CN101035555A - 包含栗精胺的组合抗病毒组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开内容主要涉及应用栗精胺与其它治疗药剂组合以治疗或阻止由Flaviviridae科病毒引起、或与其相关的感染，尤其是由丙型肝炎病毒(HCV)引起、或与其相关的感染，以及应用这些化合物研究HCV感染的生物机制。

Description

包含栗精胺的组合抗病毒组合物及其使用方法
技术领域
本公开内容主要涉及传染病的治疗，更具体而言，涉及应用栗精胺组合抗病毒化合物治疗或阻止由Flaviviridae引起或与其相关的感染，特别是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的或与其相关的感染。
技术背景
黄病毒群包括许多人类疾病和造成畜牧业重大损失的多种动物疾病的病原体。黄病毒科(family Flaviviridae，其成员在本文中称为黄病毒)包括黄病毒属(Flavivirus)(例如黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒和蜱传脑炎病毒)；瘟病毒属(Pestivirus)(例如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、典型性猪瘟病毒和边界病病毒)；丙肝病毒属(Hepacivirus)(例如丙型肝炎病毒)；和目前未分类的Flaviviridae成员(例如，GB病毒A、B和C型)。Flaviviridae的成员由病毒分类学国际委员会详细描述(目前接受的分类定义的描述见：Virus Taxonomy：The Classificationand Nomenclature of Viruses(病毒分类：病毒的分类和命名法)。病毒分类学国际委员会(the International Committee on Taxonomy of Viruses)第七次报告，van Regenmortel等人，学术出版社，圣地亚哥(2000)，以上内容在此引入作为参考)。
具有临床意义的Flaviviridae科成员为丙型肝炎病毒(HCV)。HCV在1989年第一次鉴定，是急性肝炎的主要病因，并引起输血后非甲、非乙型肝炎的多数病例。此外，HCV是慢性肝病的主要病因，包括硬化和肝癌(Hoofnagle，Hepatology 26：15S，1997)。世界卫生组织估计170,000,000人慢性感染HCV。每年约3-4百万人新感染，这些感染患者的80-85％发展为慢性感染，这些慢性感染患者的约20-30％发展为硬化和晚期肝病，常并发肝细胞癌(HCC)(参见，例如Kolykhalov et al，J.Virol.74：2046，2000)。
HCV为有被膜的正链RNA病毒。基因组在5′和3′端具有非翻译区(NTR)，形成稳定的二级和三级结构。5′NTR具有内核糖体进入位点(IRES)，其允许核糖体直接结合在接近于开放阅读框架的起始密码子处。因此，HCV RNA的翻译由IRES介导，而不是典型的用于翻译细胞mRNA的CAP依赖机制。
HCV基因组包含单个长的开放阅读框架，其编码约3000个氨基酸残基的多聚蛋白质。该多聚蛋白质在翻译时和在翻译后被加工成为至少10种不同的产物，包括两种N连接的糖基化蛋白E1和E2。在多聚蛋白质中，切割产物的顺序如下：核心(C)、外壳蛋白1(E1)、E2、p7(可能是形成离子通道的多肽)、非结构蛋白2(NS2)、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。核心蛋白为强碱性RNA结合蛋白，形成核壳体的主要成分。外壳蛋白E1和E2为高度糖基化的1型膜蛋白，通过羧基端区域锚定。它们嵌入到病毒微粒的脂质被膜上，并结合形成稳定的异源二聚体。非结构蛋白涉及病毒复制并具有蛋白酶(NS2/NS3)、解螺旋酶(NS3)和RNA聚合酶活性(NS5B)。HCV结合到宿主细胞可能需要E2或E1/E2复合体与存在于细胞表面的受体相互作用。
对HCV颗粒组装机制的了解是有限的。缺乏复合聚糖、表达的HCV糖蛋白定位于内质网(ER)内以及细胞表面缺乏这些蛋白，这些合起来都暗示了初始病毒粒子形态形成的发生是通过从ER出芽形成细胞内囊泡进行。此外，成熟的E1-E2异源二聚体不离开ER，以及在E1和E2的C端区域已鉴定出ER保留信号。因此，病毒通过固有分泌路径被排出。与这种假设一致，复合的N连接的聚糖在部分纯化病毒颗粒的表面发现，暗示了病毒通过高尔基体转运。
直到最近，干扰素-α(IFN-α)是证实有益于治疗HCV感染的仅有的疗法。约50％的病人对用IFN-α治疗表现初始反应，但这些反应在多数病人中是不可忍受的，病人经受相当大的伴生的副作用。治疗HCV感染的现有标准是IFN-α与核苷类似物利巴韦林(ribavirin)一起给药。然而，鉴定具有更为有效的抗病毒活性和较少的不希望有的副作用的治疗候选物是有必要的。
因此，亟需鉴定和开发具有增强的抗病毒活性和减少的毒性的抗Flaviviridae药剂，以及特别是治疗HCV的治疗剂。本发明满足这些需要，并进一步提供了其他相关的优点。
发明概述
本发明主要提供了用于治疗或阻止例如Flaviviridae感染(如由丙型肝炎病毒(HCV)引起的感染)的栗精胺(castanospermine)组合物。具体地，本公开内容提供了栗精胺与其他抗Flaviviridae的化合物的组合，其提供了抗HCV的意想不到的高或协同的抑制活性。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗Flaviviridae感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变免疫功能的药剂。在另外的实施方案中，提供了治疗Flaviviridae感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变Flaviviridae科病毒复制的药剂。在某些实施方案中，所述个体为人。在其他的某些实施方案中，Flaviviridae科的病毒为黄病毒属(genus Flavivirus)的成员，其可以为Hepacivirus，其中该Hepacivirus为丙型肝炎病毒(HCV)，或所述病毒为瘟疫毒属(genus Pestivirus)的成员。在另外的特定的实施方案中，改变免疫功能的药剂为干扰素，如干扰素-α；在特定的实施方案中，干扰素-α被聚乙二醇化。本发明还提供了如下方法：其中栗精胺和改变免疫功能的药剂顺序给药(其中，栗精胺先于改变免疫功能的药剂给药，或改变免疫功能的药剂先于栗精胺给药)，或栗精胺和改变免疫功能的药剂同时给药。在另外的实施方案中，栗精胺和改变免疫功能的药剂被混和成单一组合物并同时给药。在另外的实施方案中，所述方法包括给予个体(a)包含栗精胺和药物可接受的载体的组合物，和(b)包含改变免疫功能的药剂和药物可接受的载体的组合物。
在另外的实施方案中，改变病毒复制的药剂为利巴韦林或为干扰素，如干扰素-α，在特定的实施方案中，干扰素-α被聚乙二醇化。本发明还提供了如下方法：其中栗精胺和改变病毒复制的药剂顺序给药(其中，栗精胺先于改变病毒复制的药剂给药，或改变病毒复制的药剂先于栗精胺给药)，或栗精胺和药剂同时给药。在另外的实施方案中，栗精胺和改变病毒复制的药剂被混和成单一组合物并同时给药。在另外的实施方案中，所述方法包括给予个体(a)包含栗精胺和药物可接受的载体的组合物，和(b)包含改变病毒复制的药剂和药物可接受的载体的组合物。
本发明还提供了治疗Flaviviridae感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变免疫功能的药剂，其中栗精胺和改变免疫功能的药剂协同地互相作用。在另外的实施方案中，提供了治疗Flaviviridae感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变病毒复制的药剂，其中栗精胺和改变病毒复制的药剂协同地互相作用。
本文还提供了治疗Flaviviridae感染的方法，包括栗精胺与如下物质组合：抑制细胞被Flaviviridae感染的药剂；抑制病毒RNA从病毒衣壳中释放或抑制Flaviviridae基因产物的功能的化合物；改变Flaviviridae复制的化合物；改变免疫功能的化合物；改变Flaviviridae感染症状的化合物；或治疗Flaviviridae相关感染的化合物。在某些实施方案中，改变免疫功能的化合物为干扰素，如干扰素-α，在特定的实施方案中，干扰素-α被聚乙二醇化。在特定的实施方案中，改变Flaviviridae病毒复制的化合物为利巴韦林或干扰素-α。在某些实施方案中，Flaviviridae相关感染为乙型肝炎病毒(HCB)感染或逆转录病毒感染，其中逆转录病毒感染为人免疫缺陷病毒感染(HIV)。
本文还提供了治疗Flaviviridae感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及干扰素。在某些实施方案中，干扰素为干扰素-α，在特定的其他实施方案中，干扰素-α被聚乙二醇化。在一个实施方案中，栗精胺和干扰素协同地互相作用。
附图简要说明
图1A和1B分别以三维和二维表示干扰素-α2b(IFN-α)和栗精胺(Cast)对MDBK细胞的协同作用，所述MDBK细胞被BVDV以0.01的感染复数(MOI)感染。水平面(相加性表面)之上的正％显示了可观察到协同作用的区域和相应的药物浓度。从亮到暗的灰色梯度显示了协同作用的水平。
