CN101007256B - 反应器 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种反应器，包括至少一个反应罐，所述反应罐包括罐体以及安装于罐体内可转动的转轴，所述转轴上固定有固相催化剂，所述固相催化剂具有可通透反应液和气体的孔，该固相催化剂在随着转轴转动时还充当搅拌器的作用。本发明提供的反应器能够防止催化剂活力降低、延长催化剂的寿命，并具有交换效率高、反应充分以及应用范围广的特点。

Description

反应器

技术领域

本发明涉及一种反应器，特别涉及一种使用固相催化剂促进反应的反应器。

背景技术

在医药工业、食品工业、环保、农业、轻纺工业、化学工业等领域，往往借助于反应器来进行各种反应，其中所述的各种反应大都需要催化剂进行反应。对于在液态介质中进行的反应，为了提高反应效率，反应物和催化剂必须进行有效的接触。催化剂为固体时尤为如此。

在生物、医药工业、食品工业、环保、农业等领域中，酶或含酶的细胞是众多催化剂中比较引人注目的一类催化剂。而且，目前酶或含酶的细胞等多以固定化的形式使用，这是因为固定化酶/固定化细胞通常比溶液酶稳定且可从产品中分离回收、重复使用(生物催化工艺学，孙志浩主编，化学工业出版社，北京，2005年)，从而其成本可大幅降低。但大多数包括固定化酶和/或固定化细胞的固相催化剂的催化活力则较相应的溶液酶低。

目前，使用固相催化剂的反应器主要有两种：即填充床反应器和搅拌式反应器。一般而言，填充床反应器操作较为简单，其工作方式是：预先将颗粒状或片状固相催化剂填充到填充床反应器中，反应时底物溶液流经填充床而使得固相催化剂与底物混合以使反应物和催化剂进行有效接触。搅拌式反应器含有反应罐，该反应罐包括罐体、罐体内的转轴和诸如搅拌桨等搅拌器。该搅拌式反应器的工作方式是：先将颗粒状或块状的固相催化剂悬浮在反应罐内的底物溶液中，然后在反应时通过搅拌器进行搅拌或借助于气泡流动而使固相催化剂与底物充分混合以使反应物和催化剂进行有效接触。

尽管上述两种反应器均能实现固相催化剂与底物的混合而使反应物和催化剂进行有效接触，但在实际应用中不可避免地存在下述问题：

就填充床反应器而言，其存在的问题是：[1]底物与固相催化剂之间的交换效率较低；[2]反应过程不易补料和通气体，也不易调节pH值及温度等；[3]不适于粘性或不溶性底物；[4]使用颗粒较小的固相催化剂时，床层压降大，这导致容易出现阻塞。

就搅拌式反应器而言，尽管其可根据需要来调节各种反应条件，但是在搅拌器进行搅拌的过程中，由于固相催化剂悬浮在反应罐内的底物溶液中，因此在固相催化剂颗粒之间、固相催化剂颗粒与搅拌器之间以及固相催化剂颗粒与反应罐罐壁之间均会发生强烈碰撞(酶学，陈石根和周润琦编，复旦大学出版社，上海，2001年；生物反应工程，戚以政和夏杰编着，化学工业出版社，北京，2004年)，因而导致固相催化剂颗粒因碰撞而碎裂和磨损，从而使得固相催化剂活力下降、使用寿命变短，并且固相催化剂因碎裂和磨损会产生碎片或粉渣，而这些碎片或粉渣随反应的进行会流失，这会妨碍反应液的后续处理，如产品的过滤和纯化等。而且，众所周知，悬浮在溶液中的固相催化剂颗粒的密度越大、运动(转速)越快，反应的效率就越高；但与此同时，颗粒受碰撞的强度也随之增大，固相催化剂也就越容易碎裂，其活力的下降也越快。因而，搅拌式反应器的应用范围受到局限，尤为不适用于本身就易碎的固相催化剂颗粒。

