CN100515175C - 拟南芥的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了拟南芥的培养方法。该方法包括以下步骤：1)对种子进行灭菌，然后将种子在2-4℃、湿润，黑暗条件下春化处理1-3天；2)将经灭菌的培养基质装到经灭菌的培养盆中，然后将培养盆放在盛有水的托盘中，静置12-24小时后将托盘中多余的水分倒出，再向基质表面喷洒水，将种子播到基质表面；3)将播种后的培养盆连同底部托盘置于经灭菌的人工气候箱中，调节人工气候培养箱的环境因子控制器，使光周期为15-17小时光照，7-9小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2 s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90%；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90%，经培育得到拟南芥植株。

Description

拟南芥的培养方法

技术领域

本发明涉及拟南芥的培养方法，特别是涉及一种在人工气候箱中培养拟南芥的方法。

背景技术

拟南芥由于植株形体小，生活周期短，结实率高以及基因组小等特点，长期以来一直被作为遗传学、发育生物学和分子生物学的模式材料使用，被誉为植物界的“果蝇”。以拟南芥为材料进行实验，培养出健壮、无病虫害感染的植株是实验成功的基础。

通常，可以在温室、室内或人工气候箱中对拟南芥进行培养。拟南芥的生长发育对各种环境因子(如温度、湿度、光照等)的变化特别敏感，同时也非常容易感染病虫害，因此，较难培养出健壮、无病虫害感染植株。由于温室和室内各种环境因子的变异幅度很大，同时又很容易出现病虫害交叉感染，所以在温室或室内环境条件下，植株的生长发育速度往往难以控制，长势也很弱，并且病虫害感染严重。但是，在人工气候箱中各种环境因子都可以得到比较精确地控制；同时，箱体内环境与外界隔离可以有效地避免病虫害感染。虽然目前有一些实验室利用人工气候箱培养拟南芥，但培养出来的植株的生长状况仍然达不到实验要求，致使很多实验进程由于拟南芥的生长状况未达到实验要求而受到影响，因此，迫切需要一种在人工气候箱中培养健壮、无病虫害感染的拟南芥的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可在人工气候箱中重复培养出健壮、无病虫害感染的拟南芥的方法。

本发明所提供的拟南芥的培养方法，包括以下步骤：

1)对种子进行灭菌，然后将种子在2-4℃、湿润、黑暗条件下春化处理1-3天；

2)将经灭菌的培养基质装到经灭菌的培养盆中，然后将培养盆放在盛有水的托盘中，静置12-24小时，使基质通过毛细作用充分吸足水，基质水分饱和后，将托盘中剩余的水倒出，将种子播到基质表面；

3)将播种后的培养盆连同底部托盘置于经灭菌的人工气候箱中，调节人工气候培养箱的环境因子控制器，使光周期为15-17小时光照，7-9小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％，经培育得到拟南芥植株。

在上述培养方法中，步骤1)对种子进行灭菌的方法可为：先将种子用70％乙醇(V/V)浸泡30秒，然后倒出乙醇，立即用7％NaClO(W/V)溶液浸泡10分钟，最后将种子用蒸馏水清洗4-6次，每次30s。较优选的春化条件为：将种子放在湿润滤纸上，在4℃下避光处理2天。

步骤2)中所用的水优选为蒸馏水或去离子水。可采用常规的培养基质对拟南芥进行培养，如将普通市售花卉培养土与蛭石按2-3∶3-2的比例混合后得到的混合物，所述普通市售花卉培养土中的N、P和K总含量高于2.65％，有机质含量高于45％，腐殖酸含量高于9％，蛭石颗粒直径可为3-4mm。对培养基质进行灭菌的方法可为：在121-123℃下高压灭菌20-30分钟，优选为25分钟；对培养盆进行灭菌的方法可为：将培养盆用按1∶2500-3500比例稀释的“84”消毒液浸泡至少2小时，然后用水将残留的消毒液清洗干净。播种前最好向基质表面再喷洒一些水，使基质表面湿润。