图2表示图1所显示数据的等效线图解。
图3A和3B分别以三维和二维表示利巴韦林(RBV)和栗精胺(Cast)对MDBK细胞的协同作用，所述MDBK细胞被BVDV以0.01的感染复数(MOI)感染。水平面(相加性表面)之上的正％显示了可观察到协同作用的区域和相应的药物浓度。从亮到暗的灰色梯度显示了协同作用的水平。
图4表示图3所显示数据的等效线图解。
图5A和5B分别以三维和二维表示细胞病变分析结果，其中MDBK细胞被BVDV以0.01的感染复数(MOI)感染，随后暴露于干扰素-α2b(IFN-α)和栗精胺(Cast)。水平面(相加性表面)之下的负％显示了细胞毒性不增加、甚至可能减少的区域和相应的药物浓度。从亮到暗的灰色梯度显示了拮抗作用的水平(即未受影响的细胞毒性)。
图6A和6B分别以三维和二维表示细胞病变分析结果，其中MDBK细胞被BVDV以0.01的感染复数(MOI)感染，随后暴露于利巴韦林(RBV)和栗精胺(Cast)。水平面(相加性表面)之下的负％显示了细胞毒性不增加、甚至可能减少的区域和相应的药物浓度。从亮到暗的灰色梯度显示了拮抗作用的水平(即未受影响的细胞毒性)。
发明详细说明
本发明主要提供了组合物以及与另外的抗病毒化合物组合使用栗精胺治疗或阻止传染病的方法。具体地，这些组合物可用于治疗或阻止Flaviviridae感染，如丙型肝炎病毒(HCV)感染。因此，本发明主要涉及惊人的发现，即栗精胺与另外的化合物组合具有抗HCV的意想不到的高活性，所述另外的化合物如干扰素-α(IFN-α、干扰素-α、alpha-干扰素或α-干扰素)或利巴韦林。因此，本发明的化合物例如可用于治疗HCV感染和HCV相关的疾病，也可用于作为研究工具用于体外和基于细胞的分析来研究HCV感染的生物机制(例如复制和传导)。
作为背景，糖蛋白根据糖和蛋白质氨基酸之间的键被分为两大类。最普遍的为蛋白质的天冬酰胺和寡糖的N-乙酰基-D-葡糖胺残基之间的N-糖苷键。连接到多肽的主链后，N连接的寡糖由内质网(ER)中一系列特异的酶加工，这种加工途径已很明确。
在ER中，α-葡萄糖苷酶I负责从前体寡糖除去末端α-1，2葡萄糖残基，α-葡萄糖苷酶II除去两个剩余的α-1，3连接的葡萄糖残基，随后由甘露糖苷酶除去甘露糖残基，和进一步的加工反应涉及多种转移酶。这些寡糖的“修整”反应使得糖蛋白可正确折叠，并可与伴侣蛋白(如钙联接蛋白和钙网织蛋白)相互作用以转运通过高尔基体。
这种生物合成途径中关键酶的抑制剂，尤其是那些阻止α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶的抑制剂，阻止了一些有被膜病毒的复制。这些抑制剂可以通过干扰病毒被膜糖蛋白的折叠起作用，因此阻止了初始的病毒-宿主细胞相互作用或随后的融合。这些抑制剂也可通过阻止完成病毒膜所需的适当的糖蛋白的形成来阻止病毒复制。
例如，非特异性糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖和β-羟基-正缬氨酸抑制HIV糖蛋白的表达和阻止合胞体的形成(Blough et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.141：33-38(1986))。用这些药剂处理的HIV感染的细胞中病毒增殖停止，可能是由于不能获得病毒膜形成所需的糖蛋白。糖基化抑制剂2-脱氧-2-氟-D-甘露糖通过阻止病毒膜蛋白的糖基化显示了对流感感染的细胞的抗病毒活性(McDowell et al.，Biochemistry，24：8145-52(1985))。Lu等人提供了N连接的糖基化为乙型肝炎病毒分泌所需的证据(Virology 213：660-665(1995))，Block等人证实人乙型肝炎病毒的分泌被亚氨基糖N-丁基脱氧野尻霉素所抑制(Proc.Natl Acad.Sci USA 91：2235-39(1994)，还参见，例如WO9929321)。
用在本文中时，除非另外说明，任一浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围可理解为包括所列举范围内的任一整数值，以及适合时还包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。用在本文中时，除非另外说明，“约”或“包含大体上”指所表明的值或范围的±15％。“选择”(例如“或”)的应用应理解为指或者一个、两个或可选择物的任何组合。
栗精胺
如上所述，本发明提供了具有栗精胺、其药物可接受的盐的组合物及其应用。本发明公开了含有与具有抗病毒活性的其它化合物或分子组合的栗精胺的组合物，或含有与改变宿主功能或反应的其它化合物(如改变免疫功能或反应的化合物)或分子组合的栗精胺的组合物，该组合具有意想不到的高抗病毒活性，特别是高抗Flaviviridae活性，如抗HCV。
栗精胺和某些亚氨基糖(如脱氧野尻霉素(DNJ))为ERα-葡萄糖苷酶的抑制剂，两者都有效抑制糖蛋白形成的早期阶段(参见，例如Ruprecht et al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.2：149-57(1989)；还参见，例如Whitby et al.，Antiviral Chem.Chemother.15：141-51(2004)；Branza-Nichita et al.，J.Virol.75：3527-36(2001)；Courageot et al.，J.Virol75：564-72(2000)；Choukhi et al.，J.Virol.72：3851-58(1998)；WO99/29321；WO 02/089780)。然而，抑制剂的效应根据它们所应用的系统而有很大不同，并且它们显示了完全不同的特异性，栗精胺相对特异于α-葡糖苷I。
栗精胺是由黑豆和大叶榕栗树(Castanospermum australe)衍生的天然生物碱(Hohenschutz et al，Phytochemistry 20：811-14(1981))。栗精胺是水溶的，因而根据本领域常用的方法容易地分离(参见，例如AlexisPlatform，San Diego，CA)。化合物的最高浓度存在于种子和种子荚中(Pan et al.，Arch.Biochem.Biophys.303：134-44(1993))。除了抑制α-葡糖苷I的酶活性外，栗精胺还抑制肠内糖苷酶，如麦芽糖酶和蔗糖酶，这导致了不希望的副作用(Saul et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：93-97(1985))。通过将个体的饮食改变为无淀粉、高葡萄糖饮食，可以最小化或阻止接受栗精胺的个体中的很多副作用(参见，例如上述Saul et al.)。
栗精胺具有下式：
Figure A20058003425800141
系统上，这个化合物可以几种方式命名：[1S-(1α，6β，7α，8β，8αβ)]-八氢-1，6，7，8-中氮茚四醇或[1S，(1S，6S，7R，8R，8aR)-1，6，7，8-四羟基-吲哚里西啶(indolizidine)或1，2，4，8-四脱氧-1，4，8-次氮基-L-甘油-D-乳(galacto)-辛糖醇(octitol)。本文采用术语栗精胺或第一个系统命名。
药物可接受的盐指栗精胺或本文中描述的其它化合物的盐，这种盐是药物可接受的并具有期望的药理学(例如抗病毒)活性。这些盐包括：(1)酸加成盐，与无机酸或有机酸形成，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸如醋酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-八-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子(如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代形成的盐；或与有机碱(如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和N-甲基葡糖胺等)配位形成的盐。
结构上纯的化合物指如下的化合物组成：构成该组成的大部分百分比的单个分子，例如大约95％至100％的等级，优选自约95％、96％、97％、98％、99％或更多起的范围的单个分子，包含以相同的顺序和相同的键互相连接的相同数量和类型的原子。用在本文时，术语“结构上纯的”无意区分相互不同的几何异构体或相互不同的光学异构体。例如，顺式和反式-丁-2，3-烯的混合物被认为是结构上纯的，外消旋混合物也是如此。当组合物旨在包含大部分百分比的单个几何异构体或光学异构体时，分别使用术语“几何学上纯的”和“光学上或对映体上纯的”。
术语“结构上纯的”也无意区别不同的互变异构体形式或分子的离子化状态，或分子的其他形式，这些形式由平衡现象或其他可逆互变产生。因此，例如有机酸的组合物是结构上纯的，即使一些羧基基团为质子化状态(COOH)，其他的为去质子化状态(COO-)。同样地，除非另外明确说明，包含酮和烯醇互变异构体的组合物被认为是结构上纯的。
治疗制剂和应用方法
