CN101020711A - 病原真菌控制分生孢子产生的新基因MgCON3及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了病原真菌中控制分生孢子产生的一个新基因MgCON3。该基因及其cDNA、编码的蛋白质和启动子分别具有序列表中SEQ ID №：1、№：2、№：3和№：4的核苷酸或氨基酸序列。MGCON3蛋白在其它真菌如小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、小麦颖枯病菌、玉米黑粉病、棉病囊菌中均具有氨基酸序列一致性在40％以上的同源蛋白。MgCON3基因的敲除导致梨孢菌产生的分生孢子量为野生型菌株的1/800至1/1000，同时减弱对水稻叶片的侵染能力。MgCON3及其相似基因在上述真菌中的表达、转录物的剪切以及它们编码蛋白的表达、修饰与剪切可作为重要候选靶标，用于设计和筛选抗真菌的新型药剂。

Description

病原真菌控制分生孢子产生的新基因MgCON3及其用途

技术领域

本发明涉及微生物基因工程和植物保护领域中影响真菌产生分生孢子的编码基因及其相关蛋白的应用。

背景技术

梨孢菌(Magnaporthe grisea)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦、粟以及其它多种禾本科植物，导致瘟病。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10％，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病是我国水稻的主要病害之一，也是世界性的水稻病害，。

梨孢菌以分生孢子作为侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。梨孢菌的一部分菌丝在生长过程中分化为分生孢子梗。分生孢子梗顶端细胞膨大形成第一个分生孢子，此后，顶端的极性向一边偏移进而依次产生另外的分生孢子。梨孢菌的分生孢子呈梨形，由三个细胞组成。一般5至9个分生孢子以合轴的方式从一个分生孢子梗的顶端产生。分生孢子释放后，在分生孢子梗上留下屈膝状的疤痕。释放后的分生孢子吸附到叶片上，经过萌发形成附着胞，成熟的附着胞内产生与累积膨胀压；然后，附着胞下产生侵染钉直接穿透植物表皮，并在植物细胞内形成侵染性菌丝；最后侵染性菌丝在植物细胞内和细胞间扩展、定植梨孢菌侵染感病寄主时，侵染性菌丝在植物组织内扩展形成直径2-3毫米以上的灰色或灰褐色病斑，这些病斑中的侵染菌丝穿透植物组织向空中分化形成分生孢子梗，进一步形成分生孢子。分生孢子在风、雨的冲刷下释放、附着，重新引起植物的再侵染。梨孢菌从分生孢子附着到分生孢子再产生的周期一般所需时间为3-5天；在植物的生长季节，如果条件适宜，能够多次侵染，造成危害。从上面的叙述可知：分生孢子的形成是梨孢菌侵染植物所必需的过程，稻瘟病的严重度与梨孢菌分生孢子的产生量呈正相关。如果能阻断梨孢菌的分生孢子形成，就可以控制稻瘟病等的发生。因此，研究梨孢菌分生孢子形成和形态建成的分子遗传不仅对于揭示梨孢菌、丝状真菌产生分生孢子的分子机制具有重要的理论意义，而且对于稻瘟病的防治具有重要应用价值。

植物病原真菌的分生孢子的形成及其形态构建是一个很复杂的过程，可能有不少基因参与该过程。但是目前有关此方面的基因克隆与分子机理的报道非常缺少。

1993年，Shi和Leung报道了梨孢菌水稻分离物Guyll的con1-突变体(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis and rapid mapping of a sporulation mutationin Magnaporthe grisea，MPMI，Vol.7，No.1，1993，pp.113-120.)。该突变体在每一个分生孢子梗上只产生一个端生的伸长的三个细胞的分生孢子，在培养基上的生长和分生孢子的形成分别只有野生型的73％和2.3％，在载玻片或洋葱表皮上不能形成正常的附着胞，并且失去了对原来感病的水稻品种的致病性。之后，他们又运用REMI(Restriction Enzyme-mediated Insertion)技术获得了一系列与分生孢子形成有关的突变体con2-con7(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis ofsporulation in Magnaporthe grisea by chemical and insertional mutagenesis，MPMI，Vol.8，No.6，1995，pp.949-959.)。突变体con5-和con6-完全丧失了分生孢子形成能力；con1-、con2-、con4-和con7-作用于con5-和con6-的下游，影响产孢能力和分生孢子的发育；con4-和con7产孢量减少约35％。con1-和con7-不能形成附着胞，因而丧失了对水稻的致病性，con2-和con4-附着胞形成率明显减少，因而致病性明显减弱。尽管如此，这些基因目前还没有得到克隆和证明。发明人小组此前鉴定并证明了控制梨孢菌分生孢子的产生及其形态建成的三个新基因MgCON1、MgCON2和MgCOM1(国家发明专利申请号分别为：200510109447.3、200510109446.9和200510074921.3)。其中，MgCON1可能编码一个转录因子，其缺失导致梨孢菌不产生分生孢子且丧失了对感病水稻品种的致病力；MgCON2基因编码一个核蛋白，可能参与基因转录物的剪切，其缺失导致次生分生孢子梗发育不成熟、产孢量下降、对感病水稻品种的致病力减弱；MgCOM1基因可能编码一个核蛋白，其缺失导致分生孢子形态异常、对感病水稻品种的致病力减弱。

本发明通过插入突变途径从梨孢菌中又克隆了一个调控分生子产生的基因MgCON3，该基因突变可使梨孢菌产生分生孢子的能力显著下降。该基因不同于已克隆或鉴定的控制梨孢菌分生孢子产生及其形态建成的基因，为一新基因。此外，该基因在其它植物病原真菌如小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)等植物病原真菌中均存在与MGCON3在氨基酸序列一致性达40％以上的同源蛋白，它们可能具有与MGCON3相似的生物学功能。因而，MgCON3及其同源基因的表达与调控、MGCON3及其同源蛋白可作为靶标用于抗真菌药物的设计和筛选，并应用于植物病原真菌病害的控制中。

发明内容

本发明的目的旨在提供调控真菌分生孢子产生的一个蛋白及其编码基因。

本发明所提供的调控真菌分生孢子产生的蛋白在梨孢菌中称为MGCON3。MGCON3是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；其序列由302个氨基酸残基组成。

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌分生孢子产生相关的蛋白质。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

MGCON3的编码基因(MgCON3)也属于本发明的保护范围。MgCON3基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；序列表中的SEQ ID№：1由4676个碱基组成，MgCON3编码区位于SEQ ID №：1的5′端第2241位至3434位碱基之间，5′端第1位至2240位碱基为启动子序列。

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID№：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

MgCON3基因的cDNA也属于本发明的保护范围，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；序列表中的序列2由909个碱基组成，

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

利用MgCON3基因的启动子、编码区序列构建的表达载体以及通过该载体转化获得的细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

以MgCON3基因中任一区域的核苷酸序列设计引物，并通过PCR扩增用于检测在化合物处理状况下MgCON3基因的表达也属于本发明的保护范围之内。

以MGCON3或与其有40％或以上一致性的同源蛋白中任一区域的氨基酸序列设计多肽，并制备抗体用于检测在化合物处理状况下MGCON3蛋白的表达也属于本发明的保护范围之内。

