CN101062059A - 一种绵羊胸腺肽的制备方法 - Google Patents
一种绵羊胸腺肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101062059A CN101062059A CNA2006100463831A CN200610046383A CN101062059A CN 101062059 A CN101062059 A CN 101062059A CN A2006100463831 A CNA2006100463831 A CN A2006100463831A CN 200610046383 A CN200610046383 A CN 200610046383A CN 101062059 A CN101062059 A CN 101062059A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thymosin
- acid
- sheep
- preparation
- raw material
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 title claims description 71
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 title claims description 71
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 title claims description 71
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 36
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 24
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 20
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 14
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 13
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 claims description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 11
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 8
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 6
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 5
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 5
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 5
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 5
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 claims description 5
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 4
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940072033 potash Drugs 0.000 claims description 3
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 abstract 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 abstract 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 abstract 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 101710163560 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Proteins 0.000 description 4
- 101710189385 Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma Proteins 0.000 description 4
- 102400000159 Thymopoietin Human genes 0.000 description 4
- 239000000898 Thymopoietin Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- LIFNDDBLJFPEAN-BPSSIEEOSA-N (2s)-4-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 LIFNDDBLJFPEAN-BPSSIEEOSA-N 0.000 description 2
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 description 2
- 101710185318 Thymic factor Proteins 0.000 description 2
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N thymalfasin Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N 0.000 description 2
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019617 Henoch-Schonlein purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000031814 IgA Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- -1 and is centrifugal Substances 0.000 description 1
