CN101077356A - 一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗肿瘤及其它药物中的应用 - Google Patents

一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗肿瘤及其它药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗肿瘤药物中的用途。本发明提供了制备方法。

Description

一种蜈蚣藻多糖提取物在制备抗肿瘤及其它药物中的应用
技术领域：
本发明属于中药技术领域。具体涉及一种植物提取物，尤其是涉及一种蜈蚣藻多糖提取物、其制备方法及其在制备抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
心脑血管疾病和肿瘤是当前威胁人类健康最大的两类疾病。目前临床上针对此两类疾病的药物很多，但通常都具有一定的毒副作用。如已有多年临床应用的抗凝血药肝素，是很好的抗凝血类药物。同时，它作为一种血管生成抑制剂用于肿瘤的治疗也有很好的效果。但其最大的缺点是常导致难以控制的出血，从而限制了其更为广泛的应用。目前科学家正试图通过两条途径来解决：一是通过化学降解或全合成的方式获得小分子量肝素类似物；一是从其他来源分离纯化获得具有高的血管生成抑制活性而没有或只有很低的抗凝血活性的多糖。在前一途径中科学家们发现了一些活性高于肝素的小分子量的肝素或硫酸化肝素，并全合成了活性远高于肝素的一些寡糖(Digabreiele，A.D.et al.Nature，1998，393：812-817；Ram，S.et al.Nature Review：Cancer.2002，2：521-528.)，但通过该途径的成本太高。
本发明人在对红藻中多糖成分的研究中发现蜈蚣藻多糖(GFP)不但具有抗凝血作用，而且还具有较强的抗血栓、抗HIV-1病毒和抗肿瘤作用。有关蜈蚣藻多糖的结构及其抗肿瘤活性、抗HIV-1病毒、抗血栓与抗凝血活性均未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计蜈蚣藻多糖的药物用途。
本发明提供了一种具有抗凝血、抗HIV-1病毒、抗血栓和抗肿瘤作用的蜈蚣藻多糖提取物。本发明还提供蜈蚣藻多糖提取物在制备抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗肿瘤药物中的用途。
本发明的技术方案为：
一种蜈蚣藻多糖提取物，含下列重量配比成份：72～82％半乳糖、5～15％3，6-脱水半乳糖、0.5～5％2-甲基半乳糖和1～10％6-甲基半乳糖。该提取物还含有1～10％木糖和1～10％葡萄糖。特别是，本发明的提取物含有下列重量配比成分：75.0％半乳糖、9.6％3，6-脱水半乳糖、0.5％2-甲基半乳糖、3.5％6-甲基半乳糖、2.1％木糖、9.5％葡萄糖和25.7％硫酸基团。
本发明还提供了一种制备蜈蚣藻多糖提取物的方法。
本发明的蜈蚣藻多糖提取物可由如下方法制得：将蜈蚣藻粉碎后用10-30倍量热水提取1～3小时，温度控制在90～100℃，溶液pH控制在5～7之间，得一提取液；
将所述提取液经离心后留上清液，搅拌下加入1～3倍量的乙醇，再次离心留沉淀物；和
将所述沉淀物溶于水后冷冻干燥得到蜈蚣藻多糖提取物。
优选将所述溶液的pH控制在6～7之间。
本发明制备蜈蚣藻多糖提取物的方法，具体包括下列步骤：
(1)将蜈蚣藻粉碎后用其重量的10-30倍量热水用热水提取1～3小时，温度控制在90～100℃，溶液pH控制在5～7之间，得提取液；
(2)将所述提取液经离心后留上清液，搅拌下加入1～3倍量的乙醇，再次离心留沉淀物；和
(3)将所述沉淀物溶于水后冷冻干燥得到蜈蚣藻多糖提取物。
优选将所述骤(1)溶液的pH控制在6～7之间。
本发明的另一目的是提供了蜈蚣藻多糖提取物在制备抗凝血、抗血栓和/或抗肿瘤药物中的用途。特别是在制备抗白血病、肺癌或S-180肉瘤的药物中的用途。
本发明的蜈蚣藻多糖提取物通过下列试验证实了具有抑制肿瘤细胞作用；抗凝血活性；抗血栓作用和抗艾滋病毒(HIV-1)活性。
(1)蜈蚣藻多糖提取物A(GFP)体外/体内抑制肿瘤细胞生长实验(实施例5)
(2)蜈蚣藻多糖提取物体外对凝血酶原时间(PT)的影响(实施例6)
(3)蜈蚣藻多糖提取物体外对活化部分凝血酶时间(APTT)的影响(实施例7)
(4)体内法测定蜈蚣藻多糖提取物静脉注射对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT的影响(实施例8)
