发明详述
I.总论
本发明总体上涉及通过给药无规共聚物进行的疾病的治疗和预防,涉及无规共聚物在制备用于治疗疾病的药物中的应用,并涉及包含无规共聚物和用法说明二者的试剂盒。本发明还涉及自身免疫性疾病的治疗和涉及用于治疗疾病的长效无规共聚物制剂。
本发明的一个方面提供治疗受试者的方法,其包括向所述的受试者给药有效量的无规共聚物的给药方案用于改善对可用所述无规共聚物治疗的疾病,所述有效量以大于36小时的时间间隔对所述的受试者递送。本发明相关的方面提供用于治疗受试者的方法,该方法包括向所述的受试者给药有效量的至少一种无规共聚物的给药方案用于改善可用所述无规共聚物治疗的疾病,所述的有效量的至少一种共聚物以大于24小时,特别是大于48小时的时间间隔对所述的受试者递送。在一个实施方案中,以大于24小时的时间间隔给药的所述无规共聚物的有效量为当每天给药时可有效的量。在相关的实施方案中,以大于24小时的时间间隔给药的有效量为如果每天给药可有效果的量。在另一个相关的实施方案中,以大于24小时的时间间隔给药的有效量为如果每天给药已知有效的量。在本发明的一个实施方案中,所述的有效量为10mg至30mg、或者15mg至25mg。在另一些实施方案中,所述的有效量为约20mg。在另一个实施方案中,所述的有效量为低于20mg。在特定的实施方案中,所述的有效量为“x”mg,其中“x”为1至20之间的任意整数。
在本文中所提供的方法的一个实施方案中,所述的受试者患有可用所述无规共聚物治疗的疾病。在一个实施方案中,所述的疾病为由T细胞,和特别是TH1细胞或具有TH1免疫状态的细胞介导的疾病,或者是由过量炎症细胞因子恶化的疾病。在另一个实施方案中,所述的受试者患有至少一种自身免疫性疾病。在一个实施方案中,所述的受试者患有选自以下的至少一种疾病:多发性硬化、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、克隆病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、胃炎、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、肾小球性肾炎、吉-巴综合征、银屑病、重症肌无力、自身免疫性脑脊髓炎、吉德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、副肿瘤性天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、恶性贫血、多肌炎、特发性阿狄森病、与自身免疫有关的不育症、肾小球性肾炎、大疱性类天疱疮、舍格伦综合征、特发性粘液水肿和结肠炎。在优选的实施方案中,所述的疾病为多发性硬化或复发-缓解型多发性硬化。在本文中所提供的方法的另一些实施方案中,所述的疾病为宿主抗移植物病(HVGD)或移植物抗宿主病(GVHD)或两者。在本文中所述的方法的优选的实施方案中,所述的受试者为哺乳动物或更优选为人。
在本文中所述的方法的一个实施方案中,所述的给药方案包括静脉内、皮下、肌内、皮内、腹膜内、皮内或口服给药。所述的无规共聚物还可通过装置给药,所述装置被设计为可持续递送所述无规共聚物,例如为透皮贴片或泵或植入物。例如,透皮贴片可用于在每48小时或更长的时间的12小时时距内给药所述无规共聚物,或者泵可用于在每四天或更多天的两天时段内给药所述共聚物。在相关的方面,所述共聚物在缓释制剂中给药。
本发明还提供用于治疗有需要的受试者的方法,该方法包括向所述的受试者给药有效量的无规共聚物的给药方案用于改善可用所述无规共聚物治疗的疾病,所述的有效量使用缓释制剂对所述的受试者递送,所述缓释制剂在至少2天、至少4天或至少6天的时段内给药所述无规共聚物,其中所述的有效量为如果每天给药可有效果的量。在优选的实施方案中,所述的缓释制剂在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的时段内给药所述共聚物。在另一个实施方案中,通过缓释制剂每天递送的总剂量为小于已知在所述疾病的治疗中是有效的每天剂量的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。在特定的实施方案中,所述的缓释制剂每天给药的剂量为已知当每天给药时在所述疾病的治疗中是有效的无规共聚物的剂量的25%或更少。作为例举的实施例,如果共聚物1(YEAK),当每天给药剂量为20mg,例如通过每天一次皮下注射20mg时,已知在复发-缓解型多发性硬化的治疗中是有效的,则本发明提供共聚物1的缓释制剂,其导致每天给药小于20mg的共聚物,特别是小于约10mg、9mg、8mg、7mg、6mg、5mg、4mg、3mg、2mg或1mg的共聚物1。
在本文中所述的方法的一些实施方案中,所述方法进一步包括向受试者给药另外的治疗活性剂,例如抗炎药。在优选的实施方案中,所述治疗活性剂可用于治疗所述疾病。在另一个优选的实施方案中,所述治疗活性剂协同增强所述无规共聚物的作用以治疗所述疾病。
在本文中所述的方法的一些实施方案中,所述的给药方案包括向所述的受试者多次给药所述的无规共聚物,在每次给药之间具有时间间隔。在优选的实施方案中,每次给药之间的时间间隔为至少36、48、72、96、120或144小时。在另一个优选的实施方案中,每次给药之间的时间间隔为36小时至14天,或至少7天。在相关的实施方案中,给药之间的时间间隔的至少之一为至少36、48、72、96、120或144小时,至少7天,或36小时至14天。在另一个相关的实施方案中,至少10%、20%、30%、40%或更优选50%的给药之间的时间间隔为至少36、48、72、96、120或144小时,至少7天,或36小时至14天。在另一个相关的实施方案中,给药之间的平均时间间隔为至少36、48、72、96、120或144小时,至少7天,或36小时至14天。
在本文中所述的方法的一些实施方案中,所述的无规共聚物的有效量为每剂0.02mg至每剂2000mg,或者更优选每剂2mg至每剂200mg。
在本文中所述的方法的一些实施方案中,所述的无规共聚物选自共聚物1(YEAK)、YFAK、VYAK、VWAK、VEAK和FEAK。在优选的实施方案中,所述的无规共聚物为共聚物1。在另一个优选的实施方案中,所述的无规共聚物为YFAK。在另一个实施方案中,所述的无规共聚物为三元共聚物,例如选自YAK、YEK、KEA和YEA中的一个。在另一个实施方案中,所述的无规共聚物具有1至10个锚定残基。
本发明还提供用于治疗疾病的试剂盒。本发明的一个方面提供用于治疗自身免疫性疾病的试剂盒,其包含(i)包含无规共聚物的组合物,和(ii)用于以至少36小时的时间间隔向受试者给药所述组合物的用法说明。在优选的实施方案中,在试剂盒中的无规共聚物为共聚物1。在另一个优选的实施方案中,在试剂盒中的无规共聚物为YFAK。在一些实施方案中,将在试剂盒中的无规共聚物配成用于约每24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时给药的制剂。在一些实施方案中,所述试剂盒的用法说明指出将所述的无规共聚物向受试者给药的时间间隔为至少24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时。
在本发明提供的试剂盒的一些实施方案中,将所述的组合物配制成缓释制剂。在特定的实施方案中,所述的缓释制剂递送的总剂量应为如果将所述的总剂量每天给药时可有效治疗所述疾病的量。在另外的实施方案中,所述的总剂量为约20mg,小于20mg或x mg,其中x为1至20之间的任意整数。
在本发明提供的试剂盒的另一个实施方案中,所述的试剂盒包含用法说明,其用于以至少24、36、48、72、96、120或144小时或更长的时间间隔,在每次给药约20mg的剂量下,向有需要的受试者给药所述的组合物,而在另外的实施方案中,所述的剂量为小于20mg,例如x mg,其中x为1至20之间的任意整数。在相关的实施方案中,所述的试剂盒包含用法说明,其用于以至少24小时的时间间隔向有需要的受试者给药所述组合物,给药剂量为如果将其每天给药时可有效治疗所述疾病的量。在另一个相关的实施方案中,所述的试剂盒包含用法说明,其用于以至少24小时的时间间隔向有需要的受试者给药所述组合物,给药剂量为当将其每天给药时可有效治疗所述疾病的量。
在一些实施方案中,所述试剂盒所要治疗的疾病是由T细胞,和特别是TH1细胞介导的疾病,或者是由过量炎症细胞因子恶化的疾病。在另一些实施方案中,所述的疾病为所述试剂盒提供治疗的自身免疫性疾病,选自多发性硬化、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、克隆病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、胃炎、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、肾小球性肾炎、吉-巴综合征、银屑病、重症肌无力、自身免疫性脑脊髓炎、吉德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、副肿瘤性天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、恶性贫血、多肌炎、特发性阿狄森病、与自身免疫有关的不育症、大疱性类天疱疮、舍格伦综合征、特发性粘液水肿和结肠炎。在特定的实施方案中,所述的疾病为多发性硬化、糖尿病或关节炎。在优选的实施方案中,所述的疾病为复发-缓解型多发性硬化。所述的试剂盒还可包含包装和给药所述共聚物的装置,例如皮下注射器、针、测量仪器例如匙或有刻度的容器、吸入器或泵。关于试剂盒的用法说明可还包括用于家用的用法说明。
本发明进一步提供用于生产治疗疾病的药物的试剂。本文中所公开的通过向受试者给药无规共聚物而用于治疗或预防疾病的任何方法可以应用于所述无规共聚物在制备治疗所述疾病的药物中的应用中。因此,本发明的一个方面提供无规共聚物在治疗受试者的疾病中的应用,其中将所述的无规共聚物配制成以大于24小时,并更优选至少48小时的时间间隔向所述的受试者给药的制剂。在优选的实施方案中,所述的无规共聚物为共聚物1,并且所述的疾病为自身免疫性疾病,例如多发性硬化或更具体为复发-缓解型多发性硬化。在另一些优选的实施方案中,所述的无规共聚物为YFAK。
本发明的另一个方面提供一些管理事务(doing business)的方法。具体而言,本发明提供经营医药商业的方法,其中将所述的试剂盒和制剂销售给保健提供者或直接销售给需要这种试剂盒的受试者。本发明的一个方面提供用于经营医药商业的方法,其包括销售给保健提供者、或者销售给需要这种试剂盒的受试者使用本文中所述的任何试剂盒在治疗疾病或病症中的益处。本发明相关的方面提供经营医药商业的方法,其包括:(a)生产本文中所述的任何试剂盒;和(b)向保健提供者销售、或者向需要这种试剂盒的受试者销售使用所述的试剂盒在治疗疾病或病症中的益处。在一些实施方案中,开发和销售这种制剂或实施这种生产步骤的权利可以许可给要考虑的第三方。在一些实施方案中,所述的疾病为多发性硬化,例如复发-缓解型多发性硬化。在另一个实施方案中,所述的试剂盒包含共聚物1或YFAK。
在另一个实施方案中,所述的向保健提供者或者向患者的销售包括每5至7天给药50mg、或更优选20mg或更少的无规共聚物的用法说明。在另一些实施方案中,所述的销售包括至少每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天给药所述的无规共聚物的用法说明。在另一个实施方案中,所述的向保健提供者或者向患者的销售包括每5至7天给药50mg、或更优选20mg或更少的所述的无规共聚物的用法说明。在又一些实施方案中,所述的销售包括与相同的或不同的无规共聚物的已有的制剂相比,在使用描述于本文中的试剂盒或制剂中降低副作用的用法说明。在特定的实施方案中,所述的已有的制剂更加频繁地向患者给药,或者给药的时间间隔更短,而在另一个实施方案中,所述的已有的制剂导致比所销售的试剂盒的平均每天剂量更高的平均每天剂量。所述的更高的平均每天剂量可以比由所述试剂盒提供的平均每天剂量高例如20%、50%、100%、200%或500%。
II.定义
为了方便,在本说明书、实施例以及权利要求中所用的某些术语在此说明。除非另外明确定义,本文中所用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文中所用的冠词“a”指该冠词语法宾语的一个或大于一个(即指至少一个)。例如:“元素”指一种元素或多于一种元素。
本文中所用的术语“包括”意思为术语“包括但不限于”,并可与其互换使用。
本文中所用的术语“或”意思为术语“和/或”,并可与其互换使用,除非上下文中另外明确指出。
本文中所用的术语“例如”意思为术语“例如但不限于”,并可与其互换使用。
待用本发明的方法治疗的“患者”或“受试者”可以指人或非人的动物,优选哺乳动物。