如本文所述，栗精胺，特别是与诸如改变免疫功能的药剂和/或改变病毒复制的其它药剂(化合物或分子)组合时，可协同地起抑制病毒感染或病毒复制的作用。在某些实施方案中，本发明中描述的组合根据统计上可测量的标准在临床相关浓度上抑制Flaviviridae科病毒(优选HCV)的复制。将栗精胺与本发明中描述的至少一种其他治疗药剂的组合作为疗法涉及治疗应用，即，将该组合给予已知或认为感染了Flaviviridae科病毒(如HCV)的个体。本发明还关注栗精胺与诸如干扰素-α的药剂的组合，其中，与栗精胺的组合可改变(以统计上显著的方式增强或减弱，优选增强)干扰素-α或利巴韦林治疗Flaviviridae感染的效果(功效)。
治疗还涉及预防或预防性地给予本发明中描述的组合。对Flaviviridae感染的有效治疗可包括治愈感染(即，从宿主或宿主组织根除病毒)；持续反应，例如在结束治疗方案后六个月在患者血液中不再能检测到HCV RNA(这种持续反应等同于良好的预后和等同于治愈)；减慢或减少肝瘢疤形成(纤维化)；减慢或减少病毒的产生；减少、减轻或消除个体的症状；或阻止症状或感染恶化或进展。
因此，本发明描述的组合物可用于达到至少一个如下目标：(1)消除感染性和Flaviviridae感染(如HCV感染)对另外的个体的潜在的传播；(2)阻止肝病进展和改善临床预后；(3)阻止硬化和HCC的发生；以及(4)改进当前所用的治疗分子或药征的临床益处。至今，仍没有获得可充分治疗或阻止HCV感染和一些相关疾病且无严重副作用的治疗药剂。
所述治疗或预防优选治疗或防止以上确定的病毒的感染。具体地，所述治疗或预防可以是治疗或预防选自如下的疾病：丙型肝炎、黄热病、登革热、日本脑炎、墨累山谷脑炎(Murray valley encephalitis)、罗西欧病毒感染(Rocio virus infection)、西尼罗河热(West Nile fever)、圣路易斯脑炎(St.Louis encephalitis)、蜱传脑炎、跳跃病病毒感染(Louping ill virus infection)、波瓦生病毒感染(Powassan virus infection)、鄂木斯克出血热(Omsk hemorrhagic fever)、科萨努尔森林病(Kyasanurforest disease)、牛腹泻、典型性猪瘟、边界病和猪霍乱。病毒感染，如Flaviviridae感染(例如HCV感染)，指涉及(即造成、加重或特征为)在个体或患者细胞或体内存在黄病毒的任何状态或状况。患者或个体可以是人、非人的灵长类动物、绵羊、牛、马、猪、狗、猫、大鼠或其他哺乳动物。
HCV在细胞培养中难于有效繁殖，因此致使分析和鉴别潜在的抗HCV药剂存在困难。在没有能够支持人HCV复制和在体外再感染细胞的适合培养体系情况下，应用Flaviviridae科的其它成员牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是本领域接受的用于细胞培养模式的替代病毒(Stuyveret al.，Antimicrob.Agents Chemother.47：244-54(2003)；上述Whitby etal)。HCV和BVDV共享有很大程度上的局部蛋白同源性、共有复制策略和可能相同的病毒被膜亚细胞定位。HCV和BVDV都具有单链基因组(分别约9,600和12,6000核苷)，编码九个功能类似的基因产物，包括E1和E2被膜糖蛋白(参见，例如Rice，Flaviviridae：The Viruses andTheir Replication，in Fields Virology(黄病毒科：病毒和它们的复制，病毒学领域)，第三版，Philadelphia，Lippincott，931-59(1996))。
本发明描述的化合物也可为有用的研究工具，用于体外和基于细胞的分析，来研究病毒(优选HCV)的感染、生长和复制的生物机制。作为背景和不希望被理论束缚，HCV形态发生是复杂的，其中，预组装的病毒核颗粒被认为附着在病毒被膜(表面)蛋白的细胞质侧，而该被膜蛋白已插入内质网(ER)膜。获得被膜后，病毒颗粒出芽至ER的内腔，随后转运通过高尔基体到细胞外液。从未成熟的病毒糖蛋白上除去N连接的葡萄糖残基(剪切通过细胞酶作用，如α-葡萄糖苷酶)可以在病毒糖蛋白从ER转移到高尔基上起作用。
在一个实施方案中，提供了鉴别抗病毒化合物的方法，包括在给予足以抑制病毒复制的条件和时长下，使病毒感染的宿主细胞与栗精胺和一种其他测试化合物或药剂接触，鉴别抑制(阻止、减慢、消除、干扰)感染、病毒复制和/或病毒组装的候选药剂。在特定的实施方案中，本发明所描述的方法可用于鉴别测试化合物，所述测试化合物与栗精胺组合时相加地或协同地起作用。在另外的实施方案中，提供了鉴别怀疑具有病毒感染的细胞的方法，包括在给予足以抑制病毒感染、病毒复制、和/或病毒组装的条件和时长下，使怀疑被病毒感染的宿主细胞与栗精胺和一种候选化合物或药剂接触，并鉴别被病毒感染的细胞。优选地，病毒感染由HCV引起或与HCV相关。本发明中描述的分析法可用于确定候选化合物和/或组合的治疗价值，也可用于确定在有需要的个体的治疗中有用的剂量参数。
在特定的实施方案中，当与附加治疗剂组合时，栗精胺被结合或组合给药(例如，以混合物或共包装或以如下方式给药：全身或感染部位可得到栗精胺和这种其他化合物，这样各自抗病毒作用会相加或优选协同作用)。在一个优选的实施方案中，栗精胺与诸如干扰素-α的改变免疫功能的药剂组合，在另外的优选的实施方案中，栗精胺与改变病毒(如Flaviviridae)复制的药剂(例如核苷类似物，如利巴韦林(Sigma))组合。在另外的实施方案中，栗精胺与改变免疫功能的药剂(如干扰素-α)结合或组合给药，或与改变病毒复制的药剂(化合物)(如利巴韦林)组合或联合给药。
在一个实施方案中，栗精胺与改变免疫功能的药剂的组合或栗精胺与改变病毒复制的药剂的组合在给体中相加地起作用。即，栗精胺与另外的化合物相互作用导致治疗效果(或抗病毒效果)接近于单个化合物或药剂单独给药的效果。
具有抗病毒活性的化合物或分子例如可抑制或阻止感染细胞(如阻止病毒结合或黏附在细胞上)；抑制、减少或阻止病毒复制或组装；抑制、减少或阻止病毒RNA从病毒衣壳中释放；和/或抑制、降低或干扰HCV基因产物的功能。改变免疫功能(以统计上显著的方式或临床上显著的方式增强或减弱)的化合物或分子优选增加或增强对感染病毒的免疫功能或免疫反应。
在优选的实施方案中，果精胺与改变免疫功能的药剂的组合或栗精胺与改变病毒复制的药剂的组合在个体中协同地起作用。协同起作用的两种或多种化合物相互作用，以至于化合物的组合效果强于每一化合物单独给药时的单个效果的总和(参见，例如Ouzounov et al.Antivir.Res.55：425-35(2002)；Berenbaum，Pharmacol.Rev.41：93(1989))。栗精胺与另外的药剂或化合物之间的相互作用可由多种机械和经验模型来分析(参见，例如上述Ouzounov et al.)。分析药剂组合之间的相互作用的常用方法使用了等效线(等效曲线)作图，其中药剂的组合(da，db)由图中的点表示，图中的轴为单个药剂的剂量轴(参见，例如上述Ouzounov et al.；MacSynergyTM II软件操作手册(University of Michigan，Ann Arbor，MI))。当以协同作用量的峰值计算的所产生的协同作用量大于相加效果(即，每个药剂单独效果的总和)15％以上，或大于相加效果两倍以上，或大于相加效果三倍或多倍以上时，栗精胺与改变免疫功能的药剂的组合或与改变病毒复制的药剂或本文中描述的另外的药剂或化合物的组合协同地起作用或具有协同作用。将三维(3-D)图和MacSynergyTM II软件提供的协同作用量的计算作为等效线图解法的补充分析可描述协同作用。因此，当以μM/ml2％或μM(IU)/ml(孔)2％表示的值在25和50μM/ml2％之间，或25和50μM(IU)/ml(孔)2％之间(较小，但是统计学上显著的)；在50和100μM/ml2％或μM(IU)/ml(孔)2％之间(适度协同作用)；或大于100μM/ml2％或μM(IU)/ml(孔)2％(强协同作用)时，栗精胺与改变免疫功能的药剂的组合或与改变病毒复制的药剂或本文描述的另外的药剂或化合物的组合协同起作用或具有协同作用。Buckwold等人报道了利巴韦林和干扰素-α组合(所述药物组合为目前治疗HCV感染的治疗标准)具有66±25IU(μg)/ml(孔)2％的协同作用量(Atttimicrob.AgentsChemother.47：2293(2003))。本发明中描述的栗精胺与干扰素-α的组合具有范围为193-224μM/(IU/ml)2％的协同作用量。
在某些实施方案中，提供了组合物，包括与抑制Flaviviridae(如HCV)结合和/或感染细胞的化合物组合的栗精胺。这些化合物的例子包括抗体，所述抗体特异结合到一种或多种Flaviviridae的基因产物(例如HCV E1和/或E2蛋白)或特异结合到HCV结合的细胞受体。抗体可为单克隆或多克隆抗体，或其抗原结合片段，包括遗传上工程化的嵌合体、人源化的sFv或其他此类免疫球蛋白。阻止病毒结合或感染细胞的其他化合物包括糖胺聚糖(如硫酸乙酰肝素和苏拉明)。