本发明证明MgCON3基因的缺失与突变导致梨孢菌产生分生孢子量显著下降，并丧失了对水稻的侵染能力，说明MgCON3基因是梨孢菌引起水稻稻瘟病所需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达、转录物的剪切及其蛋白质的表达、修饰与定位的化合物，可以有效控制梨孢菌分生孢子的产生和水稻稻瘟病的发生，可以作为新型杀菌剂的候选新药物直接利用或改善之后加以。也就是说，本发明所提供的MgCON3的一个重要用途是，该基因的表达和转录物的剪切及其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗梨孢菌药剂)的筛选和设计中。进一步，解析该基因参与的分生孢子产生的信号传递途径，从中也可以发现候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗梨孢菌药剂)的筛选和设计中。此外，也可以以该基因核苷酸序列的某一区段作为探针或作为PCR引物设计的基础在梨孢菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。

本发明所提供的调控真菌分生孢子产生的蛋白在其它植物病原真菌如：小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)等真菌中均存在同源蛋白。这些真菌中的同源蛋白与梨孢菌MGCON3在氨基酸序列上的一致性均高于40％，它们可能与梨孢菌MGCON3具有相同的生物学功能。因此，这些同源蛋白及其编码基因的启动子也可作为靶位点，用于设计和筛选抗这些真菌的药物。

上述利用MGCON3及其同源蛋白的表达为靶标、开展抗真菌药剂的筛选和设计等用途也属于本发明的保护范围之内。

以下通过附图进一步说明本发明

附图说明

附图1.野生型菌株P131及其突变体H4186产孢状态的比较。将菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基(每升含150ml西红柿汁、30-50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时后，显微拍摄培养基表面产生的分生孢子，放大倍数100倍。

附图2.野生型菌株P131及其突变体H4186的产孢量比较。采用同上的方法，将野生菌株与突变体菌株在培养皿(直径6cm)内产生的分生孢子用同样体积水洗下，用血球记数板测定单位体积中所含有的分生孢子数。

附图3.互补转化载体构建示意图。在PCR正向引物设计酶切EcoRI酶切位点5’-ATGAATTCCACTATACCCAGCA-3’，反向引物为5’-CGACACGACCTGTTTACATCTT-3’，从野生菌P131中扩增出4949bp批包含编码MGCON3的核苷酸序列，连接KN载体，构成互补载体。

附图4.野生型菌株P131与突变体H4186互补转化体产孢性状比较。产孢方法同上，放大100倍显微拍照。

附图5.敲除转化载体构建示意图。左臂正向引物5’-CAACTAGTGAGTAACGCTGATGT-3’，其5’带有SpeI酶切位点，反向引物为5’-ATGAAGCTTATCTGTATCTGTCCA-3’，其5’端带有HindIII酶切位点；右臂正向引物5’-CATCCTCGAGAAGAAGAAGGTT-3’其5’带有XhoI酶切位点，反向引物为5’-CGACACGACCTGTTTACATCTT-3’，用SpeI和HndIII、XhoI和右臂自身存在的KpnI酶切，分别连接KN载体，最后在SalI位点连接潮霉素基因，构成敲除载体。

附图6.野生型菌株P131与敲除转化体产孢性状比较。产孢方法同上，放大100倍，显微拍照。

附图7.野生型菌株P131与六个敲除转化体PCR扩增检测。其中的第1、2、3、4、5、6、7个泳道显示为敲除转化体P2KNH-95、P2KNH-141、P2KNH-179、P2KNH-192、P2KNH-306、P2KNH-325和野生型菌株P131用正向引物5’-CCAAAGGGTTGACCTGAGG-3’和反向引物5’-GACAGACGTCGCGGTGAGTT-3’的扩增片段。其正向引物为梨孢菌中序列，位于敲除转化载体左臂序列的上游，反向引物为敲除转化载体潮霉素基因上的序列。第8道为Lambda DNA用HindIII的酶切marker。第9、10、11、12、13、14、15为P131与六个敲除转化体用正向引物5’-CACAGAACCCACGGACAC-3’和反向引物5’-GACCCTCCAGATGCTCCA-3’的扩增片断。其引物为基因MGCON3上序列。

附图8.MGCON3与其它植物病原真菌中同源蛋白的相似性比较。GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3分别为小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)中与MGCON3氨基酸序列一致性高于40％的蛋白质。

附图9.野生型菌株P131与MgCON3突变体H4186、互补转化体P2KN-17和敲除体P2KNH-95对水稻侵染能力的比较。将上述菌株分别在西红柿汁燕麦片培养基培养5天后，用手术刀切取相同大小3mm×3mm大小新鲜菌丝块，接种于丽江新团黑谷，28℃黑暗培养36小时，再见光培养72小时后拍照。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过实施例予以进一步的说明，但并非对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、控制梨孢菌分生孢子产生的基因MgCON3的分离

1、突变体的筛选与鉴定

a、分生孢子的制备

将梨孢菌菌株P131的各REMI转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基(每升含150ml西红柿汁、30-50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时后，在培养基表面即可见大量的梨孢菌孢子。

c、分生孢子产孢量相关突变体的筛选

将各REMI转化体通过上述方法制备的分生孢子用30ml水洗、收集，利用血球记数板在显微镜下测定其分生孢子数；并以野生型菌株P131为对比，筛选产孢量有显著差异的菌，结果获得一个产孢量显著降低的突变体H4186。对野生型菌株和突变体H4186各6皿进行产孢量测定，结果发现：突变体H4186的产孢量显著降低，只有野生型菌株的1/1000(表1、附图1、2)。

2、突变体表型变化与插入标记共分离分析

将突变体H4186分别与不具有潮霉素抗性、产孢正常的且交配型相反的梨孢菌菌株S1528在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先于25℃培养至菌落边缘即将接触，然后将其移至20℃光照培养，约16天左右在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳。挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，24小时后挑取子囊中子囊孢子萌发的单根菌丝到西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和分生孢子产生情况，结果如表2所示。从该结果可知，在测定的子囊孢子后代中，对潮霉素敏感的后代都能正常野生表型，抗潮霉素的后代产孢量都为突变表型，说明此突变体的失去产孢能力的表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的。

表1.突变体与野生型菌分生孢子产量的区别：

	产孢量(单位：个)
		平均值
	P131		26875000±5641642
H4186		28000±10965.86

表2.S1528与突变体杂交后代的潮霉素抗性与突变性状分析

	总后代数	抗潮霉素			不抗潮霉素
								野生型	突变型	合计	野生型	突变型	合计
		H4186×S1528	46	0	22	22	24							0	24

3、MgCON3基因的克隆

通过对突变体H4186中插入质粒的拯救，获得了相应的插入位点侧端的基因组序列，并确定了突变体中质粒的插入位置。具体方法如下：

选取插入质粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophusby restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：1264-12653)中没有酶切位点的限制性内切酶XhoI完全消解突变体的基因组，乙醇沉淀精制后用T4DNA连接酶进行自连接，转化大肠杆菌的感受态细胞JM109。提取转化体的质粒，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，还含有部分插入位点侧端的基因组的序列。对鉴定正确的质粒进行测序然后进行数据库中检索，分析插入位点附近的基因的范围和可能的外显子。结果表明在突变体H4186中，质粒的插入引起基因组中5449bp片段的缺失。将获得的侧端序列与国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http://www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因组数据库比较，质粒插入在第II号染色体的supercontig5.186。预测该插入位点所破坏的基因具有一个含909个碱基的开放阅读框，编码302个氨基酸。据此，设计PCR引物，从野生菌中扩增出4949bp，并克隆到pMD19-T载体中，得到克隆载体P2T。该克隆片段在第3到第8个碱基为EcoRI酶切位点。用EcoRI酶切后，该片段含MgCON3起始密码子前2240bp及终止密码子后1515bp的序列，包含了功能性MgCON3的全长序列。