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015446 immunoglobulin a vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000000724 thymus hormone Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种绵羊胸腺肽的制备方法，包括原料处理、热变性除杂蛋白处理、碱除杂蛋白处理，其特征在于：以绵羊胸腺肽为原料；原料处理过程为：将绵羊胸腺组织在1～4倍体积，pH为2.0～5.0的酸性缓冲液中，捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞，低温抽提1～4小时。本发明方法收率高，生产周期短，并且所生产出的绵羊胸腺肽具有较高的活性/重量比。
Description
技术领域
本发明属于药品制备技术领域，特别涉及羊胸腺肽的制备工艺。
背景技术
有关胸腺肽的研究开始于20世纪60年代，是胸腺组织上皮细胞分泌的多肽激素。1961年Miller和Archer分别在小鼠和家兔中发现胸腺对淋巴细胞的分化、成熟和免疫活性的获得有重要的作用，此后许多学者相继从人胚胸腺、小牛、绵羊、猪等的胸腺或血清中分离得到胸腺肽混合物；不同来源的胸腺肽的组分、理化性质、生物活性等没有显著性差别。1972年，Golden从小牛胸腺中分离出胸腺肽组分5(TF5)；后经等电聚焦电泳获得α1-10(PI＜5.0)、β1-5(5.0＜PI＜7.0)、γ(PI＞7.0)3个区，15条多肽(刘治军等，胸腺肽研究进展及临床应用，首都医药，2003，10910)：40)。近几年，国外研究机构对TF5进行了纯化及生物化学性质方面的研究，已证实有生物活性的单肽为α1、α5、α7、β3、β4(Edward Hhannappel et al，TheThymosins：Prothymosins α，Parathymosins，andβ-thymosins：Structure andFunction，Vitamins and Hormones，2003，66(1)：257)，目前已有单一的胸腺肽以基因工程的方式生产，如α1。虽然利用基因工程生产单一的胸腺肽已经应用于临床，但是从胸腺提取的胸腺肽混合物仍然有其优势，因为不同胸腺肽成分对不同的免疫细胞及其不同的发育阶段的作用是不同的(Bela Bodeyet al，Rewiew of thymic hormones in cancer diagnosis andtreatment，International Journal of Immunopharmacology，2004，4(4)：539)。
胸腺肽已经被广泛地应用于临床，主要用来治疗乙肝、丙肝等感染性疾病；非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、肝癌、胃癌等恶性肿瘤；自身免疫性疾病，如重症肌无力、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎；也用于皮肤病、过敏性紫癜、肺结核、上呼吸道感染等疾病的治疗。还可延缓和预防中老年人胸腺生理性退变，有防衰老的作用。
除临床上应用最广的是胸腺肽外。动物胸腺中还有多种多肽类激素，总称为胸腺激素。已由小牛胸腺分离精制的胸腺激素有胸腺素(Thymosin)、胸腺体液因子(Thymus humoral factor)、胸腺生成素(thymopoietin)和胸腺因子(Thymic factor)等。
胸腺肽的药理作用可概括为以下几方面：1.诱导和促进胸腺依赖性T淋巴细胞分化和成熟。2.增强巨噬细胞的吞噬功能和抗原提呈能力。3.提高白细胞介素-2的产生水平并增强其受体的表达水平和受体亲和力。4.在肿瘤坏死因子存在或不存在的条件下，胸腺肽α1可促进骨髓来源的树突状细胞成熟分化并增强其功能。6.胸腺肽α1具有调节海马神经元突触传递的作用。胸腺肽对免疫系统的作用途径有两个：一是通过形形色色的神经内分泌通路，改变激素水平，其作用主要表现为调节下丘脑-垂体-肾上腺轴，从而间接地作用于宿主的防御机制；二是直接介入免疫系统中发挥作用。此外，它还能调节糖皮质激素的分泌，这说明它可以抗应激作用。还发现胸腺肽具有抗衰老作用。
综上所述，胸腺肽作为一种较强的生物反应调节剂，已经在医学临床和兽医临床的疾病预防与治疗中发挥了越来越重要的作用，尤其是“非典”疫情出现以后，胸腺肽在其治疗中起了很大作用，从而引起了人们越来越多的关注，促进了胸腺肽制剂的广泛开发与应用。
目前，临床上应用的胸腺肽，除基因工程胸腺肽单组分外，都是从猪和牛的胸腺提取的、含有多种组分的胸腺肽。在1987年，谢家麒等人提取绵羊胸腺生成素(Thymopoietin，TP)，而不是胸腺肽(谢家麒等，绵羊胸腺肽类提取物的制备及其临床应用的研究，中国兽医科技，1987，1：16-19)。到目前为止，还没有用绵羊胸腺生产胸腺肽的。
目前胸腺肽的生产工艺为：
1、原料处理：将动物胸腺组织剔除筋膜，漂洗后用绞肉机和匀质器破碎组织，加2倍体积双蒸水，反复冻融2、3次。每次-20℃贮存48小时以上。
2、将提取液加热到85℃，10分钟。离心去除沉淀蛋白。
3、离心液用截留分子量为1万的超滤柱进行超滤。
4、测定多肽含量，定溶。
5、过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绵羊胸腺肽的制备方法，用该方法收率高，生产周期短，并且所生产出的绵羊胸腺肽具有较高的活性/重量比。
本发明提供了一种绵羊胸腺肽的制备方法，包括原料处理、热变性除杂蛋白处理、碱除杂蛋白处理，其主要特征在于：以绵羊胸腺肽为原料；原料处理过程为：将绵羊胸腺组织在1～4倍体积的，pH为2.0～5.0的酸性缓冲液中，捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞，低温抽提1～4小时。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法中，更为具体地，
所述热变性除杂蛋白处理过程为：将原料处理后的蛋白质粗提液用电磁炉隔水加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液，除去变性蛋白；
所述碱除杂蛋白处理过程为：用碱调经热变性除杂蛋白处理后的上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白；用酸调上清液至pH6.0～7.5，离心取上清液，经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法中，所得滤液，可以进一步经纳滤浓缩，过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述原料处理过程中，酸性缓冲液可以选择为乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸等酸的钠盐或钾盐，浓度为20～150mM。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述原料处理过程中，缓冲液体积最好为2倍，pH值最好为3.0。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述原料处理过程中，低温抽提时间最好为2小时。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述碱除杂蛋白处理过程中，碱可以选择为氨水，钠、钾碱，或钠、钾弱酸盐。最好为氨水或氢氧化钠。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法所述酸除杂蛋白处理过程中，酸可以选择为盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸、或硫酸。最好为盐酸。