栗精胺也可与抑制病毒RNA从病毒衣壳中释放或抑制Flaviviridae(如HCV)基因产物的功能的化合物组合，这些化合物包括IRES抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、解螺旋酶抑制剂和病毒聚合酶/复制酶抑制剂(参见，例如Olsen et al.，Antimicrob.Agents Chemother.48：3944-53(2004)；Stansfield et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.14：5085-88(2004))。IRES抑制剂例如包括核苷酸序列特异的反义核酸(参见，例如McCaffrey et al.，Hepatology 38：503-508(2003))；小的酵母RNA(参见，例如Liang et al.，World J，Gastroenterol 9：1008-13(2003))；或短的干扰RNA分子(siRNA)，其抑制mRNA的翻译；以及氰钴胺(CNCb1，维生素B12)(Takyar et al.，J.MoI Biol.319：1-8(2002))。NS3蛋白酶(解螺旋酶)抑制剂包括由NS3底物衍生并起阻断酶活性作用的肽。命名为BILN 2061(如参见Lamarre et al.，Nature 426：186-89(2003)(BoehringerIngelheim Phanna，Quebec)和VX-905(Vertex Pharmaceuticals，Inc.Cambridge，MA)的蛋白酶抑制剂已研究为可能的HCV治疗剂。
在另外的实施方案中，栗精胺可与干扰细胞的涉及或影响Flaviviridae复制的功能的化合物、或直接改变Flaviviridae的复制的化合物组合，这些化合物包括RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂或HCVp7抑制剂(例如DGJ和衍生物)；糖蛋白加工的其他抑制剂(如亚氨基糖，包括脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)和脱氧野尻霉素(DNJ)，及其衍生物(如N-丁基-DNJ、N-壬基-DNJ和长的烷基链亚氨基糖，如N7-氧壬基-DNJ、N7-氧壬基-DGJ))；核苷类似物，包括次黄苷单磷酸脱氢酶(例如利巴韦林、霉酚酸和VX497)；以及其他抗病毒化合物，如金刚胺(Symmetrel，Endo Pharamceuticals)、金刚乙胺(Flumadine，ForestPharmaceuticals.Inc.)和valopicitabine(NM283，IdenixPharmaceuticals)。
在另外的实施方案中，栗精胺可与改变免疫功能(统计学上显著、临床上显著或生物学上显著地增强或减弱)的化合物组合，优选对Flaviviridae感染增强或刺激免疫功能或免疫反应。例如，所述化合物可刺激T细胞反应或增强特定的免疫反应(例如，胸腺素-α和干扰素，如α-干扰素和β-干扰素)，或刺激或增强体液反应。改变免疫功能的化合物的例子包括I型干扰素，如干扰素-α(参见，例如Nagata et al，Nature287：401-408(1980))、干扰素-β(参见，例如Tanigushi et al.，Nature285：547-49(1980))和干扰素-ω(Adolf，J.Gen.Virol.68：1669-76(1987))；和II型干扰素，如干扰素-γ(Belardelti，APMFS 103：161，1995)和干扰素-γ-1b(Alferon)。干扰素-α的例子包括干扰素-α-2a(Roferon-A；Hoffinan-La Roche)、干扰素-α-2b(Intron A，PBL Biomedical)、干扰素-α-con-1(Infergen)、干扰素-α-n3(Alferon)、白蛋白干扰素-α(Albufeton-alphaTM，Human Genome Sciences，Rockville，MD)和Veldona(Amarillo Biosciences，Inc.)。干扰素-β的例子包括干扰素-β-1a(Avonex)和干扰素-β-1b(Betaseron)。
干扰素可改变免疫功能，也可改变(抑制、阻止、消除或减慢)病毒(如HCV)的复制。干扰素-α和干扰素-β在病毒感染的细胞中的产生引起抵抗病毒复制、增强I型MHC表达、增加了抗原呈递和激活自然杀伤细胞(缺乏抗原特异表面受体的淋巴细胞子集)杀死病毒感染的细胞(参见，例如Janeway et al.，in Immunobiology，第五版，New York，London：Garland Publishing，(2001))。因此，这些干扰素通过影响先天和获得性免疫来改变免疫功能。
在一个实施方案中，栗精胺与干扰素(如干扰素-α)组合给药。干扰素-α已用于治疗多种病毒感染，或作为单独治疗，或作为组合治疗的一部分(参见，例如Liang，New Engl J.Med.339：1549-50(1998)；Hultonet al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.5：1084-90(1992)；Johnson et al.，J.Infect.Dis.161：1059-67(1990))。干扰素-α结合到细胞表面受体，刺激导致抑制病毒复制的细胞酶(例如，双链RNA活化的蛋白激酶和RNaseL分别抑制翻译起始和裂解病毒RNA)活化的信号转导通路(参见，例如Samuel，Clin.Microbiol.Rev.14：778-809(2001)；Kaufman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：11693-95(1999))。HCV E2糖蛋白和NS5a可以阻断RNA活化的蛋白激酶活性，这样一些HCV菌株更加抵抗干扰素-α，因此，可能有必要以干扰素-α和一种或多种其他化合物的组合疗法治疗持久病毒感染(参见，例如上述Ouzounov et al.，及其中引用的参考文献)。在特定的实施方案中，聚乙二醇部分被连接到干扰素-α(称作聚乙二醇化的干扰素-α；聚乙二醇干扰素-α-2b(Peg-Intron；Schering-Plough或PBL Biomedical)以及聚乙二醇干扰素-α-2a(Pegasys；Hoffmann-La Roche)，其可具有增强的药代动力学性质，也显示了较少的不希望有的副作用(参见，例如Zeuzem et al.，New Engl J.Med.343：1666-72(2000)；Heathcote et al.，New Engl，J.Med.343：1673-80(2000)；Matthews et al.，Clin.Ther.26：991-1025(2004))。
干扰素-α-2a(Roferon-A；Hoffman-La Roche)、干扰素-α-2b(Intron-A；Schering-Plough)和干扰素-αcon-1(Infergen；Intermune)在美国已被批准用作治疗成人慢性丙型肝炎感染的单一药剂。治疗慢性丙型肝炎感染的干扰素-α-2b和-α-2a的推荐剂量为3,000,000单位，每周三次，皮下或肌肉注射给药。给药治疗六个月至两年。对干扰素-α-con-1，推荐剂量为第一次治疗每周三次每次9μg，对没有反应或复发的患者在接着的六个月每周三次每次15μg。在用任何这些重组的干扰素治疗期间，必需对患者监视副作用，包括流感样症状、抑郁、皮疹和反常的血球计数。单独用干扰素治疗在少于15％的患者中产生持续反应。由于这种低反应率，这些干扰素很少被用作单一疗法治疗慢性丙型肝炎感染患者。
干扰素-α与利巴韦林的组合治疗HCV感染优于任一单独治疗，该组合是治疗的现行标准。给药的效力、剂量和频率在三大组双盲法、安慰剂对照的临床试验中做了研究(Reichard et al.，Lancet351：83-87(1998)；Poynard et al.，Lancet 352：1426-32(1998)；McHutchison et al.，New Engl.J.Med.339：1485-92(1998))。(还参见Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.47：2293-93(2003)；Buckhold，Antimicrob.Chemother.53：412-14(2004))。与利巴韦林相关的负作用包括异常的胎儿发育。利巴韦林也禁忌用在具有贫血病、心脏病和肾病的患者中。因此，需要替代的组合物、疗法和治疗组合，如本发明中描述的那些。
栗精胺也可与调节(优选降低或减少严重性或程度、减少数量或消除)Flaviviridae感染(如HCV感染)症状和作用的化合物(例如，抗氧化剂，如黄酮类化合物(flavinoids))结合。
附加治疗剂可包括抗病毒化合物，例如用于治疗特定感染原的抗病毒化合物或药物，这些特定感染原常被鉴定为共感染了Flaviviridae(如HCV)的个体。这些共感染可能由HBV、人逆转录病毒如HIV1和2、和/或人T细胞亲淋巴病毒(HTLV)1型或2型引起。抗病毒化合物的例子包括核苷酸逆转录酶(RT)抑制剂(例如，拉米夫定(Lamivudine)(3TC)、齐多夫定、司他夫定、去羟肌苷、阿德福韦(adefovirdipivoxil)和阿巴卡韦)；非核苷RT抑制剂(例如奈韦拉平)；以及天冬氨酰蛋白酶抑制剂(例如沙奎那维、茚地那韦和利托那韦)。
