具体实施方式
在下文中,将对本发明进行详细描述。
<1>本发明的单克隆抗体
本发明所述的单克隆抗体是特异性识别图5中所示的抗原蛋白的单克隆抗体,所述抗原蛋白获自人胰腺癌细胞系PANC-1(ATCC No.CRL1469)并且分子量约为55kDa(包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的蛋白)。另外,本发明的所述抗体是在正常细胞中不引起形态变化但在癌细胞中引起形态变化的单克隆抗体。此外,本发明的所述抗体是特异性识别图5中所示的蛋白且在正常细胞中不引起形态变化但在癌细胞中引起形态变化的单克隆抗体,其中所述的蛋白获自人胰腺癌细胞系PANC-1并且分子量约为55kDa(包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的蛋白)。波形蛋白可以作为约55kDa的抗原蛋白的例子。另外,术语“形态变化”是指,例如,如图1的B和D中所示从正常细胞变为轴突样形态、成纤维细胞样形态和具有神经突的神经元细胞样形态。
本发明的所述单克隆抗体的具体例子包括其重链可变区包含SEQID NO:86、88和90所示的氨基酸序列且其轻链可变区包含SEQ ID NO:92、94和96所示的氨基酸序列的抗体。在SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列中,氨基酸位点10可以是Cys或Tyr。换句话说,所述重链可变区有两种类型,一种类型在位点10具有Cys,另一类型在位点10具有Tyr。另外,在本发明的所述抗体的上述6种序列中,其中的一条序列或一条以上序列中可以发生替换、缺失或增加一个或数个氨基酸,只要所述抗体具有特异性识别获自人胰腺癌细胞系PANC-1的分子量约为55kDa的抗原蛋白(含有SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列的蛋白)的特异性。在此处,术语“数个”意思是:优选2~5个,更优选2~3个,特别优选2个。
上述6种序列是重链和轻链的可变区中称为“高变区”的区域的序列。一个抗体包括重链和轻链,并且这些链的每一条由恒定区和可变区组成。可变区包含高变区,所述高变区决定免疫球蛋白作为抗体的特异性以及所述抗体与抗原表位的结合亲和力。因此,只要本发明的高变区包含上述各序列,除高变区以外的区域可以来自任何其它抗体。在这里,术语“其它抗体”包括获自除人之外的其它生物体的抗体,但对于降低副作用来说,优选人源抗体。
在本发明中,特别优选的单克隆抗体可以是在其重链可变区中包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的抗体,或是在其重链可变区中包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的抗体。这里,在序列SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:115中,位点14和位点51的氨基酸的组合可以是(Cys、Tyr)或(Tyr、Cys)。换句话说,重链可变区的序列存在两种类型,一种类型在位点14具有Cys且在位点51具有Tyr,另一种类型在位点14具有Tyr且在位点51具有Cys。而且,在SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:117的位点13可以具有Val或Ile。换句话说,轻链可变区的序列存在两种类型,一种类型在位点13具有Val,另一种类型在位点13具有Ile。
在本发明中,术语“单克隆抗体”是指包括单克隆抗体和其片段、F(ab’)2抗体、F(ab’)抗体、短链抗体(scFv)、双抗体和微型抗体的任意抗体。当单克隆抗体含有恒定区时,其重链和轻链的恒定区的氨基酸序列优选为以下文献中描述的恒定区的氨基酸序列之一:核酸研究(NucleicAcids Research)第14卷1779页,1986;生物化学杂志(The Journal ofBiological Chemistry)第257卷1516页,1982;和细胞(Cell)第22卷197页,1980。包含恒定区和可变区的本发明抗体可以是,例如,包含SEQ ID NO:130(重链)所示氨基酸序列和SEQ ID NO:132(轻链)所示氨基酸的抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过在培养基中培养产生本发明所述抗体的杂交瘤而获得,所述培养基如含胎牛血清的RPMI1640培养基。选择性地,所述单克隆抗体可以通过以下方式获得:通过PCR方法或化学合成方法制备基因(例如含有SEQ ID NO:129(重链)或SEQ ID NO:131(轻链)的基因),在该基因中,编码重链或轻链的恒定区的DNA编码各可变区的DNA(例如含SEQ ID NO:81或83的DNA)相连接;将获得的基因插入到常规使用的能够表达所述基因的表达载体(例如pcDNA3.1(Invitrogen))中;在宿主细胞如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)或大肠杆菌(Escherichia coli)中表达所述基因以产生所述抗体;使用蛋白A柱等从培养基中纯化所获得的抗体。
此外,本发明的单克隆抗体可以通过以下方式获得:由经分子量约为55kDa的蛋白免疫过的动物制备杂交瘤,其中所述蛋白获自人胰腺癌细胞系PANC-1且包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列,该蛋白优选为波形蛋白(GenBank登记号:M14144);培养所述杂交瘤;从所获得的单克隆抗体中选择能够结合到活的癌细胞表面的单克隆抗体。所述单克隆抗体的例子包括由杂交瘤细胞株2F6-1和3F9-1产生的单克隆抗体,所述单克隆抗体将在后述的实施例中进行解释。
<2>本发明的DNA
本发明的DNA是编码本发明所述单克隆抗体的DNA。其例子包括:包含编码重链可变区(含有SEQ ID NO:86、88和90所示的氨基酸序列)的区域的DNA;和包含编码轻链可变区(含有SEQ ID NO:92、94和96所示的氨基酸序列)的区域的DNA。优选地,所述DNA包含编码重链可变区(含有SEQ ID NO:85、87和89所示的核苷酸序列)的区域;和编码轻链可变区(含有SEQ ID NO:91、93和95所示的核苷酸序列)的区域。这里,在SEQ ID NO:87序列中,在位点29的核苷酸可以是“a”或“g”。换句话说,编码重链可变区的序列存在两种类型,一种类型在位点29具有“a”,而另一种类型在位点29具有“g”。另外,在SEQ ID NO:95序列中,在位点18的核苷酸可以是“c”或“t”。换句话说,编码轻链可变区的序列存在两种类型,一种类型在位点18具有“c”,而另一种类型在位点18具有“t”。
由这些DNA序列编码的高变区是确定所述抗体的特异性的区域,因此编码其它区域的序列可以是获自其它抗体的序列。这里,术语“其它抗体”包括获自除人之外的其它生物体的抗体,但对于降低副作用来说,优选人源抗体。