发明内容

为克服现有反应器存在的上述缺陷，本发明提供了这样一种反应器：其能够防止催化剂活力降低、延长催化剂的寿命，并具有交换效率高、反应充分以及应用范围广的特点。

本发明提供的技术方案为：提供一种反应器，其包括至少一个反应罐，所述反应罐包括罐体以及可转动地安装于罐体内的转轴，所述转轴上固定有固相催化剂，所述固相催化剂具有可通透反应液和气体的孔，该固相催化剂在随着转轴转动时还充当搅拌器的作用。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述固相催化剂为柱体形式，该柱体可由整个的片材卷绕而成，该柱体也可是中空的柱体，例如一种在其轴线附近设有用于安装转轴的空腔的柱体。该中空柱体套在所述的转轴上。

可以采用捆绑方式将所述固相催化剂直接固定到所述的转轴。根据反应的需要，所述固相催化剂的体积与反应罐的体积之比在1％至95％之间。该体积之比因不同的催化反应和需要而定。一般而言，该体积之比越高，反应进行得越快，故适用于不稳定或易降解的底物和/或产物。但该体积之比过高则会导致催化効率下降；另一方面，该体积之比过小(如少于5％)则降低搅拌効率，从而影响反应速率。

所述转轴具有与罐体内外相通的用于输送液体和/或气体的孔道。所述反应罐可以以直立式或卧式或其它方式安置。

在本发明的一个更为具体的实施方案中，所述固相催化剂是固定化酶/固定化细胞。优选的是，所述固定化酶或细胞由酶或表达酶的细胞与作为固定化载体的开孔的多孔有机泡沫材料制成的，所述有机泡沫材料包括木浆海绵、聚乙烯醇海绵或三聚氰胺海绵。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

第一，本发明的反应器无需使用单独的搅拌器，在使用固相催化剂的反应器中，由于整块/整片的固相催化剂具有离心搅拌功能，所谓离心搅拌是在离心作用下使反应液和气体与固相催化剂接触，就此而言，其效果类似于搅拌桨等搅拌器的搅拌动作所产生的效果，因此本发明提供的反应器无需采用搅拌器。

第二，由于本发明提供的反应器中不存在固相催化剂彼此之间、固相催化剂与搅拌器之间以及固相催化剂与反应罐罐壁之间的碰撞，因而，可以避免固相催化剂因碰撞而碎裂和磨损，从而可以避免固相催化剂因碎裂和磨损而导致酶的活力下降和其寿命降低的问题。

第三，本发明反应器还可以避免固相催化剂因碎裂和磨损而产生碎片或粉渣，这样也就不会因存在碎片或粉渣而影响反应液的后续处理。

第四，本发明的反应器的应用范围广泛。根据不同的应用场合，本发明的反应器以及其中整块/整片的固相催化剂可以采取各种式样，其外形可以是例如圆筒状、球状、棱柱状、方块状等规则形状，也可以是螺旋状、阶梯状等不规则形状。

第五，在使用整块/整片的固相催化剂的反应器中，由于本发明采用整块/整片的固相催化剂，反应罐内固相催化剂的密度可远远超过现有的搅拌式反应器，达到罐体总容量的95％或以上，反应速度可因之提高，反应时间则相应缩短。这对容易降解的底物或产物尤为有利。而且，高密度的固相催化剂用量更可提高反应时底物的浓度，进而加快反应速度，有助于产物的纯化、结晶等以及提高产率。

第六，在整块/整片的固相催化剂随转轴旋转时，进入整块/整片的固相催化剂内的反应液在离心作用下贯穿整块/整片的固相催化剂并被甩出，而被甩出的反应液则循负压再度流经整块/整片的固相催化剂，如此形成循环回流，从而提高了交换效率。而且，离心作用的旋转使得反应液与固相催化剂表面之间的传质加快，因此相对于填充床反应器，本发明提供的反应器的反应催化效率大大提升。另外，由于反应器中整块/整片的固相催化剂具有孔，因而使反应液可以直接经由该孔贯穿整块/整片的固相催化剂而与催化剂充分接触，进而也提高了交换效率。