(5)体内法蜈蚣藻多糖提取物口服对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT的影响(实施例9)
(6)静脉注射GFP对下腔静脉血栓形成的影响(实施例10)
(7)口服GFP对下腔静脉血栓形成的影响(实施例11)
(8)蜈蚣藻多糖对HIV-1病毒抑制作用(实施例12)
本发明的蜈蚣藻多糖提取物中可加入可药用载体以促进其给药。较佳的，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量比的提取物。“可药用载体”不会破坏蜈蚣藻多糖提取物的药学活性，同时其有效用量，即能够起到药物载体作用时的用量对人体无毒。
“可药用载体”包括但不限于：离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(SEDDS)如d-α-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温(Tweens)或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活化剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二纳、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙稀酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛酯、环糊精如α-、β-及γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的蜈蚣藻多糖提取物的药物传递。
其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬酯酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。
上述蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。肠道给药制剂包括丸剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液或溶液。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、膏剂、贴剂或喷雾剂。非肠道给药途径包括皮下、皮内、动脉、静脉、肌肉、关节、滑液、胸骨、鞘内、病灶内、颅内注射或滴注。其它给药途径可包括局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、粘膜、气管或尿道。蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物还可以通过气雾吸入或植入蓄积或针刺等方式给药。
蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物的口服制剂包括但不限于：胶囊、片剂、乳剂、水悬浮剂、胶体液、溶液、微胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、粉剂。常用于片剂的可药用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还会加入硬脂酸镁等润滑剂。常用于胶囊剂的可药用载体包括乳糖和干玉米淀粉。当制成口服水悬浮剂和/或乳剂时，蜈蚣藻多糖提取物可悬浮或溶解于油相里并与乳化剂或悬浮剂相结合。如果需要，也可以加入一些甜味剂和/或香味剂和/或增色剂。
本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物可被制成无菌注射剂，如无菌水相或油相悬浮液。该悬浮液可按本领域的常规方法即使用适宜的分散剂或湿润剂(如Tween 80)及悬浮剂等制得。其还可以是在可肠道外给药的无毒稀释剂或溶剂中的水溶液或悬浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液。相关的可用载体或溶剂包括甘露醇、水、林格氏液、等渗氯化钠等。另外，无菌的固定油常被作为溶剂或悬浮剂的媒介，因而包括合成甘油单酯或甘油二酯在内的多种柔和的固定油(bland fixed oil)均适用。脂肪酸，如十八烯酸及其甘油酯衍生物(如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯基衍生物)等可用于制备所述注射剂。所述油溶液或悬浮液还可包含一种长链的乙醇稀释剂或分散剂或羧甲基纤维素或类似的其他分散剂，此类物质常用于制备可药用乳剂和/或悬浮剂。其它一些制剂常用的表面活性剂如Tweens或Spans和/或其他类似的乳化剂或生物利用度促进剂等也同样可用于制备本制剂。