在本发明中,特别优选的DNA可以是包含编码重链可变区中的SEQID NO:82所示氨基酸序列的序列并包含编码轻链可变区中的SEQ IDNO:84所示氨基酸序列的序列的DNA,或是包含编码重链可变区中的SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的序列并包含编码轻链可变区中的SEQID NO:117所示氨基酸序列的序列的DNA。在这些DNA序列中,特别优选的DNA是包含编码重链可变区的SEQ ID NO:81所示核苷酸序列并包含编码轻链可变区的SEQ ID NO:83所示核苷酸序列的DNA,或是包含编码重链可变区的SEQ ID NO:114所示核苷酸序列并包含编码轻链可变区的SEQ ID NO:116所示核苷酸序列的DNA。这里,在SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:114序列中,位点41和位点152的核苷酸的组合可以是(a,g)或(g,a)。换句话说,编码重链可变区的序列存在两种类型,一种类型在位点41具有“a”且在位点152具有“g”,另一种类型在位点41具有“g”且在位点152具有“a”。另外,在SEQ ID NO:83或SEQID NO:116序列中,位点37、183和258的核苷酸的组合可以是(a,a,t)、(a,a,c)和(g,g,t)中的任何一个。换句话说,编码轻链可变区的序列存在三种类型,一种类型在位点37具有“a”、在位点183具有“a”且在位点258具有“t”,一种类型在位点37具有“a”、在位点183具有“a”且在位点258具有“c”,而另外一种类型在位点37具有“g”、在位点183具有“g”且在位点258具有“t”。
另外,只要本发明的DNA编码特异性识别获自人胰腺癌细胞系PANC-1的分子量约为55kDa的抗原蛋白(含有SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的蛋白)的单克隆抗体,其可以是在严格条件下能够与含有SEQ ID NO:81和83的DNA或与含有SEQ ID NO:114和116的DNA杂交的DNA。此处的严格条件包括在相当于60℃、1×SSC和0.1%SDS,优选0.1×SSC和0.1%SDS的盐浓度下进行杂交的条件;该条件相当于Southern杂交中的漂洗条件。
本发明的DNA可以是编码重链和轻链的所有恒定区和可变区的DNA。可选择地,所述DNA可以是只编码重链和轻链的可变区的DNA。当所述DNA编码所有恒定区和可变区时,重链和轻链的恒定区的核苷酸序列优选为以下文献中描述的核苷酸序列:核酸研究(Nucleic AcidsResearch),第14卷1779页,1986;生物化学杂志(The Journal of BiologicalChemistry),第257卷1516页,1982;和细胞(Cell),第22卷197页,1980。本发明的编码恒定区和可变区的DNA包括含有SEQ ID NO:129(重链)所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:131(轻链)的核苷酸序列的DNA。
本发明的DNA可以通过下述方法获得。首先,利用市售RNA提取试剂盒由本发明的细胞(如杂交瘤细胞)制备总RNA,然后利用随机引物等通过反转录酶由总RNA合成cDNA。随后,利用分别具有人抗体重链或轻链可变区保守序列的寡聚核苷酸作为引物,通过PCR方法扩增编码所述抗体的cDNA。编码恒定区的序列可以通过PCR方法扩增已知序列来获得。将所述DNA插入测序用的质粒后,可以通过传统方法测定所述DNA所示的核苷酸序列。
另外,本发明还提供含有本发明DNA的重组载体和含有所述重组载体的转化体。所述重组载体可以是能够用于在原核细胞如大肠杆菌中进行基因表达的载体(例如pBR322、pUC119或其衍生物),优选能够用于在真核细胞中进行基因表达的载体,和更优选能够用于在获自哺乳动物的细胞中进行基因表达的载体。能够用于在获自哺乳动物的细胞中进行基因表达的载体的例子包括质粒载体如pcDNA3.1(由Invitrogen有限公司生产)和病毒载体如pDON-AI DNA(由TAKARA BIO INC.生产)。欲导入本发明的重组载体的转化体可以是原核细胞如大肠杆菌,但优选真核细胞,更优选获自哺乳动物的细胞。获自哺乳动物的细胞的例子包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
<3>本发明的杂交瘤
本发明的杂交瘤是产生如上所述的单克隆抗体的杂交瘤。本发明的杂交瘤的例子包括将在下文中描述的实施例中进行解释的杂交瘤细胞株HoAKs-1、2F6-1和3F9-1。本发明的杂交瘤可以通过以下方法获得。首先,基于A.Imam等人的方法(癌症研究(Cancer Research),第45卷263页,1985),从经诊断患有肺癌的患者取下的肿瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞,然后利用聚乙二醇将包含淋巴细胞的细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞。随后,使用所获得的杂交瘤的上清液进行酶免疫测定,然后将产生与多聚甲醛固定的各种癌细胞系呈阳性反应的抗体的杂交瘤细胞选择出来,进一步通过有限稀释来克隆所获得的杂交瘤。选择性地,本发明的杂交瘤也可以通过免疫小鼠而获得:用图5中所示的获自人胰腺癌细胞系PANC-1的分子量约为55kDa的蛋白(包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的蛋白)对小鼠进行免疫,然后将获得的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。
<4>本发明的药物组合物
本发明的药物组合物包含本发明的单克隆抗体和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体的例子包括可溶性载体如已知的生理上可接受的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)或固态的载体如乳胶珠。
本发明的药物组合物适合用作癌症,尤其是非小细胞肺癌、胰腺癌和胃癌的治疗剂。另外,本发明的药物组合物可以是利用所述单克隆抗体本身的细胞杀伤作用和抗增殖作用的组合物;或是用作将诸如阿霉素等抗癌药物与本发明的单克隆抗体结合从而靶向作用于癌组织的组合物。
在本发明中,特别适宜的药物组合物是将本发明的抗体锚定到含有毒素、抗癌药物等的脂质体上的组合物。用作锚定所述抗体的脂质体可以由脂双层组成。选择性地,使用的脂质体可由脂多层或脂单层组成。所述脂质体的组分的例子包括磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰乙醇胺,并进一步包括用作使所述脂质体带电的物质的磷脂酸。所述组分的比例是,例如,在每摩尔(mol)的磷脂酰胆碱中:胆固醇为0.3mol~1mol,优选为0.4mol~0.6mol;磷脂酰乙醇胺为0.01mol~0.2mol,优选为0.02mol~0.1mol;磷脂酸为0~0.4mol,优选为0~0.15mol。
生产脂质体的方法可以是任何传统方法。例如,脂质体可以通过以下方法(Biochimica et Biophysica Acta第812卷55页,1985)生产:使用匀浆器等使去除溶剂的脂质的混合物乳化;然后进行冻融,以获得多层脂质体;再利用超声作用、高速匀浆、或通过具统一孔径的膜加压过滤来适当调整所述脂质体的孔径。优选地,所述脂质体的粒径为30nm~200nm。
包封在脂质体中的药剂的例子包括:抗癌剂如阿霉素、道诺霉素、丝裂霉素、顺铂、长春新碱、表柔比星、氨甲喋呤、5-Fu(5-氟尿嘧啶)和阿克拉霉素;毒素如蓖麻蛋白A和白喉毒素;以及反义RNA。可以通过将所述脂质与所述药剂水溶液经水合作用,将所述药剂包封入脂质体中。另外,对于阿霉素、道诺霉素和表柔比星,可以利用pH梯度采用远距离装载法(remote-loading method)(癌症研究(Cancer Res.),第49卷5922页,1989)将其封入所述脂质体中。
将所述单克隆抗体锚定于脂质体表面上的方法的例子包括以下方法:通过将纯化抗体与疏水物质相偶联而将抗体锚定于脂质体上的方法、和利用戊二醛使抗体与磷脂酰乙醇胺交联的方法。更优选的方法是以下方法:制备含有被导入了马来酰亚胺基团的脂质的脂质体,该脂质体包封有抗癌剂或毒素;通过使上述脂质体与硫醇化的抗体反应而将所述抗体锚定于所述脂质体的表面上。另外,可以优选使用具有与氨基的反应位点并具有巯基或固有的巯基部分的水溶性多聚体衍生物(JP11-152234A)。另一方面,脂质体表面可以通过使剩余马来酰亚胺基团与含有巯化的聚(亚烷基)二醇部分的化合物等反应而进行修饰。
