CN101077865A - 新的酞嗪类衍生物及其制法和药物组合物与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通式I所示的一系列新的1－酰胺基－4－(吡啶－4－亚甲基)酞嗪类衍生物，其可药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物，及其制备方法，含有一个或多个这类化合物的组合物，和该类化合物的药物用途，尤其用于增殖性疾病，如肿瘤疾病的治疗，炎性风湿性及类风湿疾病及疼痛，新血管形成障碍导致的疾病如眼部黄斑病变和视网膜病等。

Description

新的酞嗪类衍生物及其制法和药物组合物与用途

技术领域

本发明涉及通式I的一系列新的1-酰胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物，其可药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物，及其制备方法，含有一个或多个这类化合物的组合物，和该类化合物的药物用途，尤其用于增殖性疾病，如肿瘤疾病的治疗，炎性风湿性及类风湿疾病及疼痛，新血管形成导致的疾病如眼部黄斑病变和视网膜病等。

背景技术

目前癌症仍是最致命的疾病之一，化疗是抑制肿瘤生长和癌细胞扩散，使肿瘤消退的重要手段。传统的化疗药物多数为直接攻击DNA或抑制其合成及功能的细胞毒类药物，杀死癌细胞的同时也杀伤正常细胞，并只对增殖快的肿瘤有效，副作用强。为了提高对癌细胞作用的选择性，人们已在研究不通过抑制DNA合成机理的抗癌剂的另一途径。

近年来，由于肿瘤发生发展的分子机制研究取得了惊人的进展，新药的研究转向在癌的病因学和病理过程中起作用的特异性的分子生物靶点(Science，260(5110)：918-919(1993).Science，267(5205)：1782-1787(1995)。研究表明，80％以上的癌基因和原癌基因存在于人的癌编码蛋白酪氨酸激酶(PTK)中，人类各种癌症的产生和发展是和来自于蛋白酪氨酸激酶的异常细胞信号传导有关的，恶性细胞的一个主要特点是酪氨酸激酶活性的增加。另外，正常原致癌酪氨酸激酶的过度表达也可引起增生性疾病。实验室中已经证明：通过过分表达或变异各种受体酪氨酸激酶，增加其活性，正常细胞能够被转化成癌细胞，恶性转变的程度是与酪氨酸激酶活性密切相关；而且，通过利用受体的抗体或专门的激酶抑制剂降低受体中激酶活性又能使癌变逆转(Drugs，59(4)：753(2000).)。因此，抑制酪氨酸激酶活性，阻断其活化的信号传导路径成为控制肿瘤的新途径。

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子(Biochem BiophysRes Commun，1989；161(2)：851)，具有增加血管的通透性，刺激内皮细胞的增殖、迁移、和血管的形成。它的生物学效应是通过特异的膜受体介导实现的。迄今已发现VEGF的3种受体，分别是Flt1、KDR、Flt4，它们本质上都是酪氨酸蛋白激酶受体，属于第三亚型。受体的胞外区含有7个免疫球蛋白样结构区域，胞内区含有酪氨酸蛋白激酶结构区域，两者之间被一段插入序列所间隔。VEGF受体介导的信号转导与其他酪氨酸激酶受体相似，而VEGF与其它生长因子不同，它的高亲合力受体主要局限于内皮细胞，这决定它与肿瘤血管生成密切相关。

肿瘤生长依赖于新生血管的形成。肿瘤生长存在两个阶段，血管前期和血管期。肿瘤聚集体生成后首先进入无血管生长期，此期肿瘤通过弥散作用获得足够的营养和氧并运走代谢产物。当肿瘤体积增至1-2mm³以上时，如果没有新生血管长入，肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。一旦血管长入肿瘤，新生血管不仅为肿瘤提供必需的氧和营养物质，还提供大量的促生长因子，肿瘤将快速生长并达到难以控制的体积。因此，新血管生成被誉为肿瘤生长的“开关”。