实验过程中涉及到的限制性内切酶、pMD19-T载体和T4DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。

实施例2、MgCON3梨孢菌分生孢子产生中作用的证明

本发明采用基因互补实验和基因置换实验来证明MgCON3梨孢菌分生孢子产生中作用。在这部分内容中包括互补载体和基因置换载体的构建以及将上述两类载体导入梨孢菌中，得到相应的转化体并测定其产孢量。互补载体的构建是指将包含MgCON3的全长功能性序列的DNA片断与一个带有新霉素抗性基因的载体相连。互补载体所导入的梨孢菌受体菌株是突变体菌株。在这里新霉素抗性基因并不是对本发明的限制，其他能导致抗生素抗性的基因，即新霉素抗性基因之外的导致真菌抗性的基因都可以达到同样的效果。基因置换载体的构建是指将位于MgCON3的两侧各一段DNA序列连入一个载体中，两者之间用潮霉素抗性基因隔开。基因置换载体通过基因两侧的侧翼序列与野生型菌株基因组的相应序列发生同源重组，从而将基因组中相应位点MgCON3的基因组基因序列与潮霉素基因置换。基因置换载体所导入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌P131。

1、互补载体和敲除载体的构建

a.互补载体的构建

首先合成带有限制性内切酶XbaI识别序列的引物从克隆质粒载体pS65T-C1(gi：1019893)中扩增出新霉素磷酸转移酶基因连入pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点XbaI间，得到的质粒载体命名为KN。然后，将实施例1.3中获得的克隆载体用限制性内切酶EcoRI(pMD19-T载体上含另外一个EcoRI位点)酶切后，回收包含目标基因的片段，连入KN，得到包含有功能性MgCON3全长基因和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的互补载体P2KN(图4A)。

构建过程中涉及到的克隆载体、限制性内切酶和连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。

b.敲除载体(基因置换载体)的构建。

参照本实施例中通过互补实验验证的MgCON3全长基因的基因组序列，设计PCR引物，分别扩增左臂和右臂片断，左臂用SpeI和HindIII酶切，右臂XhoI和KpnI酶切后得到位于MgCON3起始密码子上游的序列片段(supercontig5.186的第501794位的核苷酸至第502780位的核苷酸之间的序列)和位于MgCON3终止密码子下游的序列片段(从supercontig5.186的第505028位的核苷酸至第506507位的核苷酸之间的序列)。这两段序列分别连接KN载体，另一方面用限制性内切酶SalI从质粒载体pUCATPH中切下潮霉素磷酸转移酶基因与同样限制性内切酶切连入，得到基因置换载体P2KNH(图4B)。利用同源重组的原理，将P2KNH用限制性内切酶NotI线性化后转化野生梨孢菌P131，MgCON3基因中包含编码区在内的2248bp片段就被潮霉素磷酸转移酶基因所代替，在潮霉素磷酸转移酶基因的两侧分别留下993bp和1475bp的MgCON3的基因组基因的侧端序列。

2、梨孢菌的转化。

在本发明中，梨孢菌的转化选用PEG介导的转化真菌原生质体的方法，原生质体的制备和转化方法如下：

a.原生质体的制备

500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸钙0.1％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.025％，氯化钠0.015％)，分别接入所需梨孢菌菌株的适量菌丝、孢子混和体，在26-28℃、100转/分条件下摇培30-32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7 M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mMTris-Cl，pH7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5-1×10⁸个/毫升。

b.梨孢菌转化

分别将梨孢菌P131或H4186原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管150微升，分别加入等体积的线性化的载体(约2微克，梨孢菌P131的离心管中加入用限制性内切酶NotI线性化的基因置换载体P2KNH，梨孢菌H4186的离心管中分别加用限制性内切酶NotI线性化的互补载体P2KN)和STC混合液，冰上放置20分钟，然后逐滴缓慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mMTris-pH7.5，50mM氯化钙)，冰上静止20分钟，加入25毫升/管冰冷的STC，缓慢混匀，4,000转/分、4℃离心15分钟，去上清，然后每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室温静置培养12-13小时后，转入培养皿，加入12毫升冷却至50℃的SR(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12毫升的0.7％上层琼脂(冷却至50℃，含400微克/毫升的新霉素(互补实验)或300微克/毫升的潮霉素(美国Roche公司生产，基因置换试验)。28℃培养4-6天，将出现的转化体(突变体H4186的互补转化体分别为P2KN-2、P2KN-17和P2KN20；梨孢菌P131的基因置换转化体P2KNH-95、P2KNH-141、P2KNH-179、P2KNH-192、，P2KNH-306、P2KNH-325)转至固体CM培养基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％琼脂)(含400微克/毫升的新霉素(互补实验)或250微克/毫升的潮霉素(基因置换试验)上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。

互补实验的结果表明互补载体在梨孢菌突变体H4186基因组中的异位整合使突变体恢复了分生孢子的产生能力。突变体的互补转化体的分生孢子产生量与野生型菌P131相当，两者的比较结果如表3所示。互补载体构建如附图3所示，突变体H4186的互补转化体P2KN-17和野生型菌P131的分生孢子产生情况如附图4所示。

表3.P2KN-17互补转化体与野生型菌分生孢子产量的比较

	产孢量(单位：个)
		平均值
	P131		24642000
P2KN-17		29100000

敲除实验表明，潮霉素基因置换MgCON3后，6个敲除转化体都丧失了产孢能力，表现出与突变体一样的性状，野生菌P131与敲除转化体产孢量比较如表4所示。敲除载体构建如图5所示，野生菌P131和敲除转化体分生孢子产生情况如附图6所示。

表4.MgCON3敲除转化体与野生型菌分生孢子产量的比较

	产孢量(单位：个/皿)
		平均值
	P131		26875000
P2KNH-95		32000
	P2KNH-141		39000
P2KNH-179		38300
	P2KNH-192		31000
P2KNH-306		41000
	P2KNH-325		47300

实施例3、MGCON3与其它病原真菌中同源蛋白的生物信息学分析

为获得MGCON3在其它植物病原真菌如小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)中的同源蛋白，对MGCON3的氨基酸序列在上述真菌基因组数据库中进行tblastn(蛋白质对核苷酸)查询，结果发现：在上述基因组中均具有与MGCON3同源的蛋白质。进一步，提取上述基因组中的核苷酸序列在 http:∥sun1.softberry.com网站上进行预测，得到对应的同源蛋白质，将其分别命名为GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3。GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3分别含有305、302、302、294、325和306个氨基酸残基，对应的序列如序列表中SEQ ID NO：5、6、7、8、9所示。这些同源蛋白与MGCON3在氨基酸序列上的一致性分别为76.24、76.90、68.20、57.98和41％。MGCON3与GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3的同源性关系如附图8所示。