将巯基引入抗体的方法的例子包括:采用N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸盐(SPDP)或化合物如亚氨硫醇和巯基烷基酰亚胺盐(mercaptoalkylimidate)将巯基引入到所述抗体的氨基上的方法,该方法经常用于蛋白的巯化;或将所述抗体固有的二巯基还原为巯基的方法。从保持所述抗体的活性的角度来看,优选为采用固有巯基的方法。而且,所述抗体可以用酶如胃蛋白酶处理以形成F(ab’)2,然后用二硫苏糖醇(DTT)等将其还原以形成F(ab’),该F(ab’)可提供用于与脂质体结合的1~3个巯基。所述巯化的抗体与含有马来酰亚氨基团的脂质体的结合可通过在pH为6.5~7.5的中性缓冲液中反应2~16小时来完成。
可以采用任意传统方法来制备用于治疗癌症的本发明的药物,所述方法如脱水法(JP02-502348A)、加入稳定剂以获得液体制剂的方法(JP64-9331A)和冻干法(JP64-9931A)。本发明的用于治疗癌症的药物,可以通过血管内施用以及腹膜内等局部给药法进行施用。可以对包封在脂质体内的各药物的剂量进行优化。当所述药物为阿霉素时,阿霉素的剂量可为50mg/kg或更少,优选10mg/kg或更少,更优选5mg/kg或更少。
<5>本发明的诊断试剂
本发明的诊断试剂的例子包括利用本发明的抗体对癌细胞的特异性的那些诊断试剂,尤其是含有本发明的抗体、二抗、检测底物和其它组分的癌症诊断试剂。
<6>本发明的多肽
本发明的多肽包括特异性识别分子量约为55kDa的蛋白(含有SEQID NO:107所示氨基酸序列的蛋白)的多肽,所述蛋白为图5所示的获自人胰腺癌细胞系PANC-1的蛋白。另外,本发明的多肽包括在正常细胞中不引起形态变化但在癌细胞中引起形态变化的多肽。进一步地,本发明的多肽可以是特异性识别如图5所示的获自人胰腺癌细胞系PANC-1的分子量约为55kDa的蛋白(含有SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的蛋白),且在正常细胞中不引起形态变化但在癌细胞中引起形态变化的多肽。波形蛋白可作为约55kDa的抗原蛋白的例子。另外,术语“形态变化”是指,例如,图1中B和D图所示的从正常细胞形态到轴突样形态、成纤维细胞样形态和具有神经突的神经元细胞样形态的形态变化。
本发明的多肽的具体例子包括吸附在后述实施例中解释的吸附到PROSEP-A上的多肽。更优选地,包括本发明的单克隆抗体。本发明的多肽引起癌细胞特异的形态变化,因此其可用于药物组合物的制造,尤其是用于治疗癌症,如非小细胞肺癌、胰腺癌和胃癌的治疗药物的制造。
实施例
在下文中,将参考实施例对本发明进行更详细地描述。但是,在不脱离本发明范围内本发明并不限于这些实施例。
(1)通过将获自癌症患者的癌浸润淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合来制备杂交瘤
(1)-1:淋巴细胞的制备
用解剖刀将从肺癌患者切除的肿瘤组织切成小块,然后充分悬浮在培养基A(RPMI1640+50μg/ml硫酸庆大霉素)中,并收集培养基(称作培养基(I))。用剃刀刀刃将所述肿瘤组织小块进一步切成细块,然后通过移液管将所述细胞分散在新鲜的培养基A中。将这些细胞悬浮液在1,000rpm离心5分钟,并收集上清液(称作上清液(II)),混合培养基(I)与上清液(II),将所述混合物在3,000rpm离心5分钟,据此获得约4×107个含肿瘤浸润淋巴细胞的细胞。
(1)-2:细胞融合
按照标准方法(癌症研究(Cancer Research),第45卷263页,1985),用聚乙二醇1500(Roche Diagnostics)将所述含肿瘤浸润淋巴细胞的细胞与小鼠骨髓瘤细胞(约4×107个细胞)融合。将所述融合细胞悬浮在培养基B(培养基A加入10%胎牛血清(FCS))中,使得细胞密度变为5×105细胞/毫升。将所述悬浮液分装到96孔板上,每孔100μl,然后于37℃培养在CO2培养箱中。第二天,将添加有10μM次黄嘌呤、0.04μM氨基喋呤和1.6μM胸苷的培养基B(添加有HAT的培养基B)加到所述孔中,每孔100μl,培养到杂交瘤集落出现为止。结果,在10个孔中出现杂交瘤集落。
(2)人单克隆抗体与癌细胞系的反应性的评价
(2)-1:癌细胞系及其保持
使用所获得的杂交瘤的培养物上清液,检测其与经固定的癌细胞系的反应性,以选择目的杂交瘤,所述经固定的癌细胞包括:肺癌细胞系HLC-1((癌症(Cancer)第67卷第4期483~492页,1976),由庆应义塾大学(Keio University)医学系的Suzuki先生提供);胃癌细胞系MKN45(日本癌症和化学疗法杂志(Japanese Journal of Cancer andChemotherapy)第5卷89页,1978;由IBL有限公司提供);和胰腺癌细胞系SUIT2(由国家Kyushu癌症中心(National Kyushu Cancer Center)的Iguchi先生提供)。于37℃在5%CO2的条件下,将这些细胞系保持在培养基D中并进行生长,所述培养基D是通过在培养基C(D-MEM/F12+50μg/ml硫酸庆大霉素)中添加5%的FCS而制得的。
(2)-2:对癌细胞系的反应性的测定
在96孔板中,分别培养上述癌细胞系3天~4天,直到变成单细胞层。去掉上清液后,用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4,0.15M NaCl:PBS)洗板一次,用2%多聚甲醛在室温固定20分钟。经PBS冲洗5次后,将含5%BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液加到所述板上进行封闭,每孔150μl。然后,用PBS洗板5次,并添加50μl的杂交瘤培养物上清液,在37℃反应1.5小时。接着,用PBS洗板5次,然后,加入50μl的抗人抗体的辣根过氧化物酶偶联的羊抗体(CAPPEL;稀释1,000倍),在37℃反应1小时。随后,用含0.05% Tween 20的PBS(PBS-T)洗板,然后加入含有邻苯二胺二盐酸盐(5.2%)和H2O2(过氧化氢,0.015%)的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液,每孔50μl。反应在室温下进行,直到观察到显色,再用显微光度计(Nihon Intermed)在490nm测定吸光度。将获自检测有反应性的板孔的细胞通过有限稀释而对杂交瘤细胞进行克隆,据此获得杂交瘤细胞系HoAKs-1。在下文中,由该细胞系获得的单克隆抗体称为HoAKs-1抗体。
(3)HoAKs-1单克隆抗体的纯化和标记
(3)-1:杂交瘤HoAKs-1的培养和HoAKs-1单克隆抗体的纯化
首先,使胎牛血清通过蛋白A-玻璃珠柱(PROSEP-A)(bioPROCESSING)以制备去除了吸附在PROSEP-A中的物质的血清。将添加有7%~10%的这种血清的培养基A用于培养杂交瘤HoAKs-1。接着,将培养有所述杂交瘤HoAKs-1的培养基装载到PROSEP-A上以由此吸附PROSEP-A吸附的多肽,然后将该多肽洗脱以纯化PROSEP-A吸附的多肽。在随后的程序中,将所述PROSEP-A吸附的多肽用作HoAKs-1抗体。据信在培养中使用上述血清,可以提供纯化的HoAKs-1抗体,该HoAKs-1抗体没有PROSEP-A中吸附的物质如来自血清的抗体的污染。所述HoAKs-1抗体通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认为纯的IgM(免疫球蛋白M)(数据未显示)。
(3)-2:HoAKs-1抗体的生物素化
按照生产商的说明书,用生物素化试剂(Amersham Biosciences)对经PROSEP-A纯化的HoAKs-1抗体进行生物素化后,通过凝胶过滤方法将标记抗体与游离的生物素分开。