新血管生成还是肿瘤转移的关键步骤。肿瘤内微血管密度与肿瘤的恶性表型密切相关，新生血管为肿瘤细胞提供了转移通道。肿瘤新生血管不成熟，结构缺乏完整性，缺乏细胞间连接，管壁薄弱，仅排列一层内皮细胞，缺乏平滑肌细胞，基底膜不完整，因此穿透性较高。此外，肿瘤血管化使间质内压力增高，加快了淋巴回流。血管丰富的肿瘤有更高的转移率，肿瘤内微血管密度(MVD)已成为预测肿瘤转移，复发和判断预后的重要指标。胰腺癌MVD与肿瘤恶性程度直接相关，MVD高者预后差。目前已在卵巢癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、胰腺癌等癌组织中发现VEGF及其受体的mRNA的过度表达，并证实在淋巴瘤、恶性胶质瘤等瘤体及肿瘤周围血管上有VEGF蛋白的存在。因此，通过调控VEGF，抑制肿瘤新生血管形成和控制肿瘤细胞的生长及转移成为治疗肿瘤的有效途经。

另外，VEGF广泛的分布于人和动物体内的脑、肾、肝、脾、肺及骨骼等组织内，参与正常胚胎发育，卵泡成熟及肾脏等生理性调节，并在炎症、创伤愈合、心脏缺血、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病变等与血管生成和病变相关的诸多病理过程中起重要作用。

目前，已发现的几百个具有血管生成抑制活性的化合物中，十几个正处在临床实验阶段，其中SU-11248，PTK-787和(-)-EGCG三个小分子化合物正进行三期临床实验。虽然上述抗癌化合物对本领域作出了很大贡献，但为改进抗癌药物，本领域仍在继续研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的酞嗪类衍生物，或其可药用盐，或其溶剂化物，或为前药或其前药，或其多晶或共晶。

本发明的另一目的在于提供一种制备新的酞嗪类衍生物的方法。

本发明的再一目的在于提供一种含有一个或多个这种化合物的药物组合物。

本发明的又一目的在于提供一种该类化合物在抗癌，及与VEGF有关疾病的药物中的用途。

为了完成本发明之目的，可采用如下技术方案：

本发明是涉及具有下列通式I的新型1-酰胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物：

式中

R1为一个或两个，可独立选自：氢，卤素，羟基，烷基，烷氧基，氨基，烷基氨基。

R1为一个或两个，分别独立优选为：氢，卤素，烷基，烷氧基。

R1为一个或两个，分别独立更优选为：氢，卤素。

R1为一个或两个，分别独立特别优选为：氢，氟，氯。

R2可选自：氢，MO(M＝钾，钠，锂，钙，镁)，羧烷基，烷氧甲酰烷氧基，烷(芳)基，烷(芳)氧基，烷(芳)酰氧甲氧基。

R2优选为：氢，甲基，正丙基，3-羟基丙基，4-羟基丁基，3-乙酰氧丙基，4-乙酰氧丁基，甲氧基，乙氧基，异丙氧基，叔丁氧基，叔丁酰氧甲氧基，乙酰氧甲氧基，苄氧基，3-氟苄氧基，2-吗啉代乙氧基，3-吗啉代丙氧基，2-哌啶子基乙氧基，3-哌啶子基丙氧基，2-(哌嗪-1-基)乙氧基，3-(哌嗪-1-基)丙氧基，2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基，3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基，2-吡咯烷子基乙氧基，3-吡咯烷子基丙氧基，2-(2-氧代吡咯烷子基)乙氧基，3-(2-氧代吡咯烷子基)丙氧基，2-(咪唑-1-基)-乙氧基，3-(咪唑-1-基)-丙氧基。苯甲酰氧甲氧基。

R2更优选为：氢，正丙基，3-乙酰氧丙基，甲氧基，异丙氧基，叔丁氧基，苄氧基，2-吗啉代乙氧基，3-吗啉代丙氧基，3-哌啶子基丙氧基，叔丁酰氧甲氧基，3-(哌嗪-1-基)丙氧基，3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基，3-吡咯烷子基丙氧基，3-(2-氧代吡咯烷子基)丙氧基，3-(咪唑-1-基)-丙氧基。乙酰氧甲氧基，异丁酰氧甲氧基，苯甲酰氧甲氧基。

R2最优选为：氢，3-乙酰氧丙基，甲氧基，异丙氧基，叔丁氧基，苄氧基，2-吗啉代乙氧基，3-吗啉代丙氧基，3-哌啶子基丙氧基，叔丁酰氧甲氧基，乙酰氧甲氧基，苯甲酰氧甲氧基。