第七，本发明的反应器便于反应过程中的补料、通气、pH调节及温度调节等操作，从而克服了填充床反应器在此方面的缺陷及应用障碍。

附图说明

下面结合附图、具体实施方式以及应用实例对本发明进行详细说明。

图1是本发明的反应器的一种结构的示意图；

图2是本发明的反应器的另一种结构的示意图，以及

图3是图1所示反应器的一个具体实施方式的结构示意图。

图4是表达D-氨基酸氧化酶的载体pHS-GHA的核苷酸序列。

具体实施方式

请参阅图1，本发明的反应器包括至少一个反应罐，该反应罐包括罐体51、转轴21和固相催化剂20。该固相催化剂20指的是整块/整片的固相催化剂。转轴21安装于罐体51内，其在电机或其它传动装置(未图标)的带动下以一定的转速转动。固相催化剂20具有能够通透反应液、通透气体的孔。如图所示，固相催化剂20的中央位置处开设有通孔，用以将转轴21穿插在此通孔内(如必要还可以借助于固定装置(未图标))，将固相催化剂20固定在转轴21上。

使用本发明的反应器时，罐体51中装有反应液等，反应液可通过孔进出固相催化剂20。当固定到转轴21上的固相催化剂20与转轴21一同旋转时，进入固相催化剂20的反应液在离心作用下沿离心方向贯穿整块/整片固相催化剂，从而使反应液和气体与固相催化剂20充分接触，该方式的作用结果类似于搅拌桨等搅拌器的作用结果，因此，也可以将固相催化剂20视为搅拌桨或转子。

下面具体说明各个组成部分。

罐体51一般用不锈钢材料制成，当然也可用其它材料制成，其外形与罐内转轴21和固相催化剂20的块数或片数以及排列有关，例如，当罐内只有一根转轴21时，罐体51的外形可为圆柱形且两端呈圆弧状；当罐内有多根转轴21时，罐体51的外形可为扁的柱形、波浪柱形或其它形状。并且，罐体51具有一个或多个输液管口以及可拆卸的罐盖和/或罐底。安装完成的反应罐可为直立式(即，转轴21垂直于罐底)，也可为卧式(即，转轴21平行于罐底)，当然也可为倾斜形式等其它形式。至于本发明的反应器中的罐体51的加热、保温以及温度、pH、气体等的探测与调节方式，可以与现有的反应器相同。

转轴21可以具有与罐体51内外相通的纵向孔道，因而兼具输液功能。转轴21纵穿罐体51，其一端与电机或其它传动装置连接，另一端连接罐外的输液管道。转轴21的支点位于罐体51两端罐壁上，当罐内仅有一根转轴21时，其支点位置优选地位于两端罐壁的中央位置处；当罐内有多根转轴21时，根据实际需要确定转轴21的支点位置。转轴21与罐壁的交联处装有轴承和防止漏液的装置(如油封)。

在实际应用中，转轴21的转速可在很宽的范围选择，例如为20～20,000rpm，优选的为50～10,000rpm，更为优选的为200～2,000rpm。

固相催化剂20与整个反应罐的体积之比可达95％或更高。其外形可以为通常的规则形状，例如圆柱状、球状、棱柱状、方块状等，也可以为不规则形状，例如螺旋状、阶梯状等各种形状。当为柱体形状时，其可以是整个的实心柱体形式，也可以是由片材卷绕而成的柱体，或者是中空的柱体形式。为加强固相催化剂20的结构强度，可在其外周设置一个或多个紧固环。为加强固相催化剂20的结构强度，可在其外周设置一个或多个紧固环。

至于固定装置，例如可以是带螺栓的钢环，将钢环套在固相催化剂20的外周，拧紧螺栓来实现固定；或者可以是绳索等，用其捆绑固相催化剂20的外周而将固相催化剂20固定到转轴21上。当然，也可以采用其它固定装置或者其它固定方式将固相催化剂20固定到转轴21上，例如：在固相催化剂20和转轴21之间添加物质，使得固相催化剂20借助于添加的物质而紧紧挤压转轴21，由此产生摩擦力来将固相催化剂20与转轴21紧紧固定在一起。