(4)对活的癌细胞系和血管内皮细胞的作用的分析
(4)-1:癌细胞系和血管内皮细胞及其保持
使用肺癌细胞系HLC-1、胃癌细胞系MKN45和胰腺癌细胞系PANC-1(ATCC No.CRL1469)作为人癌细胞系,使用血管内皮细胞HUVECs(DAINIPPON药物有限公司)作为人正常细胞。在37℃于5%的CO2条件下,将这些癌细胞系培养在培养基D中并进行生长。将人血管内皮细胞HUVECs培养在CS-C培养基(Cell SYSTEMS)中并进行生长。
(4)-2:对癌细胞系与血管内皮细胞的形态的作用的分析
对HoAKs-1抗体进行过滤除菌。用培养基C或CS-C培养基将所获得的HoAKs-1抗体稀释到约140μg/ml的浓度,并分装到96孔板中,每孔100μl。接着,用含10%人血清(ICN Biomedicals)的培养基C或CS-C培养基,将培养的各癌细胞和血管内皮细胞HUVECs稀释到每毫升3×104个细胞的浓度。将所述细胞悬浮液分装到孔板中,每孔100μl,使每个孔中的细胞数目为1.5×103个细胞,所述HoAKs-1抗体的浓度变为约70μg/ml。在37℃于5%的CO2条件下培养。用与上述相同的培养基更换培养物上清液,隔天更换一次,总共3次。在第六天,在光学显微镜下观察所述细胞的形态变化。
观察结果在图1中显示。通过加入所述抗体,在作为正常细胞的血管内皮细胞HUVECs中没有观察到细胞形态变化(图1-G和1-H),但通过加入所述抗体,肺癌细胞系HLC-1(图1-A和1-B)和胰腺癌细胞系PANC-1(图1-C和1-D)中观察到显著的形态变化。这些细胞变为轴突样形态、成纤维细胞样形态和具有突起的神经元细胞样形态。特别地,胰腺癌细胞系PANC-1所表现出的形态变化与饥饿条件下所观察到的形态变化类似。而且,在胃癌细胞系MKN45中观察到轻微的形态变化(图1-E和1-F)。上述观察提示HoAKs-1抗体可对癌细胞系具有一定的影响。
(4)-3:对癌细胞系的抗增殖作用的分析
在相同条件下,将观察到形态变化的肺癌细胞系HLC-1和胃癌细胞系MKN45以及没有观察到形态变化的作为正常细胞的血管内皮细胞HUVECs接种到96孔板上,并在浓度约为70μg/ml的HoAKs-1抗体存在时于37℃在5%的CO2条件下培养;用上述相同的培养基隔天更换培养物上清液一次,总共更换3次;在第六天,通过MTT(噻唑蓝)测定法(免疫方法杂志(J.Immunol.Methods),第70卷257页,1984)比较活的癌细胞的数目。用人抗体IgM(CHEMICON)作为对照进行相同的实验。
结果在图2中显示。将未加抗体的对照条件下的细胞数目定义为100%;通过加入HoAKs-1抗体,在肺癌细胞系HLC-1和胃癌细胞系MKN45中,观察到抗增殖作用分别约为60%和50%。另一方面,在血管内皮细胞HUVECs中没有观察到差异。而且,当使用人IgM作为对照时,通过加入抗体,没有观察到对癌细胞系的抗增殖作用。
将观察到形态变化的癌细胞系PANC-1接种到96孔板上,每孔1×103个细胞,并分别在浓度约为300μg/ml、100μg/ml或30μg/ml的HoAKs-1抗体存在时,于37℃在5%的CO2条件下进行培养。用上述相同的培养基隔天更换培养物上清液,总共更换3次。在第六天,通过溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖测定试剂盒(Oncogene)比较活的癌细胞的数目。在第六天,按照试剂盒说明书在每个孔中加入BrdU溶液,并过夜培养细胞。在第七天,测定被活的癌细胞吸收的BrdU量。作为对照,用人IgM进行相同的实验。
结果在图3中显示。将未加抗体的对照条件下的BrdU吸收量表示为100%;证实所述胰腺癌细胞系PANC-1的增殖以浓度依赖方式受到HoAKs-1抗体的抑制。当使用IgM作为对照时,通过加入抗体在癌细胞系中没有观察到抗增殖作用。
(5)对各种组织切片的反应性的分析
(5)-1:各种组织切片的制备
按照标准方法,将肺癌组织切片及同一癌组织周围的非癌肺组织切片在福尔马林溶液中进行固定,并用石蜡包埋以制备组织切片,其中,用于制备产生HoAKs-1抗体的杂交瘤的淋巴细胞即来自所述的肺癌组织切片。另外,在培养基D中于37℃在5%的CO2条件下,分别培养各种癌细胞系(肺癌细胞系:HLC-1(庆应义塾大学)、A549和PC9(IBL);胰腺癌细胞系:SUIT2(Kyushu癌症中心)、PANC-1和PK8(生物医学研究的细胞资源中心(Cell Resource Center for Biomedical Research);Tohoku大学的发育、衰老和癌症研究所);胃癌细胞系:MKN45、MKN74和HSC-3(全部来自IBL有限公司);以及结肠癌细胞系:HT29(ATCCNo.HTB38)、DLD-1(ATCC No.CCL221)、LoVo(ATCC No.CCL229)和COLO205(ATCC No.CCL222),并将约1×106个~1×107个细胞皮下移植到裸鼠(CLEA Japan,Inc.)中以形成肿瘤。提取形成的肿瘤并用如上所述的相同方法制备肿瘤组织切片。
(5)-2:对各种组织切片的反应性的检测
按照标准方法对制备的各种组织切片进行脱蜡和封闭处理后,将所获得组织切片与实施例(3)-2中所述的生物素化的HoAKs-1抗体反应,通过DAKO催化的信号放大(CSA)系统(DAKO)进行检测,用二氨基联苯胺染色,染成微红棕色即为检测到反应性。对于免疫染色的组织切片,将该组织的细胞核用苏木精染成蓝色以获得组织图片。
观察到反应性的各种肿瘤组织切片的染色图片和自体肺非癌部分的组织切片的染色图片在图4中显示。发现HoAKs-1抗体与自体肺癌组织的切片(杂交瘤即来自该肺癌组织切片)中的肿瘤细胞表现出强反应性,并且抗在裸鼠中形成的肿瘤细胞,该肿瘤细胞包括:肺癌细胞系介导的肿瘤如HLC-1和A549、胰腺癌细胞系介导的肿瘤如SUIT2、PANC-1和PK-8以及胃癌细胞系介导的肿瘤如MKN45。另一方面,没有观察到对来自非癌部分的组织切片的反应性。
虽然未在图4中显示,但是使用下述抗体作为对照采用与上述相同的过程进行染色,可以发现,这些对照抗体与如下所述PANC-1细胞的不可溶组分没有反应性,与上述各组织切片也没有特异反应性,其中所述对照为:以纯化HoAKs-1抗体相同的方式用PROSEP-A柱从人血清中纯化出的人抗体,或与按上述同样方法获得的HoAKs-1抗体具有相同亚型的IgM型人单克隆抗体A。
(6)对被HoAKs-1抗体识别的抗原的分析
(6)-1:由癌细胞系进行抗原样品的制备
使用来自胰腺癌细胞系PANC-1的蛋白,用Western印迹鉴定与HoAKs-1抗体反应的物质,所述胰腺癌细胞系PANC-1表现出显著形态变化并证实与移植到裸鼠中的所述细胞系形成的肿瘤中的抗体具有反应性。在37℃于5%的CO2条件下,使胰腺癌细胞系PANC-1在培养瓶中生长。去除培养瓶中的培养物上清液,并用PBS将所述细胞冲洗一次。在培养瓶中加入少量的PBS,用细胞刮刀将细胞移走并转移到离心管中,然后在1,000rpm离心5分钟进行细胞收集。用PBS冲洗2次后,加入所收集到的细胞量的10倍量(体积比)的TNE缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH7.6)、150mM的NaCl和1mM EDTA),该TNE缓冲液含有蛋白酶抑制剂(5μg/ml亮抑酶肽、5μg/ml抑肽素A和5μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂(全部来自PEPTIDE INSTITUTE,Inc.)。在冰冷却条件下用玻璃匀浆器破碎细胞,并在10,000g离心20分钟,据此获得可溶的上清液组分和不溶的沉淀组分。加入与前面加入的TNE缓冲液等体积的含蛋白酶抑制剂(5μg/ml亮抑酶肽、5μg/ml抑肽素A和5μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂)的RIPA缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH8.0)、150mM的NaCl、1%的Nonidet P-40、0.5%脱氧胆酸和0.1% SDS)以悬浮所述沉淀,并超声匀浆约3分钟以分散所述沉淀。