R3为一个或多个，可为邻位、间位或对位，可独立选自：卤素，C_1-12烷基，三氟甲基，羟甲基，羟基，硝基，氰基，氨基，取代的氨基，酰氨基，羧基，酯基，氨酰基，C_1-12烷氧基，烷酰氧基，烯基，卤代苄氧基，卤代苄氨基，卤代苯氧基，卤代苯氨基。

R3为一个或两个，独立优选为：卤素，C_1-8烷基，三氟甲基，羟甲基，羟基，硝基，氰基，酯基，氨基，取代的氨基，酰氨基，羧基，酯基，氨酰基，C_1-8烷氧基，烷酰氧基，烯基。

R3为一个或两个，分别独立更优选为：卤素，C_1-6烷基，三氟甲基，C_1-6烷氧基，硝基，氰基，酯基，氨基，取代的氨基。

R3硝基，氰基，酯基，

R3为一个或两个，分别独立特别优选为：氟，氯，甲基，三氟甲基，甲氧基，硝基，氰基，酯基。

本发明中卤素为氟、氯、溴、碘。

“烷”基选自C_1-12的直链或支链，可包含碳环或杂环(含有1-3个氧或氮或硫原子)，取代或不取代的烷基，其中取代基包括卤素(氟、氯、溴、碘)，羟基，硝基，硝酸酯基，氰基，氨基，取代的氨基，酰氨基，羧基，酯基，烷氧基，烷酰氧基，烷氨基，“芳”基，氧代。

“芳”基选自取代或不取代的芳环和芳杂环，如苯环，萘环，喹啉环，异喹啉环，吡咯环，吡啶环，嘧啶环，呋喃环，噻吩环，咪唑环，取代基选自卤素，甲基，三氟甲基，羟基，硝基，硝酸酯基，氨基，取代的氨基，酰氨基，羧基，酯基，烷氧基，烷酰氧基。

另外，特别优选的本发明化合物为通式I酞嗪类衍生物或其可药用酸加成盐。

为了制备本发明通式I所述的化合物，本发明的制备方法包括：一种是利用取代的苯胺先与酰氯或酯或酐作用给出N-取代的酰胺，然后再在强碱作用下生成N负离子与4-卤代酞嗪衍生物或4-酰氧基酞嗪衍生物或4-磺酰氧基酞嗪衍生物反应给出4-酰氨基酞嗪衍生物。

另一种是依据已报道的常规方法合成1-取代苯胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物，然后在碱性介质中使胺与酰氯或酯或酐反应生成1-酰胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物。

另外，上述反应中的起始原料及中间体很容易得到，或对本领域熟练技术人员来说可以用有机合成中的常规方法很容易合成。通式I所述酞嗪衍生物可以溶剂化物或非溶剂化物的形式存在，利用不同的溶剂进行结晶可能得到不同的溶剂化物。通式I所述药学上可接受的碱性的酞嗪衍生物的盐包括不同酸加成盐，如下列无机酸或有机酸的酸加成盐：盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，甲磺酸，对甲苯磺酸，三氟乙酸，枸杞酸，马来酸，酒石酸，富马酸，柠檬酸，乳酸。通式I所述药学上可接受的酸性的酞嗪衍生物的盐包括不同碱金属盐(锂，钠，钾盐)，碱土金属盐(钙，镁盐)及铵盐，和能提供生理上可接受的阳离子的有机碱的盐，如甲胺，二甲胺，三甲胺，哌啶，吗啉及三(2-羟乙基)胺的盐。在本发明范围内的所有这些盐都可采用常规方法制备。在所述的酞嗪衍生物及其溶剂化物和其盐的制备过程中，不同结晶条件可能出现多晶或共晶。

本发明还涉及一种含有药物有效剂量的如通式I所述的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明化合物是酪氨酸激酶抑制剂或其前体，具有明显的抗肿瘤活性。本发明化合物具有较高的生物利用度，可用于多种人类恶性肿瘤的治疗，包括卵巢癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、胰腺癌，淋巴瘤、恶性胶质瘤等。

本发明化合物可用口服方法或非肠胃道用药。口服用药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，非经肠用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为制造片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉，乳糖，明胶，糖浆、甘油、蜂蜡、阿拉伯胶，微粉硅胶，滑石粉，聚乙二醇。液体剂型所用的溶剂例如有水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，例如表面活性剂，润滑剂，抗氧化剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等。