本发明中论述的附加治疗剂可作为在药物可接受的载体中的单一组合物同时给药，或作为各自具有药物可接受的载体的单独组合物同时给药。在另外的实施方案中，栗精胺和附加治疗剂可顺序给药，或以其任一组合(例如，首先为栗精胺，随后为附加治疗，或首先为附加治疗，随后为栗精胺)。此外，如果给予多于一剂组合治疗时，顺序给药的次序可以改变或在每次给药的时间点保持相同。确定本发明中描述的任一组合治疗的效果的方法可为本发明中描述的方法，并为技术人员所常用，如确定免疫反应是否改变、确定Flaviviridae感染的症状或作用是否被调节、或确定Flaviviridae的复制是否改变(优选不利地影响、阻止、减弱、抑制或消除病毒复制)。
如本发明中所描述的，BVDV是用于细胞培养模型的本领域接受的替代病毒(上述Stuyver et al.；上述Whitby et al.)。因此可采用诸如牛肾细胞(MDBK)和牛陀螺状细胞(BT)的牛细胞系，采用BVDV的细胞病变菌株，如引起感染细胞溶解的NADL菌株(自ATCC，Manassas，VA获得)来进行分析。可用于确定单独的栗精胺或与另外的化合物、药剂或分子组合的栗精胺是否可用于治疗Flaviviridae感染或抑制或阻止Flaviviridae感染的示例性分析法包括病毒斑形成分析法、细胞毒性分析法(参见，例如Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.47：2293-98(2003)；上述Whitby et al.)、病毒释放分析法、细胞增殖分析法(例如，非放射性MTS/PMS或MTT分析法，或放射性胸腺嘧啶掺入分析法)和本发明中描述的其他分析法以及本领域技术人员公知和熟练的分析法。当与另外的化合物组合的栗精胺被分析时，从这些测定中得到的数据，如由细胞毒性分析法所得到的数据，可如本发明中所描述的方法确定药剂相互作用是否提供了相加效应或协同作用。
本发明还涉及药物组合物，其包含栗精胺与用于治疗或阻止病毒感染(如HCV)的另外的化合物的组合。本发明进一步涉及通过给予本发明的栗精胺与一种其他化合物的组合治疗或阻止病毒感染的方法，其中，每一组分的给药剂量足以治疗或阻止病毒感染，如上所述。当用于本文描述的方法中时，栗精胺以及这些化合物的组合或混合物优选为药物组合物的一部分。栗精胺可与本发明中描述的另外的化合物组合给药，其通过对个体顺序给予每种化合物来进行，即，栗精胺先于另外的化合物给药，或在另外的化合物给药之后给药，或栗精胺与另外的化合物同时给药。对于本发明中描述的组合中的每种化合物(分子、药剂)的顺序或同时给药来说，每种化合物可以相同的或不同的制剂通过相同的或不同的途径给药，这些在本发明中有描述并且部分地根据化合物的性质来确定。
在一个实施方案中，本发明包括用于本文描述的治疗方法的药物组合物，其包含本文中描述的栗精胺(或其药物可接受的盐)和药物可接受的载体、媒介物、或赋形剂、以及任选的添加剂(例如一种或多种粘合剂、着色剂、干燥剂、稳定剂、稀释剂或防腐剂)。同样地，附加治疗，如干扰素-α或利巴韦林，可与药物可接受的载体、媒介物、或赋形剂、以及任选的添加剂组合。包括干扰素-α或利巴韦林的药物组合物的制备可根据公知的和本领域常用的制备用于对个体给药的这些化合物的方法。
如本文所阐述的，栗精胺和一种或多种附加治疗化合物或分子可以被包括在药物可接受的载体、赋形剂或稀释剂中，以便以有效治疗或阻止Flaviviridae感染(尤其是HCV感染)的量向有需要的个体给药。在特定的实施方案中，本文所述的对所有适应症的活性化合物的给药剂量范围为每天约0.01mg/kg至约300mg/kg，优选每天约0.1mg/kg至约100mg/kg，或更优选每天约0.5mg/kg至约25mg/kg接受者体重。典型的给药剂量范围为适合的载体中约0.01-3％wt/wt。当与栗精胺组合给药时，干扰素-α或利巴韦林可根据本领域公知的和常用的剂量方案给药(参见，例如如上Matthews et al.；Foster，Semin.Liver Dis.24Suppl 2：97-104(2004)；Craxi et al，Semin Liver Dis.23 Suppl 1：35-46(2003))，或当与栗精胺一起给药时，所述剂量可调节。
活性成分优选给药达到血浆浓度的峰值为约0.001μM至约30μM，优选约0.01μM至约10μM。这可例如通过静脉注射栗精胺制剂的组合物(优选在盐水或其他水介质中)实现。在另外的实施方案中，栗精胺通过推注(bolus)给药。用于本文所述的治疗方法中的栗精胺和其他化合物可口服、或肌肉内、腹膜内、皮下、真皮给药，通过烟雾剂或通过吸入给药、直肠、阴道、或局部给药(包括口腔和舌下给药)。
药物组合物中活性化合物的浓度取决于化合物的吸收、分布、失活和排除速率，以及本领域技术人员公知的其他因素。剂量也可根据要减轻的疾病的严重程度而不同。特定的给药方案(包括给药剂量的频率)可根据患者个体的需要以及给药或指导该组合物给药的人员的职业判断随时间进行调节。剂量水平和方案取决于多种因素，包括年龄、体重、饮食、性别、健康状况和病史(包括患者是否被共感染有另外的病毒，如HBV或HIV)。因此，本文所述浓度范围仅为示例性的，无意限制要求保护的组合物的范围或实施。活性成分可一次给药，或分成许多较小剂量在不同的间隔时间给药。
本文中描述的药物用途的组合物可为组件的试剂盒的形式。试剂盒可例如包括栗精胺作为单位剂型中的组合物的一个组分，还可包含改变免疫功能的药剂(例如干扰素-α)或改变病毒复制的药剂(如利巴韦林)，每一种在各自的单位剂型中。试剂盒可包括使用说明书和其他相关信息，以及管理机构所需的信息。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可封装在明胶胶囊中或被压缩成片剂。为了进行口服治疗给药，活性化合物可与赋形剂结合，并以片剂、锭剂或胶囊的形式应用。药物相容的粘合剂，和/或辅助原料可作为组合物的一部分被包括在内。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有如下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；分散剂，如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterore；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或增香剂，如薄荷、水杨酸甲酯、或橙色香料(orange flavoring)。当剂量单位形式为胶囊时，除上述类型的原料之外，还可包含液态载体，如脂肪油。此外，剂量单位形式可包含改变剂量单位外形的多种其他原料，例如，糖包衣、虫胶或肠内吸收药。通常参照“Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学”)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。
活性化合物或其药物可接受的盐或衍生物可作为酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、口香糖等的成分给药。除活性成分外，糖浆剂还可包含作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂，以及调味剂。
除了栗精胺外，本文中描述的药物组合物优选包含至少一种药物可接受的媒介物、载体、稀释剂或赋形剂，以及其他组分或活性成分(如其他抗HBV药物)，包括改变病毒复制的药剂或改变免疫功能或反应的药剂，和/或抗Hepadnaviridae(例如抗HBV)的药剂，这些在本文中有详细描述。本发明的组合物具有多种活性成分，如栗精胺或其药物可接受的盐，或与一种或多种抗生素、抗真菌剂、抗炎症药剂或其他抗病毒化合物的混和物或组合。
适合与组合物一起应用的药物可接受的载体包括，例如，增稠剂、缓冲剂、溶剂、湿润剂、防腐剂、螯合剂、辅剂等，及其组合。用于治疗用途的药物可接受的载体为医药领域所熟知，并在本文中有描述，例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)”，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro编辑，第18版，1990)和CRC Handbook ofFood，Drug，and Cosmetic Exciptents(食物、药物和化妆品赋形剂CRC手册)，CRC Press LLC(S.C.Smolinski ed.，1992)。
适用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液包括下述组分：无菌稀释液，如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂被封装在安瓿、一次性注射器、或由玻璃或塑料制成的倍剂量瓶中。如果静脉内给药，优选的载体为生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)或辅剂。示例性的辅剂为明矾(氢氧化铝REHYDRAGEL)；磷酸铝；病毒颗粒；具有和没有脂质A的脂质体，Detox(Ribi/Corixa)；MF59；或其他油或水乳剂型辅剂，如纳米乳剂(如，参见第5,716,637号美国专利)和亚微粒乳剂(如，参见第5,961,970号美国专利)，以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。在优选的实施方案中，药物组合物是无菌的。