(6)-2:Western印迹分析
使用来自上述可溶组分的蛋白和来自用RIPA缓冲液增溶的不可溶组分的蛋白(两者均来自PANC-1)各20μg,在2%~15%的丙烯酰胺梯度凝胶上进行电泳。电泳后,将蛋白从凝胶转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。封闭PVDF膜后,将PVDF膜与HoAKs-1抗体在4℃反应过夜,随后在37℃反应1小时。然后,用PBS-T冲洗PVDF膜,并加入抗人抗体的辣根过氧化物酶偶联的羊抗体(稀释1,000倍,CAPPEL),在37℃反应1小时。接着,用PBS-T冲洗PVDF膜,并用Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)检测与HoAKs-1抗体反应的物质。
来自所述PANC-1细胞的蛋白的电泳图(考马斯亮兰染色)和Western印迹结果在图5中显示。发现HoAKs-1抗体与获自胰腺癌细胞系PANC-1匀浆的不可溶组分(膜组分)中的约为55kDa的单一蛋白反应。
(6)-3:氨基酸测序分析
将用RIPA缓冲液增溶的约560μg来自PANC-1的上述不可溶组分以Amersham Plus One 2-D Clean-Up试剂盒处理,然后,将约40μg的样品进行双向电泳。在电泳的第一方向中,样品渗入ZOOM STRIP(pH3-10NL)(Invitrogen)以进行等电聚焦。在第二方向,使用10%的丙烯酰胺凝胶进行SDS(十二烷基硫酸钠)电泳。用与上述Western印迹相同的方式,在双向电泳图中检测与HoAKs-1抗体反应的物质。用所述同种样品重复进行13次双向电泳,用考马斯亮兰对电泳后的凝胶进行染色,从凝胶中切下与Western印迹中检测到的HoAKs-1抗体的反应物相对应的13个斑点。
冲洗切下的凝胶,加入含赖氨酰末端肽酶的Tris缓冲液(pH8.5),在35℃过夜处理。此后,对溶液进行反相HPLC(反相高效液相色谱,TSKgel ODS-80Ts)以分离肽片段。在经过分离的多肽中,58号级分被装载到氨基酸序列分析仪(Procise 494 HT蛋白测序系统)上,据此,在主要检测到的氨基酸序列中,测定了一条N末端为Val(缬氨酸)的一直到第12个氨基酸残基的序列。该序列为VELQELNDRFAN(SEQ ID NO:107),经过同源性研究,发现该序列与各种波形蛋白(Mol.Cell.Biol.第6卷3614~3620页,1986,GenBank登记号M14144)和结蛋白(基因(Gene),第78卷243~254页,1989)的内部序列一致。因为波形蛋白与结蛋白是细胞骨架纤丝,所以认为HoAKs-1抗体是与细胞骨架纤丝具有反应性的抗体。
认为HoAKs-1抗体通过含有该氨基酸序列VELQELNDRFAN(SEQID NO:107)的蛋白使肿瘤细胞显示形态变化(图1)和对其具有抗增殖作用(图2和图3)。因为在培养基中加入HoAKs-1抗体,肿瘤细胞显示形态变化,所以预测该抗原蛋白存在于肿瘤细胞的膜表面。
(7)编码人单克隆抗体HoAKs-1的基因的克隆及其核苷酸序列的测定
用RNeasy Protect Mini试剂盒(QIAGEN)从产生HoAKs-1抗体的杂交瘤中制备总RNA。用RNA PCR试剂盒(AMV)(TAKARA生物公司)和随机的9个碱基(mer)作为引物进行反转录反应以合成cDNA。
作为PCR扩增的引物,根据已知的编码抗体的基因序列(分子生物学杂志(J Mol Biol.),第222卷581~597),1991),为了扩增重链可变区,将分别对应于人抗体重链可变区的框架1中保守的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12)的VH1(SEQ ID NO:1)、VH2(SEQ ID NO:3)、VH3(SEQ ID NO:5)、VH4(SEQ ID NO:7)、VH5(SEQ ID NO:9)和VH6(SEQ ID NO:11)的等量混合物用作5’末端的PCR引物,将分别对应于人抗体重链可变区的框架4中保守的C末端氨基酸序列(SEQ ID NO:14、16、18和20)的JH1(SEQ ID NO:13)、JH2(SEQ ID NO:15)、JH3(SEQ ID NO:17)和JH4(SEQ ID NO:19)的等量混合物用作3’末端的PCR引物。
对于扩增κ链可变区的引物,将分别对应于人抗体κ链可变区的框架1中保守的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO:22、24、26、28、30和32)的VK1(SEQ ID NO:21)、VK2(SEQ ID NO:23)、VK3(SEQ IDNO:25)、VK4(SEQ ID NO:27)、VK5(SEQ ID NO:29)和VK6(SEQID NO:31)的等量混合物用作5’末端的PCR引物,将分别对应于人抗体κ链可变区的框架4中保守的C末端氨基酸序列(SEQ ID NO:34、36、38、40和42)的JK1(SEQ ID NO:33)、JK2(SEQ ID NO:35)、JK3(SEQ ID NO:37)、JK4(SEQ ID NO:39)和JK5(SEQ ID NO:41)的等量混合物用作3’末端的PCR引物。
对于扩增λ链可变区的引物,将分别对应于人抗体λ链可变区的框架1中保守的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO:44、46、48、50、52、54和56)的VL1(SEQ ID NO:43)、VL2(SEQ ID NO:45)、VL3(SEQID NO:47)、VL4(SEQ ID NO:49)、VL5(SEQ ID NO:51)、VL6(SEQID NO:53)和VL7(SEQ ID NO:55)的等量混合物用作5’末端的PCR引物,将分别对应于人抗体λ链可变区的框架4中保守的C末端氨基酸序列(SEQ ID NO:58、60和62)的JL1(SEQ ID NO:57)、JL2(SEQID NO:59)和JL3(SEQ ID NO:61)的等量混合物用作3’末端的PCR引物。
按照制造商的说明书,用Perkin Elmer Gene Amp PCR系统2400和RNA PCR试剂盒(AMV)(TAKARA生物公司)进行PCR反应。结果,用κ链引物进行PCR,轻链得到扩增;但是,用λ链引物进行PCR扩增,轻链没有得到扩增。因此,这就揭示了:杂交瘤所产生的抗体的轻链是κ链。
用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)对扩增的编码重链或轻链可变区的各DNA片段进行纯化。接着,用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将纯化得到的PCR产物连接到pCR2.1-TOPO,并用获得的质粒转化大肠杆菌。挑取出现的菌落,用QIAGEN Plasmid mini试剂盒(QIAGEN)分离质粒,然后,用EcoR I在37℃酶切消化15分钟,并在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳,以鉴定插入的是否为目的DNA片段。
用M13引物通过CEQ 2000 DNA分析系统(Beckman)分析数个菌落中的DNA插入片段的核苷酸序列。结果,从重链的分析中鉴定出包括H09(SEQ ID NO:63)、H12(SEQ ID NO:65)、H27(SEQ ID NO:67)和H30(SEQ ID NO:69)在内的4条序列。从κ链的分析中鉴定出包括K30(SEQ ID NO:71)、K31(SEQ ID NO:73)、K32(SEQ ID NO:75)、K35(SEQ ID NO:77)、K39(SEQ ID NO:79)、KMO5(SEQ ID NO:97)、KMO6(SEQ ID NO:99)、KMO26(SEQ ID NO:101)、KMO36(SEQ ID NO:103)、KMO40(SEQ ID NO:105)在内的10条序列。在这些序列中,H09、H12、H27、H30、K30、K31、K32、K35和K39被认为编码人抗体的重链和轻链。通过比较这些核苷酸序列和相应的氨基酸序列(重链:SEQ ID NO:64、66和68;κ链:SEQ ID NO:70、72、74、76、78和80),确定了每条重链和轻链的可变区的核苷酸序列(重链:SEQ ID NO:81;轻链:SEQ ID NO:83)和氨基酸序列(重链:SEQ ID NO:82;轻链:SEQ ID NO:84)。
对于编码HoAKs-1抗体的基因,进一步确定了相对于上述经确定序列3’区的一段序列。使用对应于在人抗体重链可变区的框架1中保守的N末端氨基酸序列的PCR引物VH3(SEQ ID NO:5)作为5’端引物,使用对应于人抗体重链恒定区氨基酸序列的PCR引物IgMFOR(SEQ IDNO:108)作为3’端引物,利用PCR对重链基因3’端区域进行扩增。将所得到的PCR产物通过上述相同方法插入质粒,以确定核苷酸序列。结果,确定了一条位于上述重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:81)的3’端之后的、由57个核苷酸组成的序列(SEQ ID NO:110)。预测这条核苷酸序列编码19个氨基酸(SEQ ID NO:111)。包括这57个核苷酸的编码HoAKs-1抗体重链的基因的核苷酸序列和所述预测的氨基酸序列,分别在SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119中显示。另一方面,因为这57个核苷酸还包含有编码恒定区的序列,所以只包括编码可变区部分(24个核苷酸)的HoAKs-1抗体重链可变区的基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115中显示。
使用对应于在人抗体K链可变区的框架1中保守的N末端氨基酸序列的PCR引物VK4(SEQ ID NO:27)作为5’端引物,使用对应于人抗体κ链恒定区C末端的氨基酸序列的PCR引物GKFOR(SEQ ID NO:109)作为3’端引物,利用PCR对编码HoAKs-1抗体κ链的基因进行扩增。将所得到的PCR产物通过上述相同方法插入质粒,以确定核苷酸序列。结果,确定了一条位于上述κ链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:83)的3’端之后、由99个核苷酸组成的序列(SEQ ID NO:112)。预测该核苷酸序列编码33个氨基酸(SEQ ID NO:113)。包括这99个核苷酸序列的编码HoAKs-1抗体κ链的基因的核苷酸序列和所述预测的氨基酸序列,分别在SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121中显示。另一方面,因为这99个核苷酸还包含有编码恒定区的序列,所以只包括编码可变区的部分(24个碱基)的HoAKs-1抗体κ链可变区基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117中显示。
参考Kabat等人的文献(免疫学感兴趣的蛋白序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest),第五版,国家健康研究所,Bethesda,MD,1991),确定了高变区(CDR)和框架之间的边界。结果,重链高变区被确定为HCDR1(核苷酸序列:SEQ ID NO:85;氨基酸序列SEQID NO:86)、HCDR2(核苷酸序列:SEQ ID NO:87;氨基酸序列SEQID NO:88)和HCDR3(核苷酸序列:SEQ ID NO:89;氨基酸序列SEQID NO:90)。轻链高变区被确定为LCDR1(核苷酸序列:SEQ ID NO:91;氨基酸序列SEQ ID NO:92)、LCDR2(核苷酸序列:SEQ ID NO:93;氨基酸序列SEQ ID NO:94)和LCDR3(核苷酸序列:SEQ ID NO:95;氨基酸序列SEQ ID NO:96)。
(8)形态变化的持续时间
将通过加入HoAKs-1抗体观察到形态变化的胰腺癌细胞系PANC-1用于研究其形态变化的持续时间。胰腺癌细胞系PANC-1在约100μg/mlHoAKs-1抗体存在时于37℃在5%的CO2的条件下培养5天,然后,用不含有HoAKs-1抗体的培养基对培养基进行更换,再培养7天。去掉HoAKs-1抗体后的第3天、第6天和第7天的细胞形态显微图片在图6中显示。即使在去掉所述抗体之后,还长时间连续观察到由HoAKs-1抗体引起的PANC-1细胞的形态变化。
(9)HoAKs-1抗体与活的癌细胞表面的结合
将胰腺癌细胞系PANC-1、人肺癌细胞系HLC-1和人血管内皮细胞HUVECs接种到96孔板(3603,可获自Corning公司),并在37℃于5%的CO2条件下培养1天。然后在板上加入含有50μg/ml的在实施例(3)-2中描述的经生物素化的HoAKs-1抗体和0.05%叠氮化钠的溶液,并在室温下反应60分钟。去除所述抗体溶液后,加入含有20nM的QdotTM565链霉抗生物素蛋白标记(可获自Quantm Dot公司)和0.05%叠氮化钠的溶液,并在室温下培养30分钟。去除所述溶液后,加入含有0.05%叠氮化钠的PBS溶液,并用共聚焦荧光显微镜(CSU10,可获自YokogawaElectric公司)观察细胞。HoAKs-1抗体与各活细胞的表面的结合在图7中显示。HoAKs-1抗体结合到PANC-1和HLC-1的活细胞表面(图7-A和7-C),但未与HUVEC细胞结合(图7-E)。用作对照的人IgM抗体未与任何细胞结合(图7-B、图7-D和图7-F)。
(10)对来自胰腺癌细胞系PANC-1约为55kDa蛋白具有抗性的小鼠单克隆抗体的制备
(10)-1:对小鼠的免疫和细胞融合
用在实施例(6)-1中描述的相同方法从PANC-1细胞匀浆中制备经RIPA缓冲液增溶后的不可溶组分中的蛋白。将约180μg的所述蛋白在10%的丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后,用考马斯亮兰对凝胶进行染色,并切下对应约55kDa蛋白的条带,所述蛋白与HoAKs-1抗体反应。
将切下的凝胶破碎后,与0.2ml的弗氏完全佐剂(DIFCOLABORATORIES)混合。将该混合物对小鼠(Balb/cAJcl,6周龄,雌性,CLEA JAPAN)通过腹膜内注射进行初次免疫。再过2周后,将同样种类的凝胶与不完全佐剂混合,将按照上述相同方法得到的制剂对小鼠进行再次免疫。4天后,从同一小鼠取出脾脏。制备淋巴细胞(2.4×108个细胞),并按标准方法(单克隆抗体实验指南(Experimental Manual forMonoclonal Antibody),由Kodansha Scientific出版),与小鼠骨髓瘤细胞P3U1s进行融合。用加有常规浓度的HAT的培养基D(eRDF+50μg/ml庆大霉素+10% FCS)悬浮融合细胞。将悬浮液分装到96孔板,在37℃于CO2培养箱中培养。在细胞融合约2周后,检测到杂交瘤的出现。用培养物上清液通过Western印迹检测出其与约55kDa蛋白的反应性,据此选择目的杂交瘤。
(10)-2:与约55kDa蛋白的反应性的检测