在片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂，注射剂或栓剂中含有本发明式I化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明式I化合物一般含量为10-50mg，优选的单元剂型含有20-100mg。

附图说明

图1.在体内中空纤维培养系统中FVE-3和PTK787对肿瘤细胞诱导的血管生成的抑制作用.A：空白；B：对照；C：PTK787 50毫克/公斤；D：PTK787 100毫克/公斤；E：PTK787 150毫克/公斤；F：FVE-3 100毫克/公斤；G：FVE-3 150毫克/公斤；H：FVE-3 200毫克/公斤

图2.FVE-3(n＝6)对裸鼠中HT-29肿瘤的抑制作用.A：肿瘤体积-时间曲线；B：最后一天肿瘤重量(d 21).ap＜0.05，bp＜0.01(与对照比较)。

图3.FVE-3和PTK787对另一种人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤生长的影响A：肿瘤体积-时间曲线；B：最后一天肿瘤重量(d 21)。ap＜0.05，bp＜0.01(与对照比较)。

具体实施方式

以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。

测定仪器：熔点用Yanaco显微熔点仪，核磁共振光谱用VaariaanMercury 300型核磁共振仪。质谱用ZAD-2F和VG300质谱仪。

实施例1(FVE-3)

将0.48克氢化钠(60％)(12毫摩尔)和50毫升无水四氢呋喃置于100毫升烧瓶中，搅拌下滴加1.28克(10毫摩尔)对氯苯胺溶于10毫升无水四氢呋喃的溶液，然后加热回流一小时，冷至室温，加入2.6克(12毫摩尔)二叔丁氧甲酸酐，搅拌0.5小时后再加热回流14小时，冷至室温，加入饱和氯化铵水溶液中和，用饱和碳酸氢钠洗涤，水洗，饱和盐溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂得到N-叔丁氧甲酰基对氯苯胺，干燥后直接用于下一步反应。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)7.32-7.22(m，4H，ArH)，6.48(S，1H，NH)，1.53(S，9H，CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝228.6

将227毫克(1毫摩尔)N-叔丁氧甲酰基对氯苯胺溶于10毫升无水DMF中，加入48毫克(60％)(1.2毫摩尔)氢化钠室温搅拌10分钟，加入255毫克(1毫摩尔)1-氯-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪，室温搅拌直至原料点消失，倾入冰冷的碳酸氢钠溶液中，乙酸乙酯萃取2次，碳酸氢钠溶液洗涤，水洗，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，柱层析得到标题产物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)8.07(d，2H，ArH)，7.78(m，3H，ArH)，7.40(m，3H，ArH)，7.26(m，4H，ArH)，6.09(m，2H，ArH)，1.57(S，9H，CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝447.9

将346毫克(1mmol)1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶亚甲基)酞嗪溶于10毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1毫升无水三乙胺，然后滴加262毫克(1.2mmol)二叔丁氧甲酸酐和5毫升N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液，室温下搅拌至原料点消失，倾入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，分别用水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残余物柱层析分离同样得到标题产物。

实施例2

将346毫克(1mmol)1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶亚甲基)酞嗪溶于15毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1毫升无水三乙胺，然后滴加129毫克(1.2mmol)乙氧基甲酰氯和5毫升N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液，室温下搅拌至原料点消失，倾入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，分别用水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残余物柱层析分离得到标题产物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)8.88(d，1H，J＝8.0Hz，ArH)，8.00(m，2H，ArH)，7.85(m，1H，ArH)，7.60(m，5H，ArH)，7.02(m，1H，ArH)，6.78(m，2H，ArH)，6.37(d，1H，CH2)，5.88(S，1H，CH2)，4.42(m，2H，CH2)，1.41(t，3H，CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝419.8。

实施例3

将346毫克(1mmol)1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶亚甲基)酞嗪溶于10毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1毫升无水三乙胺，然后滴加163毫克(1.2mmol)异丁氧基甲酰氯和5毫升N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液，室温下搅拌至原料点消失，倾入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，分别用水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残余物柱层析分离得到标题产物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)8.68(d，1H，ArH)，7.89(m，3H，ArH)，7.59(m，1H，ArH)，7.43(m，2H，ArH)，7.22(m，3H，ArH)，6.90(m，2H，ArH)，6.25(d，1H，CH2)，5.98(S，1H，CH2)，4.11(m，2H，CH2)，2.05(m，1H，CH)，0.99(d，6H，CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝447.9。

