CN101074943A - 一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，该尿液蛋白质指纹图谱由4个质荷比(M/Z)位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白质或多肽(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成，采用人工神经网络(Artificial neural networks，ANN)前馈式反向传算法的方法进行质谱数据的分析。本发明通过检测尿液蛋白质指纹图谱，提供一种新的非侵入性的检测方法，从而为糖尿病肾病早期发现、为进一步寻找早期糖尿病肾病的特异性生物标记、为糖尿病肾病的病机探索和开发新的治疗方法提供思路。

Description

一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法

技术领域

本发明属于指纹图谱的检测方法，涉及一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，为一种新的非侵入性的检测方法，用于糖尿病早期肾病的辅助诊断。

背景技术

糖尿病(DM)是继心血管、肿瘤之后第三位严重危害人类健康的疾病，患病人数正随着生活水平的提高、人口老龄化、生活方式的改变而迅速增加。截止2003年，全世界糖尿病患者已达1.35亿，其中中国有2380万，预计到2025年DM总人数达到3亿。DM的最大危害在其脏器并发症，其中糖尿病肾病是DM最常见、最重要的并发症，也是DM患者死亡的主要原因之一。临床上大约30％～50％的1型DM患者和20％的2型DM患者伴有明显的肾脏损害，其中约1/3进一步发展为晚期糖尿病肾病和终末期肾功能衰竭(ESRD)。在发达国家和国内一些发达地区，糖尿病肾病是ESRD血液透析病人的首位病因。其确切发病机制至今未明，高糖毒性、肾脏血流动力学改变、脂代谢紊乱、高血压影响以及吸烟、低出生体重、身材矮小、遗传、种族、性别、环境等均是糖尿病肾病的危险因素，同时又具有遗传上的多态性。所以寻找对糖尿病肾病高度特异的生物标记物，用于筛选与其发生发展相关的基因，早期诊断和预防糖尿病肾病，成为目前研究的重要方向。新近出现的蛋白芯片技术是一种全新的蛋白质组学研究手段，该方法克服了传统蛋白质组学研究方法存在的诸多问题，实现了质谱技术用于临床检测的飞跃，为从蛋白分子水平探索研究糖尿病肾病展现又一崭新前景。

一般认为10年以上病程的糖尿病发生肾脏损害的机会很大。但是新近有研究提出糖尿病肾病与个体的易感基因密切相关，有可能终身不发生，也可能一起病就累及肾脏。目前对其易感基因的研究涉及糖脂代谢相关(如醛糖还原酶基因、葡萄糖转运蛋白-1基因、载脂蛋白基因)、血流动力学相关(如内皮素-1基因、肾素血管紧张素基因、一氧化氮合酶基因)以及胰岛素敏感性、细胞外基质代谢、信号传导相关基因等方面，但均是特异性不高。而针对这些机制的一些特殊治疗，如内皮素抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、TGF-β中和抗体等等，在人体均未能得到证实。因而，对DN患者尚缺乏有效的治疗手段，即出现临床蛋白尿后，大部分患者将不可避免地进入终末期肾功能衰竭。然而早期肾病的发展是可以被阻止或延缓的，更早期病变甚至是可以逆转的，关键是做到早期诊断。

临床上糖尿病肾病分为五期，其中微量白蛋白尿是当前国内、外公认的早期诊断DN指标。微量白蛋白尿是指24h尿白蛋白定量30-300mg(mogensen糖尿病肾病分期法)或随机尿白蛋白与肌酐比值30-300mg/g.cr。但此时也已是DN III期，而且微量白蛋白尿可能受到其它多种因素，如尿路感染、月经期、剧烈运动、高血压、心脏病及其他肾病等因素影响。事实上，在出现微量白蛋白尿之前(即I、II高肾小球滤过期)，肾脏已出现病理改变，包括肾小球基膜增厚，细胞外基质增生，与此相应也出现了尿蛋白异常，这些多为一些低浓度的小分子蛋白，用传统的检测方法(如免疫法、金标定量渗滤法、磺基水杨酸法、溴酚兰法)很难检测到。因此探索和建立一种简便的，同时灵敏度和特异性均较高的糖尿病最早期肾病生物标记物十分必要。