需要指出的是，在本发明的反应器的一个反应罐内，可根据需要配置一块/片固相催化剂20或多块/片固相催化剂20。多块/片固相催化剂20可串联在同一根转轴21上，也可并联在不同的转轴21上，并且多块/片串联的固相催化剂20可并列安装于同一反应罐内。而且，在本发明的反应器中，可以具有多个反应罐。根据实际需要，这些反应罐可以相互串联或并联，并且，其中一部分反应罐并不仅仅局限于用作反应罐，也可用于其它用途，例如用作预热罐等。

下面以包括固定化酶/固定化细胞的固相催化剂为例对本发明的反应器做进一步的说明。

使用时，首先将预先制备的整块/整片的固相催化剂20固定在反应罐内的转轴21上，该固相催化剂20具有可通透反应液和通透气体的孔。将固相催化剂20装入反应罐后，关闭罐盖，向罐体51内注入适当温度和体积的反应液，之后启动电机或其它传动装置以带动转轴21离心旋转，这样，当固相催化剂20随转轴21旋转时，进入固相催化剂20内的反应液在离心作用下沿离心方向贯穿整块/整片固相催化剂20，从而使反应液和气体与固相催化剂20充分接触。逐步调整转速至最佳反应效率，一般而言，转速越快，上述回流越快，底物与酶分子接触越频繁，而底物/产物与酶分子等的交换也就越快，反应速度也随之加快。

上述反应可批量、半批量半连续或连续进行。所谓批量反应，指的是反应完成后排放全部反应液，然后注入新的底物溶液进行下一轮反应；所谓半批量半连续，指的是在反应过程中底物连续或批量加入、而产物批量或一次性排出；所谓连续反应，指的是反应进行过程中反应液不断地输入罐内，罐内液体也以同样的流速连续输出，反应持续进行。在实际使用中，也可将多个反应罐串联起来进行连续反应.以提高总体反应效率。当有气体参与反应时，反应罐处设有专门的气体排出装置，并可借此调节罐内气体的压力。

例如，上述整块/整片固相催化剂20可以这样制成：即，采用开孔、多孔有机泡沫材料如木浆海绵、聚乙烯醇海绵和三聚氰胺海绵等作为固定化载体，先将开孔的多孔有机泡沫材料预制成片带状、蜂窝块状或其它整体结构的载体，再用多元醛及蛋白质凝絮剂将酶或细胞凝絮交联于载体的三维网壁上，从而得到整块/整片固相催化剂20。当然，在实际应用中也可以使用类似的方法来制造其它的固相催化剂。

请参阅图2，图中所示结构类似于图1中的结构，其中各个部分的结构、功能、以及彼此之间的连接作用关系类似于图1所示反应器，对此不再重复说明，并且与图1相同的部分采用相同的参考标号。

可以看出，图1和图2所示结构的不同之处仅在于：图1中，固相催化剂20固定在转轴21的两侧或将转轴21包围在其中；图2中，固相催化剂20仅固定在转轴21的侧面。除了在固相催化剂20和转轴21之间添加物质并通过固相催化剂20与转轴21挤压而产生的摩擦力将固相催化剂20与转轴21紧紧固定在一起这种方式之外，固相催化剂20和转轴21之间的固定方式可以采用如前所述的各种固定装置和固定方式。

可以理解，在图2所示的反应器的一个反应罐内，也可根据需要配置一个固相催化剂20或多个固相催化剂20。多个固相催化剂20可串联或并联在同一根转轴21上，也可并联在不同的转轴21上，并且多个串联的固相催化剂20可并列安装于同一反应罐内。

请参阅图3，通过一个具体实施方式对本发明的反应器的结构作进一步的说明。

在本实施方式中，反应器包括一个反应罐。该反应罐的罐体51由不锈钢材料制成，形状为圆筒形，其内径为11cm，内高为6.4cm；罐壁为双层结构，两层罐壁之间为循环水信道1，罐壁的外层开设有与该信道1相连的循环水输入口2和循环水输出口3，输入口2和输出口3连接恒温水浴。