实施例4

将346毫克(1mmol)1-(4-氯苯氨基)-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪溶于15毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1毫升无水三乙胺，然后滴加113毫克(1.2mmol)甲氧基甲酰氯和5毫升N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液，室温下搅拌至原料点消失，倾入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，分别用水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残余物柱层析分离得到标题产物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)8.88(d，1H，ArH)，8.00(m，4H，ArH)，7.60(m，4H，ArH)，7.31(m，1H，ArH)，7.20(m，1H，ArH)，6.85(m，1H，ArH)，6.36(d，1H，CH2)，5.91(S，1H，CH2)，3.95(S，2H，CH2)，3.99(S，3H，-CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝405.8

将185.6毫克(1毫摩尔)对氯苯氨基甲酸甲酯和256毫克(1毫摩尔)1-氯-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪溶于10毫升无水DMF中，室温搅拌下加入44毫克(1.1毫摩尔)60％的氢化钠，直至原料消失，加入饱和氯化铵溶液中止反应，乙酸乙酯萃取，分别用饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，柱层析得到同样标题产物。

实施例5

将346毫克(1mmol)1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶亚甲基)酞嗪溶于20毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1毫升无水三乙胺，然后滴加94毫克(1.2mmol)乙酰氯和5毫升N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液，室温下搅拌至原料点消失，倾入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，分别用水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残余物柱层析分离得到标题产物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)8.89(m，2H，ArH)，8.20(m，4H，ArH)，7.70(m，1H，ArH)，7.50(m，2H，ArH)，7.40(m，3H，ArH)，4.42(S，2H，CH2)，2.38(S，3H，CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝389.8

实施例6

将346毫克(1mmol)1-(4-氯苯氨基)-4-(4-吡啶亚甲基)酞嗪溶于20毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1毫升无水三乙胺，然后滴加262毫克(1.2mmol)二叔丁氧甲酸酐和5毫升N，N-二甲基甲酰胺组成的溶液，室温下搅拌至原料点消失，倾入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，分别用水洗，饱和碳酸氢钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残余物柱层析分离得到标题产物。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)，δ(ppm)8.68(d，2H，ArH)，8.34(d，1H，ArH)，8.09(m，2H，ArH)，7.93(d，2H，ArH)，7.48(d，2H，ArH)，7.21(d，3H，ArH)，4.66(S，2H，CH2)，2.34(S，3H，CH3)，2.04(S，3H，CH3)，1.73(S，3H，CH3)，1.62(S，3H，CH3).

MS-FAB：M⁺+1＝427.5

药理实验

实验例1中空纤维法分析FVE-3对肿瘤诱导的血管生成

原理：

中空纤维培养系统是一种半透膜性质的培养体系，可以让分子量小于500kD的分子自由通过。因此，肿瘤细胞分泌的VEGF等生长因子可以透过中空纤维壁，分泌到纤维周围，从而促进纤维外周的包膜上形成新生血管。而药物分子也可以通过纤维管壁进入中空纤维，影响中空纤维培养体系内肿瘤细胞的生长。

材料：

(1)、药品和材料

PTK787，分子量346，浅黄色粉末；FVE-3，分子量446，橙色粉末，均由本所合成室冯志强研究员实验室提供，体外实验用DMSO配制；整体动物实验，用5％PEG400配制腹腔注射给药。CellMax中空纤维培养系统，美国Laboratories公司产品。

(2)、细胞株

人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF-7、人非小细胞肺癌细胞A549

步骤：

(1)、细胞的准备：各受试细胞株均在含10％FCS以及2mmol/L L-谷氨酸的RPMI1640中培养。对数生长期的细胞用胰酶消化，离心，并用含20％FCS的RPMI1640将细胞稀释成0.25-10×10⁶/mL的单细胞悬液，于4℃保存，备用。

(2)、含细胞的中空纤维的准备：

①PVDF中空纤维(直径1mm，可以阻挡分子量为500kD的化合物，大约20,000-200,000细胞/20μL/2cm PVDF fiber)。实验前用70％的乙醇冲洗，并将纤维段浸泡于其中至少96h。临用前，用去离子水将纤维段至少冲洗3遍，并且将纤维段充满水，然后将纤维段浸泡于去离子水中，进行高压灭菌。