术语“自身免疫性病症”或“自身免疫性疾病”指由不适当的免疫应答导致的疾病状态,其中所述的不适当的免疫应答针对已知作为自身抗原的自编码实体。本文中所提供的共聚物化合物可用于治疗自身免疫性疾病的综合征,包括以下的一组病症:桥本甲状腺炎、特发性粘液水肿、严重甲状腺机能减退、多发性硬化、由在脑或脊髓中的斑或变硬组织标记的脱髓鞘性疾病、重症肌无力,其为由在神经肌肉接头处自身免疫攻击乙酰胆碱受体而导致的进行性肌衰退疾病、吉-巴综合征、多神经炎、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎、自身免疫性卵巢炎、慢性免疫性血小板减少性紫癜、结肠炎、糖尿病、作为甲状腺机能减退形式的格雷夫斯病、银屑病、寻常性天疱疮和类风湿性关节炎(RA)。
术语“脱髓鞘性疾病”包括这样的疾病状态,其中髓鞘部分由于降解而移除,所述的髓鞘部分由卷绕于神经细胞伸长部分的质膜组成。脱髓鞘性疾病可引起接种后感染、抗TNF治疗后感染、病毒后感染和MS。
术语氨基酸的“衍生物”指具有另外的取代基的氨基酸的化学相关形式,所述取代基为例如连接于所述氨基酸的原子上的N-羧酸酐基团、γ-苄基、ε-N-三氟乙酰基或卤化物基团。
术语“类似物”指具有不同构型的氨基酸的化学相关形式,例如异构体,或D-构型而不是L-构型,或具有所述氨基酸的相近大小、电荷和形状的有机分子,或具有对包含于肽键中的原子进行修饰的氨基酸,因此与不具有所述类似物残基的共聚物相比,具有类似物残基的共聚物比其它类似的缺少这种类似物残基的共聚物具有更高的蛋白酶抗性,无论该类似物在所述的共聚物的内部或位于共聚物的边界。
表述“氨基酸”和“氨基酸共聚物”可包括一种或多种组分,其中所述的组分为如本文中所定义的氨基酸衍生物和/或氨基酸类似物,所述的衍生物或类似物包含残基的一部分或包含整个残基,所述残基为由所述组成确定的20个天然存在的氨基酸中的任何一个或多个。例如,在具有一个或多个酪氨酸残基的氨基酸共聚物组合物中,所述的一个或多个残基的一部分可由人酪氨酸替代。另外,本定义中包括具有在两个相邻残基之间的一个或多个非肽键或拟肽键的氨基酸共聚物。
术语“疏水性”氨基酸指脂肪族氨基酸,丙氨酸(A或ala)、甘氨酸(G或gly)、异亮氨酸(I或ile)、亮氨酸(L或leu)、蛋氨酸(M或met)、脯氨酸(P或pro)和缬氨酸(V或val),在括号中的术语为每个氨基酸的一个字母或三个字母的标准编码缩写,以及芳香族氨基酸,色氨酸(W或trp)、苯丙氨酸(F或phe)和酪氨酸(Y或tyr)。这些氨基酸,当作为在共聚物或其它多肽中的残基时,赋予作为脂肪族侧链的长度和芳香族侧链的大小的函数的疏水性。
术语“带电的”氨基酸指氨基酸,天冬氨酸(D或asp)、谷氨酸(E或glu)、精氨酸(R或arg)和赖氨酸(K和lys),当共聚物或其它氨基酸组合物的水溶液包含一个或多个这些氨基酸的残基时,其在生理pH值处具有正电荷(1ys和arg)或负电荷(asp、glu)。组氨酸(H或his)在pH为7时是疏水的,并且在pH为6时是带电的。
术语“病症”和“疾病”包含性地使用并指身体的任何部位、器官或全身(或其组合)的正常结构或功能的任何偏差。特定的疾病由特征性症状和征兆,包括生物的、化学的和物理的变化而显现,并经常与很多不同的其它因素有关,包括但不限于种群统计学的、环境的、职业的、遗传的和医疗史的因素。一些特征性病症、症状和相关的因素可通过很多方法定量以获得重要的诊断信息。
术语“预防”或“治疗”处理指向受试者给药一个或多个主题组合物。如果在不希望的症状(例如宿主动物的疾病或其它不希望的状态)的临床表现之前给药,那么所述的处理就是预防,即它的贡献在于保护宿主抵抗不希望症状的发展,而如果在不希望的症状显现之后给药,那么所述的处理就是治疗(即,它意于减少、改善或防止不希望的症状或来源于其的副作用的进展)。
术语“治疗效果”指在动物,特别是哺乳动物,更特别是人中由药理活性物质产生的局部或全身性效果。因此该术语指意于在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中或在动物或人中增强想要的身体或心理发展和状况中使用的任何物质。表述“治疗有效量”指在合理的适用于任何治疗的效益/风险比下,产生一些想要的局部或全身作用的这样的物质的量。在一些实施方案中,化合物的治疗有效量将依赖于其治疗指数、溶解性等而定。例如由本发明方法发现的某些化合物可以有效量给药以产生合理的适用于这种治疗的效益/风险比。
术语“有效量”指当向受试者给药适当剂量和方案时产生想要的结果的治疗剂的量。
术语“需要治疗疾病的受试者”为被诊断的受试者具有这种疾病,好像发展出所述疾病或怀疑具有所述疾病。
本文中所用的术语“抗体”意于包括全部抗体,例如任何同型(IgG、IgA、IgM、IgE等),并包括还特异性与脊椎动物,例如哺乳动物的蛋白质反应的其片段。可使用常规技术将抗体切成片段,并且所述片段进行实用性和/或可与感兴趣的特异性表位相互作用的筛选。因此,该术语包括经蛋白酶剪切的或重组制备的抗体分子部分的片段,其能够选择性地与某些蛋白反应。这种蛋白酶解和/或重组片段的非限制性的例子包括Fab、F(ab′)2、Fab′、Fv和单链抗体(scFv),包含由肽连接体连接的V[L]和/或V[H]区域。所述的scFv′s可共价或非共价地连接以形成具有两个或多个连接位点的抗体。术语抗体还包括抗体和重组抗体的多克隆产品、单克隆产品或其它纯化产品。
术语“中心耐受”指对于由在胸腺中的事件控制的抗原的耐受性,即对胸腺体中的抗原有反应性的T细胞的克隆排除。对于所述抗原具有高亲合力受体的部分活化的T细胞,在胸腺中通过Fas介导的细胞凋亡、由共表达触发和在细胞表面上FasL向Fas的结合,而经历了负选择和克隆排除。相比之下,术语“外周耐受”指在脾中通过激活-诱导的细胞死亡(AICD)而使T细胞排除和不用克隆排除而使T细胞功能沉默(克隆无能(clonal anergy))。同样,当缺乏辅助T细胞的协同作用时,推测B细胞“无助于”对T细胞依赖性抗原的应答。中心耐受和外周耐受由p56lck和ZAP-70的磷酸化作用调节。这些蛋白的关键残基的磷酸化作用的状态和程度导致影响外周耐受和中心耐受的信号分子的正调控或负调控。T细胞受体信号的抑制也在诱导耐受性方面起到重要作用。
本文中所用的其它技术术语具有在它们所用的领域中通常的含义,如很多技术字典所例举的那样。
III.无规共聚物
本发明的无规共聚物的组合物具有编译多种多样的交叉反应性T细胞表位的特性。本发明的无规共聚物的组合物可进一步具有修饰肽配体的特性。本发明的无规共聚物的组合物的多功能性结果在于:一个是:与数千,优选数十万,更优选数百万的T细胞表位,经过由MHC分子,优选MHC II类分子的表达而功能性相互作用的能力;而另一个是:无规共聚物特异性T细胞的产生,该细胞可分泌可溶性传递质,例如细胞因子。
本发明的无规共聚物可具有特异性氨基酸序列特性,使得所选择的氨基酸的子群优先与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位中的一些可直接与致病性病症有关。优选地,本发明的无规共聚物可具有特异性氨基酸序列特性,使得所选择的氨基酸的子群包含2至8个氨基酸,该氨基酸优先与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位中的一些可直接与致病性病症有关,所述的病症由可溶性传递质如细胞因子的异常产生而恶化。
优选地,本发明的无规共聚物可具有特异性氨基酸序列特性,使得所选择的氨基酸的子群包含2至8个氨基酸,该氨基酸借助于所述氨基酸的选择和所述氨基酸相互之间的比例,优先与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位中的一些可直接与致病性病症有关,所述的病症由可溶性传递质如细胞因子的异常产生而恶化。所述的致病性病症与特异性MHC II类等位基因如HLA-DR或HLA-DQ相关联。
更优选地,本发明的无规共聚物包含从2个至8个优选经过肽键无规连接的氨基酸的聚合物,其优先与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位中的一些可直接与致病性病症有关,所述的致病性病症通过可溶性传递质如细胞因子的异常产生而恶化,所述的致病性病症与MHC II类等位基因如HLA-DR或HLA-DQ相关联。
更优选地,本发明的无规共聚物包含从3个至5个优选经过肽键无规连接的氨基酸的聚合物,其优选与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位中的一些可直接与致病性病症相关,所述的致病性病症通过可溶性传递质如细胞因子的异常产生而恶化,所述的致病性病症与MHC II类等位基因如HLA-DR或HLA-DQ相关联。
本发明的无规共聚物可包含适当量的带有正电荷的氨基酸,例如赖氨酸或精氨酸,与带有负电荷的氨基酸(优选较少量),例如谷氨酸或天冬氨酸组合,任选与电中性氨基酸如丙氨酸或甘氨酸组合作为填充剂,并任选与适于赋予共聚物以免疫性的氨基酸如芳香族氨基酸如酪氨酸或色氨酸组合。这种组合物可包括在WO 00/005250中公开的所有的那些,该文献的全部内容通过引用并入本发明中。
包含4种氨基酸的共聚物
在本发明的一个实施方案中,所述的无规共聚物包含4种不同的氨基酸,每个得自如下组中的不同的一个:(a)赖氨酸和精氨酸;(b)谷氨酸和天冬氨酸;(c)丙氨酸和甘氨酸;(d)酪氨酸和色氨酸。
本发明的这个实施方案的特定共聚物包含丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸的组合,并具有净的总正电荷。一个优选的实施方案为YEAK,也指为共聚物1(Cop 1)或醋酸格拉默,其平均分子量为约4,700至约13,000道尔顿。优选的共聚物的分子量为约2,000至约40,000道尔顿,或约2,000至约13,000道尔顿。优选的分子量范围和用于制备共聚物1的优选形式的方法描述于美国专利5,800,808中,其全部内容全部并入本发明中。因此,所述共聚物可以为具有约15至约100,优选约40至约80个氨基酸长度的多肽。在优选的实施方案中,共聚物1的长度为35至75个氨基酸残基。更优选地,共聚物1的长度为35至65个氨基酸残基。在优选的实施方案中,共聚物1的长度为约50个氨基酸。在另一个优选的实施方案中,共聚物1的长度为约52个氨基酸。在优选的实施方案中,共聚物1的平均摩尔产出比(output ratio)对于Y∶E∶A∶K分别为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,其通过固相化学而合成,如更详细描述于下的那样。产出比的可变性包含不同氨基酸间的约10%的范围。
在优选的实施方案中,共聚物1长度为约52个氨基酸残基,在氨基酸位置31-52中丙氨酸的组成比大于在氨基酸位置11-30中的组成比,并且在氨基酸位置11-30中丙氨酸的组成比大于在氨基酸位置1-10中的组成比。更具体地,本发明的优选实施方案为组合物YEAK(L-酪氨酸、L-谷氨酸盐、L-丙氨酸和L-赖氨酸)的无规共聚物,其平均摩尔产出比分别为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中所述共聚物序列的残基1-10的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。
为了本发明的目的,“Cop 1或Cop 1相关肽或多肽”意于包括所有的肽或多肽,包括无规共聚物,其在抗原呈递中与髓鞘碱性蛋白(MBP)官能性地交叉反应并能与在MHC II类上的MBP相竞争。商品名为COPAXONETM的共聚物1已经在数个国家被批准用于治疗多发性硬化(MS)。COPAXONETM是Teva Pharmaceuticals Ltd.,Petah Tikva,Israel的商标。共聚物1以高亲合力和肽特异性方式结合于纯化的MS相关HLA-DR2(DRB1*1501)和类风湿性关节炎(RA)相关HLA-DR1(DRBI*0101)或HLA-DR4(DRB1*0401)分子。因为共聚物1为无规多肽的混合物,它可以包含结合于不同HLA蛋白的不同序列;在这个情况下,在整个化合物中只有一部分将是“活性成分”。或者,整个化合物可能是有效的,即所有多肽结合于任何HLA-DR分子。
更优选地,本发明的无规共聚物包含经过肽键无规连接的氨基酸共聚物1或YFAK的聚合物,其优先与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位与通过炎症细胞因子的异常产生而恶化的自身免疫性疾病相关联,所述的自身免疫性疾病与特异性MHC II类等位基因如HLA-DR或HLA-DQ相关联。