罐体51底部开设有四个孔，分别通向放料口40、取样口5、输液口6及通气口7。其中，放料口40处设置有放料阀4；通气口7由外向内通向嵌于罐底内表的环形管道8。该环形管道8上有众多的细孔通向罐内。在罐体51底部的中央位置处设置有与转轴21相匹配的油封9和下轴承10。

罐体51顶部为圆形罐盖11，罐盖11的中央隆起形成隆起顶部12。隆起顶部12的内表面设置有连接转轴21的上轴承13。罐盖11上开设有三个小孔，分别通向排液口14、补液口15及排气口16。排气口16位于隆起顶部12的中央位置处。罐盖11上另有两孔，分别用于安装pH和温度探测电极17以及进料口螺旋盖18。罐盖11经四个螺丝19与罐口吻合固定，罐口与罐盖11的吻合面有一环形橡胶密封圈(未图标)。

罐内有固相催化剂20和转轴21。转轴21直径约为2cm。在固相催化剂20的中央位置处插入转轴21，然后使用固定装置将固相催化剂20固定到转轴21上。转轴21内有纵向孔道22，此孔道22的顶部、上端23及中下端24分别通向排气口16、罐盖11隆起的内腔及固相催化剂20的孔。

调速直流电机(例如，DC直流电机，200瓦，VEM MOTORS CO.，LTD.HK)位于罐体51底部中央，电机轴经活动关节与罐内转轴21连接。

需要指出的是，本实施方式的反应器可以利用本发明的基本原理对现行常规的搅拌式反应器进行改造而获得。同现行常规的搅拌式反应器相比，本实施方式中的固相催化剂既是催化剂，又是具离心搅拌功能的搅拌器(转子)；固相催化剂搅拌产生的离心力和负压进而强化其所具有催化作用。并且，在现行的搅拌式反应器中的催化反应中，固相催化剂与底物(反应液)的旋转方向和速度基本相同；而本发明的反应器中，反应液与固相催化剂的旋转方向和速度不同，并且固相催化剂搅拌产生的离心力和负压形成有利于底物传质和产物传质的回流。此外，由于反应是不断循环的混匀体系，易施行补料、通气、温度调节、pH调节等操作。

下面，通过应用实例来对本发明反应器的原理、结构、用途和有益效果作更为详尽的说明。

实例1.整块开孔D-氨基酸氧化酶固定化酶直接作为搅拌桨批量搅拌反应制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)

首先按照下述方法制备蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块。

D-氨基酸氧化酶将头孢菌素C转化成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)。按下列方法制备BL-HS-GHA[含有重组D-氨基酸氧化酶GHA的E.coli BL21(DE3)pLysS]大肠杆菌菌体。

BL-HS-GHA的来源：

根据已知的Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699)，设计PCR引物，具体为：

上游引物GI-NdeI：

5’-AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGA

下游引物GI-EcoRI：

5’-ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC

以Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC，USA)DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,376bp产物。PCR条件为：50ng T.saccharolyticum DNA，0.4μM GI-NdeI，0.4μMGI-EcoRI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH为8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mMMgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Platinum Taq High Fidelity DNA聚合酶(Invitrogen)，用无菌水将反应体积调至50μL。PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，利用TA克隆方法，与pGEMT-Easy(Promega)连接，得pGEMT-Easy-GI。用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得pRSET-lac-GI-kan。根据已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)设计10条引物(见表1)。PCR基因构造根据Kikuchi，M.et al.，1999，Gene236：159-167所述，惟具体步骤有变更。PCR条件为：20ng各个引物，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mMTris-HCl(pH为8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水将反应体积调至50μL。PCR扩增反应程序为：95℃，4分钟；94℃，1.5分钟，50℃，1.5分钟，72℃，5分钟，循环30次；72℃，10分钟。取PCR扩增反应混合物5μL作模板，引物1和10，依上述条件再次PCR扩增，得PCR产物长为580bp，在其5’和3’端分别含有AscI及EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，AscI及EcoRI酶切后，与经AscI及EcoRI酶切的pRSET-lac-GI-kan连接，得pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。