本发明绵羊胸腺肽的制备方法与传统方法相比，用冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞代替了反复冻融，时间有4天以上缩短到一天；并用酸性溶液代替了双蒸水，从而抑制了蛋白酶活性，避免了活性成分的降解，提高了胸腺肽的生物活性。另外，热变性除杂蛋白也是在酸性条件下进行的，这也使一部分杂蛋白由于酸变性产生沉淀，并与热变性除杂蛋白一步完成，也避免了热变性除杂蛋白的升温过程中活性成分的降解；最后，在工艺中增加了一步碱变性除杂蛋白，使提取的绵羊胸腺肽的活性/重量比进一步得到提高。
利用本发明方法提取绵羊胸腺肽。活性测定采用T细胞活性测定法——脱E-玫瑰环试验。结果表明，用新工艺提取的绵羊胸腺肽，不仅收率高，而且活性显著提高。与目前药厂所用的生产工艺相比：生产周期明显缩短，由7天以上缩短到4天；收率提高近1倍(2500mg/每kg胸腺提高到大于4200mg/每kg胸腺)；体外玫瑰花结试验(E-RFC％)测定活性提高达200多倍；胸腺素α1含量提高由1％到2％以上。
具体实施方式
1.原料处理：将动物胸腺组织剔除筋膜，漂洗后加1～4倍体积的pH2.0～5.0的缓冲液，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞。低温抽提1～4小时。
2.热变性除杂蛋白：上述蛋白质粗提液用电磁炉隔水加热至70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，低温离心取上清液，除去变性蛋白。
3.用碱调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。可以用氨水、或钠、钾碱、或、钾弱酸盐，最好用氨水或氢氧化钠。
4.上清液用酸调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液。可以用乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸、硫酸。
5.液进行纳滤，提高胸腺肽原料中胸腺肽的浓度，用来配制不同规格的胸腺肽制剂。
6.测定多肽含量，定溶。
7.过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
实施例1
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加20mMNaAc pH2.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提2小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HCL调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2500ml，再进行纳滤得滤液300ml。测定胸腺肽含量为16mg/ml，胸腺素α1的含量为3.1％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加27％。
实施例2
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加100mMNaAc pH5.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提2小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HAc调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2600ml，再进行纳滤得滤液310ml。测定胸腺肽含量为13.5mg/ml，胸腺素α1的含量为2.9％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加25％。
实施例3
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加50mM pH5.0的磷酸缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提2小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的H3PO4调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2400ml，再进行纳滤得滤液295ml。测定胸腺肽含量为14.5mg/ml，胸腺素α1的含量为2.8％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加29％。
实施例4
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加20mMNaAc pH3.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提3小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HCL调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2700ml，再进行纳滤得滤液320ml。测定胸腺肽含量为15mg/ml，胸腺素α1的含量为3.0％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加25％。
实施例5
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，加20mMNaAC pH3.0的缓冲液2000ml，高速捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞。低温抽提4小时，蛋白质粗提液加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液。用5N的NaOH调上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白。上清液用6N的HCL调pH6.0～7.5，离心，得上清液经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液2700ml，再进行纳滤得滤液320ml。测定胸腺肽含量为14mg/ml，胸腺素α1的含量为2.9％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.002mg/ml，(E-RFC％)活性增加23％。
实施例6