实施例4、野生型菌株、突变体、互补转化体与敲除体对水稻侵染能力的比较

为验证MgCON3基因在对水稻侵染能力中的作用，将野生型菌株P131、互补转化体P2KN-17、敲除体P2KNH-95与突变体H4186分别在西红柿汁燕麦片培养基上培养5天，接种丽江新团黑谷。取完全展开的第五片水稻叶片的中间部分，剪成长约5cm的片断，一部分叶片用细针划伤表面接种，其余叶片不划伤接种。用手术刀切取西红柿汁燕麦片培养基上相同大小(3mm×3mm)的新鲜菌丝块，1cm间距接种在水稻叶片上。0.025％的吐温喷于叶片表面保湿，28℃黑暗培养36小时，再见光保湿培养72小时。结果表明：野生型菌株P131和互补转化体P2KN-17在划伤和不划伤的水稻叶片上均能形成病斑；而突变体H4186和敲除体P2KNH-95仅在划伤的水稻叶片上形成病斑，在不划伤的水稻叶片上不能形成病斑。说明MgCON3基因的缺失导致稻瘟菌对水稻侵染能力明显减弱，如附图9所示。

序列表

<110>中国农业大学

<120>病原真菌控制分生孢子产生的新基因MgCON3及其用途

<160>9

<210>1

<211>4946

<212>DNA

<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)