表1

序号	引物序列
		1	5’-ttggcgcgccttaagatatcaacaaactccgggaggcagcgtgatgcggcaacaatcacacggatttcccgtgaa-3’
2	5’-catatacctgcacgctgaccacactcactttccctgaaaataatccgctcattcagaccgttcacgggaaatccgtgtga-3’
		3	5’-ggtcagcgtgcaggtatatgggctatgatgtgcccggcgcttgaggctttctgcctcatgacgtgaaggtggtttgttgc-3’
4	5’-cgtggtggttaatgaaaattaacttactacggggctatcttctttctgccacacaacacggcaacaaaccaccttcacgt-3’
		5	5’-aattttcattaaccaccacgaggcatccctatgtctagtccacatcaggatagcctcttaccgcgctttgcgcaaggaga-3’
6	5’-tgagacacacgatcaacacacaccagacaagggaacttcgtggtagtttcatggccttcttctccttgcgcaaagcgcgg-3’
		7	5’-tgtgttgatcgtgtgtctcacactgttgatattcacttatctgacacgaaaatcgctgtgcgagattcgttacagagacg-3’
8	5’-cgcctccaggttgctacttaccggattcgtaagccatgaaagccgccacctccctgtgtccgtctctgtaacgaatctcg-3’
		9	5’-taagtagcaacctggaggcgggcgcaggcccgccttttcaggactgatgctggtctgactactgaagcgcctttataaag-3’
10	5’-cggaattcacaacatcagcaaggagaaaggggctaccggcgaaccagcagcccctttataaaggcgcttcagt-3’

用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA(公开号为CN1680558的中国专利申请)，得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的长片断连接，得pHS-GHA(其序列请参见附图4)。将pHS-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-HS-GHA。

制备BL-HS-GHA[含有重组D-氨基酸氧化酶GHA的E.coliBL21(DE3)pLysS]菌体的方法如下所述。

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌BL-HS-GHA，接种到2×5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养8小时(摇床转速为250转/分钟)，再接种至2×50mL含卡那霉素(100g/mL)和氯霉素(40μg/mL)的种子培养基，在30℃培养16小时(摇床转速为400转/分钟)。

玉米浆1的制备：

将300g玉米浆(购自华北制药康欣有限公司)溶于300mL的蒸馏水中，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆1。沉淀物留用。

玉米浆2的制备：

将上述沉淀物再溶于600mL的蒸馏水中，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆2。

50mL种子培养基中各成分重量如下：

玉米浆1       4mL

玉米浆2       4mL

酵母浸膏      0.2g

硫酸铵        0.075g

磷酸氢二钠    0.25g

磷酸二氢钾    0.04g

氯化钠        0.075g

将各成分溶于50mL的蒸馏水中，以10N氢氧化钠将pH值调至7.15，高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部100mL的种子接种至含卡那霉素(50μg/mL)的2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

玉米浆1    160mL

玉米浆2    160mL

酵母浸膏   8g

硫酸铵     3g

磷酸氢二钠    10g

磷酸二氢钾    1g

氯化钠        3g

将各成分溶于1.9L的蒸馏水中，以10N氢氧化钠将pH值调至7.15，于2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)高温消毒。

将12.5g葡萄糖溶于50mL的蒸馏水中，高温消毒；将1.25g硫酸镁溶于50mL的蒸馏水中，高温消毒。

发酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸镁放进2L发酵罐中。

补料的制备：

将250mL玉米浆1和250mL玉米浆2混合，以10N氢氧化钠将pH值调至7.25，高温消毒。

将2.25g硫酸铵、7.56g磷酸氢二钠、1.2g磷酸二氢钾、2.25g氯化钠溶于60mL的蒸馏水中，高温消毒。

将15g酵母浸膏溶于100mL的蒸馏水中，高温消毒。

将70g葡萄糖溶于140mL的蒸馏水中，高温消毒。

将30mL甘油混合10mL的蒸馏水中，高温消毒。

将20g硫酸镁溶于30mL的蒸馏水中，高温消毒。

将所有溶液混合，加入卡那霉素直至浓度为50μg/mL，加入2mL的消泡剂。

在35℃生长，在初始的6小时，pH值由6.9自然上升至7.2，开始补料(50mL/小时)。在平衡条件下(以5N氢氧化钾将pH值维持在7.2，溶氧水平pO₂不大于0.5％)，继续生长26小时。