SELDI-TOF-MS技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法。以这一技术为基础开发的系列蛋白质芯片可以非特异性的结合被测样本中的各种蛋白质，当在质谱仪中受激光轰击时，各种结合的蛋白质会被激发而形成气化离子，由于不同质荷比的离子在电场中飞行的时间长短不一，因此接收装置可根据蛋白质质荷比的不同及量的多寡直观地用位置、强弱不同的峰表现出来，进而形成相应图谱，用于分析、判别。这一方法具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点，可检测到fmol(10^-15mol)数量级的微量蛋白质，并且样本不需进行精细的分离，粗样本就可直接点样。对照分析患者和正常人的质谱图，可发现和捕获新的特异性疾病相关蛋白及其特征。然而，通过这一方法获得的数据是海量的，必需要运用生物信息学手段来分析处理。人工神经网络(ANNs)和支持向量机(SVMs)是近年来开发和应用最广泛的生物信息学算法，也已成熟用于蛋白芯片的研究。目前，用SELDI蛋白芯片技术获得有意义成果的数量已经日益凸现，在筛选肿瘤标记物、多囊卵巢综合征和系统性红斑狼疮的研究中都有多项报道，有的已应用临床，但在糖尿病的研究中只有很少报道。本研究采用SELDI-TOF-MS芯片技术，进行糖尿病患者的尿液蛋白质质谱检测，以往多数糖尿病蛋白芯片研究都着眼于患者的血清及相关组织，对于尿液蛋白质质谱的研究甚少。尿蛋白的60％来自血浆蛋白，40％来自肾脏及其它泌尿生殖组织，因此不仅能反映肾脏的病变，还能体现机体的代谢异常。有学者用毛细血管电泳(CE)联合质谱技术发现1型糖尿病的尿液中有1000余种蛋白，分子量为800D-66.5KD。而在2型糖尿病亲属的尿液中发现分子量100KD的蛋白，与胰岛素抵抗有关。尿液样本获取方便，芯片高通量、大样本的特点也适宜疾病筛查，在临床上有很大的潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，通过以下步骤实现：

(1)尿白蛋白准备：

根据测定的尿白蛋白分为四组，A组：健康对照组，B组：尿白蛋白＜30mg/g.cr，C组：30≤尿白蛋白≤300mg/g.cr，D组：尿白蛋白＞300mg/g.cr，分装冻存于-80℃低温冰箱中；

(2)数据收集和处理：采用PBS-II型表面增强激光解析-电离时间飞行质谱仪(SELDI-TOF-MS)进行质谱数据收集，其中激光强度150，检测敏感度6，收集数据的质荷比范围为1000～100000，收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次，采用H4(疏水性)蛋白质芯片、去离子水，基质SPA(sinapinic acid，芥子酸)；

(3)对获得的质谱数据进行检测：采用人工神经网络(Artificial neuralnetworks，ANN)前馈式反向传算法的方法进行质谱数据的分析，该蛋白质指纹图谱由4个质荷比(M/Z)位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白质或多肽(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修饰前或修饰后)所组成。对尿白蛋白质荷比峰值进行ROC(Receiver operating characteristic接受者工作特征)分析。

本发明应用SELDI-TOF-MS，对糖尿病患者和正常对照组的尿液蛋白质做筛选，在捕获到的1000余种蛋白质中大部分没有差异，利用Biomarker Wizard初步聚类，产生200个左右有差异的质荷比峰值。提示SELDI-TOF-MS芯片可有效避免血液中正常滤过的和肾脏及其它泌尿组织正常分泌的蛋白的干扰，捕获到尿液中的微量蛋白，通过蛋白质芯片的检测可以从糖尿病患者的尿液中找到与疾病相关的微量差异性蛋白。

进一步分析发现，(1)糖尿病患者无蛋白尿和微量白蛋白尿组(B和C组)比较筛选出18种差异蛋白中有14种的M/Z＜10000，通过P值评价每个峰，有5种蛋白比Alb(白蛋白)的差异更有显著性，说明在糖尿病肾病早期尿液中存在的蛋白以小分子蛋白为主，而且尚存在比Alb更有特异性甚至更早出现的蛋白。目前传统的检测方法能检出的尿蛋白如Alb(分子量69KD)、转铁蛋白(77KD)、a1-微球蛋白(26KD)、B2-微球蛋白(11.8KD)、NAG酶(130-150KD)等都是大分子蛋白。因此进一步优化筛选并纯化、分析和鉴定这些小分子蛋白有助于寻找糖尿病肾病的极早期诊断标志物并深入探求其病因。(2)B、C、D组三组比较得到的差异蛋白中Alb和转铁蛋白的差异最明显，表明III期及以上的糖尿病肾病蛋白尿中大分子蛋白明显增多，Alb对此有很好的诊断敏感性和特异性。而16种随着Alb的升高而降低的M/Z的均值中15种小于10000，说明这些表达下调，可能对肾脏有保护作用的蛋白绝大多数是小分子蛋白。