更优选地,本发明的无规共聚物包含经过肽键无规连接的氨基酸共聚物1或YFAK的聚合物,其优先与特异性T细胞表位相互作用,所述的T细胞表位与类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、乳糜泻、类风湿性关节炎、类固醇敏感型肾病综合征、系膜IgA肾病、发作性睡病、神经性多发性硬化、复发型多发性软骨炎、皮肤病例如疱疹样皮炎、特应性皮炎、白塞病、天疱疮、银屑病、原发性舍格伦综合征、系统性脉管炎(vasculitides)、红斑、肠胃疾病例如克隆病、呼吸系疾病例如Sommer型超敏性肺炎和自身免疫性甲状腺疾病(AITD)相关联。
在本发明的另一个方面,所述的无规共聚物包含YFAK、VYAK、VWAK、VEAK和FEAK。在优选的实施方案中,所述的无规共聚物由氨基酸残基YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸)组成,摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶XA∶6.0,其中XA大于11.0并小于30.0,并且关于产出比的可变性包含不同氨基酸间的约10%的范围。在另一个优选的实施方案中,所述的无规共聚物由YFAK组成,摩尔产出比分别为约1.0∶1.0∶XA∶6.0,其中XA大于5.0并小于15.0,并且关于产出比的可变性包含不同氨基酸间的约10%的范围。优选实施方案的无规共聚物的YFAK的摩尔产出比示于下表I中:
表I:无规共聚物的氨基酸组合比
Y F A K |
1.0∶ 1.2∶ 11.0<30.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.2∶ 16.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.2∶ 18.0∶ 4.0 |
1.0∶ 1.2∶ 18.0∶ 5.0 |
1.0∶ 1.2∶ 18.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.2∶ 18.0∶ 7.0 |
1.0∶ 1.2∶ 18.0∶ 8.0 |
1.0∶ 1.2∶ 20.0∶ 4.0 |
1.0∶ 1.2∶ 20.0∶ 5.0 |
1.0∶ 1.2∶ 20.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.2∶ 20.0∶ 7.0 |
1.0∶ 1.2∶ 20.0∶ 8.0 |
1.0∶ 1.2∶ 22.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.2∶ 24.0∶ 6.0 |
(Y+F=2.2)∶ 18.0∶ 6.0 |
0.66∶ 1.54∶ 18.0∶ 6.0 |
0.88∶ 1.32∶ 18.0∶ 6.0 |
1.1∶ 1.1∶ 18.0∶ 6.0 |
1.32∶ 0.88∶ 18.0∶ 6.0 |
1.54∶ 0.66∶ 18.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.0∶ 5.0<15.0∶ 6.0 |
1.0∶ 1.0∶ 10.0∶ 6.0 |
在优选的实施方案中,任何这种共聚物的长度为35至75个氨基酸残基。更优选地,无规共聚物的长度为35至65个氨基酸残基。在优选的实施方案中,无规共聚物的长度为约50个氨基酸。在另一个优选的实施方案中,无规共聚物的长度为约52个氨基酸。
本发明优选的实施方案为组成为YFAK的无规共聚物,其平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,其通过固相化学合成,如由下文更详细描述的那样。
在优选的实施方案中,YFAK的平均摩尔产出比为约1.0∶1.2∶XA∶6.0,其中XA大于18,并且丙氨酸的比例随着共聚物的长度增加。在优选的实施方案中,这种无规共聚物的长度为约52个氨基酸残基,并且在氨基酸位置31-52中的丙氨酸的组成比比氨基酸位置11-30中的组成比更大,并且在氨基酸位置11-30中的丙氨酸的组成比比氨基酸位置1-10中的组成比更大。更特别地,本发明优选的实施方案为组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸)的无规共聚物,其平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,其通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中所述共聚物序列的残基1-10的摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18∶6,和残基31-52的摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶20∶6。
包含三个氨基酸的共聚物
在另一个实施方案中,所述的无规共聚物包含三种不同的氨基酸,每种得自如上所述的组(a)至(d)中的三个组中的不同的一个。这些共聚物本文中指作“三元聚合物”。平均分子量为2,000至约40,000道尔顿,并且优选约3,000至约35,000道尔顿。在更优选的实施方案中,平均分子量为约5,000至约25,000道尔顿。
在一个实施方案中,用于本发明的三元聚合物包含酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸,下文中指定为YAK。在这些三元聚合物中,这些氨基酸的平均摩尔分数可以变化。例如,存在的酪氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.250;存在的丙氨酸的摩尔分数可以为约0.3至约0.6;和存在的赖氨酸的摩尔分数可以为约0.1至约0.5。可以用精氨酸代替赖氨酸,用甘氨酸代替丙氨酸和/或用色氨酸代替酪氨酸。酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸,或者YAK的更优选的三元聚合物的单体摩尔比为约0.10∶约0.54∶约0.35。典型的YAK共聚物描述于Fridkis-Hareli M.,HumImmunol.2000;61(7):640-50中。
在另一个实施方案中,用于本发明的三元聚合物包含酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸,下文中指定为YEK。在这些三元聚合物中,这些氨基酸平均摩尔分数可以变化:存在的谷氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.300;存在的酪氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.250;和存在的赖氨酸的摩尔分数可以为约0.3至约0.7。可以用天冬氨酸代替谷氨酸,用精氨酸代替赖氨酸和/或用色氨酸代替酪氨酸。谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸,或者YEK的更优选的三元聚合物的单体摩尔比为约0.26∶约0.16∶约0.58。
在另一个优选的实施方案中,用于本发明的三元聚合物包含赖氨酸、谷氨酸和丙氨酸,下文中指定为KEA。在这些三元聚合物中,这些氨基酸平均摩尔分数可以变化。例如,存在的谷氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.300;存在的丙氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.006;和存在的赖氨酸的摩尔分数可以为约0.2至约0.7。可以用天冬氨酸代替谷氨酸,用甘氨酸代替丙氨酸和/或用精氨酸代替赖氨酸。谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸,或者KEA的更优选的三元聚合物的单体摩尔比为约0.15∶约0.48∶约0.36。
在另一个优选的实施方案中,用于本发明的三元聚合物包含酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸,下文中指定为YEA。在这些三元聚合物中,这些氨基酸平均摩尔分数可以变化。例如,存在的酪氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.250;存在的谷氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.300;和存在的丙氨酸的摩尔分数可以为约0.005至约0.800。可以用色氨酸代替酪氨酸,用天冬氨酸代替谷氨酸和/或用甘氨酸代替丙氨酸。谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸,或者YEA的更优选的三元聚合物的单体摩尔比为约0.21∶约0.65∶约0.14。
在优选的实施方案中,所述三元聚合物的氨基酸的摩尔分数与在共聚物1中优选的相当。在共聚物1中氨基酸的摩尔分数为:谷氨酸约0.14,丙氨酸约0.43,酪氨酸约0.10和赖氨酸约0.34。共聚物1的最优选的平均分子量为约5,000至约9,000道尔顿。对于本文中所公开的效用,如果进行一个或多个如下的替换:天冬氨酸(D)替换谷氨酸(E)、甘氨酸(G)替换丙氨酸(A)、精氨酸(R)替换赖氨酸(K)、和色氨酸(W)替换酪氨酸(Y),共聚物1的活性预计保留。
结合于MHC II类蛋白的共聚物
在一个实施方案中,在本文中所描述的方法中使用的共聚物能结合于优选与自身免疫性疾病相关联的MHC II类蛋白。有至少三种类型的II类MHC分子:HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP分子。还有许多等位基因,其编码这些HLA分子的各自类型。所述的II类MHC分子主要在B淋巴细胞和抗原呈递细胞例如巨噬细胞的表面上表达。任何可用的方法可用于确定是否所述的共聚物结合于一个或多个MHC II类蛋白。例如,所述的多肽可用报道分子(例如放射性核素或生物素)标记,与粗的或纯的MHC II类蛋白混合,并且如果在排除所述的未结合多肽后,所述的报道分子连接于所述的MHC II类蛋白,则检测到结合。
在另一个实施方案中,在本文中所描述的方法中使用的共聚物能结合于与多发性硬化相关联的MHC II类蛋白。对于MHC II类蛋白的抗原结合沟槽而言,这个实施方案的多肽比共聚物1可具有类似的或更大的亲合力。因此,所预计的多肽能抑制或置换得自MHC II类蛋白的髓磷脂自身抗原的结合。一种与多发性硬化相关联的MHC II类蛋白为HLA-DR4(DRB1*1501)。
在另一个实施方案中,在本文中所描述的方法中使用的共聚物能结合于优选与关节炎疾病如类风湿性关节炎或骨关节炎相关联的MHCII类蛋白。对于与自身免疫性疾病相关联的MHC II类蛋白的抗原结合沟槽而言,这个实施方案的无规共聚物比II型胶原蛋白261-273肽可具有更大的亲合力。因此,所预计的本文中所述的共聚物1或无规共聚物例如YFAK能抑制结合或置换得自MHC II类蛋白的抗原结合沟槽的II型胶原蛋白261-273肽。所述的II类MHC蛋白由大小约相等的α和β亚单元组成,这两种亚单元都是跨膜蛋白。肽结合沟槽部分由两种α和β亚单元的氨基末端形成。这种肽结合沟槽是T细胞抗原的呈递位点。
在其它的实施方案中,本发明中所用的无规共聚物可结合于HLA-DR分子的肽结合沟槽。由于Cop1与MS相关HLA-DR分子的结合基元是已知的(Fridkis-Hareli等人,1999,J Immunol.;162(8):4697-704),可如在Fridkis-Hareli中所述,可容易地制备和测试固定序列的多肽的与HLA-DR分子的肽结合沟槽的结合。这种肽的例子为公开于WO 00/005249中的那些,其全部内容通过引用而并入本发明中。特定公开于所述申请中的肽中的32个如下所示:
AAAYAAAAAAKAAAA;AEKYAAAAAAKAAAA;AKEYAAAAAAKAAAA;
AKKYAAAAAAKAAAA;AEAYAAAAAAKAAAA;KEAYAAAAAAKAAAA;
AEEYAAAAAAAKAAA;AAEYAAAAAAKAAAA;EKAYAAAAAAKAAAA;
AAKYEAAAAAKAAAA;AAKYAEAAAAKAAAA;EAAYAAAAAAKAAAA;
EKKYAAAAAAKAAAA;EAKYAAAAAAKAAAA;AEKYAAAAAAAAAAA;
AKEYAAAAAAAAAAA;AKKYEAAAAAAAAAA;AKKYAEAAAAAAAAA;
AEAYKAAAAAAAAAA;KEAYAAAAAAAAAAA;AEEYKAAAAAAAAAA;
AAEYAAAAAAAAAAA;EKAYAAAAAAAAAAA;AAKYEAAAAAAAAAA;
AAKYAEAAAAAAAAA;EKKYAAAAAAAAAAA;EAKYAAAAAAAAAAA;
AEYAAAAAAAAAAAA;AEKAYAAAAAAAAAA;EKYAAAAAAAAAAAA;
AYKAEAAAAAAAAAA;AKYAEAAAAAAAAAA.