在发酵罐发酵后，细菌在4℃经离心机分离(5,000g，8分钟)，弃上清液，取沉淀，将沉淀重悬于600mL的磷酸钠缓冲液(50mM，pH为7.5)中。用珠磨法裂解细菌，以50mL/分钟的速度把细菌重悬液送进珠磨机(DYNO-MILL TYP KDL，直径为0.2mm的玻璃珠，WA Bachofen)内，最后再以800mL的磷酸钠缓冲液(50mM，pH为7.5)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液在55℃水浴中浸泡30分钟，以高速离心(10,000g，30分钟)，取上清液，即为粗纯的重组D-氨基酸氧化酶GHA。D-氨基酸氧化酶的纯化基本上按Alonso，J.，Barredo，J.L.，Diez，B.，Mellado，E.，Salto，F.，Garcia，J.L.，Cortes，E.(1998，Microbiology 144：1095-1101)所述。提取的粗纯重组D-氨基酸氧化酶GHA，加入甘油至最终浓度为10％，用5N氢氧化钠将pH值调至8，离心(13,000g，30分钟)，取上清液。按产品供货商所述制备法制备DEAE-纤维素离子交换树脂(Sigma，D-0909)。按每1mL粗纯酶混合0.5mL DEAE-纤维素离子交换树脂，在4℃搅拌5小时(100转/分钟)，用滤斗(Buchner filter funnel，120mm P1)将酶液滤去。以3倍于DEAE-纤维素离子交换树脂体积的40mM的磷酸二氢钠缓冲液(含10％甘油)冲洗DEAE-纤维素离子交换树脂，再用2倍于DEAE-纤维素离子交换树脂体积的400mM的磷酸二氢钠缓冲液将重组D-氨基酸氧化酶GHA洗脱出来。按每1L洗脱的重组D-氨基酸氧化酶GHA，加入262g硫酸铵，在室温搅拌15分钟(100转/分钟)。离心(13,000g，15分钟)，弃上清液，保留沉淀物。将沉淀物溶于20mM磷酸二氢钠缓冲液(pH为7.5)后，以MilliporeYM30滤膜超滤除去剩余硫酸铵，将酶液浓缩至25mg/ml。用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。取酶液20ml，加牛血清白蛋白3g，蒸馏水90ml，搅拌均匀，得到稀释酶液110ml。将三聚氰胺海绵(珠海天虹特种海绵厂)切割成5.5cm厚的板状，再穿刺海绵使之具有均匀密布的穿透孔道(孔的密度为6个/cm²、孔径为0.2cm，所有孔道平行且与海绵穿刺表面呈45度角)；然后，将海绵切割成直径为8.5cm、高为3cm的圆盘柱状，并于圆盘中央留一直径为2cm、穿透并垂直于圆盘面的空腔。之后，按以下顺序操作：a)在海绵载体上加32ml稀释酶液，挤压使酶液在海绵中均匀分布；b)向海绵加0.05％的聚乙烯亚胺(PEI，购自Sigma，St.Luis，USA)溶液(pH为7.0)260ml，反复挤压海绵至挤出液由混变清，再次挤压并除去未被吸附的液体；c)向海绵加入0.05％的戊二醛溶液(购自广东汕头市西陇化工厂)260ml，挤压使戊二醛分布均匀并除去未被吸附的液体。d)重复步骤a)至c)5次。在流动空气中干燥24小时后，即可得到重9.2克的蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块。