<400>1

AATTCCACTA TACCCAGCAT GAATCAGAAT CAAGTCTGGC GAGGACTGTG GCGTCGCAGA    60

AATGAGTCGG GCAGATTTGA AATGGATGGA TCAAGCCTAC ATCAATGGCT ACTGTCTGTG    120

CGACGAATAG TTCCTGGGGT TTTAAGGGGG ATCTAGAGCG TTTGGGAAAA TCACGTCTCG    180

AGTAACGCTG ATGTGCGTCA GCTTGCAGAT AGTACATGGT GCAGGTCGCC AGTGCTTCAC    240

AGCTGACAAT CAGCGCCTTG GGAGCGAGTT CGGATTGCTG CAACTCACAT ATTGCTTACA    300

ACCATGCTTT TCTACATATG CAGTGTCTGA TGTGTTTTCG ATCAGACAAT CAACCCATCT    360

GCCAGGCACA AACCTGGAGA ACTGTCTGTA AAGTGTGGCC TGATGTCCTA GTCAGCTTCT    420

AGGGCAGTTA GGCATCTGCA ATAAAAGAAA GAGATCATGC CTATTTTGTC CTCTGATCAT    480

AGATTGGACG ACGTTAAATT GGGCCCGGCC CGTAGCCGCC AACACATACA CGGCGCCGAT    540

TCGGCCTGTC GGCAACGGTA CAGCTCGGCT GGGCTTACTC AGTTCGGGCA TCTGGGCGGC    600

GTCATGATGA ATGCCAACAG CCACCTGTCC TGTCACCTTG GAAGAAAAAA AAGTGTGAGA    660

AAACTGAGCC TTGATGGCGG TGTTTTTCTT ATGTGGCAGC GCTGCTTACA CAAGATGCAT    720

TCTTGTCTTG CCTGTGTATG TTTTGGCGCC GAGAAATGCA GGCAGCAAAT AATCAACCTT    780

CACACCCAAC CTTAGATGCA TCTTTAGATC TGGGAGTTTG TTGAGGCTCG TTTCATGACT    840

TGGCAACACA AAAAAACACA CTGGCTCACG AATCCGTGGC TTATGATAGG CCGGCTATTT    900

CGGGAATTGG GGCGGGCCTC TTGTGGTTTT GGGGGCTGCG CCCGCCGGGA CGCCCGGGGT    960

CTGTTTTGTT GCCTCGGGTC AGTCTCCATT TCTTCAGTAA TACTGCCACG ATAGGTAATT    1020

ACGAAGTACT GCATTTAACG GATTTTTTAT TCTTCGCAAT TGACAAAAGG ACTCGACACT    1080

GTATGGCACA CCATCAAGAT CCGAAGTAAT CTTCTGTCTT GTGATTACCT TAGCCCAATG    1140

CATGCGCCCG GTGGACAGAT ACAGATGTCA ACCATACTCG AGTGGGAATC GTCTATCCAA    1200

GAAATTGAAT CGGCATTGGC TTTCCGAGCT ATTAGTACGC ATAACTAAGA CTAACGGCAA    1260

AAATTGCAAC TCAGAAGAAA TGTCGTCACT GAGAACAGAT CGTCAGATGA ATACAGTACT    1320

TCACTCGAGA TCCACCAGGG GGCGTATAAG AAAAGTCGTA TAAATAAACT CTCGAGATCA    1380

AAATAACTCG TTTGCATTAA TTGTACAACT AGCATCCTGA TAACTATGGA TTGATCGACT    1440

GTGTTGCTTG TCATACTCTA TTTTCTCGAC ACCATAATAG TAATATTTCG AGCCCTGTCC    1500

AATTTGTCGG GTCCATTTTT TTCTCTTTCT TTTCTTCAGA CTGCTTCTTC GACTTTTTTT    1560

CCCCCCTTAG TTCAGCTCCA GCGGACCTCC CAGTTGCCTG CAAGGTACCA CACCACCCAC    1620

ACCTTTCGCG GGGTACAGTG TATTAAGTGA GACTGTGGGC TAATTCAGGT ATCCTACCTA    1680

TTCAGCCACA GAACCCACGG ACACTGCCGG GCTCTTGTCA GAACCCCGGT CTCCACTGGT    1740

CGTCGCGCTT ATCCACACTC CACCTGTCGA AGCTTGGGAA AAAGGACACA GTTGTTTTAT    1800

CTAAGCTTCT AGCCCCCGTG TAGGTTTGAG AGCTCCCCTC TATTGTAAAA AGCCTCTATC    1860

CCAATCTAGC TCTCCGGGAA GTCGTTTTTA GTCTTTTATT ATTTTCCATT TTCCACTGCA    1920

CTACGTTATT TCGTACATTC CTAGAGAGAA AACAACGAAA CACCACGTTG GTTTTGTTTT    1980

CGCATTCACT GATCAGACTC GACCGCCTTT TTCGATTACA ACAGAAACTT GGCCCACCGA    2040

CAGCCTCGCC GCTGCATTCC CCATAAGTTT GTCCACGCAC ACTAGCGAAG GATACGGCTC    2100

GAAATCCGCGT TACACGCAGA AGCGCTCGAC CACCTTGTAT TTTTTTGTGT GCGCTTGGCC   2160

GGCAACAAAG GACAAGCGAT ACAAATCTCC CGCTTGATAC AACAACCCGC TTGCACAAAC    2220

TCCGGGTAGA GCTAGCAACA ATGTCGCAAC GAGGACCTTC GGGCTACGGC ATACCGAATG    2280

CCCCCAACCC TTTCGGAGGC CCATCATCAC AGCCTGACGG CCAAGGCAGC GCCCTGGATG    2340

CCATCAGGGA GCAAACGAGC AAGATCGAGG ACATGTTGGA CTCGGTTTCG GAGCCCATCA    2400

AGCCGTATGT CTTTTTCTTG AATCGTGCCA CTTACGCCCG GTGATGGATC CAAGTCGCGG    2460

GAGACTAGTT TACGTGGCCG CTAACATGTT AGGGCGAAAC TGCAGATATC TTCCAGCCAT    2520

CGGCCGCTTT CTTATTGTGG TCACCTTTAT CGAGGACGCC CTGCGGATAT TGACGCAATG    2580

GAGTGATCAA GTCTACTACC TTCGTGACTA CCGTGGCTGT ATGCATACTC CTTATTTCCC    2640

TCCCGCCCAT AGACTCATGG AGAGCATCGA TTATCGCCTC GAATTGCGTG ACACGAGCTA    2700

ACATACTTTC AACGCACTTA CAGTCCCCAG GGGCTTCCCC CAGCTCTTCC TCATCATCAA    2760

CGTTGTCGCC ATGGTCGTCT GCTCAGGAAT GGTCATCACC AGGAGATTCT CAGAGTATGC    2820

CGTTGGCGGT CTCATCGCCG TGGTTATCAC CCAGGCTCTC GGCTACGGTC TTATTTTCGA    2880

TCTCAACTTC TTCTTGCGCA ACCTGTCGGT CATGGGTGGC CTGATCATGG TCTTGTCGGA    2940

CTCTTGGGTG CGCAAGACCG TCAACTTTGC CGGCCTGCCG CAGCTTGAGG AGAAGGACCG    3000

CAAGATGTAC TTCCAGCTTG CCGGCCGTGT TCTGCTCATC TTCCTCTTCA TCGGCTTTGT    3060

GTTCGCTGGC GAGTGGAGCA TCTGGAGGGT CATGGTCTCC ATCGTCGGCC TGGTTGCCTG    3120

CATCATGGTT GTTGTTGGAT TCAAGGCCAA GTTCAGCGCC ACTCTCCTAG TCGTCATCTT    3180

GAGCATCTTC AACCTCTTTG TCAACAACTT CTGGACTGTG AGTTGAAATT CCACAACGGC    3240

TTAGCCGGGC TACCCCTGCA TCGTTCATCT GCTAACACGT CATTGCCTTT CCCCAGCTTC    3300

ACGAGCACCA CCCCCACAAG GACTTTGCCA AGTACGACTT CTTCCAGATC CTCTCGATCG    3360

TCGGTGGCCT GCTTCTGCTC GTCAACAGCG GTCCTGGCCA GTTCAGCATC GACGAGAAGA    3420

AGAAGGTTTA CTAAAGAAAA AACGACGCAT CACACAATTG GGGCTGCCAG GAAGGTTGGG    3480

GGAGGTTTTG CGGAGACCTG GTTCCCCTCT ATTACCTCTT CACGAACGCG GTACGGCGGC    3540

GGCGCAGGTC TGCTGCGGCG ATGGGGCAGT GGTTCCCCTG ACTGGATATT TGCAGCAGGC    3600

GTTTGATCTT TGTTACGAGG GGCTCTACCT TTGAACATTG GGCTCATTTT AGGGGGTTAG    3660

GGGGTATTTT TTTTTAAAAA AAAGGAAAGA AAGATGATTC AAGCAGCACG GACGTCGGAT    3720

CACATGGGTG TGGTCTGAAG AGCACGGATT TGGGCTTGAC GTTGGCAAAC CGGGAGGGGA    3780

AGAAATTCTA GCCCCAAACG ATACTCTACT CTTCAGCTTT GACGTTGCAG ACTTGTGTAT    3840

AAAAATTCAA TTAAACAAAG ATGTTATGAT TCTGTTTCAA ACCCGCGTGT CAGTTGGCGC    3900

AAGTGATCAA CCTAGAGAGA AATCTTAAAA GAAGCCACAC AAGCCACCCA CTGTGGATGT    3960

GCTGTGGCGT CAGCCGAATA AAAAGATGGA CGTCACCTCG GTTCGAGCCA ATGTTGAGAC    4020

CGATCCGATG ATTAATTGAT TGGTGTTGTC ACCATTTCCA TATTCCAAAA GAAAATAACC    4080

GAAGGAAATG AGTTGATAAC TCATTACTCT TTGTTTCTTT TATTTTCCCA ACAGAGCTCA    4140

CTGGGCTGCA AGCATTACGG AGTAGTCGAC CACAATGAGG CTTTCGGGGT TGCAGAAGGA    4200

AGTCTTGTCT CTCTACCGGA GTACACTCCG CGAGATTCGA AAGAAGCCCG AGGTAAGCTT    4260

TGTTTGTAGC CAATTCCTAC ATAAAAAGGC TCCTTTTTTC GTTTTTTTTC TCTTTAAAAA    4320

GACTTAAAAA GAAAAAAAAA GGAAGAGGAA GCTAGTTACA ATGCACACGT CTGCTGGGAA    4380

TAATTTGTAA AATTGGTTCT TGTTACTAAT AGCAATGGCG AACCAAGACC AGTCGGCAAC    4440

ACTTTCGGGA CTTTGCGAGA GCAGAGTTTG ACAGGAACCT GGTCATCGAC AAGCGTGATT    4500

TTGCAGCTGT CGAATATCTT CTTCGCAAGG GCCGCCGTCA GCTTGAAACT TACTCTGCAC    4560

CTGGGATCAA AGATATTAGG CGATGAGACG ACCTAATGTT TGTTATTATG GAGGGCAACT    4620

GCCTGGTCTT TTCGGGAAGT CGGTAGAGAT ACCTTAATGT ACCGGACCGA CCTACCTGGC    4680

TTATAGAGTC CAAACACCTT GCTGGCTGAG AATCGCTCTT TCCAAACGCG GACCACATAA    4740

GGTGCCTTAT TTTACCATGG AGCTTTCCTG CCAAAATGGC ACCTTCCTCC AGTTCGACCA    4800

GGACCTGTAT ATGCGTGGAG GAGGCGCGGC AACTCAAGCC CAATTAGCAT GTTCTCTTCG    4860

GAAATTTTAA AGATTGCCTA AAAGCACCTT GGTACCTTGG GTCTGAGCCT CAAAAGGAAA    4920

TTGAAAGATG TAAACAGGTC GTGTCG                                         4946

<210>2

<211>909

<212>DNA

<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)

<400>2

ATGTCGCAAC GAGGACCTTC GGGCTACGGC ATACCGAATG CCCCCAACCC TTTCGGAGGC    60

CCATCATCAC AGCCTGACGG CCAAGGCAGC GCCCTGGATG CCATCAGGGA GCAAACGAGC    120

AAGATCGAGG ACATGTTGGA CTCGGTTTCG GAGCCCATCA AGCCATATCT TCCAGCCATC    180

GGCCGCTTTC TTATTGTGGT CACCTTTATC GAGGACGCCC TGCGGATATT GACGCAATGG    240

AGTGATCAAG TCTACTACCT TCGTGACTAC CGTGGCTTCC CCAGGGGCTT CCCCCAGCTC    300

TTCCTCATCA TCAACGTTGT CGCCATGGTC GTCTGCTCAG GAATGGTCAT CACCAGGAGA    360

TTCTCAGAGT ATGCCGTTGG CGGTCTCATC GCCGTGGTTA TCACCCAGGC TCTCGGCTAC    420

GGTCTTATTT TCGATCTCAA CTTCTTCTTG CGCAACCTGT CGGTCATGGG TGGCCTGATC    480

ATGGTCTTGT CGGACTCTTG GGTGCGCAAG ACCGTCAACT TTGCCGGCCT GCCGCAGCTT    540

GAGGAGAAGG ACCGCAAGAT GTACTTCCAG CTTGCCGGCC GTGTTCTGCT CATCTTCCTC    600

TTCATCGGCT TTGTGTTCGC TGGCGAGTGG AGCATCTGGA GGGTCATGGT CTCCATCGTC    660

GGCCTGGTTG CCTGCATCAT GGTTGTTGTT GGATTCAAGG CCAAGTTCAG CGCCACTCTC    720

CTAGTCGTCA TCTTGAGCAT CTTCAACCTC TTTGTCAACA ACTTCTGGAC TCTTCACGAG    780

CACCACCCCC ACAAGGACTT TGCCAAGTAC GACTTCTTCC AGATCCTCTC GATCGTCGGT    840

GGCCTGCTTC TGCTCGTCAA CAGCGGTCCT GGCCAGTTCA GCATCGACGA GAAGAAGAAG    900

GTTTACTAA                                                            909

<210>3

<211>302

<212>PRT

<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)