用于本发明中的另外的无规共聚物及合成它们的方法,可在文献中找到,例如在Shukaliak Quandt,J.等人,2004,Mol.Immunol.40(14-15):1075-87;Montaudo,M.S.,2004,J.Am.Soc.Mass Spectrom.15(3):374-84;Takeda,N.等人,2004,J.Control Release 95(2):343-55;Pollino,J.M.等人,2004,J.Am.Chem.Soc.126(2):563-7;Fridkis-Hareli,M.等人,2002,J.Clin Invest.109(12):1635-43;Williams,D.M.等人,2000,J.Biol.Chem.275(49):38127-30;Tselios,T.等人,2000,Bioorg.MedChem.8(8):1903-9;和Cady,CT.等人,2000,J.Immunol.165(4):1790-8。
在一个特定的实施方案中,所述的无规共聚物在长度上包含至少7个氨基酸残基,并能结合于与自身免疫性疾病相关的MHC II类蛋白,所述的合成肽,其比II型胶原蛋白261-273肽更大的亲合力结合于MHCII类蛋白的抗原结合沟槽,其中所述的合成肽包含选自如下序列的序列:丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸(AEKYA),丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸(AEKVA),丙氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(AEKFA),丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸-谷氨酸(AKYAE),谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸(EAKYA),丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸(AKVAE)和谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸(EAKVA),丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸(AKFAE)和谷氨酸-丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(EAKFA)。
在某些优选的实施方案中,本发明的共聚物结合于HLA-DQA1分子,并甚至更优选结合于一个或多个HLA分子,所述的HLA分子在等位基因DQA1*0501-DQB1*0201,DQA1*0301,DQB1*0401和DQA1*03-DQB1*0302中编码。
在其它的实施方案中,本发明方法的共聚物结合于某些HLA-DQ分子,这些HLA-DQ分子使这种分子的载体易受自身免疫相关疾病如I型糖尿病和乳糜泻的感染,其中对于结合HLA-DR分子和/或其它DQ同型而言的解离常数(Kd)比所述的共聚物的Kd小至少10倍。这种HLA-DQ分子为已知为DQB1*0201、DQB1*0302、DQB1*0304、DQB1*0401、DQB1*0501、DQB1*0502;和DQA1*0301、DQA1*0302、DQA1*0303、DQA1*0501的特异性HLA-DQB1和DQA1等位基因的组合蛋白产物。这些等位基因可以编码于相同的单元型(″顺式″等位基因),例如DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*0301和DQB1*0302-DQA1*0301-DRB1*0401上。所形成的HLA分子包含″顺式″等位基因的多肽产物,该HLA分子本文中指作“顺式二聚体”。或者,所述的等位基因可以编码于不同的单元型(″反式″等位基因)上。所述的HLA分子包含″反式″等位基因的多肽产物,该HLA分子本文中指作“反式”二聚体。“反式”等位基因的例子为在DQB1*0201-DQA1*0501-DRB1*0301上的DQB1*0201和在DQB1*0301-DQA1*0301-DRB1*0404上的DQA1*0301的组合。
在一些实施方案中,在本文中所述的方法中使用的DQ定向共聚物为无规或部分无规的氨基酸序列的混合物,其包含得自如下四组中每一个的氨基酸:(1)疏水性的脂肪族氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸);(2)具有酸侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸);(3)具有小的亲水侧链的氨基酸(例如丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸)和(4)具有小的脂肪族侧链的氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸);另外,所述的共聚物还包含脯氨酸残基。在一个实施方案中,所述的共聚物用氨基酸谷氨酰胺(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、丝氨酸(S)和丙氨酸(A)衍生,并在本文中指作″ELSA″共聚物。
在另一些实施方案中,所述的DQ-定向共聚物为无规或部分无规的氨基酸序列的混合物,其包含得自如下四组中每一个的氨基酸:(1)疏水性的脂肪族氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸);(2)大的疏水性氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸);(3)具有小的亲水侧链的氨基酸(例如丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸)和(4)具有小的脂肪族侧链的氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸);另外,所述的共聚物还包含脯氨酸残基。典型的共聚物用氨基酸谷氨酰胺(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)衍生,并在本文中指作″DLYV″共聚物。
在一个实施方案中,自身免疫性疾病的治疗方法包括给药结合于与自身免疫性疾病相关联的HLA-DQ分子的共聚物。优选使用包含含有多个氨基酸残基的多肽的共聚物进行所述的治疗方法,所述的氨基酸残基选自(1)疏水性的脂肪族残基(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸);(2)酸性残基(天冬氨酸、谷氨酸);(3)小的亲水性残基(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸)和(4)小的脂肪族残基(丙氨酸、甘氨酸);和(5)脯氨酸。
在优选的实施方案中,本发明的共聚物组合物结合于一种或多种DQ同型,其中平均Kd为1μM或更小,并且更优选平均Kd为小于100nM、10nM或甚至1nM。鉴别优选共聚物的另一种方式基于在竞争性结合试验中置换另一种共聚物的共聚物的测量,例如于Sidney等人,2002,J.Immunol.169:5098中所描述的,其以IC50值表达。本发明优选的共聚物的IC50值小于1μM,更优选小于500nM,并且甚至更小于100nM。
在一些优选的实施方案中,所述的共聚物通过不同氨基酸残基的无规合成(聚合)而形成。要被并入到所述无规共聚物中的氨基酸的一些比例可被使用。本发明优选的无规共聚物包含氨基酸残基K、E、A、S、V和P。更优选地,K∶E∶A∶S∶V的比例为0.3∶0.7∶9∶0.5∶0.5∶0.3。优选地,所述的无规共聚物长度为约10至100个氨基酸残基,更优选20至80个氨基酸残基,甚至更优选40-60个氨基酸残基,并且最优选约50个氨基酸残基。当合成时,无规共聚物的典型制剂为不同长度的肽的混合物,它们大部分具有希望的长度,但也包含由本发明可用的合成过程不可避免地形成的更短或更长的肽。
另外,在一些实施方案中,所述的共聚物可以是半无规(或半有规)的聚合物,该聚合物具有在形成的聚合物中以规则间隔出现的“锚”或固定残基,提供最佳的II类结合。在所述肽中的锚残基可以是E、D或V。例如,所述的共聚物可被合成为具有如下通式序列中的一个:
1.[XXEXXXXXXXEXX]n
2.[XXEXXXXXXXDXX]n
3.[XXDXXXXXXXDXX]n
4.[XXDXXXXXXXEXX]n
5.[XXEXXVXXXXDXX]n
6.[XXDXXVXXXXDXX]n
7.[XXDXXVXXXXEXX]n
8.[XXEXXVXXXXEXX]n
其中X为A、S、V、K或P,其比例为5∶1∶1∶1∶0.5,并且1≤n≤8。
所述的肽的长度可以是9-25个氨基酸残基。优选地,所述的肽的长度为13个氨基酸残基。所定义的序列长度为9-25个氨基酸的肽可包含2-25个固定残基。描述于本发明中的肽的单独的固定残基可在P1、P4、P7或P9的任何上结合于MCH II类分子的肽结合沟槽。优选地,这种肽包含2或3个固定残基。在一个实施方案中,所定义的序列长度为13个氨基酸的肽将包含2个固定残基,为E或D或其任意组合。优选地,所定义的序列长度为13个氨基酸的肽将包含3个固定残基。所述的肽可以为定义序列的多聚体,其中重复单元数优选为2-8。更优选地,重复单元数为3-6。最优选地,重复单元数为4。在优选的实施方案中,本发明的多聚体包含所定义的序列长度为13个氨基酸的肽,其包含2个固定残基,为E或D或其任意组合。
在一些优选的实施方案中,主题共聚物被配制成用作医药,从而使多分散性小于25,000,并且更优选小于10000、5000、1000、500、100、50或甚至小于10。
无规共聚物的合成
本发明中所用的三元共聚物和无规共聚物可通过本领域技术人员可用的任何步骤制备。例如,所述的三元共聚物可在溶液中在缩合条件下采用所需摩尔比的氨基酸制备,或者通过固相合成步骤。缩合条件包括合适的温度、pH和溶剂条件,这些条件用于使一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合以形成肽键。缩合剂,例如二环己基-碳二亚胺,可被用于促进肽键的形成。大体积基团可用于保护官能团,例如侧链部分和一些氨基和羧基,使它们避免发生不希望的副反应。
例如,可使用描述于美国专利3,849,550中的方法,其中酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸γ-苄酯和N-ε-三氟乙酰基-赖氨酸的N-羧酐在室温下,在无水二烷中,用二乙胺作为引发剂进行聚合。所述的谷氨酸的γ-羧基可通过溴化氢在冰醋酸中解块。所述的三氟乙酰基通过1摩尔的哌啶从赖氨酸上移去。本领域技术人员易于理解的是所述的方法可被调整以通过选择性地消除关于谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或赖氨酸的反应而制备包含所希望的氨基酸,即在共聚物1中的三种或四种氨基酸,的肽和多肽。为了本申请的目的,术语“环境温度”和“室温”指约20℃至约26℃的温度。
本发明无规共聚物的优选的合成方法为通过固相合成。通过固相肽合成(SPPS)方法,使用Fmoc保护的氨基酸以多步骤进行所述合成。SPPS基于向聚合物载体(珠)顺序附加被保护的氨基酸衍生物,如果适合则进行侧链保护。碱不稳定的Fmoc基团用于N-保护。在除去保护基团后(经过哌啶水解),用偶合剂(TBTU)添加下一个氨基酸混合物。在最后一个氨基酸被偶合上后,将N-端乙酰化。
将所得到的肽(通过C端连接于聚合物载体)用TFA剪切以形成粗品肽。在剪切的过程中,所有的侧链保护基也被剪切掉。用二异丙醚沉淀后,将固体过滤并干燥。所形成的肽在2-8℃下分析和储存。
固相合成的例子
所述的无规共聚物YFAK由L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸组成,其以其被保护的形式在Wang树脂上制备。所用的树脂为Fmoc-L-酪氨酸(叔丁基)-Wang(0.62mmol/g)、Fmoc-L-苯丙氨酸-Wang(0.72mmol/g)、Fmoc-L-丙氨酸-Wang(0.70mmol/g)和Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-Wang(0.72mmol/g)。所述的四个用F-moc保护的氨基酸,Fmoc-L-酪氨酸(叔丁基)-OH、Fmoc-L-苯丙氨酸-OH、Fmoc-L-丙氨酸-OH和Fmoc-L-赖氨酸-OH,以摩尔产出比为1∶1∶10∶6在各自偶合的步骤过程中分别加入。其它用于合成的试剂为2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、哌啶和三氟乙酸(TFA)。所用的溶剂为N-甲基吡咯烷酮(NMP)、异丙醇(IsOH,IPA,i-PrOH)、二氯甲烷和异丙醚。每种偶合剂的化学计量如下所示:
·残基1到10用2当量的Fmoc保护的氨基酸;
·残基11到30用2当量的具有双重偶合的Fmoc保护的氨基酸;
·残基31到52用2.5当量的具有双重偶合的Fmoc保护的氨基酸。
在典型的具有逐渐升高丙氨酸含量的YFAK合成的例子中氨基酸产出比的例子如下所示:
位置 |
Y |
F |
A |
K |
0-10 |
3.7 |
5.5 |
64.6 |
26.4 |
11-20 |
4.3 |
5.1 |
71.4 |
19.2 |
21-30 |
4.0 |
4.7 |
71.5 |
19.8 |
31-40 |
3.6 |
4.7 |
74.3 |
17.4 |
41-52 |
3.0 |
4.1 |
76.0 |
16.8 |
以相似的方式,共聚物1,本发明的优选实施方案的无规共聚物,在Wang树脂上以其被保护的形式被制备。所用的树脂为Fmoc-L-酪氨酸(叔丁基)-Wang(0.62mmol/g)、Fmoc-L-谷氨酸-Wang、Fmoc-L-丙氨酸-Wang(0.70mmol/g)和Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-Wang(0.72mmol/g)。所述的四个用F-moc保护的氨基酸,Fmoc-L-酪氨酸(叔丁基)-OH、Fmoc-L-谷氨酸-OH、Fmoc-L-丙氨酸-OH和Fmoc-L-赖氨酸-OH,以摩尔产出比为1∶2∶6∶5在各自偶合的步骤过程中分别加入。其它所用的试剂和偶合化学计量与YFAK的合成相同。
在典型的具有逐渐升高丙氨酸含量的YEAK合成的例子中氨基酸产出比的例子如下所示:
位置 |
Y |
E |
A |
K |
0-10 |
3.7 |
9.1 |
21.4 |
22.0 |
11-20 |
4.3 |
8.5 |
23.8 |
16.0 |
21-30 |
4.0 |
8.0 |
23.9 |
16.5 |
31-40 |
3.6 |
7.8 |
24.8 |
14.5 |
41-52 |
3.0 |
6.8 |
25.3 |
14.0 |
非天然的多肽,以及共聚物的化学修饰