使用来自PANC-1细胞匀浆的、经RIPA缓冲液增溶后的不可溶组分中的蛋白约4mg,在10%的丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将所述蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上,并封闭PVDF膜。从实施例(10)-1中所述96孔板的各孔中收集培养物上清液,并与转移后的PVDF膜在37℃反应1小时。用PBS-T冲洗PVDF膜。将抗鼠抗体的HRP(辣根过氧化物酶)偶联的羊抗体(1,000倍稀释,CAPPEL)加到所获得的PVDF膜上,并在37℃再反应1小时。接着,用PBS-T冲洗PVDF膜,用KonicaImmunostain HRP-1000(Konica)检测培养物上清液与约55kDa蛋白的反应性。通过有限稀释对来自检测到反应性的孔的杂交瘤进行克隆化,据此建立起2F6-1和3F9-1杂交瘤细胞系。
(11)抗55kDa小鼠单克隆抗体与活的癌细胞的表面的结合
(11)-1:抗55kDa小鼠单克隆抗体的纯化和标记
培养在实施例(10)-2中建立的2F6-1和3F9-1杂交瘤细胞系。收集各杂交瘤细胞系的培养物上清液,并装载到PROSEP-A上以纯化抗体。通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析发现每个单克隆抗体都是IgM(免疫球蛋白M)。按照生产商说明书用生物素化试剂对各纯化的抗体进行生物素化,然后通过凝胶过滤方法将标记的抗体与未游离的生物素分开。
(11)-2:所述抗体与活的癌细胞的表面的结合
通过与实施例(9)中相同方法将胰腺癌细胞系PANC-1、肺癌细胞系HLC-1和血管内皮细胞HUVECs接种到96孔板(3603,Corning),并在37℃于5%的CO2条件下培养1天。然后在板上加入含有50μg/ml的在实施例(11)-1中描述的经生物素化的抗55kDa鼠单克隆抗体和0.05%叠氮化钠的溶液,并在室温下反应60分钟。去除抗体溶液后,加入含有20nM的QdotTM565链霉抗生物素蛋白标记(Quantm Dot公司)和0.05%叠氮化钠的溶液,并在室温下反应30分钟。去除所述溶液后,加入含有0.05%叠氮化钠的PBS,用共聚焦荧光显微镜(CSU10,YokogawaElectric Corporation)观察细胞。抗55kDa鼠单克隆抗体与各活的癌细胞的表面的结合在图8中显示。来自2F6-1和3F9-1的抗体与实施例(9)所述的HoAKs-1抗体类似,结合到PANC-1和HLC-1的活细胞表面(图8-A、8-B、8-D和8-E),但不与HUVECs细胞结合(图8-G和图8-H)。
(12)通过Western印迹评价抗波形蛋白抗体和抗结蛋白抗体与约55kDa蛋白的反应性
将来自PANC-1细胞匀浆的、经RIPA缓冲液增溶后的不可溶组分中的蛋白,点样到10%的丙烯酰胺凝胶的泳道上进行电泳,每泳道约10μg。将蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上,并封闭该膜。使抗波形蛋白的小鼠单克隆抗体(sc-6260,Santa Cruz Biotechnology)或抗结蛋白的羊抗体(sc-7559,Santa Cruz Biotechnology)与所述PVDF膜在37℃反应1小时。然后用PBS-T冲洗PVDF膜并加入抗鼠抗体的辣根过氧化物酶偶联的羊抗体(稀释1,000倍,CAPPEL)或抗羊抗体的辣根过氧化物酶偶联的鼠抗体(稀释1,000倍),并进一步在37℃反应1小时。接着,用PBS-T冲洗PVDF膜,并用Western印迹鲁米诺试剂检测与所述抗体反应的物质。虽然抗波形蛋白对约55kDa蛋白表现出反应性,但抗结蛋白抗体没有表现出反应性。
这些结果表明,被HoAKs-1抗体识别的来自PANC-1的约55kDa蛋白被确定为波形蛋白,在对所述蛋白具有反应性的抗体中,存在与活的癌细胞的表面具有结合能力的抗体。
(13)γ-HoA.(重组HoAKs-1抗体)的制备
(13-1)cDNA的制备和编码HoAKs-1可变区的DNA片段的克隆
按照生产商说明书,使用Perkin Elmer Gene Amp PCR系统2400和ThermoScript RT-PCR系统加带铂标签的高保真DNA聚合酶(ThermoScript RT-PCR Systems plus platinum Tag DNA polymerase HighFidelity,Invitrogen),由总RNA(在实施例(7)中描述)进行cDNA的制备和PCR反应。以在试剂盒中提供的随机6聚体作为引物来制备重链的cDNA。以P1(SEQ ID NO:122)为引物,制备κ链的cDNA。
为了扩增重链和κ链的可变区,使用带有用于插入到表达质粒中的限制性酶切位点的引物。为了扩增重链可变区,使用在5’末端含有HindIII位点和信号序列的引物P2(SEQ ID NO:123)和在3’侧含有Nhe I位点的引物P3(SEQ ID NO:124)。为了扩增K链可变区,使用在5’侧含有HindIII位点和信号序列的引物P4(SEQ ID NO:125)和在3’侧含BsiWI位点的引物P5(SEQ ID NO:126)。
用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)对扩增的重链和κ链的可变区的各DNA片段进行纯化。接着,为了插入到表达载体中,用限制性酶对DNA片段进行酶切消化。使用HindIII和Nhe I,在37℃酶切消化重链片段2小时。首先使用BsiW I,在37℃对κ链的DNA片段进行2小时的酶切消化,然后用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化,接着再用HindIII在37℃酶切消化2小时。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)对酶切消化的DNA片段进行1.5%琼脂糖电泳以纯化目的DNA片段。
(13-2)表达质粒的酶切消化和质粒片段的制备
为了表达HoAKs-1的人IgG1(免疫球蛋白G1)型重组抗体,将含有重链恒定区序列的pEX-G1-WLpHy用作表达重链的质粒,将含有κ链恒定区序列的pKS-κ’-Hind-5用作表达κ链的质粒。在37℃,用HindIII和Spe I对pEX-G1-WLpHy酶切消化2小时。在37℃,用Asp718对pKS-κ’-Hind-5酶切消化2小时,然后用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化,在37℃,再用HindIII酶切消化2小时。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN),将酶切消化片段进行0.8%琼脂糖电泳,以纯化目的片段。
(13-3)将HoAKs-1可变区插入到表达质粒中
按照生产商说明书,使用连接试剂盒Ver.2.1(TAKARA生物公司),将通过上述方法获得的含HoAKs-1重链可变区的DNA片段插入到经过酶切消化的表达质粒pEX-G1-WLpHy中,并按照生产商说明书,用获得的质粒转化大肠杆菌DH5α-T1(Invitrogen)。挑取出现的菌落并用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化所述质粒。在37℃,用Nde I对含有重链核苷酸序列的质粒进行1小时的酶切消化,并进行1.5%琼脂糖电泳,据此获得所需质粒pEX-HoAKs-H。在5’端使用引物P6(SEQ IDNO:127)、3’端使用引物P7(SEQ ID NO:128)对所获得的质粒的核苷酸序列进行分析。HoAKs-1重组抗体的重链结构基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:129中显示。