本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物可制成栓剂通过直肠给药，方法是将蜈蚣藻多糖提取物与适宜的非刺激性赋形剂混合，后者在室温下为固体而在直肠温度下为液体，因而该栓剂可融解于直肠中并释放出活性成份。此类赋形剂包括但不限于；可可油、蜂蜡和聚乙烯。本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物的局部给药制剂(如油膏)可直接用于患处。此类局部制剂含有活性成份及可药用载体，后者包括但不限于：矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯或聚氧丙稀化合物、乳化腊或水。另外，本发明的药物组合物还可制成洗剂或油剂。适用的载体包括但不限于：矿物油、三梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸腊酯、十六烷醇、2-十八烷醇、苯甲基乙醇或水。本发明的蜈蚣藻多糖提取物还可制成灌肠剂等用于直肠局部给药。局部透皮贴剂亦在本发明的保护范围之内。本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物亦可经鼻喷雾或者吸入给药，即按本领域的常规方法，使用苯甲基乙醇或其他防腐剂、吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他增溶剂或分散剂制得盐溶液。
本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物还可通过植入给药。采用植入给药方式可达到在给药对象体内持续，定时释放本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物的效果。另外，植入给药还能在局部组织和器官定位给药(Negrin et al.，Biomaterials 22(6)：563，2001)定时释放技术亦可用于本发明蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物的给药中，如基于聚合体技术的定时释药胶囊、缓释技术和制剂包裹技术(如聚合体和脂质体)等。
贴剂同样包括在本发明的范围之内。其包括基层(如聚合体、布、纱和绷带)和本发明的药物组合物。基层的一边可设有一保护层以防止活性成份的流出。所述贴剂还可含有一用于固定的粘合剂，后者可以是一种自然的或者合成的物质，当其与给药对象的皮肤接触时可暂时粘附于皮肤上。粘合剂可以是防水的。
当本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物和制剂可与一种或多种附加的治疗药物或预防药物混合。附加药剂可作为独立的剂型与本发明的蜈蚣藻多糖提取物、及其药物组合物分别给药。附加药剂也可和本发明的蜈蚣藻多糖提取物及其药物组合物一起以单一剂型给药。
为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而绝非对本发明的任何形式的限制。
实施例1  制备蜈蚣藻多糖提取物A
蜈蚣藻300g粉碎，然后加入90℃水6升提取1小时，期间加入冰醋酸控制提取液的pH值为6.2。离心得上清液5升，搅拌下加入95％乙醇15升，离心，弃去上清液。沉淀物溶于水3升，冷冻干燥得蜈蚣藻多糖10g(A提取物)。
实施例2  制备蜈蚣藻多糖提取物B
蜈蚣藻1.5kg粉碎，然后加入沸水50升提取2小时，期间加入冰醋酸控制提取液的pH值为6.8。离心得上清液浓缩至30升，搅拌下加入95％乙醇60升，离心，弃去上清液。沉淀物溶于水10升，冷冻干燥的蜈蚣藻多糖60g(B提取物)。
实施例3  制备蜈蚣藻多糖提取物C
蜈蚣藻1.0kg粉碎，然后加入70℃水30升提取3小时，期间加入冰醋酸控制提取液的pH值为5.5。离心得上清液浓缩至15升，搅拌下加入95％乙醇15升，离心，弃去上清液。沉淀物溶于水10升，冷冻干燥的蜈蚣藻多糖31g(C提取物)。
实施例4  蜈蚣藻多糖提取物结构特征的确证
蜈蚣藻多糖提取物1mg经2mol/L三氟乙酸水解，硼氢化钠还原，醋酐乙酰化后进行GC分析，表明蜈蚣藻多糖提取物含有75.0％半乳糖、9.6％3，6-脱水半乳糖、0.5％2-甲基半乳糖、3.5％6-甲基半乳糖、2.1％木糖和9.5％葡萄糖.