在一个实施方案中,本发明的组合物由天然存在的氨基酸组成。在另一些实施方案中,所述的共聚物由天然存在的和合成的衍生物,例如硒代半胱氨酸组成。氨基酸进一步包括氨基酸类似物。氨基酸的“类似物”为具有不同构型的氨基酸的化学相关形式,例如异构体,或D-构型而不是L构型,或具有所述氨基酸的相似大小和形状的有机分子,或具有对包含于肽键中的原子进行修饰的氨基酸,因此当在多肽中聚合时具有蛋白酶抗性。
用于本发明的共聚物可由L-或D-氨基酸或其混合物组成。如本领域技术人员已知的,存在于天然蛋白质中的大部分是L-氨基酸。然而D-氨基酸可商购并能取代一些或所有用于制备本发明的三元聚合物和其它共聚物的氨基酸。本发明预计共聚物包含D-和L-氨基酸两者,以及预计共聚物基本上包含L-或D-氨基酸。
在某些实施方案中,本发明的无规共聚物包括这样的线性共聚物,其通过取代或附加不同的化学部分而进一步修饰。在一个实施方案中,这种修饰在残基位置上并且其量足够抑制所述共聚物在受试者中的蛋白酶解降解。例如,所述的氨基酸修饰可存在于至少一个脯氨酸残基的序列中,该残基以羧基和氨基端基的至少之一的形式存在;另外,所述的脯氨酸可存在于具有羧基和氨基端基中的至少之一的四个残基中。另外,所述的氨基酸修饰可以是存在D-氨基酸。
在一些实施方案中,所述的主题无规共聚物为拟肽(peptidomimetic)。拟肽是基于或衍生自肽和蛋白的化合物。本发明的共聚物拟肽通常可通过一种或多种天然的氨基酸残基的结构修饰而获得,所述的结构修饰例如使用非天然的氨基酸,构象限制,同型空间配位取代等。主题拟肽构成了在肽和非肽合成结构之间的连续结构空间。
这种拟肽可具有这样的性质,其不可水解(例如,增加抵抗蛋白酶或其它使相应的肽共聚物降解的生理条件的稳定性),具有增加的特异性和/或功效。为了举例说明的目的,本发明的肽类似物可使用如下物质生成:例如苯二氮卓(例如参见Freidinger等人,在″Peptides:Chemistry and Biology,″中,G.R.Marshall编,ESCOM Publisher:Leiden,NeTHerlands,1988),取代的γ内酰胺环(Garvey等人,在″Peptides:Chemistry and Biology,″中,G.R.Marshall编,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988,第123页),C-7模拟物(Huffman等人,在″Peptides:Chemistry and Biology,″中,G.R.Marshall编,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988,第105页),酮-亚甲基拟肽(Ewenson等人,1986,J.Med.Chem.29:295;和Ewenson等人,在″Peptides:Structure andFunction(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)″中,Pierce Chemical Co.Rockland,IL,1985),β-反转二肽核(Nagai等人,1985,Tetrahedron Lett.26:647;和Sato等人,1986,J Chem.Soc.PerkinTrans.1:1231),β-氨基醇(Gordon等人,1985,Biochem.Biophys.Res.Commun.126:419;和Dann等人,1986,Biochem.Biophys.Res.Commun.134:71),二氨基酮(Natarajan等人,1984,Biochem.Biophys.Res.Commun.124:141),以及亚甲基氨基修饰物(Roark等人,在″Peptides:Chemistry and Biology,″中,G.R.Marshall编,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988,第134页)。同样通常参见,Session III:Analytic andsynthetic methods,在″Peptides:Chemistry and Biology,″中,G.R.Marshall编,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988。
无规共聚物的分子量在多肽合成过程中或在所述共聚物已经合成之后可以被调整。为了在多肽合成过程中调整分子量,可以调整所述的合成条件或氨基酸的量,因此当所述的多肽达到所需的近似的长度时,停止合成。在合成后,具有所需分子量的多肽可通过任何可用的大小选择步骤获得,例如在分子量筛选柱或凝胶上的多肽色谱分离,并且收集所需的分子量范围。本发明的多肽还可部分水解以除去高分子量物质,例如通过酸或酶水解,并且然后纯化以除去酸或酶。
在一个实施方案中,具有所需分子量的无规共聚物可通过如下方法制备,所述方法包括使被保护的多肽与氢溴酸反应以形成具有所需分子量分布的三氟乙酰基-多肽。所述反应在一定温度下进行一段时间,所述的时间和温度通过一个或多个试验反应预先确定。在试验反应过程中,使所述的时间和温度变化并且确定给定批次的受试多肽的分子量范围。对于某个批次的多肽,提供最优化的分子量范围的试验条件就用于该批。因此,具有所需分子量分布的三氟乙酰基-多肽可通过如下方法制备,所述方法包括使被保护的多肽与氢溴酸在由试验反应而预先确定的时间内和温度下反应。然后将具有所需分子量分布的三氟乙酰基-多肽用哌啶水溶液进一步处理以形成低毒性的具有所需分子量的多肽。
在一个优选的实施方案中,将得自给定批次的被保护多肽的受试样品与氢溴酸在20-28℃的温度下反应10-50小时。通过进行数次试验反应确定该批的最佳反应条件。例如,在一个实施方案中,将被保护的多肽与氢溴酸在约26℃的温度下反应约17小时。
在一些实施方案中,可用于本发明中的无规共聚物包括描述于如下文献中的那些:国际PCT公开WO 00/05250、WO 00/05249、WO02/59143、WO 00/27417、WO 96/32119,美国专利公开2004/003888、2002/005546、2003/0004099、2003/0064915和2002/0037848,美国专利6,514,938、5,800,808和5,858,964,以及在PCT申请PCT/US05/06822中描述的那些。这些参考文献进一步描述合成无规共聚物的方法、包含无规共聚物的组合物、无规共聚物的治疗剂、向受试者给药无规共聚物的方法、可用无规共聚物治疗的疾病,和另外的可与所述无规共聚物一起向受试者共同给药的有效的治疗剂。所有这些专利、申请和公开的教导内容通过引用其全部内容并入本发明中。
清楚的是,这仅是所给的例子,并且如果将上述通用标准结合其中,所述的组合物既可关于组分又可关于组分的相对比例进行变化。
IV.疾病
本发明提供用于治疗和预防受试者的疾病的方法。处于疾病发展的危险中,被怀疑患有疾病,或者患有所述疾病的受试者可使用本发明提供的方法进行治疗。
在一个实施方案中,可用本发明的方法治疗的疾病包括由T细胞,和特别是TH1细胞介导的疾病,或者是由过量炎症细胞因子恶化的疾病。本发明的方法可用于治疗如下疾病:缺血性损伤,包括由全身性缺血或局部缺血导致的那些,特别是心脏、肺或肾。在一些实施方案中,所述的炎症与如下疾病有关:脓毒性休克、过敏性休克、中毒性休克综合征、恶病质、坏死、坏疽、假体植入物或超敏感性,包括I型超敏感性、II型超敏感性、III型超敏感性、IV型超敏感性、即刻超敏感性、抗体介导的超敏感性、免疫复合体介导的超敏感性、T淋巴细胞介导的超敏感性和延迟型超敏感性。在另外的实施方案中,所述的疾病包括心肌梗死、心动停止、缺血-再灌注损伤、充血性心衰、心脏中毒、由于寄生虫感染导致的心脏损伤、急性心脏淀粉样变性、心脏外科手术、心脏移植、外伤性心脏损伤、胸主动脉瘤的外科手术修复、肾上腺主动脉瘤、失血导致的失血性休克、心肌梗死或心衰导致的心源性休克、过敏反应、不稳定型冠脉综合征、心动过速、心动过缓或其组合。
在一个实施方案中,可用本发明的方法治疗的疾病包括自身免疫性疾病。本发明所考虑的自身免疫性疾病包括细胞介导的疾病(例如T细胞)或抗体介导的疾病(例如B细胞)。这样的疾病特别可以是关节炎病症、脱髓鞘疾病和炎症性疾病。本发明的方法特别用于治疗脱髓鞘炎症性疾病,其包括多发性硬化、EAE、视神经炎、急性横贯性脊髓炎和急性弥散性脑炎。在一个具体的实施方案中,如果将所考虑的多肽结合于与自身免疫性疾病相关联的MHC II类蛋白,可用本发明的多肽治疗所有自身免疫性疾病。疾病的进展可通过使用已知方法监控临床或诊断症状进行测量。
在一个实施方案中,用本文中提供的方法治疗的疾病是“关节炎病症”。如本文中所用的,关节炎病症是这样的病症,其中在哺乳动物中的至少一个关节处,例如在所述哺乳动物的肩、膝、髋、脊椎或趾观察到至少一种类风湿性关节炎的症状。RA是常见的人自身免疫性疾病,其在白种人中的患病率为约1%(Harris,B.J.等人,1997,InTextbook of Rheumatology 898-932),目前感染该病的美国人有250万。RA的特征在于滑液关节的慢性发炎和由导致所述关节软骨逐步破坏的活化T细胞、巨噬细胞和血浆细胞产生的浸润。这是关节疾病最严重的形式。RA的遗传易感性与在所述MHC II类DRB1基因座具有等位基因DRB1*0401、DRB1*0404或DRB1*0405或所述的DRB1*0101等位基因的被感染的受试者高度相关。对在RA中的一种或多种自身抗原的性质知道的很少,尽管胶原蛋白II型(CII)是突出的候选者。在相当于残基261-273的II型胶原蛋白中的免疫优势T细胞表位已经被确定(Fugger,L.等人,1996,Eur.J.Immunol.26:928-933)。
关节炎病症的其它例子包括“多发性关节炎”,其作为关节炎病症感染不止一个关节;“幼年型关节炎”,人在21岁以下的关节炎病症;和费尔蒂综合征,其可包含中性粒细胞减少、脾大、体重减轻、贫血、淋巴结病和皮肤色素斑的综合征。
在另一个实施方案中,由本文中提供的方法治疗的疾病为多发性硬化(MS)。多发性硬化的疾病的过程是高度变化的、不可预知的,并在大部分患者中是间歇性的。MS的病理特点是多中心的、多相的CNS炎症和脱髓鞘。疾病消退可独立地为数月或数年,特别是在疾病的早期。复发-缓解型(RR)的约70%的患者,其特征在于具有完全或部分消退的急性恶化。其它的患者表现出慢性MS发展,其进一步细分为(a)原发-进展型(PP),(b)复发-进展型(RP),其为RP和RP特征的组合模式,并且其临床严重性是中等的,和(c)继发-进展型(SP),其中许多患有RP的患者随时间发展。在特定的优选的实施方案中,通过本发明方法治疗的疾病为复发-缓解型多发性硬化。
MS的临床症状包括感觉丧失(感觉异常)、运动(肌肉抽筋继发痉挛)和自发性(膀胱、肠、性功能障碍)脊髓症状、小脑症状(例如构音障碍、共济失调、震颤的Charcot三联症);疲劳和头昏;关于神经心理测试的信息加工方面的损伤;眼部症状,包括关于往外侧注视的复视;三叉神经痛和视神经炎。
在MS中的自身抗原最可能是几种髓鞘蛋白中的一种(例如蛋白脂质蛋白(PLP);髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG);髓鞘碱性蛋白(MBP);髓鞘相关的糖蛋白(MAG);髓鞘相关的少突胶质基础蛋白(MBOP);瓜氨酸修饰的MBP(MBP的C8异形体,其中6个精氨酸已经被deiminated成瓜氨酸),环状核苷酸磷酸二酯酶(CNPase),α-B结晶质的,等)。完整的膜蛋白PLP为髓鞘主要的自身抗原。小神经胶质细胞和巨噬细胞作为抗原呈递细胞共同作用,这导致发炎过程、目标特异性少突神经胶质细胞和它们的膜髓鞘的细胞因子、补体和其它调质的活化。在具有分泌IFN-γ能力的髓鞘自体反应TH1细胞方面量的增加与MS和EAE的发病机理相关,这说明自身免疫诱导物/助手T淋巴细胞,在MS患者的周围血中可引发和/或调整患有MS的患者中的脱髓鞘过程。另一方面,关于产生抗炎细胞因子例如IL-4和IL-10的TH2细胞的保护作用有很多文献。细胞的由TH1到TH2类型的转化平衡预计对预防和治疗MS和EAE是有利的。
在另一个实施方案中,用本文中所提供的方法治疗的疾病为胰岛素依赖型糖尿病。人的I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的特征在于在兰格尔翰斯胰岛中的细胞的自身免疫破坏。β-细胞的损耗导致不能调节在血中的葡萄糖水平。显性(Overt)糖尿病发生于当在血中的葡萄糖水平上升至高于特定水平时,通常约250mg/dl时。在人中,长期的症状前时段发生于糖尿病发病之前。在这段时段中,胰腺β细胞功能逐步丧失。疾病的发展涉及抵抗胰岛素的自身抗体、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的出现,每个例子都是本发明的自身-蛋白、-多肽和-肽的例子。目前用监控血液葡萄糖水平以指导重组胰岛素的注射或基于泵的递送而治疗人的IDDM。饮食和运动方案帮助达到适当的血液葡萄糖控制。
在症状前阶段过程中可被评价的标记为胰腺中胰岛炎的出现、小岛细胞抗体的水平和频率、小岛细胞表面抗体、胰腺β细胞上MHC II类分子的异常表达,血液中葡萄糖浓度和胰岛素血浆浓度。在胰腺中T淋巴细胞的数量、小岛细胞抗体和血液葡萄糖的增加是该疾病的指示,如胰岛素浓度降低时的那样。
在血清中具有各种特异性的自身抗体的组合的出现对人I型糖尿病而言是高度敏感性和特异性的。例如,抵抗GAD和/或IA-2的自身抗体的出现为约98%敏感度和99%特异于鉴别得自对照血清的I型糖尿病。在非糖尿病性一度相关的I型糖尿病患者中,对三个包括GAD的自身抗原中的两个,胰岛素和IA-2具有特异性的自身抗体的出现传达了对于I型DM的发展在5年内的正预测值为>90%。
在另一个实施方案中,用本文中提供的方法治疗的疾病为自身免疫性葡萄膜炎。自身免疫性葡萄膜炎为眼的自身免疫性疾病,估计感染400,000人,在美国每年出现43,000个新病例。自身免疫性葡萄膜炎通常用如下试剂治疗:类固醇、免疫抑制剂如甲氨蝶呤和环孢素、静脉内免疫球蛋白和TNFα-拮抗剂。
在另一个实施方案中,用本文中提供的方法治疗的疾病为实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)。EAU是T细胞介导的自身免疫性疾病,其靶点是眼睛中的视网膜神经、葡萄膜和相关组织。EAU具有人自身免疫性葡萄膜炎的许多临床和免疫学特征,并且由在Complete Freund′sAdjuvant(CFA)中乳化的致葡萄膜炎(uveitogenic)肽的外部给药诱导。
在另一个实施方案中,用本文中提供的方法治疗的疾病为原发性胆汁性肝硬化(PBC)。PBC为器官特异性自身免疫性疾病,其主要感染40-60岁的妇女。在这组中报告的患病率达到每1,000个中有1个。PBC的特征在于肝胆上皮细胞(IBEC)内层小肝胆管的逐步破坏。这导致阻塞和干扰胆分泌,导致最终硬化。与以上皮内层/分泌腺系统破坏为特征的其它自身免疫性疾病的联合已经有报导,包括舍格伦综合征、CREST综合征、自身免疫性甲状腺疾病和类风湿性关节炎。