另一方面,按照生产商说明书,使用连接试剂盒Ver.2.1(TAKARA生物公司),将含HoAKs-1κ链可变区的DNA片段插入到经过酶切消化的表达质粒pKS-κ’-Hind-5中,并用获得的质粒转化大肠杆菌DH5α-T1(Invitrogen)。挑取出现的菌落,并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化所述质粒。在37℃,用BsiW I对含有所述κ链核苷酸序列的质粒进行1小时的酶切消化,并进行1.5%琼脂糖电泳,据此获得所需的质粒pKS-HoAKs-K。在5’端使用引物P6、在3’端使用引物P1,对所获得的质粒的核苷酸序列进行确认。HoAKs-1重组抗体κ链结构基因的核苷酸序列在SEQ ID NO:131中显示。
(13-3)将编码HoAKs-1重链的基因插入到含有HoAKs-1的κ链的质粒中
为了将HoAKs-1的重链和κ链连接到一个质粒上,用限制性内切酶对上述获得的质粒进行酶切消化。用Nhe I在37℃对pEX-HoAKs-H进行2小时的酶切消化;用Nhe I和Spe I在37℃对pKS-HoAKs-K进行2小时的酶切消化。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化所得到的片段。按照生产商说明书,用连接试剂盒Ver.2.1(TAKARA生物公司)将所述片段相互连接,并用得到的质粒转化大肠杆菌DH5α-T1(Invitrogen)。挑取出现的菌落,并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化所述质粒。在37℃,用Nhe I对所获得的质粒进行30分钟的酶切消化,并进行0.8%琼脂糖电泳,据此获得所需的质粒pEX-HoAKs-HK。
(13-4)γ-HoA.表达质粒的构建
将以上获得的pEX-HoAKs-HK与含有dhfr基因的质粒pSV2dhfr”连接,以构建表达γ-HoA.的质粒。首先,用BamH I和Nhe I在37℃对pEK-HoAKs-HK进行2小时的酶切消化,然后,进行0.8%琼脂糖电泳,接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化目的DNA片段。用BamH I和Nhe I在37℃对pSV2dhfr”进行2小时的酶切消化,然后加入碱性磷酸酶(TAKARA生物公司)在65℃处理15分钟,接着用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化。其后,将所得到的混合物进行0.8%琼脂糖电泳,并用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化目的DNA片段。
根据生产商说明书,用连接试剂盒Ver.2.1(TAKARA生物公司)将所述片段相互连接,并用所获得的质粒转化大肠杆菌DH5α-T1(Invitrogen)。挑取出现的菌落,用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化质粒。然后用Nde I在37℃将所获得的质粒酶切消化1小时,并进行1.5%的琼脂糖电泳,据此获得所需的用于表达重组抗体的质粒pEX-HoAKs-HK/pSV2dhfr”。
(13-5)产生γ-HoA.的细胞的制备
以可培养在没有血清的培养基中的CHO(DG325)细胞系作为生产γ-HoA.的细胞系。在CHO-S-SFM II(GIBCO)中将CHO(DG325)稀释到1×106个细胞/毫升。其后,按照生产商说明书,将2μg的pEX-HoAKs-HK/pSV2dhfr”DNA与6μL的FuGENE6(罗氏)进行混合以转染CHO(DG325)。转染后5小时,加入EX-CELL325-PF(Nichirei)。经过2天的培养,向培养基中加入400μg/ml的G418硫酸盐(Promega)和0、25nM或50nM的氨甲喋呤(Sigma)以便选择,并进一步培养,据此获得产生γ-HoA.的细胞。
(13-6)通过ELISA(酶联免疫吸附)测定法测定抗体的产量
通过夹心ELISA测定所述细胞产生的γ-HoA.的量。首先,用溶液1(PBS)将兔抗人免疫球蛋白抗体(CAPPEL)稀释到50μg/ml,并分装到96孔弹性板(FALCON),每孔50μL,在37℃处理2小时。然后去掉孔中的溶液,将溶液2(0.1%明胶/PBS/0.05%吐温20)加到孔中,每孔200μL,在4℃反应16小时或更长时间。去掉各孔中的溶液,往板中加入经溶液2稀释的培养物上清液,每孔50μL,在4℃培养16小时或更长时间。反应后,去掉每个孔中的溶液。经溶液3(PBS/0.05%吐温20)冲洗5次后,往板中加入经溶液2稀释1,000倍的HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗人免疫球蛋白抗体(CAPPEL),每孔50μL,在37℃反应1小时。去掉各孔中的溶液。经PBS/0.05%吐温20冲洗5次后,往板中加入底物溶液(避光且用前校准),每孔50μL,在所述底物溶液中,50mM的柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中溶解有邻苯二胺片(Wako PureChemical Industries),并添加有过氧化氢溶液。为了显色,将板在室温下反应约3分钟,之后,加入1N的硫酸,每孔50μL,以终止反应。使用多板测读仪SPECTRA MAX250(Molecular Devices)测定在L1=495nm处的吸光度(A1)和在L2=650nm处的吸光度(A2),计算A1-A2的值。稀释人IgGlκ(CAPPEL)用作标准溶液来制作标准曲线,以计算所述抗体在培养物上清液中的含量。根据计算结果,选择具有最大抗体产量的细胞用于生产γ-HoA.。
(13-7)γ-HoA.的纯化
将以上所获得的产生γ-HoA.的细胞系培养在添加有G418硫酸盐(Promega)和氨甲喋呤(Sigma)的EX-CELL325-PF(Nichirei)中,以获得含有γ-HoA.的培养基。接着,将该培养基装载到PROSEP-A上以使γ-HoA.吸附在其上面。然后洗脱吸附的γ-HoA.,据此对γ-HoA.进行纯化。通过SDS-PAGE,确定γ-HoA.为纯的IgG(免疫球蛋白G)(未显示)。
(14)检测γ-HoA.与来自胰腺癌细胞系PANC-1的约55kDa蛋白的反应性
将来自PANC-1细胞匀浆的、经RIPA缓冲液增溶后的不可溶组分中的蛋白各10μg在10%的丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将蛋白从凝胶中转移到PVDF膜上,并封闭该膜。将转移的PVDF膜与在实施例(13-7)中所述的纯化的γ-HoA.在37℃反应1小时。用PBS-T冲洗PVDF膜,将抗人抗体的辣根过氧化物酶偶联的羊抗体(稀释1,000倍,CAPPEL)加到所得到的PVDF膜上,并在37℃再反应1小时。接着,用PBS-T冲洗PVDF膜,并用Western印迹鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology)检测γ-HoA.与约55kDa蛋白的反应性,结果显示,γ-HoA.和HoAKs-1抗体一样,与约55kDa蛋白具有反应性。
(15)γ-HoA.与活的癌细胞的表面的结合
将胰腺癌细胞系PANC-1、肺癌细胞系HLC-1和血管内皮细胞HUVECs接种到96孔板(3603,Corning),并在37℃于5%的CO2条件下培养1天。然后在板上加入含有实施例(13-7)中所述的纯化的γ-HoA.和0.05%叠氮化钠的溶液,并在室温反应60分钟。去除γ-HoA.溶液后,加入含有稀释20倍的FITC偶联的抗人抗体的羊抗体(CAPPEL)和0.05%叠氮化钠的溶液,并在室温反应30分钟。去除所述溶液后,加入含有0.05%叠氮化钠的PBS,用共聚焦荧光显微镜(CSU10,Yokogawa ElectricCorporation)观察细胞。所述抗体与各活细胞的表面的结合在图9中显示。和在实施例(9)所述的HoAKs-1抗体一样,γ-HoA.表现出与PANC-1和HLC-1的活细胞的表面的结合(图9-A和9-C),但与HUVEC细胞没有结合(图9-E)。