称取1kg的新鲜小绵羊胸腺，用绞肉机和匀质器破碎组织，加2000ml双蒸水，反复冻融三次，每次-20℃贮存48小时。将提取液加热到85℃，10分钟。离心去除沉淀蛋白，取上清液。离心液用截留分子量为1万的超滤柱进行超滤，得滤液2600ml。测定胸腺肽含量为1.2mg/ml，胸腺素α1的含量为1.1％。体外玫瑰花结试验，样品稀释到0.5mg/ml，(E-RFC％)活性增加20％。
Claims (10)
1、一种绵羊胸腺肽的制备方法，包括原料处理、热变性除杂蛋白处理、碱除杂蛋白处理，其特征在于：以绵羊胸腺肽为原料；原料处理过程为：将绵羊胸腺组织在1～4倍体积，pH为2.0～5.0的酸性缓冲液中，捣碎制成匀浆，冰浴超声破碎细胞或用匀质机破碎细胞，低温抽提1～4小时。
2、按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于，
所述热变性除杂蛋白处理过程为：将原料处理后的蛋白质粗提液用电磁炉隔水加热70～85℃保持10～15分钟，迅速冷却降温到4～8℃，离心取上清液，除去变性蛋白：
所述碱除杂蛋白处理过程为：用碱调经热变性除杂蛋白处理后的上清液至pH8～10，离心取上清液，除去变性蛋白；用酸调上清液至pH6.0～7.5，离心取上清液，经截流分子量为10000的超滤柱进行超滤，得滤液。
3、按照权利要求2所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所得滤液，进一步纳滤浓缩，过滤除菌制成水针剂或加赋形剂冻干。
4、按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述原料处理过程中，酸性缓冲液选择为乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸等酸的钠盐或钾盐，浓度为20～150mM。
5、按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述原料处理过程中，缓冲液体积为2倍，pH值为3.0。
6、按照权利要求1所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述原料处理过程中，低温抽提时间为2小时。
7、按照权利要求2所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述碱除杂蛋白处理过程中，碱选择为氨水，钠、钾碱，或钠、钾弱酸盐。
8、按照权利要求7所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于碱为氨水或氢氧化钠。
9、按照权利要求2所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于所述碱除杂蛋白处理过程中，酸选择为盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸、苹果酸、或硫酸。
10、按照权利要求9所述绵羊胸腺肽的制备方法，其特征在于酸为盐酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006100463831A CN101062059B (zh) | 2006-04-25 | 2006-04-25 | 一种绵羊胸腺肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006100463831A CN101062059B (zh) | 2006-04-25 | 2006-04-25 | 一种绵羊胸腺肽的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101062059A true CN101062059A (zh) | 2007-10-31 |
| CN101062059B CN101062059B (zh) | 2010-12-15 |
Family
ID=38963473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006100463831A Active CN101062059B (zh) | 2006-04-25 | 2006-04-25 | 一种绵羊胸腺肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101062059B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110496216A (zh) * | 2018-05-18 | 2019-11-26 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种胸腺肽注射液的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1152052C (zh) * | 2002-05-16 | 2004-06-02 | 西安迪赛生物药业有限责任公司 | 一种制备胸腺肽的工艺方法 |
-
2006
- 2006-04-25 CN CN2006100463831A patent/CN101062059B/zh active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110496216A (zh) * | 2018-05-18 | 2019-11-26 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种胸腺肽注射液的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101062059B (zh) | 2010-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8293708B2 (en) | Liquid formulations N-terminal serine of pegylated growth hormone | |
| CN104955472A (zh) | 用于生长激素递送的脂肪酸酰化的氨基酸 | |
| CN108997483B (zh) | 一种生物活性多肽dqdlvli及其制备方法和应用 | |
| CN108794590B (zh) | 一种生物活性多肽epgivnld及其制备方法和应用 | |
| CN110655556A (zh) | 一种免疫调节肽的制备及方法 | |
| CN102292349B (zh) | 稳定的生长激素化合物 | |
| WO2016018761A1 (en) | Mesenchymal stem cells expressing biomarkers that predict the effectiveness of the mesenchymal stem cells for treating diseases and disorders | |
| CN117440964A (zh) | 一种glp-1r和gipr双重靶向激动作用的多肽衍生物及其制备方法和用途 | |