在特定的实施方案中，活性化合物与载体一起制备，可防止化合物从体内快速除去，如可控释放制剂，包括植入物和微胶囊递送体系。可采用生物可降解的、生物相容的聚合体，如乙烯醋酸乙烯酯、多聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法对本领域技术人员是熟知的。例如，如本领域所公知的，一些这样的原料可从Alza Corporation(CA)和Gilford Pharmaceuticals(Baltimore，MD)购得。
脂质体悬浮液也可为药物可接受的载体。这些可根据本领域技术人员公知的方法制备(例如第4,522,811号美国专利；第6,320,017号美国专利；第5,595,756号美国专利)。例如脂质体制剂可通过如下方法制备：将适合的脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生四烯酸酰(arachadoyl)磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂中，这些无机溶剂随后蒸发，在容器表面留下薄层干燥的脂质。随后将活性化合物或其单磷酸盐、二磷酸盐和/或三磷酸盐衍生物的水溶液引入容器中。容器随后用手旋转，以使脂质材料脱离容器壁以及分散脂质聚集体，由此形成脂质悬浮液。亲水化合物，如栗精胺，很可能被封在脂质体的含水内部。
本发明中提到的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物在此全部引入作为参考。下述实施例旨在说明本发明，而不是对本发明的限制。
                   实施例
                   实施例1
栗精胺、干扰素-α2B和利巴韦林保护MDBK细胞不受BVDV诱
                 导的细胞毒性
采用非放射性细胞增殖MTS/PMS分析法(MTS：3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(PromegaCorporation，Madison，WT)；PMS：吩嗪硫酸甲酯(Sigma Aldrich，StLouis，MO))进行细胞增殖分析。MDBK细胞接种于96孔平板，密度为每孔约2×104细胞。培养孵育3-24小时，在感染和加入化合物之间使细胞附着于培养板。适当PFU量的BVDV加入到每个孔中，达到所需的MOI(0.1或0.01)；细胞暴露于用含有1％马血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释到适当浓度的病毒1至2小时。随后除去病毒接种物，细胞用含有1％HS的PBS洗涤。将测试化合物、栗精胺、利巴韦林和干扰素-α溶于含2％HS的细胞生长培养基，并以不同浓度加至细胞，随后在5％CO2、37℃下孵育3-4天。未感染的细胞和感染的、未处理的细胞(即，没有化合物)作为另外的对照。孵育3-4天后，组合的MTS/PMS溶液加入到含有100μL细胞培养物的分析平板每孔中，得到终浓度为333μg/ml MTS和25μM PMS。分光光度计板式读数器用于测定96孔板在湿润的、5％CO2空气中37℃孵育1-4小时后在490nm处的吸收值。测定每套三个重复孔的平均吸收值。抗病毒活性作为MTS转化相对于细胞(未感染的)和病毒(未经药物处理的)对照转化之间的差额进行测定。对每个浓度的测试化合物，细胞病理效应(CPF)减少(与抗病毒活性相关)的测定如下：％CPE减少＝[(D-ND)/(NI-ND)]×100，其中，D(药物处理的)为药物处理的细胞的吸收值；ND(未经药物处理的)为未处理的感染的细胞的吸收值；NI(未感染的)为未感染的细胞的吸收值。数据如表1所示。
表1.保护MDBK细胞不受BVDV诱导的细胞毒性
  MOI＝0.01   MOI＝0.1
  化合物   EC50   EC50   CC50
  栗精胺   61.5±15.4μM   177±14.5μM   ＞1000μM
  干扰素-α2b   19.4±6IU/孔   96.5±22IU/孔   ＞300IU/孔
  利巴韦林   4.4±2μM   9±1μM   57±34μM
*IU＝干扰素单位
EC50代表保护50％细胞不受BVDV诱导的细胞毒性(即，50％CPE减少)的药物浓度。CC50等于影响50％MDBK细胞成活力的浓度。这些结果表明每种测试化合物都具有抗病毒效果，它可以是直接的或间接的。实施例2和3公开了抗病毒效果实际上由于对病毒的直接作用。
                      实施例2
栗精胺、干扰素-α2B和利巴韦林在体外抑制BVDV从MDBK细
                      胞中释放
Madin-Dafby牛肾细胞(MDBK)(American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，VA；ATCC CCL22)以每孔约2×104细胞的密度接种在96孔板的含2％热失活马血清(HS)的细胞生长培养基(例如，Dulbecco′s Modified Eagles Medium(DMEM)；Gibco，Ontario，Canada)中。在感染和添加化合物之间，让细胞孵育3-24小时，以使得细胞附着到组织培养板。将在含有1％HS的无菌PBS中稀释的适当斑形成单位(PFU)量的BVDV菌株NADL(ATCC VR-534)加入到每个孔，达到期望的感染复数MOI(约0.01)。将细胞在37℃、5％CO2下暴露于病毒1.5小时，随后用PBS洗涤。将溶解在具有2％HS的细胞生长培养基中的测试化合物随后以不同浓度加至细胞。培养板在37℃、5％CO2中孵育24小时(BVDV复制的一个周期)。96孔板随后低速离心以沉淀细胞。上清被连续稀释，并用于感染12孔板中的新的单层细胞。细胞单层随后用0.5％的琼脂糖覆盖，所述琼脂糖溶解在具有5％HS的包含如下物质的细胞生长培养基中：(1)栗精胺(Phytex，Australia)；(2)利巴韦林(Ribavirin，Sigma)；(3)IFN-α2b(PBL BiomedicalLaboratories，Piscataway，NJ)；或(4)单独的(即，没有加入的测试化合物)。处理的细胞在37℃、5％CO2中孵育3-5天，用甲醛固定，用结晶紫或亚甲基蓝染色，在重蒸溜水中洗涤，最后在室温中风干。手工计数形成的病毒斑，并测定滴度。数据如表2所示。
表2.抑制病毒释放
  化合物   EC50   EC50
  栗精胺   14±8μM   83±21μM
  干扰素-α2b   0.4IU/孔*   1.4±0.4IU/孔*
  利巴韦林   2.4±2.2μM   4.9±1.9μM
*IU＝干扰素单位
EC50为抑制感染细胞的培养基中50％的病毒释放(与未处理的对照相比)的化合物浓度。这些结果支持实施例1中的数据，并进一步证实了每个测定化合物具有直接的抗病毒效果，这表明了HCV也被栗精胺、干扰素和利巴韦林直接抑制。
                    实施例3
                   斑抑制分析
BVDV病毒储备物在含1-5％马血清(HS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续稀释。MDBK细胞生长至在培养皿中汇合，在37℃用不同感染复数(＜1至＞0.001)的BVDV感染。吸附1.5小时后，除去接种物。细胞单层用0.5％的琼脂糖覆盖，所述琼脂糖溶解在包含5％HS、具有和没有测试化合物(栗精胺、利巴韦林或IFN-α)的细胞生长培养基中。培养皿在37℃、5％CO2中孵育3-5天。单层MDBK细胞用甲醛固定，根据标准方法用结晶紫或亚甲基蓝染色，随后在重蒸溜水中洗涤。洗涤后，将板在室温风干。手工计数在MDBK细胞培养物中形成的病毒斑。试验化合物的抑制活性的测定通过计算斑减少的百分数(％)进行：％斑减少＝(斑数(药物处理的感染细胞)/斑数(对照(没有化合物)的感染细胞)×100。数据如表3所示。
表3.斑减少分析
  EC50   CC50
  栗精胺   110±82μM   ＞1000μM
  干扰素-α2b   8.5±4.4IU+   ＞100IU
  利巴韦林   9.1±6.3μM   250μM
+IU＝干扰素抗性单位
EC50为抑制50％的病毒斑形成单位(与未处理的对照相比)的化合物浓度。这些结果进一步证实了，如实施例2的试验结果，每个测试化合物具有对病毒增殖的直接效果。
                    实施例4
栗精胺与IFN-α2b或利巴韦林组合的协同作用和细胞毒性
进行细胞病变分析，以确定栗精胺与IFN-α2b或利巴韦林协同作用的可能性。采用平均的背景和颜色校正数据，在抑制细胞病变效应(CPE)分析法中进行双向组合分析(two-way combination assay)，描述如下。通过产生“棋盘”实现该双向药物组合，其中一种药物水平地、另一种药物垂直地滴定到以0.01MOI的BVDV感染的MDBK细胞上。同样的方法用在未感染的MDBK细胞上，以观察该组合对药物的细胞毒性的影响。每一双向组合进行两次。EC50代表对BVDV诱导的细胞毒性(CPE)提供50％保护的化合物浓度。应用MacSynergy软件程序(由Dr.Mark Prichard赠予，University of Alabama，Tuscaloosa，AL)分析EC50数据来确定任何协同作用(参见，例如上述Ouzounov et al.；Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.47：2293，2003)。