<400>3

Met Ser Gln Arg Gly Pro Ser Gly Tyr Gly Ile Pro Asn Ala Pro Asn

1               5                   10                  15

Pro Phe Gly Gly Pro Ser Ser Gln Pro Asp Gly Gln Gly Ser Ala Leu

            20                   25                 30

Asp Ala Ile Arg Glu Gln Thr Ser Lys Ile Glu Asp Met Leu Asp Ser

        35                  40                  45

Val Ser Glu Pro Ile Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Phe Leu

    50                  55                  60

Ile Val Val Thr Phe Ile Glu Asp Ala Leu Arg Ile Leu Thr Gln Trp

65                  70                  75                 80

Ser Asp Gln Val Tyr Tyr Leu Arg Asp Tyr Arg Gly Phe Pro Arg Gly

                    85              90                  95

Phe Pro Gln Leu Phe Leu Ile Ile Asn Val Val Ala Met Val Val Cys

            100                 105                 110

Ser Gly Met Val Ile Thr Arg Arg Phe Ser Glu Tyr Ala Val Gly Gly

        115                 120                 125

Leu Ile Ala Val Val Ile Thr Gln Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ile Phe

      130               135                 140

Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Met Gly Gly Leu Ile

145                 150                 155                  160

Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Thr Val Asn Phe Ala Gly

                165                 170                 175

Leu Pro Gln Leu Glu Glu Lys Asp Arg Lys Met Tyr Phe Gln Leu Ala

            180                 185                 190

Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Ile Gly Phe Val Phe Ala Gly

        195                 200                 205

Glu Trp Ser Ile Trp Arg Val Met Val Ser Ile Val Gly Leu Val Ala

    210                 215                 220

Cys Ile Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Phe Ser Ala Thr Leu

225                 230                 235                 240

Leu Val Val Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Phe Val Asn Asn Phe Trp

                245                 250                 255

Thr Leu His Glu His His Pro His Lys Asp Phe Ala Lys Tyr Asp Phe

            260                 265                 270

Phe Gln Ile Leu Ser Ile Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Ser

        275                 280                 285

Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ile Asp Glu Lys Lys Lys Val Tyr

    290                 295                 300

<210>4

<211>2240

<212>DNA

<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)

<400>4

AATTCCACTA TACCCAGCAT GAATCAGAAT CAAGTCTGGC GAGGACTGTG GCGTCGCAGA    60

AATGAGTCGG GCAGATTTGA AATGGATGGA TCAAGCCTAC ATCAATGGCT ACTGTCTGTG    120

CGACGAATAG TTCCTGGGGT TTTAAGGGGG ATCTAGAGCG TTTGGGAAAA TCACGTCTCG    180

AGTAACGCTG ATGTGCGTCA GCTTGCAGAT AGTACATGGT GCAGGTCGCC AGTGCTTCAC    240

AGCTGACAAT CAGCGCCTTG GGAGCGAGTT CGGATTGCTG CAACTCACAT ATTGCTTACA    300

ACCATGCTTT TCTACATATG CAGTGTCTGA TGTGTTTTCG ATCAGACAAT CAACCCATCT    360

GCCAGGCACA AACCTGGAGA ACTGTCTGTA AAGTGTGGCC TGATGTCCTA GTCAGCTTCT    420

AGGGCAGTTA GGCATCTGCA ATAAAAGAAA GAGATCATGC CTATTTTGTC CTCTGATCAT    480

AGATTGGACG ACGTTAAATT GGGCCCGGCC CGTAGCCGCC AACACATACA CGGCGCCGAT    540

TCGGCCTGTC GGCAACGGTA CAGCTCGGCT GGGCTTACTC AGTTCGGGCA TCTGGGCGGC    600

GTCATGATGA ATGCCAACAG CCACCTGTCC TGTCACCTTG GAAGAAAAAA AAGTGTGAGA    660

AAACTGAGCC TTGATGGCGG TGTTTTTCTT ATGTGGCAGC GCTGCTTACA CAAGATGCAT    720

TCTTGTCTTG CCTGTGTATG TTTTGGCGCC GAGAAATGCA GGCAGCAAAT AATCAACCTT    780

CACACCCAAC CTTAGATGCA TCTTTAGATC TGGGAGTTTG TTGAGGCTCG TTTCATGACT    840

TGGCAACACA AAAAAACACA CTGGCTCACG AATCCGTGGC TTATGATAGG CCGGCTATTT    900

CGGGAATTGG GGCGGGCCTC TTGTGGTTTT GGGGGCTGCG CCCGCCGGGA CGCCCGGGGT    960

CTGTTTTGTT GCCTCGGGTC AGTCTCCATT TCTTCAGTAA TACTGCCACG ATAGGTAATT    1020

ACGAAGTACT GCATTTAACG GATTTTTTAT TCTTCGCAAT TGACAAAAGG ACTCGACACT    1080

GTATGGCACA CCATCAAGAT CCGAAGTAAT CTTCTGTCTT GTGATTACCT TAGCCCAATG    1140

CATGCGCCCG GTGGACAGAT ACAGATGTCA ACCATACTCG AGTGGGAATC GTCTATCCAA    1200

GAAATTGAAT CGGCATTGGC TTTCCGAGCT ATTAGTACGC ATAACTAAGA CTAACGGCAA    1260

AAATTGCAAC TCAGAAGAAA TGTCGTCACT GAGAACAGAT CGTCAGATGA ATACAGTACT    1320

TCACTCGAGA TCCACCAGGG GGCGTATAAG AAAAGTCGTA TAAATAAACT CTCGAGATCA    1380

AAATAACTCG TTTGCATTAA TTGTACAACT AGCATCCTGA TAACTATGGA TTGATCGACT    1440

GTGTTGCTTG TCATACTCTA TTTTCTCGAC ACCATAATAG TAATATTTCG AGCCCTGTCC    1500

AATTTGTCGG GTCCATTTTT TTCTCTTTCT TTTCTTCAGA CTGCTTCTTC GACTTTTTTT    1560

CCCCCCTTAG TTCAGCTCCA GCGGACCTCC CAGTTGCCTG CAAGGTACCA CACCACCCAC    1620

ACCTTTCGCG GGGTACAGTG TATTAAGTGA GACTGTGGGC TAATTCAGGT ATCCTACCTA    1680

TTCAGCCACA GAACCCACGG ACACTGCCGG GCTCTTGTCA GAACCCCGGT CTCCACTGGT    1740

CGTCGCGCTT ATCCACACTC CACCTGTCGA AGCTTGGGAA AAAGGACACA GTTGTTTTAT    1800

CTAAGCTTCT AGCCCCCGTG TAGGTTTGAG AGCTCCCCTC TATTGTAAAA AGCCTCTATC    1860

CCAATCTAGC TCTCCGGGAA GTCGTTTTTA GTCTTTTATT ATTTTCCATT TTCCACTGCA    1920

CTACGTTATT TCGTACATTC CTAGAGAGAA AACAACGAAA CACCACGTTG GTTTTGTTTT    1980

CGCATTCACT GATCAGACTC GACCGCCTTT TTCGATTACA ACAGAAACTT GGCCCACCGA    2040

CAGCCTCGCC GCTGCATTCC CCATAAGTTT GTCCACGCAC ACTAGCGAAG GATACGGCTC    2100

GAATCCGCGT TACACGCAGA AGCGCTCGAC CACCTTGTAT TTTTTTGTGT GCGCTTGGCC    2160

GGCAACAAAG GACAAGCGAT ACAAATCTCC CGCTTGATAC AACAACCCGC TTGCACAAAC    2220

TCCGGGTAGA GCTAGCAACA                                                2240

<210>5

<211>302

<212>PRT

<213>小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)