在另一个实施方案中,用本文中提供的方法治疗的疾病为乳糜泻,也已知为脂肪痢或麸胶敏感性肠病。乳糜泻是由有缺陷的胃肠吸收导致的疾病,其中所述的有缺陷的胃肠吸收是由于对谷类谷物储存的蛋白质,包括存在于小麦、大麦和燕麦中的谷蛋白或其产品麦胶蛋白和麦谷蛋白过度敏感造成的。该疾病由CD4T细胞导致,所述CD4T细胞识别麦胶蛋白为饮食抗原并且这些细胞诱导TH1-介导的慢性炎症应答。可见的症状包括腹泻、失重和脂肪泻,绒毛萎缩和吸收障碍。它可能与皮炎疱疹,小泡状的皮肤出疹相关。乳糜泻与等位基因DQB1*0302和DQB1*0201相关,其与DQA1*0301和DQA1*0501组合。95%的患者携带DQB1*0201或者DQB1*0302。与HLA的强关联据信是由于由DQB1*0201、DQA1*0501、DQB1*0302和DQA1*0301编码DQ分子的能力导致的,以有效地表现出得自麦胶蛋白和麦谷蛋白的富含谷氨酰胺的肽的脱氨基变体。
在另一个实施方案中,用于在受试者中治疗自身免疫性疾病的方法进一步包含抑制T细胞的增殖或功能,所述的T细胞对自身抗原有反应。自身免疫性疾病和免疫排斥的病理学过程是由T细胞介导的。当结合于抗原并识别抗原时,T细胞增殖,向所述位点分泌细胞因子并募集更多的炎症细胞和细胞毒性细胞。
在另一个实施方案中,描述于本文中的用于在受试者中治疗自身免疫性疾病的方法涉及将所述的无规共聚物结合于主要的组织相容性复合体II类蛋白,该蛋白与自身免疫性疾病相关。所述的MHC II类蛋白主要在B淋巴细胞和抗原呈递细胞如巨噬细胞的表面上表达。这些MHC II类蛋白具有肽结合沟槽,该沟槽为将抗原肽呈递于T细胞的位点。当本发明的无规共聚物结合于主要的组织相容性复合物II类蛋白时,那些无规共聚物可阻断或另外干扰抗原呈递和/或T细胞激活。
在一个实施方案中,通过本发明方法治疗的疾病为宿主抗移植物病(HVGD)或移植物抗宿主病(GVHD)。移植系统例如器官移植和骨髓再构成,对于许多危及生命的疾病而言已经成为重要和有效的治疗。然而,免疫排斥对于成功的移植仍是主要障碍。在器官移植(宿主抗移植物病或HVGD)的情况下,显现功能退化和移植物排斥。另一个病理免疫反应性的表现形式为发生于约30%骨髓接受者身上的GVHD。患有GVHD的那些患者中的最多至一半可能死于这一过程。这种高的发病率和死亡率已经使人们对控制和预防GVHD的可能性方面一直有兴趣。临床病理学上,已经识别了两种形式的GVHD。急性GVHD在骨髓移植后的最初3个月内发展并且其特征为皮肤、肝和胃肠道的疾病。慢性GVHD是类似于多器官自身免疫的疾病,在移植后3个月至最多3年内出现并具有相同于天然发生的自身免疫性疾病的特征,如系统性红斑狼疮(SLE)和硬皮病。描述于本文中的方法可用于治疗急性和慢性GVHD两者。
在本文中所述方法的特定实施方案中,共聚物1或YFAK无规共聚物可用于预防和治疗在所有发展成GVHD的器官移植情况下的GVHD,但特别在胎儿胸腺,和更特别在异种骨髓移植的情况下。向处于适当处理方案下的患者可给药GLAT共聚物,治疗方案为在移植前2天和然后在移植后另外的60-100天,至少60天给药。这个过程的方案可包括在大于24、30、36、42或48小时的时间间隔的条件下给药所述无规共聚物。其它的免疫抑制药物,例如环孢素、甲氨喋呤和泼尼松可与共聚物1共聚物一起给药。
本发明的方法还可应用于预防和治疗在患者中移植骨髓过程中的GVHD,所述的患者患有可通过骨髓移植治疗的疾病,包括白血病,例如急性淋巴母细胞白血病(ALL),急性非淋巴母细胞白血病(ANLL),急性髓细胞白血病(AML)和慢性髓细胞白血病(CML),严重联合免疫缺陷综合征(SCID),骨硬化病,再生障碍性贫血,高雪氏症,地中海贫血和其它天生的或遗传决定的造血或代谢异常。
在另一个实施方案中,本发明的方法可应用于促进神经再生或应用于防止或抑制可另外随着原发性神经系统损伤而发生的继发性衰退,例如密闭型脑外伤和钝挫伤,例如由参予危险运动导致的那些,贯穿性损伤,例如火器伤,出血性休克,缺血性休克,青光眼,脑缺血,或由外科手术例如肿瘤切除导致的损伤。另外,这种组合物可用于缓解导致衰退过程的疾病的作用,所述疾病例如由于各种疾病或病症而发生于灰质或白质(或两者)中的退化,包括但不限于:糖尿病性神经病,老年性痴呆,阿尔茨海默病,帕金森氏病,面部神经(贝尔氏)瘫痪,青光眼,亨廷顿氏舞蹈病,肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS),癫痫持续状态,非动脉炎性视神经病变,椎问盘突出,维生素缺乏,朊病毒病例如库贾氏病,腕管综合征,与各种疾病相关的外周神经病,包括但不限于尿毒症,卟啉症,低血糖症,Sjorgren Larsson综合征,急性感觉神经病,慢性混乱神经病,胆汁性肝硬变,原发性淀粉样变性,阻塞性肺病,肢端肥大症,吸收障碍综合征,真性红细胞增多,IgA和IgG gammapathies,各种药物(例如甲硝哒唑)和毒素(例如醇或有机磷酸酯)的并发症,Charcot-Marie-Tooth病,巨大轴突病,遗传性共济失调型多神经炎病(Refsum′s disease),法布瑞氏症,脂蛋白血症等。另外,可通过给药本发明的无规共聚物而治疗的其它临床病症包括癫痫症,健忘症,忧虑症,痛觉过敏,精神病,癫痫发作,眼内压非正常升高,氧化应激和阿片剂耐受和依赖。
在特定的实施方案中,通过描述于本文中的方法治疗的疾病包括多发性硬化、I型糖尿病,桥本甲状腺炎,克隆病,类风湿性关节炎,系统性红斑狼疮(SLE),胃炎,自身免疫性肝炎,溶血性贫血,自身免疫性血友病,自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS),自身免疫性葡萄膜视网膜炎,肾小球性肾炎,吉-巴综合征,银屑病,重症肌无力,自身免疫性脑脊髓炎,吉德帕斯丘综合征,格雷夫斯病,副肿瘤性天疱疮,自身免疫性血小板减少性紫癜,具有抗胶原抗体的硬皮病,混合性结缔组织病,恶性贫血,多肌炎,特发性阿狄森病,与自身免疫有关的不育症,大疱性类天疱疮,舍格伦综合征,特发性粘液水肿或结肠炎。在一些实施方案中,所述的受试者患有多于一种疾病。
V.治疗用组合物
本发明的无规共聚物可以组合物形式向受试者给药,所述的组合物包含药学有效量的共聚物和可接受的载体和/或赋形剂。药学可接受的载体包括生理学可接受的所有的溶剂、分散介质或包衣。优选地,所述的载体适合于静脉内、肌内、口服、腹膜内、皮内、透皮、局部或皮下给药。一个典型的药学可接受的载体为生理盐水。其它药学可接受的载体和它们的制剂是公知的并通常描述于例如Remington′sPharmaceutical Science(第18版,编者Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990)中。很多种药学可接受的赋形剂在本领域是公知的并可在例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(第4版,编者Rowe等人,Pharmaceutical Press,Washington,D.C)中找到。所述的组合物可被配制成溶液剂、微乳剂、脂质体、胶囊剂、片剂或其它合适的形式。包含所述共聚物的活性组分可以在材料中被包衣以保护使其在到达作用的靶点位置之前避免由于周围环境而失活。本发明的药物组合物优选为无菌的并且在递送的时候是非致热性的,并优选在制备和储存条件下是稳定的。
在本发明的另外的实施方案中,所述的药物组合物可为控释制剂。本发明的共聚物可与控制所述共聚物进入到最近环境中的释放速率的生物相容性聚合物或基质掺混。控释或缓释组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸,蜡,油类)中的制剂。
在本发明的一些实施方案中,药物组合物包含无规共聚物,其用油和乳化剂配成制剂以形成油包水微粒剂和/或乳剂。所述的油可以是在室温至约体温的温度下无毒的疏水材料液体,例如可食用的植物油包括红花油、豆油、玉米油和肉桂油;或矿物油。还可使用化学定义的油物质例如月桂二醇。用于该实施方案的乳化剂包括司盘20(失水山梨醇单月桂酸酯)和磷脂酰胆碱。在一些实施方案中,无规共聚物组合物被制备成水溶液并制备成油包水乳液,所述的油包水乳液被分散到95-65%的油例如矿物油,和5-35%乳化剂例如司盘20中。在本发明的另一个实施方案中,所述的乳液用明矾而不是用油和乳化剂形成。这些乳液和微粒剂降低了无规共聚物的吸收速度并达到可控抗原递送的目的。
在一些实施方案中,所述的药物组合物还包括另外的治疗活性剂,这种另外的组分可为结合于不同的HLA分子的至少一种另外的无规共聚物,例如共聚物1(YEAK,CopaxoneTM),结合于不希望的炎症分子或细胞因子例如白细胞介素-6、白细胞介素-8、粒细胞、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,以及肿瘤坏死因子-α;酶抑制剂例如蛋白酶抑制剂抑肽酶或环氧合酶抑制剂;抗生素例如阿莫西林、利福平、红霉素;抗病毒剂例如阿昔洛韦;甾体抗炎药例如糖肾上腺皮质激素;非甾体抗炎药例如阿司匹林、布洛芬或扑热息痛;或非炎症细胞因子例如白细胞介素-4或白细胞介素-10。还可以使用保留类似的生理活性的其它细胞因子和生长因子例如干扰素-β,肿瘤坏死因子,新血管生成抑制因子,红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素、成熟因素、趋化蛋白和它们的变体和衍生物作为另外的组分。
在一些实施方案中,所述另外的活性的治疗活性剂选自抗银屑病霜剂,滴眼剂,滴鼻剂,柳氮磺胺吡淀,糖皮质激素类,丙基硫尿嘧啶,甲巯基咪唑,I131,胰岛素,IFN-β1a,IFN-β1b,糖皮质激素类,ACTH,avonex,咪唑硫嘌呤,环磷酰胺,UV-B,PUVA,甲氨蝶呤,calcipitriol,环磷酰胺,OKT3,FK-506,环孢素A,咪唑硫嘌呤和霉酚酸酯。
本发明的共聚物还可用于与抗肥胖药物组合使用。抗肥胖药物包括P-3激动剂,CB-1拮抗剂,食欲抑制剂例如西布曲明(Meridia)和脂肪酶抑制剂例如奥利司他(Xenical)。目标共聚物还可在糖尿病患者中与通常用于治疗脂质紊乱的药物组合在本发明的方法中使用。这些药物包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂,烟酸,胆汁酸多价螯合剂和苯氧酸衍生物。本发明的多肽还可与抗高血压药物组合使用,所述的抗高血压药物例如β阻断剂,组织蛋白酶S抑制剂和ACE抑制剂。β阻断剂的例子为醋丁洛尔,比索洛尔,艾司洛尔,普萘洛尔,阿替洛尔,拉贝洛尔,卡维地洛和美托洛尔。ACE抑制剂的例子为卡托普利,依那普利,赖诺普利,苯那普利,福辛普利,雷米普利,喹那普利,培哚普利,群哚普利和美西普利。
本发明进一步提供的试剂盒,其包含(i)包含无规共聚物的组合物和(ii)用于向有需要的受试者以大于24小时,更优选大于36小时的时间间隔给药该组合物用于治疗疾病例如自身免疫性疾病的用法说明。在一个实施方案中,所述的自身免疫性疾病为多发性硬化。在优选的实施方案中,所述的无规共聚物为共聚物1。在另一个优选的实施方案中,将所述的无规共聚物配成制剂,给药的间隔为大于约24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时,或者其任何给药间隔。在本文中所述的试剂盒的另一个实施方案中,所述的用法说明指示将所述的无规共聚物在每隔约24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时或任何之间的时间间隔给药。试剂盒可包含另外的组分,例如包装和一种或多种用于给药所述共聚物的装置,例如皮下注射器。
在特定的实施方案中,所述的自身免疫性疾病选自多发性硬化、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、克隆病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、胃炎、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生性综合征(ALPS)、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、肾小球性肾炎、吉-巴综合征、银屑病、重症肌无力、自身免疫性脑脊髓炎、吉德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、副肿瘤性天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、具有抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、恶性贫血、多肌炎、特发性阿狄森病、与自身免疫有关的不育症、大疱性类天疱疮、舍格伦综合征、特发性粘液水肿和结肠炎。
VI.治疗方法
本发明的一个方面提供新的方法以治疗患有或怀疑患有例如自身免疫性疾病的疾病的受试者,其通过向所述的受试者给药治疗有效量的一种或多种无规共聚物。具体而言,将包括无规共聚物组合物的药物组合物进行皮下给药考虑为是本发明优选的实施方案。皮下注射引起更希望的偏向于TH2应答的免疫应答,其是对于某些抗原耐受的基础。
通常,作为对需要这种治疗的受试者进行免疫调节的本发明的治疗方法可不同于接种疫苗。成功的接种疫苗依赖于被给药的疫苗的免疫原性,其增加了抗体直接与在疫苗中的抗原反应的效价。相反,本发明的无规共聚物在治疗疾病中是有效的,而不会引起抵抗所述共聚物自身抗体的高效价。如由如下实施例证明的,本发明的方法的有效性不依赖于抵抗所述共聚物产生的抗体,并因此根本不同于接种疫苗。与接种疫苗不同,通过本发明的方法给药的本发明的无规共聚物,引起对于所述疾病相关的抗原的耐受性,并且更特别地,引起外周耐受性。外周耐受性与中心耐受性相对照,其益处是作为调节现象更安全。因此,本发明的一个方面具体化为给药包含本发明无规共聚物的组合物的方法,以引起对无规共聚物和与所述疾病相关的抗原的外周耐受性。
通常,本发明的实施方案是给药适当剂量的治疗用共聚物组合物,所述剂量为产生治疗效果如减轻症状的最低的有效剂量。所述的治疗用共聚物优选对每个受试者以一定剂量给药,所述一定剂量相当于每天每剂至少约2mg,至少约5mg,至少约10mg或至少约20mg作为合适的最小起始剂量,或者约x mg,其中x为1-20的整数。在本文中所述的方法的一个实施方案中,可给药约0.01至约500mg/kg的剂量。通常,本发明化合物有效剂量为每千克受试者体重每天约50至约400微克。在一个特定的实施方案中,无论给药剂量的频率,每天剂量是等当量的,其为约5至100,或更优选约10至40,或更优选约20mg/天。在另一个特定的实施方案中,在治疗方案中每个单独的剂量为约5至100,或更优选约10至40,或更优选约20mg/剂。
然而,本领域技术人员应当理解的是,本发明组合物的剂量将根据所述的受试者和所用的具体给药途径而变化。在本领域中,调整剂量以适应个体受试者是常规工作。另外,所述的有效量可特别基于所述化合物的大小、所述化合物的生物可降解性、所述化合物的生物活性和所述化合物的生物使用度。如果所述化合物不会快速降解,可生物使用和具有高度活性,则只需少量就有效。适合于受试者的实际剂量可由本领域技术人员,例如给出通常的起始剂量的医师或兽医,作为常规工作容易地确定。例如所述的医师或兽医为了获得所需的治疗效果,可在开始给药在所述药物组合物中采用的本发明的化合物,其剂量低于所需的水平,并随时间增加所述剂量直至达到所需的效果。医师或兽医还可指定建议CopaxoneTM的给药作为通常起始点。