本应用实例采用如图3所示的反应罐。将含空腔的蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块直接套入反应罐内的转轴21，这样固定到转轴21上的蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块即可作为随转轴21转动的搅拌桨；然后将固定到转轴21上的蜂窝状固定化D-氨基酸氧化酶块插入罐内，合上带有密封圈的罐盖11，使两端露出的转轴21分别与罐底和罐盖11的凹槽良好配合，然后拧紧固定螺丝19使罐盖11与罐体51紧密接合；再后，将连接着可指示温度的pH控制器(Biotech-2020，上海保兴生物设备有限公司)的电极17旋进罐盖11，将pH控制器的蠕动泵输出端连接罐底的补液口15，将pH控制器的蠕动泵吸液口插入15％的氨水溶液中，将罐体51上下所有的输液/气口套上硅胶管，用金属夹夹封位于罐底的取样口5、通气口7及位于罐盖11的排气口16和补液口15，关闭放料阀4；将温度设定为25℃的精密循环水浴(THD-0506型，宁波天恒仪器厂)的进、出水管分别与罐体51循环水输入口2和输出口3连接并启动水循环。加料前，关闭取样口5、输液口6、排液口14及放料阀4，排气口16保持开放；将氧气从通气孔7通入罐内，调节气流量为2.17L/min；将300ml 75mM头孢菌素C钠水溶液(pH为7.5)从罐盖进料口加入罐内，然后盖上并旋紧进料口螺盖18，启动电机，并根据需要调节转速。启动pH控制器以15％的氨水维持反应液pH为7.5±0.1；在不同时间(10、20、30、40、50分钟)取样，参照公布号为CN1680558的中国专利申请中实例5所述，以HPLC法(色谱柱：Diamonsil ^TM C18，250x4.6mm；流动相：含50mM K₂HPO₄/KH₂PO₄及5％乙腈，pH为7.0；柱温为30℃；流速为1ml/min；检测波长为260nm)测定固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7-ACA)的活力和转化率。一单位酶活力定义为在上述反应条件每分钟转化一微摩尔头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的酶量。共进行7次反应，99％头孢菌素C均在50分钟之内被转化完毕。本应用实例中所用转速、底物的体积、浓度以及测定的结果见表2。

表2

实验	反应液浓度(CPC)	体积(mL)	转速(rpm)	固定化D-氨基酸氧化酶初始10分钟的酶活力(单位/克)
					1	74mM	500mL	300	79.48
2	74mM	500mL	600	106.08

本专利申请中参照的各种文献的全部公开内容，无论是专利文献还是非专利文献，全部以引用方式并入本文。另外，本发明不受上述具体实施方式和应用实例的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变也在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种反应器，包括至少一个反应罐，所述反应罐包括罐体以及安装于罐体内可转动的转轴，其特征在于：所述转轴上直接固定有固相催化剂，所述固相催化剂具有可通透反应液和气体的孔，该固相催化剂在随着转轴转动时还充当搅拌器的作用，并且该固相催化剂是由酶或表达酶的细胞与开孔的多孔有机泡沫材料制成的，所述有机泡沫材料包括木浆海绵、聚乙烯醇海绵或三聚氰胺海绵。

2.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于：所述固相催化剂为柱体形式。

3.根据权利要求2所述的反应器，其特征在于：所述的柱体是由片材卷绕而成的。

4.根据权利要求3所述的反应器，其特征在于：所述的柱体是中空柱体，在该柱体的轴线附近设有用于安装转轴的空腔。

5.根据权利要求4所述的的反应器，其特征在于：所述的中空柱体套在所述的转轴上。

6.根据权利要求1至3中任意一项所述的反应器，其特征在于：所述固相催化剂与转轴之间采用捆绑方式固定。

7.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于：所述固相催化剂的体积与反应罐的体积之比在1％至95％之间。

8.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于：所述转轴上设有与罐体内外相通的用于输送液体和/或气体的孔道。

9.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于：所述反应罐为直立式。

10.根据权利要求1所述的反应器，其特征在于：所述固相催化剂是固定化酶/固定化细胞。

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