经比色法测定蜈蚣藻多糖提取物中含有25.7％硫酸基团。
实施例5  蜈蚣藻多糖提取物A(GFP)体外/体内抑制肿瘤细胞生长实验
经实验证实：GFP对小鼠白血病肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，在1mg/ml时抑制率为100％。GFP对人肺腺癌肿瘤细胞的生长同样具有明显的抑制作用，在1mg/ml时抑制率为94.％。
实验小鼠移植S-180肉瘤后第二天按80mg/kg、40mg/kg静脉给药，连续7天，测定实验组与对照组平均瘤重，结果表明80mg/kg时GFP对小鼠移植性S-180肉瘤具有明显的抑制作用(P＜0.01)(表1)。
                表1GFP对小鼠S-180肉瘤的抑制作用
  组别   剂量(mg/kg)   平均瘤重±SD   抑瘤率(％)   P值
  对照组(NS)   1.62±0.52   -----   -----
  GFP   40   1.17±0.43   27.8
  GFP   80   0.78±0.23   51.9   ＜0.01
  5-FU   50   0.10±0.05   93.8   ＜0.01
实施例6  蜈蚣藻多糖提取物体外对凝血酶原时间(PT)的影响(表2)
       表2蜈蚣藻多糖提取物体外对PT的影响
  组别   样本数   PT(X±SD)s  P值
  Normal   9   14.56±1.64
  肝素钠   9   24.38±1.22  ＜0.001
  GFP10mg/ml   9   44.96±6.21  ＜0.001
  GFP1mg/ml   9   22.79±2.70  ＜0.001
结果显示GFP大剂量和小剂量均能明显延长凝血酶原时间，与正常组比均有显著性差异，表明GFP具有抗凝血活性。
实施例7  蜈蚣藻多糖提取物体外对活化部分凝血酶时间(APTT)的影响(表3)
    表3蜈蚣藻多糖提取物体外对APTT的影响
  组别   样本数   APTT(X±SD)s  P值
  Normal   9   38.94±13.15
  肝素钠   9   120.00±0.00  ＜0.001
  GFP1mg/ml   9   121.45±4.10  ＜0.001
结果显示GFP能明显延长活化部分凝血活酶时间，与正常组比较有显著性差异，表明GFP具有抗凝血活性。
实施例8  体内法测定蜈蚣藻多糖提取物静脉注射对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT的影响(表4)
      表4蜈蚣藻多糖提取物静脉注射对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT的影响
  组别   凝血时间(X±SD)s   流血时间(X±SD)s   PT(X±SD)s   APTT(X±SD)s
  Normal   112.8±18.7   205.0±44.9   14.2±1.3   38.0±6.2
  肝素钠   285.2±37.2***   336.5±40.7***   26.2±4.5***   117.6±6.2***
  GFP10mg/kg   241.5±47.4***   325.2±46.5***   55.8±15.3***   118.2±3.8***
  GFP5.0mg/kg   228.6±41.3***   322.7±54.0***   34.3±11.7**   114.6±9.6***
  GFP2.5mg/kg   183.6±34.5**   312.0±66.3***   23.1±3.4***   110.8±17.0***
**P＜0.01，***P＜0.001
结果显示GFP静脉注射对小鼠凝血时间、流血事件、PT、APTT均有明显的延长作用，与正常组有显著性差异，表明GFP静脉注射具有良好的抗凝血作用。
实施例9  体内法蜈蚣藻多糖提取物口服对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT的影响(表5)
   表5蜈蚣藻多糖提取物口服对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT的影响
  组别   凝血时间(X±SD)s   流血时间(X±SD)s   PT(X±SD)s   APTT(X±SD)s
  Normal   110.5±16.5   173.6±16.1   12.7±1.6   36.6±4.9
  华法林钠   169.5±37.1*   302.3±55.0***   30.9±4.1***   109.4±8.1***
  GFP10mg/kg   160.5±20.6***   213.4.2±24.0***   28.7±4.1***   93.8±15.7***
  GFP5.0mg/kg   166.9±14.6***   213.0±28.8**   28.9±3.7***   95.7±13.5***
  GFP2.5mg/kg   132.9±13.4*   197.5±7.3*   25.8±5.5**   57.9±15.8*
*P＜0.05，**P＜0.01，P＜0.001
结果显示GFP口服对小鼠凝血时间、流血时间、PT、APTT均有明显延长作用，与正常组比有显著性差异，表明GFP口服亦有抗凝血作用。
实施例10  静脉注射GFP对下腔静脉血栓形成的影响(表6)
          表6静脉注射GFP对下腔静脉血栓形成的影响
  组别  样本数(n)   血栓湿重( X±SD)s(mg)   血栓干重( X±SD)s(mg)
  Normal  8   29.9±4.4   16.5±1.9
  ASP   8   15.6±4.3***   8.8±2.7***
  GFP10mg/kg   8   13.9±5.8***   8.2±3.4***
  GFP5mg/kg   8   20.6±2.4***   11.7±1.6***
  GFP2.5mg/kg   8   23.4±2.8**   12.0±1.8***
*表示与正常组相比有显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)
结果显示静脉注射GFP各剂量组均能显著的减少小鼠血栓干湿重，表明蜈蚣藻多糖具有良好的抗血栓作用.