在本发明的上下文中,术语“治疗方案”意于包括给药包含一种或多种无规共聚物的一种或多种组合物的治疗、减轻和预防形式。具体的治疗方案持续的时间可根据具体疾病或病症的性质、其严重性和患者的综合状况,并可由每天一次或更优选每36小时或48小时或更长时间一次扩展到每月或数月一次。治疗后,监控患者的症状变化和病症或疾病状态的症状的缓和。寡核苷酸的剂量可在患者对通常剂量水平没有响应的情况下增加,或者所述剂量可在如果观察到所述病症或疾病状态的症状的缓和、或者所述的病症或疾病状态已经被消除、或者如果用所述的起始剂量观察到不能接受的副作用的情况下降低。
在一个实施方案中,将治疗有效量的无规共聚物给药到受试者,治疗方案包括给药之间的时间间隔为至少36小时,或更优选48小时。在另一个实施方案中,所述的无规共聚物在至少54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时的时间间隔或每天等当量的给药。在一些实施方案中,每隔一天给药所述试剂,而在另一些实施方案中,每周给药。如果向受试者给药两种共聚物,这些共聚物可在同一时间给药,例如同时或基本同时,例如先后给药。另外,它们的给药可以是交错的。例如每48小时各自给药的两种共聚物可同一天给药,或者可以用交替方式,一种在一天给药,而另一种在第二天给药等等。
由如下实施例所示,采用较长给药间隔的治疗方案因此通常采用较低的共聚物的总暴露,引起较低的抵抗共聚物自身的抗体效价,而又引起所需的保护作用。希望中和抗体的这种降低,因为它可能帮助无规共聚物组合物保持其作用而不被中和,并且其关联于降低过敏性休克的风险,提供更安全的疾病的治疗。较长的时间间隔方案也是希望的,因为它们加强了对于TH2应答的倾向,该倾向被认为是所述无规共聚物治疗作用的模式。
在另一些实施方案中,给药所述的无规共聚物,治疗方案包括至少一个不平均的时间间隔,其中至少一个时间间隔为至少24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时,或数天的等当量。
在一个实施方案中,将所述共聚物向受试者给药,在一个治疗方案过程中至少3次,因此在给药之间有至少两个时间间隔。这些时间间隔可以用I1和I2指示。如果所述聚合物被给药4次,那么将在第三和第四次给药之间有增加的间隔,I3,因此对于给药的给定数目“n”,间隔数为n-1。因此,在一个实施方案中,至少在给药之间的时间间隔之一为大于约24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时。在另一个实施方案中,时间间隔的总数n-1的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%为至少约24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时。
在另一个实施方案中,在给药之间的平均时间间隔((I1+I2+...+In-1)/n-1)为至少24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时,或至少两周。
在另一个实施方案中,所述的给药方案包括两个或多个不同的时间间隔组。例如,给药方案的第一部分为向受试者每天、每隔一天或每隔两天,例如在约22mg共聚物/m2受试者体表面积给药,其中,所述的受试者为人。在本发明的一些实施方案中,所述的给药方案开始于向所述的受试者每隔一天、每隔两天、每周、每两周或每月给药。每隔一天或每隔两天给药的剂量可以分别为最高至约65mg/m2和110mg/m2。对于包含每周给药所述无规共聚物的给药方案而言,所述剂量包含最高至约500mg/m2,并且对于包含每两周或每月给药所述无规共聚物的给药方案而言,可给药剂量最高至1.5g/m2。所述给药方案的第一部分可以给药最多至30天,例如7、14、21或30天。之后可任选随后进行给药方案的第二部分,其具有不同的、较长的给药时间间隔,具有通常较低暴露(下降的剂量),其每周、每14天或每月给药,例如在每周500mg/m2身体表面积至最高1.5g/m2身体表面积,持续4周至最高2年,例如4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78或104周。或者,如果所述疾病缓解或总体改善了,则可保持剂量或保持在低于最大量,例如在每周140mg/m2身体表面积。如果在下降给药方案过程中,所述的疾病症状复发,可以恢复第一给药方案直至看到效果,并且可执行第二给药方案。该循环如必要可重复多次。
更具体地,本发明的一个方面为治疗可用无规共聚物治疗的疾病。本发明的一个实施方案为治疗可用组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸)的无规共聚物可治疗的疾病的治疗方法,所述的YFAK的摩尔产出比分别为约1.0∶1.0∶10.0∶6.0,由固相化学合成,其中所述的共聚物长度为52个氨基酸,其为向需要治疗的人受试者给药所述的无规共聚物,治疗方案的第一部分包括的剂量为每天约22mg/m2身体表面积。在本发明的一些实施方案中,所述的给药方案开始于向所述的受试者每隔一天、每隔两天、每周、每两周或每月给药。用于每隔一天或每隔两天给药的剂量可以分别为最高至约65mg/m2和110mg/m2。对于包含每周给药所述无规共聚物的给药方案而言,该剂量包含最高至约500mg/m2,并且对于包含每两周或每月给药所述无规共聚物的给药方案而言,给药可以最高至1.5g/m2。所述给药方案的第一部分可以给药最多至30天,例如7、14、21或30天。之后可任选随后进行给药方案的第二部分,其具有不同的、较长的给药时间间隔,具有通常较低暴露(下降的剂量),其每周、每14天或每月给药,例如在每周500mg/m2身体表面积至最高1.5g/m2身体表面积,持续4周至最高2年,例如4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78或104周。或者,如果所述疾病缓解或总体改善了,则可保持剂量或保持在低于最大量,例如在每周140mg/m2身体表面积。如果在降低给药方案过程中,所述的疾病症状复发,可以恢复第一给药方案直至看到效果,并且可执行第二给药方案。该循环如必要可重复多次。
在本发明另一个实施方案中,所述的方法用于治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病,所述的共聚物1的长度为约52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且通过固相化学合成。所述的给药方案类似于上述对于YFAK所描述的。
本发明的另一个实施方案为治疗可用组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸)的无规共聚物治疗的疾病的方法,所述的YFAK平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶1.2∶20∶6,其为向需要治疗的人受试者给药所述的无规共聚物,剂量为约每天22mg/m2身体表面积,或者具有较长的间隔例如如上所述的每隔一天、每隔两天、每周、每两周或每月。在本发明的另一个实施方案中,所述的方法用于治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,其中共聚物1的长度为52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。所述的给药方案类似于如上所述的方案,并可以任选地包括降低给药。如果在降低给药方案中,所述的疾病症状复发,可恢复第一给药方案直至看到效果,并且可执行第二给药方案。该循环如必要可重复多次。
本发明的另一个方面具体化为用于缓解疾病的方法,所述的疾病为可用无规共聚物治疗的疾病,所述的无规共聚物包括组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),其摩尔产出比分别为约1.0∶1.0∶XA∶6.0,其中XA为大于5.0并小于15.0的数,其为向受试者给药对缓解所述疾病有效的剂量。更特别地,本发明的一个实施方案为用于缓解疾病的方法,所述的疾病为可用无规共聚物治疗的疾病,所述的无规共聚物包括组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),其平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶1.2∶20∶6。在另一个实施方案中,所述的方法为用于治疗可用无规共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,所述的无规共聚物1的长度为约52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。所述的受试者用在22mg共聚物/m2受试者体表面积的给药方案治疗,其中所述的受试者为人。在本发明的一些实施方案中,所述的给药方案开始于向所述的受试者每隔一天、每隔两天、每周、每两周或每月给药。用于每隔一天或每隔两天给药的剂量可以分别为最高至约65mg/m2和110mg/m2。对于包含每周给药所述无规共聚物的给药方案而言,该剂量包含最高至约500mg/m2,并且对于包含每两周或每月给药所述无规共聚物的给药方案而言,给药可以最高至1.5g/m2。所述给药方案的第一部分可以给药最多至30天,例如7、14、21或30天。之后可任选随后进行给药方案的第二部分,其具有不同的、较长的给药时间间隔,具有通常较低暴露(下降的剂量),其每周、每14天或每月给药,例如在每周500mg/m2身体表面积至最高1.5g/m2身体表面积,持续4周至最高2年,例如4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78或104周。或者,如果所述疾病缓解或总体改善了,则可保持剂量或保持在低于最大量,例如在每周140mg/m2身体表面积。如果在降低给药方案过程中,所述的疾病症状复发,可以恢复第一给药方案直至看到效果,并且可执行第二给药方案。该循环如必要可重复多次。
本发明的一个方面为用于改善不希望的免疫应答的手段,其为通过用无规共聚物向受试者给药对于改善所述疾病的有效的剂量,所述的无规共聚物包含组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),摩尔产出比分别为约1.0∶1.0∶10.0∶6.0。在本发明的另一个实施方案中,所述的方法为用于治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,其中所述的共聚物1的长度为约52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且通过固相化学合成。给药方案类似于本文中为YFAK所描述的。对于两种类型的无规共聚物,典型的手段是通过向人受试者给药每天剂量为约22mg无规共聚物/m2身体表面积。在本发明的一些实施方案中,所述的给药方案开始于向所述的受试者每隔一天、每隔两天、每周、每两周或每月给药。用于每隔一天或每隔两天给药的剂量可以分别为最高至约65mg/m2和110mg/m2。对于包含每周给药所述无规共聚物的给药方案而言,该剂量包含最高至约500mg/m2,并且对于包含每两周或每月给药所述无规共聚物的给药方案而言,给药可以最高至1.5g/m2所述给药方案的第一部分可以给药最多至30天,例如7、14、21或30天。之后可任选随后进行给药方案的第二部分,其具有不同的、较长的给药时间间隔,具有通常较低暴露(下降的剂量),其每周、每14天或每月给药,例如在每周500mg/m2身体表面积至最高1.5g/m2身体表面积,持续4周至最高2年,例如4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78或104周。或者,如果所述疾病缓解或总体改善了,则可保持剂量或保持在低于最大量,例如在每周140mg/m2身体表面积。如果在降低给药方案过程中,所述的疾病症状复发,可以恢复第一给药方案直至看到效果,并且可执行第二给药方案。该循环如必要可重复多次。
本发明的又一个实施方案为用无规共聚物改善不希望的免疫应答的手段,所述的无规共聚物为组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为约52个氨基酸,其中共聚物序列的残基1-10具有的比例为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的比例为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的比例为约1.0∶1.2∶20∶6。在本发明的另一个实施方案中,所述的方法为治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,所述的共聚物1的长度为约52个氨基酸,摩尔产出比为1.0∶2.0∶6.0∶5.0,通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。所述的给药方案类似于如上所述的用于YFAK的方案。对于两种类型的无规共聚物,这种方法可通过向人受试者每天给药约22mg无规共聚物/m2身体表面积而实行。给药方案可类似于如上所述的那些,修改为符合受试者的需求。或者,所述的无规共聚物可向人受试者给药最大每天剂量的约80mg。
本发明的另一个方面是用无规共聚物改善不希望的具有TH1显型的免疫应答的方法,所述的无规共聚物为组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),其平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中共聚物序列的残基1-10具有比例为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的比例为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的比例为约1.0∶1.2∶20∶6。在本发明的另一个实施方案中,所述方法为用于治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,其中所述的共聚物1的长度为52个氨基酸,其具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。对于两种类型的无规共聚物,所述的给药方案可以被确定,修改以符合受试者的需求,并可类似于如上所述的那些。
本发明的另一个方面是在受试者中用无规共聚物改善自身免疫反应的方法,所述的无规共聚物为组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),其平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中共聚物序列的残基1-10具有比例为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的比例为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的比例为约1.0∶1.2∶20∶6。在本发明的另一个实施方案中,所述的方法是用于治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,其中共聚物1的长度为52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。对于两种类型的无规共聚物,所述的给药方案可类似于如上所述的那些被修改以符合受试者的需求。
