为对照，将100mgReichardt染料悬浮于10ml乙腈中。将此悬浮液点滴到陈放鸡汁上，立即脱色。

比较实施例2：

将陈放鸡汁点滴到SCOTT纸巾上。将以下结构35的CI AcidGreen 25溶液(0.008mol/l)(蒽醌染料的实例)点滴到陈放鸡汁上。没有观察到颜色变化。作为对照，将100mg Reichardt染料悬浮于10ml乙腈中。将此悬浮液点滴到陈放鸡汁上，立即脱色。

比较实施例3：

将陈放鸡汁点滴到SCOTT纸巾上。将50mg的以下结构36的CI Acid Red 37(获自Aldrich Chemical)(氨基偶氮染料的实例)溶于10ml去离子水中。将此染料溶液点滴到纸巾上的陈放鸡汁上。没有观察到颜色变化。作为对照，将100mg Reichardt染料悬浮于10ml乙腈中。将此悬浮液点滴到陈放鸡汁上，立即脱色。

比较实施例4：

将陈放鸡汁点滴到SCOTT纸巾上。将50mg的以下结构37的CI Acid Yellow 23(也称食用色素柠檬黄)(获自Aldrich Chemical)(苯基吡唑酮染料的实例)溶于10ml去离子水中。将此染料溶液点滴到纸巾上的陈放鸡汁上。没有观察到颜色变化。作为对照，将100mgReichardt染料悬浮于10ml乙腈中。将此悬浮液点滴到陈放鸡汁上，立即脱色。

比较实施例5：

将陈放鸡汁点滴到SCOTT纸巾上。将以下结构38的CI AcidRed 52(磺酰罗丹明B)(呫吨染料的实例)的水溶液点滴到纸巾上的陈放鸡汁上。没有观察到颜色变化。作为对照，将100mg Reichardt染料悬浮于10ml乙腈中。将此悬浮液点滴到陈放鸡汁上，立即脱色。

比较实施例6：

将陈放鸡汁点滴到SCOTT纸巾上。将30mg的以下结构39的CI Acid Blue 74(也称靛蓝胭脂红)(获自Aldrich Chemical)(靛类染料的实例)溶于10ml去离子水中。将此染料溶液点滴到纸巾上的陈放鸡汁上。没有观察到颜色变化。作为对照，将100mg Reichardt染料悬浮于10ml乙腈中。将此悬浮液点滴到陈放鸡汁上，立即脱色。

本领域技术人员会认识到，对本发明作出各种变化和改动可认为在本领域技术人员的能力范围内。这种变化的实例包含在上文确定的本专利中，每个实施例通过引用整体结合到本文中，结合的程度与本说明书相符合。本发明人意图是这种变化和改动落入本发明的范围之内。还要认识到，当根据以上公开内容阅读时，不能将本发明的范围解释为限于本文公开的具体实施方案，本发明范围只应根据所附的权利要求书解释。

Claims (22)

1.一种半定量或定量检测样品中微生物存在的方法，所述方法包括：

使试验染料与样品接触，使得试验染料发生可检测的颜色变化；

然后，将试验染料的颜色与对照染料的颜色进行比较，其中对照染料的颜色对应于已知的微生物浓度。

2.权利要求1的方法，其中所述试验染料、对照染料或两者是溶剂化变色染料。

3.权利要求1的方法，其中所述试验染料、对照染料或两者是份菁染料。

4.权利要求3的方法，其中所述份菁染料具有以下结构：

5.权利要求1的方法，其中所述试验染料、对照染料或两者是两性离子染料。

6.权利要求5的方法，其中所述两性离子染料是N-酚酸甜菜碱染料。

7.权利要求5的方法，其中所述两性离子染料是Reichardt染料。

8.权利要求5的方法，其中所述两性离子染料具有以下结构：

其中，

n为0或更大；

X为氧、碳、氮或硫。

9.权利要求1的方法，其中将所述试验染料的颜色与多种对照染料的颜色进行比较，其中所述对照染料各自具有对应于不同的已知微生物浓度的颜色。

10.一种半定量或定量检测样品中微生物存在的方法，所述方法包括：

使溶剂化变色试样染料与样品接触，使得试验染料发生可检测的颜色变化；

然后，将所述试验染料的颜色与多种溶剂化变色对照染料的颜色进行比较，其中所述对照染料各自具有对应于不同的已知微生物浓度的颜色。

11.权利要求10的方法，其中所述试验染料和对照染料是份菁染料、N-酚酸甜菜碱染料或它们的组合。

12.权利要求10的方法，其中所述试验染料和对照染料是Reichardt染料。

13.前述权利要求任一项的方法，所述方法进一步包括测量试验染料、一种或多种对照染料或它们的组合的颜色强度。

14.权利要求13的方法，其中所述试验染料的颜色强度与试验样品当中微生物的浓度成比例。

15.权利要求13的方法，所述方法进一步包括通过将一种或多种对照染料的颜色强度对多个已知的微生物浓度作图，产生检测曲线。

16.权利要求15的方法，所述方法进一步包括将所述试验染料的颜色强度与所述检测曲线上的微生物浓度进行关联。

17.前述权利要求任一项的方法，其中基材限定含有试验染料的检测区和含有一种或多种对照染料的对照区。

18.前述权利要求任一项的方法，其中所述颜色变化在小于约5分钟内发生，优选在小于1分钟内发生。

19.一种供半定量或定量检测样品中微生物存在的基材，所述基材限定检测区和对照区，其中试验染料包含在检测区中，所述试验染料在微生物存在下能够发生可检测的颜色变化，且其中多种对照染料包含在对照区中，每种对照染料的颜色对应于不同的已知微生物浓度。

20.权利要求19的基材，其中所述试验染料、对照染料或它们的组合是溶剂化变色染料。

21.权利要求19的基材，其中所述试验染料、对照染料或它们的组合是份菁染料、N-酚酸甜菜碱染料或它们的组合。

22.权利要求19的基材，其中所述试验染料、对照染料或它们的组合是Reichardt染料。

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