②取上述灭菌后的纤维段置于无菌的平皿中，并在其中充满含20％FCS的RPMI1640，然后将平皿于37℃平衡至少12h。

③细胞的灌装，在细胞灌装之前，先将上述处理好的纤维段用冰冷的含20％的RPMI1640中冷却。然后将已经制备好的细胞悬液通过1ml注射器(4号针头)注入中空纤维中，再用平头持针器进行热封，随后用加热后的持针器先将纤维段分成若干小段，每段约为1-2cm，剪断后将各小段放入盛有完全培养基(4℃)的平皿中，37℃，5％CO₂，孵育过夜。

(3)、纤维段的植入：

Balb/C Nu裸鼠，18-22g，雌性，戊巴比妥钠麻醉(50mg/Kg)。

皮下移植(subcutaneous，SC)：在裸鼠颈背部做一小切口，将纤维段植入裸鼠皮下组织中，缝合切口。

(4)、新生血管的分析

纤维段植入24h后开始给药，连续给药21d，每天一次。于末次给药24h后处死动物，切开背部皮肤，照相，用ImagePro Plus 5.0软件分析血管生成情况。

结果：

图1所示为FVE-3和PTK787对A549、HT29和MCF-7细胞诱导的血管生成的抑制作用，Table 1为ImagePro Plus 5.0软件的半定量统计的结果。从中可以看出，给药21天后，与空白培养基组相比，模型组的血管生成明显丰富。而PTK787和FVE-3的给药组均有明显的抑制作用。

表1 FVE-3对肿瘤诱导的血管生成影响(n＝3)

组别	心血管的相对面积(％)
		空白组模型组PTK787 50mg/kgPTK787 100mg/kgPTK787 150mg/kgFVE-3 100mg/kgFVE-3 150mg/kgFVE-3 200mg/kg	0.26±0.194.17±0.37b2.89±0.13d2.20±0.21d2.32±0.17d3.07±0.12d2.04±0.16d2.37±0.16d

bp＜0.01和空白组比较；dp＜0.01和对照组比较

实验例2、FVE-3对结肠癌HT-29、HCT-116裸鼠移植性肿瘤的生长抑制作用

原理：裸鼠又称无胸腺小鼠，先天性胸腺缺如，其胸腺依赖性免疫功能缺乏。人体肿瘤异种移植时无排斥反应，故可供人体肿瘤移植。异种移植后的人体肿瘤在裸鼠仍保持其原有的组织形态及免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药的原有敏感型。移植后的人功能性肿瘤仍保持其原有的功能。

材料：BALB/C/Nu裸鼠

步骤：雄性4-6周龄BALB/C/Nu裸鼠，于背部皮内接种HT-29或HCT-116人结肠癌细胞1×10⁷/只，当肿瘤长至1cm³左右时，无菌条件下取下部分瘤块，切成1mm³瘤块，用套管针接种到实验裸鼠背部皮下，形成皮下移植瘤。接种48h后随机分组，每组6只。各样品每周连续给药6d。上述各组动物每周两次测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，三周后结束实验，取下肿瘤组织称重并计算肿瘤抑制率。瘤块用10％的甲醛-PBS溶液固定，石蜡包埋后切片，免疫组化法检测相关蛋白表达情况。

结果：

图2.所示为FVE-3和PTK787对人结肠癌细胞HT-29裸鼠移植瘤生长的影响。结果表明，FVE-3和阳性对照药PTK787裸鼠肿瘤的生长曲线均有明显的影响，使其生长明显减慢；给药21天后，肿瘤湿重显著降低，PTK787两个剂量组的抑制率分别为48.2％、53.6％(p＜0.01)，而FVE-3的抑制率分别为30.4％和53.6％(p＜0.05)。

图3.所示为FVE-3和PTK787对另一种人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤生长的影响。与HT-29细胞的结果一样，FVE-3和阳性对照药PTK787对肿瘤生长呈现明显抑制，抑制率分别为63.0％、68.0％(p＜0.01)和39.7％、42.0％(p＜0.05)。

Claims (9)

1、如通式(I)所示的1-酰胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物，包括其可药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物