由添加第二抗病毒药物剂量得到的第一抗病毒药物的EC50值对第二抗病毒药物浓度绘图产生等效线(剂量对)，所有等效线以等效线图解法绘制来确定存在协同作用、拮抗或相加性。相加线的作图通过连接两种测试化合物(即，栗精胺和干扰素或栗精胺和利巴韦林)中每个的单一治疗的EC50值。连接单一治疗EC50值的线代表了两种化合物的理论上的相加作用值。组合治疗的等效线在相加线以下表示协同作用，而在相加线以上表示拮抗。也测定单独的以及组合中的每种化合物对MDBK细胞的细胞毒性百分数(或％存活)，并用于计算CC50值。抗病毒药物的CC50为在50％细胞中(与未处理的细胞相比)引起细胞毒性的剂量。
与等效线图解法结合，MacSynergyTMII软件也用于获得双组合数据的协同作用量百分数或拮抗量百分数。从实验测定的值中减去计算的相加相互作用，以揭示观察到协同作用(以正的％值表示)或拮抗(以负的％值表示)作用时的区域和相应的药物浓度。0％抑制的水平面代表了相加性(相加表面)。从亮到暗的灰色梯度表明协同作用的水平。实验的剂量效应表面的95％置信区间用于统计学上评价数据。
表4列出了用于每个试验的每种化合物的浓度范围。
表4.测试的浓度范围
  化合物   实验1   实验1
  栗精胺(μM)   3.7-300   6.25-100
  利巴韦林(μM)   0.37-30   0.25-20
  干扰素-α2b(IU/mL)   0.40-250   0.08-50
如实施例1进行的，对于每一组合试验，开始时测定单个化合物在MDBK细胞中抑制BVDV诱导的细胞病变效应的效力(EC50)(见表5)。可观察到单个药物效力的最小实验间波动。
表5.保护MDBK细胞不受BVDV诱导的细胞毒性(EC50)
  栗精胺   干扰素-α2b   利巴韦林
  59±16μM   19±6IU/mL   4±2μM
剂量对EC50的影响
随着干扰素-α2b浓度的增加，栗精胺的EC50显示了剂量依赖的减小(表6)。随着干扰素-α2b的浓度从0增加到60IU/mL，栗精胺的EC50从52μM减少到＜1μM，在20IU/mL干扰素-α2b时减少了约50倍(表6)。同样地，随着栗精胺浓度从0增加到100μM，干扰素-α2b的EC50从16μM减少到＜1μM，在11μM栗精胺时减少了约2倍(表6)。
表6.剂量对EC50的影响
                                         栗精胺EC50的平均值(μM)
  干扰素-α2b加入量(IU/mL)   0   0.7   2.2   6.7   20   60
  栗精胺EC50(μM)   52   39   19   12   1   ＜1
                              干扰素-α2b EC50的平均值(IU/mL)
  栗精胺加入量(μM)   0   1.2   3.7   11   33   100
  干扰素-α2b EC50(IU/mL)   16   18   13   7   1   ＜1
双组合的效力
较大的正百分数(协同作用)量表明了协同作用。小于25μM/ml2％或25μM(IU/mL(孔)2％的值是不显著的；在25和50μM/ml2％或25和50μM(IU/mL(孔)2％之间的值被认为是较小但显著的；在50和100μM/ml2％或μM(IU/mL(孔)2％之间的值表明了适度的协同作用，其可能表明在体内的显著的协同作用；大于100μM/ml2％或μM(IU/mL(孔)2％的值显示了强协同作用，其很可能表示在体内的显著的协同作用。
栗精胺与干扰素-α2b组合显示了对BVDV感染的MDBK细胞的效力的强协同作用(表7)，以及在任一测试的浓度组合都没有显著的拮抗作用(＞-25μM(IU/mL)％；小于-25μM(IU/mL)％的任何值为显著的拮抗作用)。协同作用的峰值在栗精胺的浓度为25μM和33μM之间以及干扰素-α2b的浓度为10IU/mL(见图1)。应用等效线图解法作图分析组合数据证实了所观察到的强的协同作用；例如，在干扰素-α2b为10IU/mL时，栗精胺的EC50减少了＞7倍，而预期减少不到2倍(见图2)。
栗精胺与利巴韦林组合显示了对BVDV感染的MDBK细胞的效力的适度的协同作用(表7)。协同作用的峰值在栗精胺的浓度为10μM和50μM之间以及利巴韦林的浓度为1μM和6μM之间(见图3)。协同作用达到的最大百分数在22μM2％和31μM2％之间(见图3)。在化合物的较高浓度时可观察到效力的拮抗作用(-145μM2％)，例如，拮抗作用的峰值发生在栗精胺的浓度为300μM以及利巴韦林的浓度为30μM时，它们在体内是不可能相关的。拮抗作用达到的最大百分数约-68μM2％。由栗精胺与利巴韦林组合得到的等效线图解法曲线图也表明了栗精胺与利巴韦林之间的协同作用；例如，在约2μM利巴韦林时，栗精胺的EC50减少了2到3倍，而预期减少不到2倍(见图4)。
干扰素-α2b与利巴韦林结合显示了对BVDV感染的MDBK细胞的效力的适度的协同作用(68μM(IU/mL)％)(表7)。类似的协同作用量由Buckwold等人在2003年的文献中报道。协同作用的峰值在干扰素-α2b的浓度为2IU/mL和10IU/mL之间以及利巴韦林的浓度为0.7μM和3.3μM之间(数据未示出)。协同作用达到的最大百分数在20％和30％之间。在高浓度药物时也观察到效力中的拮抗作用(-102μM(IU/mL)％)，拮抗作用的峰值发生在干扰素-α2b的浓度≥50IU/mL以及利巴韦林的浓度≥20μM。拮抗作用达到的最大百分数约-63μM(IU/mL)％。由干扰素-α2b与利巴韦林组合得到的等效线图解法曲线图也表明了干扰素-α2b与利巴韦林之间具有协同作用；例如，在约10IU/mL干扰素-α2b时，利巴韦林的EC50减少了高达＞6倍，而预期减少约2倍(数据未示出)。
表7.双组合治疗的效力协同作用量
  组合   效力协同作用(95％CI)
  栗精胺/IFN-α2b(μM(IU/mL)％)   231±52
  栗精胺/利巴韦林(μM2％)   97±11
  利巴韦林/IFN-α2b(μM(IU/mL)％)   68±1
CI＝置信区间；IFN-α2b＝干扰素-α2b
双组合的细胞毒性
较大的负百分数(拮抗)量表明了组合对细胞具有较小的细胞毒性作用。小于-25μM/(IU/mL)％被认为是显著的拮抗作用(即，没有显著的细胞毒性)。
栗精胺与干扰素-α2b组合在未感染的MDBK细胞中显示了对细胞毒性的适度的拮抗作用(-63μM/(IU/mL)％)，同时没有观察到协同作用(＞25μM/(IU/mL)％)(表8)。拮抗作用的波谷位于栗精胺的浓度为50μM和100μM之间以及干扰素-α2b的浓度为大于0.4IU/mL(见图5)。
拮抗作用达到的最大百分数在-9％和-17％之间。
栗精胺与利巴韦林组合在未感染的MDBK细胞中显示了对细胞毒性的适度的拮抗作用(-46μM2％)，同时没有观察到协同作用(＞25μM2％)(表8)。拮抗作用的波谷位于栗精胺的浓度大于20μM以及利巴韦林的浓度为约3μM。拮抗作用达到的最大百分数在-6％和-7％之间(见图6)。
干扰素-α2b与利巴韦林组合在未感染的MDBK细胞中显示了对细胞毒性具有平均值为-83μM/(IU/mL)％的适度的拮抗作用，同时没有观察到显著的协同作用(＞25μM2％)(表8)。拮抗作用在两个抗病毒药物的整个浓度范围内相当一致，没有区域发现比其他区域具有显著的较高的拮抗作用(数据未显示)。拮抗作用达到的最大百分数在-8％和-18％之间。
表8.双组合治疗的细胞毒性拮抗作用量
       细胞毒性(95％CI)
  化合物   协同作用   拮抗作用
  栗精胺/IFN-α2b(μM(IU/mL)％)   0   -63±10
  栗精胺/利巴韦林(μM2％)   0   -46±13
  利巴韦林/IFN-α2b(μM(IU/mL)％)   6±1   -83±18
CI＝置信区间；IFN-α2b＝干扰素-α2b
一般地，栗精胺与干扰素-α2b的组合具有强协同作用(协同作用量＞100(IU/mL)μM％)。栗精胺与利巴韦林的组合显示了更为适度的协同作用(25μM2％和100μM2％之间)。在组合中观察到的强拮抗作用量发生在高药物浓度，它们在在体内是不可能相关的。任一组合的细胞毒性量均为拮抗作用，显示了组合对它们的细胞毒性作用没有显著影响。这些细胞毒性的拮抗作用可表明该组合可减少每种化合物的单独细胞毒性。随着添加的干扰素-α2b浓度的增加，可观察到栗精胺EC50剂量依赖的减少(高达＞52倍)。EC50的这种减少随着利巴韦林浓度的增加变得更加显著。所述组合不增加干扰素-α2b或利巴韦林的细胞毒性。这些数据表明了栗精胺与干扰素-α2b的组合以及栗精胺与利巴韦林的组合有益于治疗HCV感染患者。
                      实施例5
    栗精胺与金刚胺或NB-DNJ组合的协同作用和细胞毒性