步骤3)中对人工气候箱进行灭菌的方法可为：先用水将人工气候箱清洗干净，再在箱体内喷洒70％乙醇(V/V)，关闭箱门杀菌12-24小时，最后开门通气，使箱体内的乙醇完全挥发，以避免残余乙醇对苗产生毒害作用。在培育过程中，可根据拟南芥植株生长发育所需的最适环境因子对人工气候箱中各种环境因子的数值进行设置，人工气候箱中各环境因子的数值优选为：光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为350μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为23℃，相对湿度为80％；黑暗条件下的温度为19℃，相对湿度95％。

此外，由于人工气候箱对湿度的调控能力有限，可在箱体外面再添加一个加湿器，以保证箱体内的相对湿度在适宜范围内。加湿器可位于人工气候箱旁边的地面上，在临近加湿器的人工气候箱的一个侧面设置一个圆孔，用一根输料管连接加湿器排气孔和人工气候箱圆孔；所述输料管直径与人工气候箱侧面上的圆孔孔径相同。

植株在生长过程中，可每隔2-4天将培养盆在人工气候箱中的位置随机更换一次，每隔5-7天浇一次水。

此外，为使拟南芥长得更加健壮，可在幼苗长出2片真叶和植株刚抽苔时施加液体肥料，并将盆中的表面土层轻轻松动；所述液体肥料可为1/2MS培养液或1/2Hoagland培养液等。

所述浇水和施肥的方法为：将水或液体肥料倒入托盘中，静置12-24小时，盆中基质通过毛细作用吸收水分或养分，然后将托盘中剩余的水或液体肥料倒出。

上述培养方法对任意生态型的野生型拟南芥及其突变体均适用，包括Columbia、WS和Ler等。

本发明提供了一种在人工气候箱中培养拟南芥的方法。在本发明的培养方法中，对种子、培样基质、培养盆、培养箱等进行灭菌处理是为避免拟南芥植株受到病虫害感染；对种子进行春化处理是为保证种子的萌发时间比较一致；精确控制人工气候箱中的各种环境因子的数值，定期随机改变培养盆在箱体内的位置、浇水、施肥及松土是为保证拟南芥植株健壮生长，同时也可防止病虫在基质表层繁殖，进一步降低感染病虫害的可能性；此外，利用毛细作用吸收水分或营养液可以避免直接浇水对基质的冲刷。实验证明，用本发明方法培育拟南芥，约40天就可以获得健壮、无病虫害感染的开花的拟南芥植株，约60天种子开始成熟，整个生活周期约100天，且用该方法培育的拟南芥植株不仅生长健壮、无病虫害感染，同时各个世代的植株生长发育速率及各种形态指标的重复性较好，完全能够满足各种实验的要求。本发明具有重复性好、简单易行的优点，将在拟南芥的培育中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为拟南芥在人工气候箱中萌芽后40天的生长状况

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、拟南芥的培育

现用本发明的方法在人工气候箱中培育拟南芥，包括以下步骤：

1)拟南芥种子的灭菌：先将生态型为Columbia的拟南芥种子用70％乙醇(V/V)浸泡30秒，然后倒出乙醇，立即用7％NaClO(W/V)溶液浸泡10分钟，最后将种子用蒸馏水清洗5次，每次30s。

2)春化处理：将经灭菌的种子放在底部垫湿润滤纸的培养皿中(不要让水把种子淹没)，放在4℃冰箱中避光处理2天。

3)在121℃下对培养基质高压灭菌25分钟；将培养盆用按1∶3000比例稀释的“84”消毒液浸泡4小时，然后用自来水将残留的消毒液清洗干净。

4)将经灭菌的培养基质装到经灭菌的培养盆中，然后将培养盆放在盛有蒸馏水的托盘中，静置12-24小时，使基质通过毛细作用充分吸足水，基质水分饱和后，将托盘中剩余的水倒出，向基质表面喷洒少许蒸馏水使基质表面湿润即可，用牙签将种子播到基质表面(不要让种子被基质覆盖，因为种子萌发需要光)；

5)对人工气候箱进行灭菌：先用水将人工气候箱清洗干净，再在箱体内喷洒70％乙醇(V/V)，关闭箱门杀菌12-24小时，最后开门通气，使箱体内的乙醇完全挥发，以避免残余乙醇对苗产生毒害作用。