任何方法和手段可使用在本申请中的组合物和制剂实践。
在本发明的另一个实施方案中,本发明的任何方法可使用包含无规共聚物的缓释制剂实现。当使用缓释方式给药本发明的无规共聚物时,所述共聚物的总暴露通常低于在快速注射给药中的总暴露。例如,给药方案的第一部分是向受试者每天、每隔一天或每隔两天给药,例如在约22mg/m2受试者体表面积,其中所述的受试者为人。在本发明的一些实施方案中,所述的给药方案采用缓释方式,每隔一天、每隔两天、每周、每两周或每月向受试者给药,使得所述的共聚物在所述的间隔内释放。用于每隔一天或每隔两天给药的剂量可以分别为最高至约35mg/m2和65mg/m2。对于包含每周给药所述无规共聚物的给药方案而言,该剂量包含最高至约140mg/m2,对于包含每隔1周或每月给药所述无规共聚物的给药方案而言,可给药最高至约750mg/m2。所述给药方案的第一部分可以给药最多至30天,例如7、14、21或30天。之后可任选随后进行给药方案的第二部分,其具有不同的、较长的给药时间间隔,具有通常较低暴露(下降的剂量),其每周、每14天或每月给药,例如在每周140mg/m2身体表面积至最高1.5g/m2身体表面积,持续4周至最高2年,例如4、6、8、12、16、26、32、40、52、63、68、78或104周。或者,如果所述疾病缓解或总体改善了,则可保持剂量或保持在低于最大量,例如在每周140mg/m2身体表面积。如果在降低给药方案过程中,所述的疾病症状复发,可以恢复第一给药方案直至看到效果,并且可执行第二给药方案。该循环如必要可重复多次。
本发明的另一个方面为用无规共聚物治疗患有或显示出多发性硬化(MS)的症状的受试者的手段,所述的无规共聚物为组合物YFAK(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸),平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中共聚物序列的残基1-10具有比例为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的比例为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的比例为约1.0∶1.2∶20∶6。在本发明的另一个实施方案中,所述的方法为治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,所述的共聚物1的长度为约52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。可将这种共聚物用最大剂量为500mg如上所述无规共聚物的无规共聚物的给药以治疗患有或显示出MS症状的受试者。所述的无规共聚物可以在缓释制剂中递送。
用于治疗患有多发性硬化的受试者的方法,其用的最大剂量为在缓释制剂中递送的500mg,所述的缓释制剂为组合物(L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-赖氨酸)的无规共聚物,其平均摩尔产出比分别为约1.0∶1.2∶18.0∶6.0,通过固相化学合成,其中所述的共聚物的长度为52个氨基酸,并且其中共聚物序列的残基1-10具有比例为约1.0∶1.2∶16∶6,残基11-30的比例为约1.0∶1.2∶18∶6,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶1.2∶20∶6。在本发明的另一个实施方案中,所述的方法是治疗可用共聚物1(YEAK)治疗的疾病的方法,所述的共聚物1的长度为约52个氨基酸,摩尔产出比为约1.0∶1.2∶6.0∶5.0,并通过固相化学合成,其中共聚物序列的残基1-10具有摩尔产出比为约1.0∶2.0∶5.5∶5.0,残基11-30的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.0∶5.0,并且残基31-52的摩尔产出比为约1.0∶2.0∶6.5∶5.0。或者,所述的受试者可用每周最大剂量为500mg的、在缓释制剂中递送的无规共聚物治疗。
在如上所述的任何典型的实施方案中,每种剂型的量优选为0.1ml至0.5ml。
在本文中所述的方法的一个实施方案中,给药的途径可以是口服、腹膜内、经皮、皮下、通过静脉或肌内注射、通过吸入、局部、病灶内的、灌输、脂质体介导的递送、局部、鞘内的、龈袋、直肠的、叶鞘内的、支气管内的、鼻的、经粘膜的、肠的、眼睛或耳部递送,或如本领域中技术人员可容易获知的本领域的其它方法。本发明组合物的其它实施方式包括用于给药的各种途径的颗粒形式的保护涂层、蛋白抑制剂或促渗剂,所述途径包括非肠道的、肺部的、鼻的和口的。给药可以是全身性的和局部用的。在优选的实施方案中,将所述的无规共聚物皮下给药。
本发明方法的一个实施方案为在缓释形式中给药本发明的共聚物。这种方法包括施用缓释透皮贴片或植入缓释胶囊或涂覆可植入的药物装置,使得治疗有效的本发明的共聚物的剂量以限定的时间间隔向这种方法的受试者递送。本发明的化合物和/或试剂可通过胶囊递送,所述胶囊允许所述的无规共聚物在一段时段内调整释放。控释或缓释组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明还包括用聚合物(例如聚氧乙烯聚氯丙烯共聚物或其乙二胺衍生物)涂覆的颗粒组合物。在一些实施方案中,共聚物的来源被立体定向地提供,在或接近于自身免疫攻击的区域,例如接近用于治疗IDDM的胰腺。
对于口服给药,所述的药物制剂可以是液体形式,例如溶液剂、糖浆或悬浮剂,或者可以呈现为可用水或其它合适的介质在使用前重新组成的药物产品。这种液体制剂可通过常规的方法用药学可接受的添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用油脂);乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶);非水性介质(例如扁桃仁油、油性酯或分馏植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)制备。所述的药物组合物可采用如下形式,例如由常规方法制备的片剂或胶囊剂,其采用药学可接受的赋形剂例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、云母或硅石)、崩解剂(例如土豆淀粉或淀粉乙醇酸钠)或保湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。所述的片剂可通过本领域公知的方法包被。
当将共聚物1或其它无规共聚物口服时,它可以与其它食物形式混合并以固体、半固体、悬浮液或乳液形式使用,并且其可与药学可接受的载体,包括水、悬浮剂、乳化剂、增味剂等混合。在一个实施方案中,所述的口服组合物具有肠包衣。肠包衣的使用在本领域中是公知的。例如Lehman(1971)教导了肠包衣,例如Eudragit S和EudragitL。The Handbook of Pharmaceutical Excipients,第2版也教导了EudragitS和Eudragit L的应用。可用于本发明中的一种Eudragit为L30D55。用于口服给药的制剂可适合于配成给出所述活性化合物的控释效果的制剂。
对于经颊用药,所述的组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。所述的组合物可配制成用于非肠道给药的制剂,其可通过注射,例如通过快速注射或持续灌输。用于注射的制剂可以单位剂量的形式,例如以安瓿或多剂量容器的形式存在,其中加入防腐剂。所述的组合物可采取如在油性或水性介质中的悬浮剂、溶液剂或乳剂这种形式,并且可以包含配制用试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,所述的活性组分在使用前可以是粉末形式,其用于与适合的媒介物例如无菌无致热源的水构成试剂。
所述的组合物还可被配成直肠用组合物形式,例如栓剂或停留灌肠剂,例如包含常规的栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。对于通过吸入给药,用于本发明的组合物通常以气溶胶喷雾形式递送,所述的气溶胶喷雾由压力包装或雾化器提供,其使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在压力气溶胶的情况下,所述的剂量单位可通过提供阀控制以递送计量而确定。用于吸入器或吹入器的,例如明胶的胶囊和药包,可配制成包含所述化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
在优选的实施方案中,包含共聚物1或其它无规共聚物的组合物可根据常规步骤配制成制剂作为适用于向人静脉内给药的药物组合物。通常,用于静脉内给药的组合物是无菌的等渗水缓冲溶液。只要需要,所述的组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂,例如利多卡因以缓解在注射位置的疼痛。通常,将所述的组分单独或者混合在一起提供。如果将所述的组合物通过灌输给药,它可以用包含无菌制药级水或盐水的灌输瓶分配,其中给药的时间间隔为大于24小时、32小时或更优选大于36或48小时。如果将所述的组合物通过注射给药,可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿,使得所述的组分可在给药前被混合。
在某些实施方案中,描述于本文中的方法允许通过缓释载体持续治疗自身免疫性疾病,所述的缓释载体例如适于活性组分缓释的透皮贴片、涂覆有缓释制剂的可植入药物装置,或可植入或可注射药物制剂。在这些实施方案中,给药之间的间隔优选大于24小时,32小时或更优选大于36或48小时。例如在2天的时间内释放所述共聚物的可植入装置或缓释制剂可以是每四天进入到患者体内的植入物,使得在2天的时间内,没有共聚物向所述的受试者给药。在相关的实施方案中,没有给药发生的时间间隔为至少24+x小时,其中x表示任何正整数。
在另一个实施方案中,将所述的无规共聚物配置成制剂,其当以至少24小时的时间间隔给药到需要其的受试者时,具有治疗效果。在特定的实施方案中,所述的无规共聚物被配制成长效治疗有效的制剂,使得治疗所述的疾病的治疗效果在当将所述无规共聚物在给药之间的时间间隔为至少24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222、228、234或240小时给药到所述的受试者时观察到。
本发明的另一个实施方案为通过给药无规共聚物预防治疗受试者的方法,所述的受试者处于发展为自身免疫性疾病的危险中。处于危险中的受试者通过如下方式确定,例如通过测试与这种自身免疫性疾病相关的和/或基于家族史HLA的等位基因,或其它与这种自身免疫性疾病相关的基因标记而确定对所述自身免疫性疾病的遗传敏感性。这种预防治疗可另外包含结合于第二HLA分子的第二共聚物,所述的第二HLA分子与待治疗的自身免疫性疾病相关。所述的第二HLA分子可以是HLA-DQ或HLA-DR分子。优选地,待被预防治疗的自身免疫性疾病为IDDM或乳糜泻。
在描述于本文中的方法的其它实施方案中,将另外的治疗活性剂向受试者给药。在一个实施方案中,将包含另外一种或多种治疗剂的组合物以单独组合物的形式向所述的受试者给药,其中所述的单独组合物得自包含所述无规共聚物的那些。例如,可向受试者皮下给药包含无规共聚物的组合物,而包含另一种治疗剂的组合物可口服给药。所述的另外的治疗剂可以治疗与所述无规共聚物治疗的疾病相同的疾病,相关的疾病,或可意于治疗所述共聚物的给药所产生的不希望的副作用,例如降低在皮内注射位置处的肿胀。
可向所述的受试者给药的另外的治疗活性剂包括结合于与所述疾病相关的第二HLA分子的共聚物,例如CopaxoneTM,抗体,酶抑制剂,抗菌剂,抗病毒剂,类固醇,非甾体抗炎药,抗代谢剂,细胞因子或可溶细胞因子受体。所述的第二HLA分子可以是HLA-DQ分子或HLA-DR分子。所述的酶抑制剂可以是蛋白酶抑制剂或环氧合酶抑制剂。可以将所述的另外的药剂作为所述药物组合物的部分加入,或者可以伴随给药或在如下所述的时间期间内给药,所述的时间期间为可使所述的另外的试剂的生理作用与本发明的共聚物的生理作用重叠。更特别地,所述的另外的试剂可以伴随给药或在给药所述的共聚物之前一周、数天、24小时、8小时或即刻给药。或者,可在给药所述共聚物之后一周、数天、24小时、8小时或即刻给药。
作为给药所述的无规共聚物结果的患有多发性硬化(MS)的受试者的症状的改善可以通过MS事件发生的频率的降低,通过症状严重性的降低和通过在开始给药后消除重新发生事件一段时间来说明。相对于未治疗的受试者,治疗有效剂的剂量优选使症状和再次发生的频率降低一种或多种症状消除的至少约20%,例如降低至少约40%,至少约60%和至少约80%,或者约100%,或消除自身免疫性疾病的再次发生。所述的时间周期可以是至少约1个月,至少约6个月或至少约1年。
对于患有关节炎或其它导致关节发炎的自身免疫性疾病的受试者的症状的改进,其指征为一个或多个关节的浮肿的降低、一个或多个关节的炎症的降低、一个或多个关节活动性的增强。相对于未治疗的受试者,治疗有效的剂量优选降低关节炎症和水肿并改善活动性至少约20%,更优选至少约40%,甚至更优选至少约60%,和甚至更优选至少约80%。
在本申请中任何地方参考的任何专利、专利申请或科技文章的内容以它们的全部内容并入本发明中。
如果合适,除非另外提及,本发明的实践将应用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、基因改造生物学、微生物学、病毒学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些技术在本领域的技术范围内。这些技术描述于文献中。参见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,编者Sambrook and Russell(Cold Spring Harbor Laboratory Press:2001);the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Using Antibodies,第二版,作者Harlow和Lane,Cold Spring HarborPress,New York,1999;Current Protocols in Cell Biology,编者Bonifacino,Dasso,Lippincott-Schwartz,Harford和Yamada,John Wileyand Sons,Inc.,New York,1999;和PCR Protocols,编者Bartlett等人,Humana Press,2003。