进行细胞病变分析，以确定栗精胺与IFN-α2b或利巴韦林协同作用的可能性。采用平均的背景和颜色校正数据，在抑制细胞病变效应(CPE)分析法中进行双向组合分析(two-way combination assay)，描述如下。通过产生“棋盘”实现该双向药物组合，其中一种药物水平地、另一种药物垂直地滴定到以0.01MOI的BVDV感染的MDBK细胞上。同样的方法用在未感染的MDBK细胞上，以观察该组合对药物的细胞毒性的影响。每一双向组合进行两次。EC50代表对BVDV诱导的细胞毒性(CPE)提供50％保护的化合物浓度。应用MacSynergy软件程序(由Dr.Mark Prichard赠予，University of Alabama，Tuscaloosa，AL)分析EC50数据来确定任何协同作用(参见，例如上述Ouzounov et al.；Buckwold et al.，Antimicrob.Agents Chemother.47：2293，2003)。也将M-1914(HCV聚合酶的非核苷HCV抑制剂，不抑制BVDV)作为阴性对照进行了测试。
对于每一组合实验，测定了每种药物在MDBK细胞中抑制BVDV诱导的细胞病变效应的单独效力(EC50)(见表9)
表9.保护MDBK细胞不受BVDV诱导的细胞毒性(EC50)
  栗精胺   金刚胺   M-1914   NB-DNJ
  ＞100   400.4   ＞50   ＞500
双组合效力研究
栗精胺与金刚胺的组合在MDBK细胞中抑制BVDV的细胞病变作用方面显示了适度的协同作用(协同作用量为60.7μM2％)。栗精胺与NB-DNJ或M-194的组合在MDBK细胞中抑制BVDV的细胞病变作用方面没有显著的协同作用(协同作用量＜25μM2％)。在栗精胺和金刚胺、栗精胺和NB-DNJ、或栗精胺和M-194的组合之间没有观察到显著的拮抗作用(协同作用量＞-25μM2％)(表10)。
表10.组合物治疗的效力协同作用量
  组合   效力协同作用(μM2％)(95％CI)
  栗精胺-金刚胺   60.7
  栗精胺-M-1914   6
  栗精胺-NB-DNJ   16.3
CI＝置信区间；测试的范围：栗精胺＝33.3-0.4μM；M-1914＝50-3.12μM；金刚胺＝250-31.3；NB-DNJ＝250-31.3
双组合的细胞毒性研究
在未感染的MDBK细胞中测定了栗精胺与金刚胺、M-1914或NB-DNJ组合的细胞毒性。双组合的细胞毒性量对栗精胺与金刚胺、M-1914或NB-DNJ的双组合是相加性的(协同作用量＜25μM2％)。对栗精胺与NB-DNJ的组合没有观察到显著的拮抗作用(协同作用量＞-25μM2％)，然而在栗精胺与金刚胺(协同作用量-40.1μM2％)或栗精胺-M-1914(协同作用量-26.3μM2％)的组合中观察到适度的拮抗作用，表明了栗精胺与金刚胺或M-1914的组合可减少它们预期的毒性。
表11.组合治疗的细胞毒性拮抗作用量
   细胞毒性量(μM2％)(95％CI)
  组合   协同作用   拮抗作用
  栗精胺-金刚胺   1.3   -40.1
  栗精胺-M-1914   0   -26.3
  栗精胺-NB-DNJ   8.1   -1.7
仅采用常规试验，本领域技术人员就会意识到或能确定许多本文中描述的具体实施方案的等同物。这些等同物也包括在所附权利要求中。

Claims (41)

1.治疗黄病毒科病毒感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变免疫功能的药剂。
2.治疗黄病毒科病毒感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变黄病毒科病毒复制的药剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述个体为人。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述黄病毒科病毒为黄病毒属成员。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述黄病毒科病毒为瘟病毒属成员。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述黄病毒为丙肝病毒属病毒，以及其中所述丙肝病毒属病毒为丙型肝炎病毒(HCV)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述改变免疫功能的药剂为干扰素。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述干扰素为干扰素-α。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述干扰素-α被聚乙二醇化。
10.如权利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改变免疫功能的药剂顺序给药。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述改变免疫功能的药剂先于栗精胺给药。
12.如权利要求10所述的方法，其中栗精胺先于所述改变免疫功能的药剂给药。
13.如权利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改变免疫功能的药剂同时给药。
14.如权利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改变免疫功能的药剂混合为单一的组合物，并且同时给药。
15.如权利要求1所述的方法，包括给予个体(a)包含栗精胺和药物可接受的载体的组合物，和(b)包含所述改变免疫功能的药剂和药物可接受的载体的组合物。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述改变病毒复制的药剂为利巴韦林。
17.如权利要求2所述的方法，其中所述改变病毒复制的药剂为干扰素-α。
18.如权利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改变病毒复制的药剂顺序给药。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述改变病毒复制的药剂先于栗精胺给药。
20.如权利要求18所述的方法，其中栗精胺先于所述改变病毒复制的药剂给药。
21.如权利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改变病毒复制的药剂同时给药。
22.如权利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改变病毒复制的药剂混合成为单一组合物，并且同时给药。
23.如权利要求1所述的方法，其中栗精胺和所述改变免疫功能的药剂协同地相互作用。
24.如权利要求2所述的方法，其中栗精胺和所述改变病毒复制的药剂协同地相互作用。
25.治疗黄病毒科病毒感染的方法，包括栗精胺与选自如下的药剂组合：
(a)抑制黄病毒科病毒感染细胞的化合物；
(b)抑制病毒RNA从病毒衣壳中释放或抑制黄病毒科病毒基因产物功能的化合物；
(c)改变黄病毒科病毒复制的化合物；
(d)改变免疫功能的化合物；
(e)改变黄病毒科病毒感染症状的化合物；以及
(f)治疗黄病毒科病毒相关感染的化合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述改变免疫功能的化合物为干扰素。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述干扰素为干扰素-α。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述干扰素为聚乙二醇化干扰素-α。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述改变黄病毒科病毒复制的化合物为利巴韦林或干扰素-α。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述黄病毒科病毒相关感染为乙型肝炎病毒(HBV)感染或逆转录病毒感染。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述逆转录病毒感染为人免疫缺陷病毒感染(HIV)。
32.治疗黄病毒科病毒感染的方法，包括给予个体栗精胺、或其药物可接受的盐，以及干扰素。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述干扰素为干扰素-α。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述干扰素为聚乙二醇化干扰素-α。
35.如权利要求32所述的方法，其中栗精胺和所述干扰素协同地相互作用。
36.组合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途，其中所述组合物包含栗精胺、或其药物可接受的盐、以及改变免疫功能的药剂。
37.如权利要求36所述的用途，其中所述改变免疫功能的药剂为干扰素。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述干扰素为干扰素-α。
39.如权利要求37所述的用途，其中所述干扰素为聚乙二醇化干扰素-α。
40.组合物在制备治疗黄病毒科病毒感染的药物中的用途，其中所述组合物包括栗精胺、或其药物可接受的盐，以及改变黄病毒科病毒复制的药剂。
41.如权利要求36所述的用途，其中所述改变黄病毒科病毒复制的药剂为利巴韦林。
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