本发明的有益之处是：通过检测尿液蛋白质指纹图谱，提供一种新的非侵入性的检测方法，从而为糖尿病肾病早期发现、进一步寻找早期糖尿病肾病的特异性生物标记、为糖尿病肾病的病机探索和开发新的治疗方法提供思路。

附图说明

图1为ANN示意图。

图2为糖尿病与健康者尿液蛋白质质谱图。

图3为4个M/Z峰的ROC曲线下的面积结果。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例：

1.样本和临床资料：

106例糖尿病者的尿液标本来自浙江大学医学院附属第二医院内分泌科住院患者，50例正常对照的尿液标本取自本院体检的自愿健康人群。糖尿病诊断标准依据1999年WHO分型诊断标准。其中1型14例，2型92例；年龄10-82岁，平均58岁。男性57例，女性46例。所有患者病情基本稳定，无急性并发症及严重肝功能损害，并除外全身或泌尿道感染、心力衰竭、发热、妊娠、结缔组织病及其他原发性肾小球或肾小管间质性疾病。同时收集年龄、性别、分型、体重指数(BMI)、血压、尿微量白蛋白(白蛋白)等临床相关资料。50例健康对照与糖尿病组性别、年龄相匹配。

2.研究对象分组：

入选者根据尿白蛋白分为四个组，A组：健康对照组50例；B组：尿白蛋白＜30mg/g.cr，45例；C组：30＜尿白蛋白＜300mg/g.cr，35例；D组：尿白蛋白＞300mg/g.cr，26例。

以上样本全部留取清晨中段尿5-10ml，以2000rpm(900g)离心5min后取上清液10-100ul分装冻存于-80℃低温冰箱中。

3.仪器与试剂：

PBS-II型表面增强激光解析-电离时间飞行质谱仪(SELDI-TOF-MS)、H4(疏水性)蛋白质芯片及相应分析软件Proteinchip Software 3.0由美国Ciphergen Biosystems公司研制。基质SPA(sinap inic acid芥子酸)购自美国Sigma公司。尿白蛋白测定采用免疫散射比浊仪由法国生物梅里埃公司生产。

4.技术路线：

取已制备的尿液标本在冰浴中解冻后14000rpm离心5min，取5ul上清加至已装好H4芯片的Bioprocessor(美国Ciphergen公司)中，湿盒中室温孵育30min，然后甩去孔中的残留液体，再用去离子水5ul洗涤芯片上斑点3次，每次1分钟，待样品风干后，每孔点加基质SPA：0.5ul/次共两次。上机检测及数据收集。

5.数据收集和处理：

(1)利用all-in-one蛋白质芯片校正PBS-II型SELDI-TOF-MS系统，使蛋白质分子量误差小于0.1％。然后，将结合好蛋白质的H4蛋白芯片进行质谱阅读仪分析。使用的分析参数为：激光强度150，检测敏感度6，收集数据的质荷比范围为1000～100000，收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次，所有的样本用相同的参数。以质控蛋白芯片做重复性检测，其峰值大小及其强度的变异系数(CVs)均控制在0.05％和15％以下，具有很好的重复性。

(2)所有原始数据先用Proteinchip Software 3.0做校正(总离子强度及分子量的均一化)。对位于1000～100000的质荷比(m/z)，用BiomarkerWizard软件(美国Ciphergen公司)进行2次噪音过滤，设置初始噪音过滤值为5，第二次噪音过滤值为2，蛋白质荷比峰在10％以上的样本中同时存在，且同一蛋白质荷比峰在不同的样本中的偏差小于0.3％。

(3)得到初步筛选结果后，对初步筛选出来的质荷比峰做糖尿病与正常对照的成组比较，以及糖尿病组根据尿白蛋白进行分组比较。

6.生物信息学分析

用ANN(Artificial neural networks人工神经网络)软件(STATISTICNeural Networks 4.0)进一步分析糖尿病无肾病组和早期肾病组(即B和C组)的检测数据，建立ANN模型，并用测试集进行盲法检验，计算诊断模型的临床检测确诊率。所用ANN采用前馈式反向传算法，分设3层：输入层4个神经元，1个隐含层含8个神经元，输出层含1个神经元(见图一)。设定无肾病组目标输出值为0，当输出值在0与0.5之间时，归入该组；糖尿病早期肾病患者的目标输出值为1，当输出值在0.5和1之间时，归入该组。所有的样本随机划分，2/3样本作为训练和验证组，1/3样本作为盲法测试组，采用留一法交叉验证，使训练样本尽可能地产生各种组合的训练集和验证集，以最大限度减少误差。从P值最小的蛋白质荷比峰开始逐个增加质荷比数，且分别训练ANN，筛选出预测准确率最高的蛋白质荷比峰组合，用以建立ANN模型。