| CN113024643B (zh) | 一种人工拟肽及其制备方法和应用 | |
| CN101062059B (zh) | 一种绵羊胸腺肽的制备方法 | |
| EP2070549A1 (en) | Therapeutic agent for acceleration of spinal nerve repair comprising desacyl ghrelin or derivative thereof as active ingredient | |
| EP2052738A1 (en) | THERAPEUTIC AGENT FOR ACCELERATION OF SPINAL NERVE REPAIR COMPRISING GHRELIN, DERIVATIVE THEREOF OR SUBSTANCE CAPABLE OF ACTING ON GHS-R1a AS ACTIVE INGREDIENT | |
| JP2004097021A (ja) | ワカメタンパク質含有組成物および食品 | |
| CN113813291B (zh) | 一种动物药材冻干粉的制备方法 | |
| US9265791B2 (en) | Resorption enhancers as additives to improve the oral formulation of low molecular weight heparins | |
| KR20230021929A (ko) | 실크 및 유청단백질의 가수분해물을 유효성분으로 포함하며, 칼슘흡수촉진능이 우수한 복합펩타이드 조성물 및 그 제조방법 | |
| KR20230028992A (ko) | 편도 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 근육 감소 관련 질환 치료용 조성물 | |
| CN108794594B (zh) | 一种生物活性多肽ipliags及其制备方法和应用 | |
| CN1686167A (zh) | 一种脑必舒冻干粉针剂及其制备方法 | |
| CN107814840B (zh) | 一种生物活性多肽pkypvepf及其制备方法和应用 | |
| CN107827971B (zh) | 一种生物活性多肽qsltltdve及其制备方法和应用 | |
| US20230149510A1 (en) | Method for alleviating arthritis using epidermal growth factor | |
| US9078868B2 (en) | Therapeutic agent for accelerating recovery of animal under medical treatment | |
| CN106589110B (zh) | 包含聚合物和glp-2衍生物的缀合物 | |
| JPS6157518A (ja) | 新規ペプチド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: LIAONING NUOKANG BIO-PHARMACEUTICALS CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHENYANG SHOUZHENG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20130527 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 110015 SHENYANG, LIAONING PROVINCE TO: 110171 SHENYANG, LIAONING PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130527 Address after: 110171 Liaoning Province, Shenyang Hunnan New District Nanping Road No. 18 Patentee after: Liaoning Nuokang Bio-pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 110015, building 11, building 219, youth Avenue, Shenhe District, Shenyang, Liaoning, China C Patentee before: Shouzheng Biological Technology Co., Ltd., Shenyang |
|
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 110171 Liaoning Province, Shenyang Hunnan New District Nanping Road No. 18 Patentee after: Liaoning Yuanda Nuokang Bio-Pharmaceuticals Co., Ltd. Address before: 110171 Liaoning Province, Shenyang Hunnan New District Nanping Road No. 18 Patentee before: Liaoning Nuokang Bio-pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 110171 Liaoning province Shenyang Hunnan Nanping Road No. 18-1 Patentee after: Liaoning Yuanda Nuokang Bio-Pharmaceuticals Co., Ltd. Address before: 110171 Liaoning Province, Shenyang Hunnan New District Nanping Road No. 18 Patentee before: Liaoning Yuanda Nuokang Bio-Pharmaceuticals Co., Ltd. |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: No.18-1, Nanping East Road, Hunnan New District, Shenyang City, Liaoning Province Patentee after: Yuanda Life Science (Liaoning) Co.,Ltd. Address before: No.18-1, Nanping East Road, Hunnan New District, Shenyang City, Liaoning Province Patentee before: LIAONING GRAND NUOKANG BIOPHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |