CN101037447B

CN101037447B - 以白花丹素为配体的金属配合物、其合成方法及其用途

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Publication number: CN101037447B
Application number: CN2006100205238A
Authority: CN
Inventors: 梁宏; 陈振锋; 谭明雄; 王恒山; 刘华钢; 杨斌
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2026-03-17
Also published as: CN101037447A

Abstract

本发明将公开以白花丹素为配体的金属配合物、其合成方法及其用途，本金属配合物如下式：

Description

以白花丹素为配体的金属配合物、其合成方法及其用途

(一)技术领域：

本发明涉及金属配位化合物，特别是以白花丹素为配体的金属配合物；本发明还涉及这种金属配合物的合成方法及其用途。

(二)背景技术：

白花丹素(Plumbagin)是从蓝雪科蓝雪属植物白花丹(Plumbagozeylanica)中分离的天然生物活性分子，又名蓝雪醌，化学名为5-羟基-2-甲基-1，4-萘醌，具有抗菌、消炎和抗肿瘤作用。抗肿瘤体外实验体表明，白花丹素具有较强的细胞毒活性，如能显著抑制白血病细胞(Raji)，肺癌细胞(Calu-1)，子宫癌细胞(HeLa)和上皮细胞(Wish)等多种肿瘤细胞的生长，IC₅₀值分别为8.1μM，25.0μM，21.5μM和21.2μM。(参见文献：Nguyen A T，Malonne H Duez P.Cytotoxic constituents fromPlumbago zeylanica.Fitoterapia，2004，75：500-504)；体内实验也表明白花丹素可抑制P388淋巴白血病细胞瘤的生长。(参见文献：KrishnaswamyM，Purushothaman K K.Plumbagin：a study of its anticancer，antibacterial and antifungal properties.Indian J.Exp.Biol.，1980，18(8)：876-877)。但迄今，白花丹素的药学用途只是局限在对皮肤的抗菌、消炎作用，以白花丹素为配体的金属配合物的合成及其药理活性研究尚未有公开的报道。

(三)发明内容：

本发明将公开以广西特有植物白花丹的抗肿瘤有效成份——白花丹素为配体的金属配合物；本发明还将公开上述金属配合物的合成方法及其用途。

对天然活性成分进行结构修饰和优化，合成高效、低毒的抗肿瘤有效成分是当今研究和开发新药的热点，特别是生物无机化学、配位化学与天然药物化学之间学科的交叉应用，许多具有抗肿瘤活性的金属配合物如顺铂配合物、二烃基锡衍生物已被合成并且一些已用于临床，在这种情况下，把具有抗肿瘤活性的白花丹素与一些已用于临床或试验的具有抗肿瘤作用的金属配合物的金属离子作用，以增加其作用靶点，提高白花丹素的药效和降低其毒性，这是极有意义的工作。

作为配体的白花丹素化学式为C₁₁H₈O₃，分子量为188，结构式如下：

白花丹素在结构上具有较高的超离域度，完整的大∏键共轭体系，较强的配位氧原子与合适的空间构型，可作为金属离子良好的螯合配体。

本发明所述的金属配合物的结构如式(I)：

合成时，白花丹素的羰基氧和羟基氧(脱去一个质子)以双齿鳌合形式与金属离子M配位，形成六元环鳌合体。

其中，M代表某种能接受孤对电子的金属离子；所述金属离子可为主族金属离子，或过渡金属离子，或稀土金属离子；具体选择时，可优先选取一些其金属配合物已被用于治疗肿瘤的临床应用或临床试验的金属离子，如Ga(III)、Ru(III)、Pt(II)、Au(I)、Sn(IV)等，以增加其作用靶点；或选择一些对人体的正常生长、发育是必需的，而且对人体的其它生命活动有着极为重要的作用的微量元素：如Fe(II)、Zn(II)、Cu(II)等是酶和蛋白质的关键成分，Ni(II)有可促进胰腺作用；还有对人体有特殊生理功能的Mn(II)、Co(II)、Mo(VI)、Mg(II)、Ca(II)等；当然也可选择一些有药理实验表明具有生物活性、且以其合成的金属配合物有研究报道具有较强的抗肿瘤活性和抑菌活性的金属离子，如稀土元素Y(III)、La(III)、Nd(III)等；及可优先选择Sm(III)、Eu(III)、Er(III)、Ag(I)、Pd(II)、W(VI)等金属离子。

本发明金属配合物的合成方法有：溶液法、水热法、溶剂热法等，一般可采用溶液法合成，合成步骤如下：

1)将摩尔比为1∶1～3的金属盐与配体溶于溶剂中；溶剂的选择应由溶解度来决定，以能溶解金属盐和配体为准，一般选择溶解性较好的溶剂，如水，或其它强极性有机溶剂，或弱极性有机溶剂，如乙醇、甲醇、氯仿、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等，还可根据反应需要选择相应的混合溶剂及其配比量，如常用水-乙醇溶液；金属盐与溶剂、配体与溶剂之间的配比用量与溶解度有关，确定溶剂用量时，首先考虑要能将金属盐和配体完全溶解，当然也可根据反应需要可以适当过量些，如有些长时间的加热回流反应，则需要加大溶剂的用量，配体与溶剂的用量比、金属盐与溶剂的用量比一般均为1mol∶30～100ml为宜；若将金属盐与配体分别用溶剂溶解后再混合，溶解金属盐的溶剂与溶解配体的溶剂的配比量(体积比)一般可为1∶1～3；

2)所得的混合溶液进行反应；由于搅拌可使反应物分子或离子之间能有更好的碰撞、接触，使反应进行得更充分、更完全，因此最好将所得的混合溶液在搅拌条件下进行反应；反应温度和反应时间可根据实际反应需要确定，一般来说，反应温度的提高可以加快反应的进行，缩短反应时间，但具体合成时，有些反应一般在常温条件下反应已经能快速完成，则没有必要提高温度，如白花丹素Cu(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Fe(II)、Mn(II)、Y(III)、La(III)、Nd(III)、Sm(III)、Eu(III)、Er(III)、Ag(I)、Ru(III)金属配合物的合成；反之，有些反应不能在常温下进行，没有达到一定的温度则不能反应或反应很慢，则需要提高温度，一般从20℃加热至80℃，如白花丹素Mo(VI)、W(VI)、Pt(II)、Pd (II)、Sn(IV)金属配合物的合成；其次，温度的提高还需考虑所用溶剂的沸点温度，一般反应温度不超过所用溶剂的沸点温度，还有对高温时容易分解的反应物，反应温度还不能超过其分解温度；而反应时间一般可由反应速度确定，对反应速度慢的反应，则可适当加长反应时间；所述反应温度一般为20℃～80℃，反应时间一般为2～48小时；反应时，金属离子按一定的配位方式与配体配位作用，从而达到制备配合物的目的；在合成过程中，最好适当的调节溶液的pH值，其pH值大小可根据反应的需要来选择的，一般来说，反应碱性强有利于白花丹素羟基上的质子脱去，有利于反应的进行，溶液的pH值范围最好为5～8；此外，对于一些见光易氧化、分解的金属盐，还需要避光、惰性气体保护等；

3)将反应后溶液过滤，取溶液的沉淀进行提纯、干燥，得到相应的金属配合物；所述将溶液的沉淀提纯的方法可为，将沉淀用不同类型的溶剂进行洗涤：例如选用水或极性较强的有机溶剂如乙醇、丙酮，极性较弱的有机溶剂如氯仿等洗涤沉淀，以除去未反应的配体、金属盐和其它副产物，一般可洗涤三次；所得金属配合物的结构可由一些物理性质的分析和谱学分析来确定，如元素分析、差热-热重分析、红外光谱、核磁共振分析等。

由于可以给出孤对电子的白花丹素非常适合与能接受孤对电子的金属离子作用形成金属配合物，所以本发明以其为配体与多种金属盐合成了一系列金属配合物，并通过考察所得配合物对多种肿瘤瘤株的抑制作用，结果表明其中多种配合物表现出了比白花丹素更为显著的抗肿瘤活性，具有很高的药用价值，可用于各种抗肿瘤药物的制备。

(四)具体实施方式：

实施例1：合成白花丹素Cu(II)金属配合物

按摩尔比1∶2的比例，将1mol的醋酸铜和2mol的白花丹素分别称取后，分别溶于30ml水和30ml乙醇中，在25℃搅拌的条件下，将醋酸铜水溶液逐滴加到白花丹素乙醇溶液中，即有棕红色沉淀生成，继续搅拌2小时使其完全反应，过滤溶液，所得的沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再置于P₂O₅的干燥器中真空干燥至恒重，此产物即(C₁₁H₇O₃)₂Cu.2H₂O。

白花丹素Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Fe(II)、Mn(II)等金属配合物的合成方法与此方法相同。

实施例2：合成白花丹素Mo(VI)金属配合物

按摩尔比1∶2的比例，将1mol的钼酸溶于25ml水中，将2mol的白花丹素溶于50ml乙醇溶液，将所得的钼酸水溶液加入白花丹素乙醇溶液中，所得的混合溶液加热回流20分钟，然后在其中滴入氢氧化四乙基铵，调节混合溶液的pH值至6～7，再回流6小时，滤出黄绿色沉淀，所得沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再置于P₂O₅的干燥器中真空干燥至恒重，此产物即MoO₂(C₁₁H₇O₃)₂。

白花丹素W(VI)金属配合物的合成方法与此方法相同。

实施例3：合成白花丹素Y(III)金属配合物

按YCl₃·6H₂O：白花丹素＝1∶3的摩尔比，称取1mol的YCl₃·6H₂O和3mol的白花丹素，分别溶于30ml水和30ml乙醇中，将得到YCl₃·6H₂O水溶液和白花丹素乙醇溶液混合，将所得的混合溶液搅拌20分钟，再滴加1∶1(体积比)氨水溶液入其中，调节混合溶液的pH值至5～6，再于30℃继续搅拌2小时使其完全反应，析出棕红色沉淀，过滤溶液，所得的沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再置于P₂O₅的干燥器中真空干燥至恒重，此产物即(C₁₁H₇O₃)₃Y·2H₂O。

白花丹素La(III)、Nd(III)、Sm(III)、Eu(III)、Er(III)等金属配合物的合成方法与此方法相同。

实施例4：合成白花丹素Pt(II)金属配合物

按摩尔比1∶2的比例，将1mol的K₂[PtCl₄]溶于30ml水中，在搅拌状态下缓慢将其加入至溶有2mol白花丹素的60ml甲醇溶液中，所得的混合溶液搅拌20分钟，再滴加5wt％的KOH水溶液，调节混合溶液的pH值至6～7，在50℃、避光、惰性气体(N₂或Ar)条件下，让混合溶液反应48小时，生成墨绿色沉淀，过滤溶液，所得的沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再在无水CaCl₂真空干燥器中干燥至恒重，此产物即Pt(C₁₁H₇O₃)₂。

白花丹素Pd(II)金属配合物的合成方法与此方法相同。

实施例5：合成白花丹素Sn(IV)金属配合物

按摩尔比1∶2的比例，将1mol SnCl₄·5H₂O溶于30ml乙醇溶液中，并将所得溶液在搅拌状态下缓慢加至溶有2mol白花丹素的30ml乙醇溶液中，50℃下搅拌1小时，出现沉淀，再继续搅拌1小时，生成浅紫色沉淀，过滤溶液，所得的沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再在无水CaCl₂真空干燥器中干燥至恒重，此产物即Sn(C₁₁H₇O₃)₂Cl₂。

实施例6：合成白花丹素Ag(I)金属配合物

按摩尔比1∶1的比例，将1mol的AgNO₃溶于30ml水中，并将所得溶液在避光、搅拌状态下缓慢加至溶有1mol白花丹素的30ml乙醇溶液中，滴加1∶1(体积比)氨水溶液，调节混合溶液的pH值为6～7，再于30℃反应24小时，生成紫色沉淀，过滤溶液，所得的沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再在无水CaCl₂真空干燥器中干燥至恒重，此产物即Ag₂(C₁₁H₇O₃)₂。

实施例7：合成白花丹素Ru(III)金属配合物

将1molRuCl₃·3H₂O和4mol醋酸钠溶于30ml水中，在搅拌状态下，将所得的溶液缓慢加热至30℃，再将该溶液逐滴加至溶有3mol白花丹素的30ml乙醇溶液中，所得混合溶液于30℃继续搅拌12小时，溶液由红色变为橙色，且有深黄色的固体生成，过滤溶液，所得的沉淀先用水、无水乙醇分别洗涤三次，再在无水CaCl₂真空干燥器中干燥至恒重，此产物即Ru(C₁₁H₇O₃)₃。

实验例1：白花丹素金属配合物的抗肿瘤活性实验

1)细胞株与细胞培养

本实验选用乳腺癌MDA-MB-231和喉癌细胞KB及其耐药株KBv200细胞。KBv200细胞较KB细胞对VCR(硫酸长春新碱)耐药约100倍，在VCR浓度为200nmol/l时生长良好。所有细胞株均培养在含10wt％小牛血、100∪/ml青霉素、100∪/ml链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％C0₂孵箱中培养。KBv200细胞培养时加入VCR维持其多药耐药性，实验前停药1周。

2)初筛

根据抗肿瘤药物疗效的评价标准之一，即体外抑瘤试验：合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC₅₀＜10μg/ml或植物粗提物的IC₅₀＜20μg/ml，并有细胞毒性的剂量依赖关系，且最高抑制效率应达80％以上，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。本研究所用化合物，纯度较高(≥95％)，故反用这一抗肿瘤药物疗效评价标准，将所有化合物配制成10μg/ml，助溶剂DMSO终浓度≤1％(体积百分比浓度)，测试该浓度下化合物对癌细胞的抑制，凡抑制率大于50％(0.5)并符合光镜下细胞受抑的形态变化(如细胞皱缩，破碎，漂浮等)的，则判定为初筛有效，进入下一步求IC₅₀。结果二者在抗肿瘤活性判定上完全一致，各化合物10μg/ml抑制率初筛结果见表1。

3)细胞生长抑制实验(MTT法)

注：MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。英文名为MTT，

即([4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazoliumbromide)。

将初筛抗肿瘤效果较好的受试化合物以DMSO助溶后，使用完全培养基依次对半稀释成五个梯度，20倍于终浓度的工作液，各梯度之间除药物浓度不同外，助溶剂DMSO等含量均一致。再用直径为0.22um的微孔滤膜过滤除菌置于4℃保存。将对数生长期的MDA-MB-231、KB与KBv200细胞，以每孔0.19ml分别接种于96孔板，细胞浓度依次约为0.5×10⁴/孔、0.4×10⁴/孔、0.5×10⁴/孔，培养12h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的受试化合物，每孔10μL，使其终浓度分别为12μg/ml、6μg/ml、3μg/ml、1.5μg/ml、0.75μg/ml，每个梯度设4个复孔，其中DMSO终浓度≤0.5％，同时设相应的阴性对照组(培养液中只有细胞和等量DMSO，无药物)和空白对照组(培养液中只有等量的药物，无细胞)，每个组也设4个复孔，药物作用48h。培养结束前4h加入10μLMTT(5mg/ml PBS)，继续培养4h后，倾去培养液，加入DMSO 0.15ml，平板震荡器振荡5min，使结晶物充分溶解，空白对照组调零，用酶标仪以550nm/655nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度(A)值，以Bliss法分别计算各化合物对三种癌细胞的IC₅₀值，所有实验重复3次。实验结果见表2、表3。

表1白花丹素金属配合物对肿瘤细胞的体外活性(10μg/ml抑制率)

表2白花丹素金属配合物对肿瘤细胞的体外活性(IC₅₀值)

表3白花丹素金属配合物对肿瘤细胞的体外活性(IC₅₀值)

注：其中KB为口腔上皮癌细胞株，KBV200口腔上皮癌耐长春新碱株，MDA-MB-231为乳腺癌细胞株，SGC-7901为人类胃癌细胞株，hela细胞为人宫颈癌细胞株，cne-1、cne-2鼻咽癌细胞株，skov3为卵巢癌耐紫杉醇药株。

体外抑瘤实验表明，所得的配合物对所试的肿瘤细胞的体外活性则普遍较好，表中列举的所试配合物活性较好、对各种肿瘤细胞的生长具有显著抑制效果，适用于制备高效的抗肿瘤药物。

Claims

1.以白花丹素为配体的金属配合物白花丹素铜、白花丹素钴或白花丹素镍在制备抗肿瘤药物中的运用。

2.根据权利要求1所述的以白花丹素为配体的金属配合物的运用，其特征在于：所述的以白花丹素为配体的金属配合物的合成方法，其步骤如下：

1)将摩尔量比为1∶1～3的金属盐和白花丹素配体溶解于溶剂中；

2)所得的混合溶液进行反应；

3)将反应后溶液过滤，取溶液的沉淀进行提纯、干燥，得到相应的金属配合物。

3.根据权利要求2所述的以白花丹素为配体的金属配合物的运用，其特征在于：所述溶剂为水，或强极性有机溶剂，或弱极性有机溶剂。

4.根据权利要求3所述的以白花丹素为配体的金属配合物的运用，其特征在于：所述溶剂为水，或乙醇，或甲醇，或二甲亚砜，或二甲基甲酰胺，或乙腈，或丙酮，或四氢呋喃，或氯仿。

5.根据权利要求2～4中任何一项所述的以白花丹素为配体的金属配合物的运用，其特征在于：步骤2)中，反应时间为2～48小时；反应温度为20～80℃。

6.以白花丹素为配体的金属配合物，其特征在于：所述以白花丹素为配体的金属配合物为白花丹素铜、白花丹素钴或白花丹素镍。