6)将播种后的培养盆连同底部托盘置于经灭菌的人工气候箱中，调节人工气候培养箱的环境因子控制器，使光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为350μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为23℃，相对湿度为80％；黑暗条件下的温度为19℃，相对湿度95％。由于人工气候箱对湿度的调控能力有限，再在箱体外面再添加一个加湿器，加湿器位于人工气候箱左侧地面上，人工气候箱左侧面离地面40cm处有一个直径为3cm的圆孔，一根直径3cm输料管连接加湿器和人工气候箱圆孔，其中加湿器电源插头与培养箱背部所附有的电源插座相连接，以协助调控箱体内的相对湿度。

7)每隔3天将培养盆在人工气候箱中的位置随机更换一次，每隔6天浇一次水，浇水的方法为：将水倒入托盘中，静置12-24小时，然后将托盘中剩余的水倒出。

8)在幼苗长出2片真叶和植株刚抽苔时施加1/2MS培养液，施肥方法与步骤7)的浇水方法相同，同时将盆中的表面土层用牙签轻轻松动。

播种后约40天，植株就可以开花(如图1所示)，60天后角果中种子就开始成熟，整个生活周期约100天，证明用本发明的培养方法可得到健壮、无病虫害感染的拟南芥植株。

Claims (8)

1、一种拟南芥的培养方法，包括以下步骤：

1)对种子进行灭菌，然后将种子在2-4℃、湿润，黑暗条件下春化处理1-3天；所述对种子进行灭菌的方法为：先将种子用体积百分浓度为70％的乙醇浸泡30秒，然后倒出乙醇，用质量百分浓度为7％的NaClO溶液浸泡10分钟，最后将种子用蒸馏水清洗4-6次，每次30s；所述春化条件为：将种子放在湿润滤纸上，在4℃下避光处理2天；

2)将经灭菌的培养基质装到经灭菌的培养盆中，然后将培养盆放在盛有水的托盘中，静置12-24小时后将托盘中多余的水分倒出，将经步骤1)处理的种子播到基质表面；

3)将播种后的培养盆连同底部托盘置于经灭菌的人工气候箱中，调节人工气候培养箱的环境因子控制器，使光周期为15～17小时光照，7-9小时黑暗；光强为300-400μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的温度为18-20℃，相对湿度大于90％，经培育得到拟南芥植株。

2、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2)中的水为蒸馏水或去离子水；所述培养基质为将市售花卉培养土与蛭石按2-3∶3-2的比例混合后得到的混合物，所述市售花卉培养土中的N、P和K总含量高于2.65％，有机质含量高于45％，腐殖酸含量高于9％，蛭石颗粒直径为3-4mm；对培养基质进行灭菌的方法为：在121-123℃下高压灭菌20-30分钟；对培养盆进行灭菌的方法为：先将培养盆用按1∶2500-3500比例稀释的“84”消毒液浸泡至少2小时，再用水冲掉残留的消毒液；播种前向基质表面喷洒水。

3、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤3)中对人工气候箱进行灭菌的方法为：先用水对人工气候箱进行清洗，再在箱体内喷洒体积百分浓度为70％乙醇，关闭箱门杀菌12-24小时，最后开门通气；将人工气候箱中各环境因子的数值设为：光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为350μmol m^-2s^-1；光照条件下的温度为23℃，相对湿度为80％；黑暗条件下的温度为19℃，相对湿度95％。

4、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：在所述人工气候箱箱体外面添加一个加湿器，加湿器位于人工气候箱旁边的地面上，在临近加湿器的人工气候箱的一个侧面设置一个圆孔，用一根输料管连接加湿器排气孔和人工气候箱圆孔；所述输料管直径与人工气候箱侧面上的圆孔孔径相同。

5、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：每隔2-4天将培养盆在人工气候箱中的位置随机更换一次，每隔5-7天浇一次水；所述浇水的方法为：将水倒入托盘中，静置12-24小时，然后将托盘中剩余的水倒出。

6、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：在幼苗长出2片真叶和植株刚抽苔时施加液体肥料，并将盆中的表面土层轻轻松动；所述液体肥料为1/2MS培养液或1/2Hoagland培养液；所述施肥的方法为：将液体肥料倒入托盘中，静置12-24小时，然后将托盘中的剩余液体倒出。

7、根据权利要求1-6任一项所述的培养方法，其特征在于：所述拟南芥包括野生型拟南芥及其突变体。

8、根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于：所述拟南芥的生态型为Columbia、WS或Ler。

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