CN101041598A - 纤维素分解混合细菌的使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种纤维素分解混合细菌的使用方法。其主要特征在于：用机械粉碎法对稻草进行预处理后，分次施用所需尿素或者施用缓控释氮肥，将纤维素分解混合细菌喷雾接种吸附在稻草表面，然后撒开用少耕法或免耕法进行稻草还田。10～20天后腐解基本完成，稻草的失重率为50～65％。本发明显著提高了植物纤维素腐解效率，同时具备简单易操作的优点，适于在广大农村推广使用。

Description

纤维素分解混合细菌的使用方法

技术领域

本发明涉及应用微生物处理农业废弃稻草的生物技术，尤其是应用纤维素分解混合细菌菌剂直接分解还田秸秆的使用方法。

背景技术

我国可利用的植物纤维素资源丰富，仅稻草年产量达数亿吨。农作物秸秆含有丰富的氮、磷、钾及多种微量元素，但我国复种指数高的农业种植区稻草大多被焚烧，容易造成对环境的严重污染，影响航空和高速公路运输，同时也大大减少了稻田有机质的投入，由于反复耕种稻田有机质急剧下降，化肥施用过量最终导致了稻田贫瘠、板结及盐碱化，直接后果是农作物产量和质量均下降。

稻草还田是农业生产上解决农业废弃稻草和改良土壤、增加土壤有机质的有效方法，将稻草直接还田被当季农作物利用，有利于作物的生长，是对农业资源的有效利用和适应生态农业发展需要的较佳选择。但由于组成秸秆的木质素是一种高度抵抗生物降解的高分子聚合物且具有一定的结晶度，而成熟秸秆的纤维素部分处于木质素的包蔽鞘中，从而给纤维素的降解带来困难。此外，稻草自然分解过程中产生的高温和臭气，将造成植物烧根和污染空气的后果。因此，长期以来对秸秆还田的推广较难进行。

采用纤维素分解菌群作为秸秆生物腐熟剂，能够促进稻草的快速腐熟，一方面消除了自然分解过程中产生的高温和臭气，另一方面加速了有机物的分解，提高了秸秆的利用率。如专利号为02133713.6中公开了“一种直接分解秸秆为肥的微生物肥料菌剂及其生产工艺和使用方法”，涉及的微生物肥料菌剂使用方法为将新鲜秸秆均匀铺在地面，用锄头斩成碎片后将菌剂均匀喷洒在秸秆上，两小时内将秸秆埋入土中，使其与土壤均匀混合于耕作层作为底肥。使用该微生物肥料菌剂进行农业秸秆还田试验取得了良好效果，对于增加土壤有机质含量、抑制有害微生物生长起到一定效果，但采用锄头将新鲜秸秆斩成碎片及将秸秆埋入土壤中这一方法费时又费力，给农业推广使用造成一定难度。专利申请号为200510011217.3中公开了“利用秸秆预处理和酶解工艺使秸秆纤维素完全酶解的方法”，秸秆首先经气爆进行预处理，然后用热水冲洗除去半纤维素多糖，干燥后与离子液体混合，微波加热或直接加热，然后将处理国的秸秆用水反复冲洗，采用这一方法虽然纤维素酶解率很高，但处理过程繁琐，采用热水冲洗和微波加热需消耗大量能量，在一定程度上增加了处理成本，不利于农田大面积推广使用。

然而，微生物菌剂直接用于秸秆还田过程中存在的问题是容易造成微生物与农作物争氮，直接影响苗期生长，从而影响后期产量。在秸秆还田过程中加入适量氮肥，能加速腐解并有效防止氮素损失及氨臭味的产生，但一次性加入尿素将为整个腐解系统中的微生物提供氮源，其中一些不能产生纤维素酶的微生物也大量繁殖，最终导致腐解过程中纤维素分解菌氮源不足，同样影响腐解效果。此外，由于细菌产生的纤维素酶属于胞外附着酶，需要细菌菌体直接接触作用物，因此，采用直接加菌在水中的方法会降低稻草表面的腐解菌浓度，不利于提高腐解效率。

迄今为止，尚未见利用纤维素分解混合细菌菌剂用于稻草还田使用方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种腐解效率高、有害物质产生少、适用性广的稻草腐解细菌制剂的使用方法。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

应用混合细菌用于稻草还田的使用方法为：

用机械粉碎法对稻草进行预处理后，分次施用所需尿素或者施用缓控释氮肥，将纤维素分解混合细菌喷雾接种吸附在稻草表面，然后撒开用少耕法或免耕法进行稻草还田。

所述的机械粉碎法采用农业收割配套机械进行。

施用所需尿素的方法为在稻草还田初期分2～3次施用所需尿素，每次施用间隔期为4～5天，每亩共施用尿素40～80kg。

缓控释氮肥的施用量为每亩50～75kg。

纤维素分解混合细菌接种量为稻草质量的1～2％。

纤维素分解混合菌剂为细菌制剂，功能菌含量为1～7×10⁹个/ml。

纤维素分解混合菌剂可以是市场上所提供的具有纤维素分解作用的细菌菌剂。

本发明具体稻草还田方法为：

取保存的产黄纤维单胞菌和枯草芽孢杆菌在液体菌种培养基中活化，按1％接种量接种富集培养；将培养好的菌按一定比例混合，使混合物中产黄纤维单胞菌和枯草芽孢杆菌含量分别为1～5×10⁹个/ml和1～2×10⁹个/ml；进行纤维素腐解前先使用机械粉碎法对稻草进行预处理，在稻草还田初期分2～3次施用所需尿素或者施用缓控释氮肥，每次施用尿素间隔期为4～5天；将纤维素分解混合细菌按稻草质量的1～2％接种量喷雾接种吸附在稻草表面，10～20天后腐解基本完成。

本发明的优点在于：

1、使用机械粉碎法对稻草进行预处理，能降低纤维素的聚合度并增加原料的可及性，从而有效解决纤维素降解困难的问题。

2、以喷雾方式将细菌制剂接种在稻草表面再撒开，纤维素分解细菌吸附在稻草上，能够增加稻草表面的腐解细菌浓度，从而提高腐解效率。

3、氮源的添加方式为分次施用或采用缓控释肥，这样有利于接种的优势纤维素分解菌群争夺氮源进行繁殖，加速了稻草的腐解并有效防止氮素损失及氨臭味的产生。

具体实施例

实施例1：纤维素分解混合细菌用于稻草还田的使用方法

本发明的混合菌剂由产黄纤维单胞菌和枯草芽孢杆菌组成，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ACCC10115)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，其活化及富集培养基为：NaNO₃ 1g，(NH₄)₂SO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，CMC-Na 1g，H₂O 1000ml，pH 7.0～7.4。

产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)(CGMCC1.1002)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其活化富集培养基为：酵母膏0.5％；(NH₄)₂SO₄ 0.5％；淀粉1.5％；FeSO₄·7H₂O 0.02％；NaCl 6g；KH₂PO₄ 0.5g；CaCl₂ 0.1g；KK₂HPO₄ 0.5g；CMC-Na 5g；pH7.0～7.5。

取保存的产黄纤维单胞菌和枯草芽孢杆菌分别在上述液体培养基中活化，按1％接种量接种到装有上述液体培养基的500ml三角瓶中，120rpm、36℃培养。将培养好的菌按一定比例混合，使混合物中产黄纤维单胞菌和枯草芽孢杆菌含量分别为1～5×10⁹个/ml和1～2×10⁹个/ml。

以下通过三个腐解效果比较实验来支持本发明的技术方案：

1、混合菌群对稻草秆和稻草粉的腐解效果比较实验

分别称取3.0kg早稻秸秆和稻草粉装入塑料桶中，按质量比稻草∶水＝1∶5进行浸泡，并按水的质量加入0.1％的尿素，再接种1％的液体菌种，在35℃恒温箱内进行腐解，每隔一定时间取一次水样，测定还原糖含量，腐解15天，设3次重复。分别以不接纤维素分解菌做为对照。

由图(1)可知，稻草粉腐解过程中的还原糖量都要高于稻草秆腐解过程中的还原糖含量，并且稻草粉对照的还原糖含量要比稻草秆处理的还原糖含量还要高。以上结果表明在将稻草转化为有机肥时，先将稻草粉碎有利于稻草的腐解，提高还田效果。

2、尿素施用方法对稻草腐解的影响实验

分别称取3.0kg早稻秸秆装入尼龙袋后放入塑料桶中，然后按质量比稻草∶水＝1∶5进行浸泡，并按每桶水质量的0.1％称取尿素，设处理(1)尿素一次性加入；处理(2)先加入尿素用量的50％，然后分别在第5天和第10天加入尿素用量的25％，各设3次重复，接种1％的液体菌种。分别以不接菌种为对照。在35℃恒温箱中进行腐解，每隔一定时间取一次水样，测定纤维素酶活性，腐解15天后取出用流水洗净，烘干至恒重并计算失重率，用邓肯氏新复极差法进行显著性分析。

由图(2)可知，采用不同尿素施用方法时，加菌发酵的还原糖量都要比相应的对照高，一次性加入尿素要比分次加入尿素的高。分次加入尿素的纤维素酶活要比对应的一次性加入尿素的高。

由表1可知，加菌腐解的失重率要比相应的对照高，但处理1和CK1的失重率没有达到显著水平，而处理2和CK2的失重率达到了极显著水平，处理1和处理2没有达到显著水平，而CK1和CK2达到显著水平。这说明分批加入氮源有利于接种优势纤维素分解菌群争夺氮源进行繁殖，能加速稻草的腐解并防止氮素损失及氨臭味的产生。在配合稻草还田时，也应该分批施用氮肥。

         表1尿素施用方法对菌腐解稻草的影响

处理

失重率(％)

5％显著性

1％极显著性

处理1	63.40	ab	A
				处理2	67.73	a	A
CK1	60.16	b	AB
				CK2	54.42	c	B

3、菌的使用方法对稻草的腐解试验

分别按每袋称取3.0kg早稻秸秆，设处理(1)按稻草量的1％喷雾接种混合液体菌种吸附10min，然后装入尼龙袋，按质量比稻草∶水＝1∶5进行浸泡；处理(2)将稻草装入尼龙袋后，然后按质量比稻草∶水＝1∶5进行浸泡，再按稻草量的1％接种混合液体菌种；对照组：将稻草装入尼龙袋后按质量比稻草∶水＝1∶5进行浸泡但不接菌种。然后分别按每桶水质量的0.1％加入尿素，在35℃的恒温箱中进行腐解，每隔一定时间取一次水样，测定纤维素酶活性、还原糖含量、pH值及COD(未提供测定结果)，腐解15天后取出用流水洗净，烘干至恒重并计算失重率，用邓肯氏新复极差法进行显著性分析。以上各设3次重复。

由图(3)可知，喷菌处理的纤维素酶活要高于加菌处理和对照的，而对照的纤维素酶活比加菌处理的高，这与纤维素酶是一种诱导酶，菌与稻草的直接接触影响着纤维素酶的产生。由图(4)可知，加菌处理的pH要比喷菌处理和对照的高，这与菌分解其中的尿素及稻草上易分解物质的双重作用紧密联系在一起。由图(5)可知，发酵初期和末期，添加菌剂的纤维素酶活要比对照高，而喷菌的纤维素酶活性要比加菌的高，这是由于喷菌直接与稻草接触，诱导纤维素酶产生较早的缘故。由图(6)可知，发酵早期喷菌的COD要比加菌的和CK的都高，并且加菌的COD要比CK的高，这与喷菌处理的菌附着在稻草上，早期产酶活性强，分解的物质多，而加菌处理的菌分散在水中，能够利用其中的物质，减少还原性物质的量，这与图(5)的变化有一定的相关性，在发酵后期加菌的COD最低。结合以上指标综合分析，该类菌剂以直接喷在稻草上使用比较适宜。

由表2可知，喷菌(处理1)与加菌(处理2)的失重率达到显著水平，但是没有达到极显著水平，而处理有对照之间的失重率达到极显著水平。说明将菌吸附在稻草上能够有助于这类制剂的作用效果，这主要是由于喷菌在稻草上使用能够增加稻草表面的腐解菌浓度，而加菌在水中会减少稻草表面的腐解菌浓度。因此使用这类菌剂宜直接喷在稻草上使用，而不是撒在稻田中。

     表2菌使用方法对菌腐解稻草失重率的影响

处理	失重率	5％显著性	1％极显著性
				1	65.93	a	A
2	58.02	b	A
				CK	43.13	c	B

基于以上结果，我们在进行纤维素腐解前使用机械粉碎法对稻草进行预处理，以有利于稻草的腐解，提高还田效果；在稻草还田初期分2～3次施用所需尿素，每次施用尿素间隔期为4～5天，每亩共施用尿素40～80kg，以有利于接种的优势纤维素分解菌群争夺氮源进行繁殖，加速稻草的腐解并防止氮素损失及氨臭味的产生；由于细菌产生的纤维素酶属于胞外附着酶，需要细菌菌体直接接触作用物，我们采用将纤维素分解混合细菌按稻草质量的1～2％接种量喷雾接种吸附在稻草表面，然后再撒开进行少耕或免耕，以增加稻草表面的腐解菌浓度。

实施例2：模拟稻田发酵稻草试验

在每个尼龙袋中装入早稻秸秆500g，试验设处理(1)在塑料桶底部装土2kg，然后将按稻草质量1％喷液体菌种的稻草装入尼龙袋放入桶中，按水质量的0.1％加入缓控释氮肥，然后加水至淹没稻草为止；处理(2)在塑料桶底部装土400g，然后按稻草质量1％喷液体菌种，再将稻草装入尼龙袋并放入桶中，在其上面覆土100g，按水质量的0.1％加入缓控释氮肥，然后加水至淹没稻草为止；对照组：在塑料桶底部装土2kg，然后将按稻草质量1％喷液体菌种的稻草装入尼龙袋放入桶中，加水至淹没稻草为止。在35℃的恒温箱中进行腐解，15天后取出用流水洗净，烘干至恒重并计算失重率，用邓肯氏新复极差法进行显著性分析。各设3次重复。

在105℃～110℃烘至恒重并计算失重率，按失重率＝(腐解前稻草质量-腐解后稻草质量)/腐解前稻草质量×100％。结果见表4。

            表3模拟稻田发酵稻草试验

处理	失重率	5％显著性	1％极显著性
				1	64.77	a	A
2	61.89	a	A
				CK	45.27	b	B

由表3可知，2个处理的失重率与对照的失重率相比较均达到极显著水平，说明采用缓控释氮肥代替分批加入尿素的方法能够有效减轻劳动强度，且基本能够达到同样的腐解效果；表中覆盖薄层土壤的失重率虽然比不覆盖土壤的低，但2者差异没有达到显著水平，说明稻草还田少耕与免耕条件下，该菌剂同样有效果。

基于以上结果，我们在稻草还田初期每亩施用缓控释氮肥50-75kg；将纤维素分解混合细菌按稻草质量的1～2％接种量喷雾接种吸附在稻草表面，然后撒开进行少耕或免耕，能够达到与分批加入尿素同样的效果。

Claims (6)

1、纤维素分解混合细菌的使用方法，其特征在于：用机械粉碎法对稻草进行预处理后，分次施用所需尿素或者施用缓控释氮肥，将纤维素分解混合细菌喷雾接种吸附在稻草表面，然后撒开用少耕法或免耕法进行稻草还田。

2、权利要求1所述的纤维素分解混合细菌的使用方法，其特征在于：所述的机械粉碎法采用农业收割配套机械进行。

3、权利要求1所述的纤维素分解混合细菌的使用方法，其特征在于：施用所需尿素的方法为在稻草还田初期分2～3次施用所需尿素，每次施用间隔期为4～5天，每亩共施用尿素40～80kg。

4、权利要求1所述的纤维素分解混合细菌的使用方法，其特征在于：缓控释氮肥的施用量为每亩50～75kg。

5、权利要求1所述的纤维素分解混合细菌的使用方法，其特征在于：纤维素分解混合细菌接种量为稻草质量的1～2％。

6、权利要求1所述的纤维素分解混合细菌的使用方法，其特征在于：纤维素分解混合菌剂由细菌组成，功能菌含量为1～7×10⁹个/ml。

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