7.统计学方法

各组检测数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较用t检验，并按照P值大小排列蛋白质荷比峰，P值＜0.05为差异有显著意义。四格表法评价蛋白质质谱模型对糖尿病早期肾病的诊断价值，并对尿白蛋白质荷比峰值进行ROC(Receiver operating characteristic接受者工作特征)曲线分析。

1.糖尿病组和健康人对照组尿液蛋白质峰谱比较：全部芯片在PBS-II型SELDI-TOF-MS进行数据的读取，结果显示在优化范围1000-100000内，芯片共捕获1000余种蛋白质，健康人和糖尿病患者尿液的蛋白质荷比峰值图谱有明显不同。利用Biomarker Wizard初步聚类和峰值分析后，共产生200个左右不同质荷比(M/Z)的峰值图谱。其M/Z值最低为1008.5.最高为79942.3。包括α1-微球蛋白(M/Z：23587.2)、白蛋白(M/Z：66696.8)等已知蛋白和多种未知蛋白(M/Z：5898.5Da，5281.1Da，4453.5Da，和4139.0Da)，结果参见图二，其中A、B、C、D、E、F为糖尿病患者和正常人在质荷比为66696.8Da，23587.2Da，，5898.5Da，5281.1Da，4453.5Da，和4139.0Da的蛋白质质谱图的比较，上三曲线为糖尿病患者；下三曲线为健康对照者。

2.按微量白蛋白尿分组比较：(1)对这A、B、C、D四组尿液蛋白质质谱数据均数进行比较，A与B的差异不显著，只得到5种表达有显著差异蛋白质，P值位于0.01-0.0468，M/Z值均小于10000。

(2)B、C和D组比较得到73种差异蛋白，M/Z值最低为2197.3；最高为79613.1。而P值＜0.01的有35种，其中8种的M/Z均值随着尿白蛋白的升高而升高，16种随着尿白蛋白的升高而降低。白蛋白(M/Z：66696.8)和转铁蛋白(M/Z：79613.1)的差异最明显，P值分别为9.1E-09和4.35E-08。

(3)再进行B与C的比较发现18种差异蛋白，白蛋白的P值为0.016，而P值比其小的尚有5种，且这5种蛋白的M/Z值均小于10000。

3.蛋白质质谱在糖尿病早期肾病中的诊断价值：

(1)以53份样本(30例无肾病组和23例早期肾病组)作为训练集，留一法交叉验证，建立ANN并筛选出预测准确率最高的5281.1、4139.0、5898.5和4453.5m/z的4个蛋白质荷比峰。用此预测模型对27份样本进行盲法测试。结果见表1：

表1

	训练集		验证集		测试集
							无肾病组	早期肾病组	无肾病组	早期肾病组	无肾病组	早期肾病组
	无肾病组早期肾病组	290	123	263	420	123							39
敏感度特异度阳性预测率阴性预测率准确度							100％(23/23)96.7％(29/30)95.8％(23/24)100％(29/29)98.1％(52/53)		86.9％(20/23)86.7％(26/30)83.3％(20/24)89.7％(26/29)86.8％(46/53)		75％(9/12)80％(12/15)75％(9/12)80％(12/15)77.8％(21/27)

(2)经过ROC曲线统计分析，得到尿白蛋白质荷比峰值在糖尿病早期肾病诊断中的ROC曲线，同时该曲线下面积为0.8476，与AUC＝0.5比较，差异有统计学意义，结果参见图三，图中ROC：曲线下面积＝0.8476。

Claims (2)

1.一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，其特征是通过以下步骤实现：

(1)尿白蛋白准备：

根据测定的尿白蛋白分为四组，A组：健康对照组，B组：尿白蛋白＜30mg/g.cr，C组：30≤尿白蛋白≤300mg/g.cr，D组：尿白蛋白＞300mg/g.cr，分装冻存于-80℃低温冰箱中；

(2)数据收集和处理：采用PBS-II型表面增强激光解析-电离时间飞行质谱仪进行质谱数据收集，其中激光强度150，检测敏感度6，收集数据的质荷比范围为1000～100000，收集位置20～80，平均每点收集20次，收集总点数为140次，并采用H4蛋白质芯片、去离子水、芥子酸基质；

(3)对获得的质谱数据进行检测：是依据由4个质荷比位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白质或多肽组成的质谱模型，并利用人工神经网络分析获得检测结果。

2.根据权利要求1所述的一种检测尿液蛋白质指纹图谱的方法，其特征是：采用人工神经网络前馈式反向传算法的方法进行质谱数据的分析。

Images