式中

R1为一个或两个，独立的选自：氢，卤素，羟基，烷基，烷氧基，氨基，烷基氨基；

R2选自：氢，MO(M＝钾，钠，锂，钙，镁)，羧烷基，烷氧甲酰烷氧基，烷(芳)基，烷(芳)氧基，烷(芳)酰氧甲氧基；

R3为一个或多个，可为邻位、间位或对位，独立的选自：卤素，C_1-12烷基，三氟甲基，羟甲基，羟基，硝基，氰基，氨基，取代的氨基，酰氨基，羧基，酯基，氨酰基，C_1-12烷氧基，烷酰氧基，烯基，卤代苄氧基，卤代苄氨基，卤代苯氧基，卤代苯氨基。

2、根据权利要求1的化合物，其特征在于，

R1为一个或两个，独立的选自：氢，卤素，烷基，烷氧基；

R2选自：氢，甲基，正丙基，3-羟基丙基，4-羟基丁基，3-乙酰氧丙基，4-乙酰氧丁基，甲氧基，乙氧基，异丙氧基，叔丁氧基，叔丁酰氧甲氧基，乙酰氧甲氧基，苄氧基，3-氟苄氧基，2-吗啉代乙氧基，3-吗啉代丙氧基，2-哌啶子基乙氧基，3-哌啶子基丙氧基，2-(哌嗪-1-基)乙氧基，3-(哌嗪-1-基)丙氧基，2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基，3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基，2-吡咯烷子基乙氧基，3-吡咯烷子基丙氧基，2-(2-氧代吡咯烷子基)乙氧基，3-(2-氧代吡咯烷子基)丙氧基，2-(咪唑-1-基)-乙氧基，3-(咪唑-1-基)-丙氧基。苯甲酰氧甲氧基；

R3为一个或两个，独立的选自：卤素，C_1-8烷基，三氟甲基，羟甲基，羟基，硝基，氰基，酯基，氨基，取代的氨基，酰氨基，羧基，酯基，氨酰基，C_1-8烷氧基，烷酰氧基，烯基。

3、根据权利要求2的化合物，其特征在于，

R1为一个或两个，分别独立的选自：氢，卤素；

R2独立的选自：氢，正丙基，3-乙酰氧丙基，甲氧基，异丙氧基，叔丁氧基，苄氧基，2-吗啉代乙氧基，3-吗啉代丙氧基，3-哌啶子基丙氧基，叔丁酰氧甲氧基，3-(哌嗪-1-基)丙氧基，3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基，3-吡咯烷子基丙氧基，3-(2-氧代吡咯烷子基)丙氧基，3-(咪唑-1-基)-丙氧基。乙酰氧甲氧基，异丁酰氧甲氧基，苯甲酰氧甲氧基；

R3为一个或两个，分别独立的选自：卤素，C_1-6烷基，三氟甲基，C_1-6烷氧基，硝基，氰基，酯基，氨基，取代的氨基。

4、根据权利要求3的化合物，其特征在于，

R1为一个或两个，分别独立的选自：氢，氟，氯；

R2选自：氢，3-乙酰氧丙基，甲氧基，异丙氧基，叔丁氧基，苄氧基，2-吗啉代乙氧基，3-吗啉代丙氧基，3-哌啶子基丙氧基，叔丁酰氧甲氧基，乙酰氧甲氧基，苯甲酰氧甲氧基；

R3为一个或两个，分别独立的选自：氟，氯，甲基，三氟甲基，甲氧基，硝基，氰基，酯基。

5、根据权利要求4的化合物，其特征在于，所述化合物选自

6、权利要求1-5的化合物的制备方法，包括如下步骤：

A)取代的苯胺先与酰氯或酯或酐作用给出N-取代的酰胺，

B)在强碱作用下生成N负离子与4-卤代酞嗪衍生物或4-酰氧基酞嗪衍生物或4-磺酰氧基酞嗪衍生物反应给出4-酰氨基酞嗪衍生物。

7、权利要求1-5的化合物制备方法，包括如下步骤：

A)常规方法合成1-取代苯胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物，

B)在碱性介质中使胺与酰氯或酯或酐反应生成1-酰胺基-4-(吡啶-4-亚甲基)酞嗪类衍生物。

8、一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如权利要求1-5所述的任一化合物及药用载体。

9、根据权利要求1-5所述的化合物在制备预防和/或治疗肿瘤、炎性风湿性疾病、类风湿疾病、眼部黄斑病变、视网膜疾病和/或疼痛的药物中的应用。

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