<400>5

Met Ser Asn Arg Phe Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Pro Ala Pro

1               5                   10                  15

Tyr Gly Gly Ser Gln Ala Ala Glu Pro Gln Gln Gly Glu Gly Phe Leu

            20                  25                  30

Glu Gln Ile Arg Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Glu Asp Ala Leu Asp Thr

        35                  40                  45

Ile Ser Glu Pro Val Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Phe Leu

    50                  55                  60

Ile Val Val Thr Phe Phe Glu Asp Ala Leu Arg Ile Val Thr Gln Trp

65                  70                  75                  80

Ser Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Lys Asp Tyr Arg His Ile Pro Ser Gly

                85                  90                  95

Ile Thr His Leu Phe Leu Leu Val Asn Ile Ile Ala Met Phe Ser Cys

            100                 105                 110

Ser Thr Leu Val Ile Ile Arg Lys His Ser Asp Tyr Ala Val Ala Gly

        115                 120                 125

Leu Met Gly Val Val Val Thr Gln Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ile Phe

    130                 135                 140

Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Ile Gly Gly Leu Val

145                 150                 155                 160

Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Thr Gln Val Phe Ala Gly

                165                 170                 175

Leu Pro Gln Ile Asp Glu Lys Asp Arg Lys Met Tyr Phe Gln Leu Ala

            180                 185                 190

Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Ile Gly Phe Val Phe Ser Gly

        195                 200                 205

Glu Trp Ser Leu Trp Arg Val Ile Val Ser Ser Leu Gly Gly Ile Ser

    210                 215                 220

Cys Val Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Tyr Ser Ala Thr Leu

225                 230                 235                 240

Leu Val Val Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Asn Phe Trp

                245                 250                 255

Thr Leu His Glu His His Pro His Lys Asp Phe Ala Lys Tyr Asp Phe

            260                 265                 270

Phe Gln Ile Leu Ser Ile Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Ser

        275                 280             285

Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ile Asp Glu Lys Lys Lys Val Tyr

    290                 295                 300

<210>6

<211>302

<212>PRT

<213>棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)

<400>6

Met Ser Gln Arg Phe Asn Ser Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Pro Ala Pro

1               5                   10                  15

Tyr Gly Gly Ser Gln Ala Ala Asp Pro Gln Gln Gly Glu Gly Phe Leu

            20                  25                  30

Glu Gln Ile Arg Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Glu Asp Ala Leu Asp Thr

        35                  40                  45

Ile Ser Glu Pro Ile Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Phe Leu

    50                  55                  60

Ile Val Val Thr Phe Phe Glu Asp Ala Leu Arg Ile Val Thr Gln Trp

65              70                      75                  80

Ser Asp Gln Leu Leu Tyr Leu Lys Asp Tyr Arg His Ile Pro Ser Gly

                85                  90                  95

Ile Thr His Leu Phe Leu Leu Val Asn Ile Ile Ala Met Phe Ser Cys

            100                 105                 110

Ser Thr Leu Val Ile Ile Arg Lys His Ser Asp Tyr Ala Val Ala Gly

        115                 120                 125

Leu Met Gly Val Val Val Thr Gln Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Ile Phe

    130                 135                 140

Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Ile Gly Gly Leu Val

145                 150                 155                 160

Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Thr Gln Val Phe Ala Gly

                165                 170                 175

Leu Pro Gln Ile Asp Glu Lys Asp Arg Lys Met Tyr Phe Gln Leu Ala

            180                 185                 190

Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Ile Gly Phe Val Phe Ser Gly

        195                 200                 205

Glu Trp Ser Leu Trp Arg Val Ile Val Ser Ser Leu Gly Gly Ile Ser

    210                 215                 220

Cys Val Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Tyr Ser Ala Thr Leu

225                 230                 235                 240

Leu Val Val Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Leu Val Asn Asn Phe Trp

                245                 250                 255

Thr Leu His Glu His His Pro His Lys Asp Phe Ala Lys Tyr Asp Phe

            260                 265                 270

 Phe Gln Ile Leu Ser Ile Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Ser

        275                 280                 285

Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ile Asp Glu Lys Lys Lys Val Tyr

    290                 295                 300

<210>7

<211>294

<212>PRT

<213>小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)

<400>7

Met Ala Gln Ile Arg Gly Thr Ala Gly Tyr His Leu Gly Asn Gln Ser

1               5                   10                  15

Pro Phe Gly Asn Ala Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Asn Asp Pro Ser

            20                  25                  30

Pro Leu Asp Gln Leu Arg Ala Gln Thr Ser Lys Ile Glu Asp Met Leu

        35                  40                  45

Asp Thr Leu Ser Asp Pro Ile Lys Pro Tyr Leu Pro Ala Ile Gly Arg

    50                  55                  60

Phe Leu Ile Val Val Thr Phe Leu Glu Asp Ala Leu Arg Ile Ile Thr

65                  70                  75                  80

Gln Trp Arg Asp Gln Leu Thr Tyr Leu His Asp Tyr Arg His Ile Trp

                85                  90                  95

Asn Gly Val Thr His Leu Phe Leu Ile Val Asn Val Ile Val Met Thr

            100                 105                 110

Gly Ala Ser Ile Met Val Ile Ala Arg Lys His Ser Glu Tyr Ala Val

        115                 120                 125

Ala Gly Leu Met Gly Val Val Val Leu Gln Gly Ile Gly Tyr Gly Leu

    130                 135                 140

Val Phe Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu Ser Val Met Gly Gly

145                 150                 155                 160

Leu Leu Met Val Leu Ser Asp Ser Trp Val Arg Lys Lys Phe Ala Pro

                165                 170                 175

Ala Gly Leu Pro Thr Leu Asp Glu Lys Asp Lys Lys Met Tyr Phe Gln

            180                 185                 190

Leu Ala Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe Val Gly Phe Val Phe

        195                 200                 205

Arg Gly Glu Trp Gly Phe Trp Arg Ile Val Ala Ser Leu Leu Gly Leu

    210                 215                 220

Val Ala Cys Ile Met Val Val Val Gly Phe Lys Ala Lys Phe Ser Ala

225                 230                 235                 240

Ile Met Leu Val Leu Ile Leu Ser Ile Phe Asn Leu Tyr Val Asn Asn

                245                 250                 255

Phe Trp Lys Leu His Pro His His Pro His Lys Asp Phe Ala Asn Gly

            260                 265                 270

Gly Leu Leu Leu Leu Val Asn Met Gly Pro Gly Gln Phe Ser Val Asp

        275                 280                 285

Glu Lys Lys Lys Val Tyr

    290

<210>8

<211>325

<212>PRT

<213>玉米黑粉病病(Ustilago maydis)