实施例11  口服GFP对下腔静脉血栓形成的影响(表7)
                   表7口服GFP对下腔静脉血栓形成的影响
  组别  样本数(n)   血栓湿重( X±SD)s(mg)   血栓干重( X±SD)s(mg)
  Normal  8   13.6±2.8***   7.9±1.5***
  ASP5mg/kg  8   3.6±1.0***   1.9±0.4***
  GFP10mg/kg  8   4.0±2.1***   2.6±1.1***
  GFP5mg/kg  8   4.5±2.7***   2.7±1.5***
  GFP2.5mg/kg  8   5.8±2.2***   3.3±1.3***
*表示与正常组相比有显著性差异(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)
结果显示口服GFP各剂量组均能显著减少小鼠血栓干湿重，表明GFP口服亦具有良好的抗血栓作用.
实施例12  蜈蚣藻多糖对HIV-1病毒抑制作用(表8)
   表8蜈蚣藻多糖对HIV-1病毒的抑制作用
  sample  IC50μM  EC50μM  EC90μM TI
  GFP  ＞10  0.005  0.57 ＞2000
  DS  1  0.002  0.23 500
结果表明蜈蚣藻多糖对未感染HIV-1病毒细胞的半致死剂量大于10μM，50％有效抑制剂量为0.005μM，90％有效抑制剂量为0.57μM，治疗指数大于2000.同批实验阳性药(硫酸化右旋糖苷)的半致死剂量为1μM，50％有效抑制剂量为0.002μM，90％有效抑制剂量为0.23μM，治疗指数为500.表明蜈蚣藻多糖具有良好的抗HIV-1病毒活性。

Claims (9)

1、一种蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于该提取物含有下列重量配比的成份：72～82％半乳糖、5～15％3，6-脱水半乳糖、0.5～5％2-甲基半乳糖和1～10％6-甲基半乳糖。
2、根据权利要求1所述的一种蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于该提取物还含有1～10％木糖和1～10％葡萄糖。
3、一种蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于该提取物含有下列重量配比的成份：75.0％半乳糖、9.6％3，6-脱水半乳糖、0.5％2-甲基半乳糖、3.5％6-甲基半乳糖、2.1％木糖、9.5％葡萄糖和25.7％硫酸基团。
4、一种如权利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)将蜈蚣藻粉碎后用其重量的10-30倍量热水提取1～3小时，温度控制在90～100℃，溶液pH控制在5～7之间，得提取液；
(2)将所述提取液经离心后留上清液，搅拌下加入1～3倍量的乙醇，再次离心留沉淀物；和
(3)将所述沉淀物溶于水后冷冻干燥得到蜈蚣藻多糖提取物。
5、根据权利要求4所述的一种蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于其中所述步骤(1)的提取溶液pH为6～7。
6、一种权利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
7、一种权利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制备抗凝血药物中的应用。
8、一种权利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制备抗血栓药物中的应用。
9、一种权利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制备抗艾滋病药物中的应用。
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