<400>8

Met Ala Ala Arg Leu Gly Phe Asn Thr His Asp Ser Ser Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Thr Ala Cys Phe Ala Arg Ser Asn Cys Ile Ala Ala Ser Gly Tyr Ser

            20                  25                  30

Thr Met Ala Ser Tyr Gly Ala Ser Pro Tyr Ala Ser Thr Ser Thr Ser

        35                  40                  45

Ser His Ala Glu Ser Pro Leu Asp Lys Val Arg Glu Tyr Thr Ser Lys

    50                  55                  60

Val Glu Asp Leu Ile Asp Gln Tyr Thr Gln Pro Ile Lys Pro His Leu

65                  70                  75                  80

Pro Ala Leu Gly Arg Phe Leu Ile Val Val Thr Phe Leu Glu Asp Ala

                85                  90                  95

Leu Arg Ile Met Thr Gln Trp Ser Asp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gln Arg

            100                 105                 110

His Arg Gly Phe Pro Trp Gly Ile Ser His Ile Phe Leu Leu Ala Asn

        115                 120                 125

Val Val Val Met Cys Ala Gly Ser Ala Ala Val Ile Leu Arg Lys Tyr

    130                 135                 140

Pro Glu Ile Ser Val Gly Ala Leu Phe Gly Val Val Val Val Gln Gly

145                 150                 155                 160

Phe Gly Tyr Gly Leu Ile Phe Asp Leu Asn Phe Phe Leu Arg Asn Leu

                165                 170                 175

Ser Val Val Gly Gly Leu Leu Met Val Leu Ser Asp Ser Phe Ala Ala

                180             185                 190

Lys Lys Asn Ile Phe Ala Gly Leu Pro Ser Leu Ser Glu Thr Asp Arg

        195                 200                 205

Lys Ile Tyr Phe Gln Leu Ala Gly Arg Val Leu Leu Ile Phe Leu Phe

    210                 215                 220

Ile Gly Phe Ile Ile Gln Gly Glu Trp Ser Val Ala Arg Val Leu Val

225                 230                 235                 240

Ser Val Leu Gly Leu Gly Ala Cys Val Met Val Val Val Gly Phe Lys

                245                 250                 255

Ala Arg Trp Ser Ala Ser Phe Leu Val Leu Ile Leu Ser Val Phe Asn

            260                 265                 270

Val Phe Val Asn Asn Phe Trp Thr Val His Ser Ala His Pro Ser Arg

        275                 280                 285

Asp Phe Leu Arg Tyr Asp Phe Phe Gln Thr Leu Ser Ile Val Gly Gly

    290                 295                 300

Leu Leu Leu Leu Val Asn Met Gly Pro Gly Gly Leu Ser Val Asp Glu

305                 310                 315                 320

Arg Lys Lys Val Thr

                325

<210>9

<211>306

<212>PRT

<213>棉病囊菌(Ashbya gossypii)

<400>9

Met Ser Tyr Arg Gly His Asn Tyr Asn Ala Met Ala Pro Gly Gly Gln

1               5                   10                  15

Thr Phe Ser Asn Ser Pro Tyr Thr Ser Asn Met Gly Ser Thr Gly Ala

            20                  25                  30

Arg Gly Arg Ser Ser Glu Leu Phe Gln Lys Phe Glu Arg Phe Ala Lys

        35                  40                  45

Arg Ile Glu Asp Val Thr Asp His Pro Leu Val Gln Arg Phe Val Pro

    50                  55                  60

Tyr Thr Pro Leu Ile Ala Arg Phe Phe Ile Val Ala Thr Phe Tyr Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ser Ile Arg Ile Leu Ser Gln Trp Pro Glu Gln Val Ser Phe Leu

                85                  90                  95

Ser Tyr Tyr Arg Arg Tyr Pro Arg Val Phe Val Val Leu Phe Leu Met

            100                 105                 110

Val Val Ala Val Leu Met Met Val Gly Ala Thr Met Ile Leu Leu Arg

        115                 120                 125

Lys Gln Gln Leu Tyr Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ala Cys Ile Ile Ser

    130                 135                 140

Gln Gly Phe Val Tyr Gly Leu Phe Ser Gly Thr Ser Phe Val Leu Arg

145                 150                 155                 1G0

Asn Phe Ser Val Ile Gly Gly Leu Leu Ile Thr Phe Gly Asp Ser Ile

                165                 170                 175

Val Gln Lys Arg Ile Thr Phe Gly Met Leu Pro Glu Leu Thr Ser Arg

            180                 185                 190

Asp Gly Arg Thr Lys Gly Tyr Ile Leu Leu Ala Gly Arg Ile Leu Ile

        195                 200                 205

Val Leu Met Phe Val Thr Phe Thr Phe Gly Lys Ser Trp Leu Thr Val

    210                 215                 220

Phe Leu Thr Ile Ala Gly Thr Val Cys Ile Ala Val Gly Tyr Lys Thr

225                 230                 235                 240

Lys Phe Ala Ser Ile Ile Leu Cys Leu Ile Leu Thr Phe Tyr Asn Val

                245                 250                 255

Thr Leu Asn Asn Tyr Trp Leu Tyr Gly Tyr Ala Lys Arg Asp Phe Leu

            260                 265                 270

Lys Tyr Glu Phe Tyr Gln Asn Leu Asn Ile Ile Gly Gly Leu Leu Leu

        275                 280                 285

Val Leu Asn Thr Gly Ala Gly Thr Ile Ser Phe Asp Glu Lys Lys Lys

    290                 295                 300

Ile Tyr

305

Claims (10)

1、真菌中一种控制分生孢子产生的蛋白，该蛋白在梨孢菌中为MGCON3。MGCON3是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且为真菌影响分生孢子产生的蛋白质。

2、根据权利要求1，在其它病原真菌小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)中、与序列表中的SEQ ID №：3具有一致性高于40％的的同源蛋白质，分别命名为GZCON3、GMCON3、PNCON3、UMCON3和AGCON3，其特征为分别具有如序列表中SEQ ID №：5，6，7，8，9所示的氨基酸序列。

3、权利要求2所述的梨孢菌影响分生孢子产生的蛋白MGCON3的编码基因MgCON3，其特征在于具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列或与其一致性高于40％的蛋白质的多核苷酸。

4、根据权利要求3所述梨孢菌影响分生孢子产生的蛋白的编码基因，其特征在于：编码区位于序列表中的SEQ ID №：1的5′端第2241位至3434位碱基之间。

5、根据权利要求3所述梨孢菌影响分生孢子产生的蛋白的编码基因的eDNA，其特征在于：可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码蛋白质的序列为自序列2的5′端第1位至909位碱基；

3)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

6、利用权利要求1所述的梨孢菌分生孢子产生所必需蛋白的编码基因构建的表达载体及其转化所获得的细胞系和宿主菌。

7、梨孢菌影响分生孢子产生的蛋白MGCON3的编码基因的启动子，具有序列表中的SEQ ID №：4的5′端第1位至2240位碱基的核苷酸序列。

8、权利要求1所述的梨孢菌影响分生孢子产生的蛋白MGCON3的表达、或修饰、或剪切作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。

9、权利要求8所述的基因启动子及其结合蛋白作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。

10、根据权利要求8、9所述的抗真菌药物包括抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)及小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、棉花枯萎病菌(Gibberella moniliformis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、玉米黑粉病(Ustilago maydis)、棉病囊菌(Ashbya gossypii)的药物。

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