CN100503422C - 微结构错流式分离芯片 - Google Patents

Abstract

本发明的“一种微结构错流式分离芯片”，由硅质基片、沟道和盖片组成，沟道中的微柱或微坝作为分离过滤结构，其基于错流分离原理，沟道中微柱或微坝的排列方向与沟道轴向平行，且沿沟道轴向方向上微柱间的间隙大小或微坝顶端与盖片间的间隙大小由所需分离颗粒尺寸决定，微柱或微坝将沟道沿轴向至少分为两条微通道，不同尺寸颗粒在不同的微通道中流动并从不同出样口流出，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。本发明利用微机电系统技术研制了一种基于错流过滤原理的分离芯片，采用错流式分离颗粒从原理上解决了芯片堵塞问题，并能进行循环分离，以获得纯度更高的目标颗粒。

Description

微结构错流式分离芯片

技术领域

本发明涉及生物芯片技术领域，是一种能对样品(颗粒、细胞等)进行分离或过滤预处理的芯片，具体来讲，是在芯片上采用错流分离或过滤的方式进行样品的预处理。

背景技术

对复杂样品(尤其是生物样品)进行预处理是后续任何一个生化实验所必须的。其中对复杂生物样品各组分的分离或过滤技术相当重要，研究者们需要从原始样本中分离提取目标组分用于后续分析实验。例如，利用离心技术可以有效分离生物样品各组分。

目前在生物学和生命科学应用领域中的发展趋势是生物分析设备和器件的自动化与微型化。基于微机电系统(MEMS)技术的微流控生物芯片的研究开发受到了特别关注。微流控生物芯片是指利用微机电系统(MEMS)技术在一片固体基片(一般是硅片，还可以是玻璃、PDMS等其他材料)上制备出各种微结构(如微管道、槽、微柱、坝式结构等)，芯片中流体在流动过程中完成各种生物、化学、物理反应和处理。微流控芯片的最终目标是集样品预处理、基因扩增等微流体生化反应和分离检测分析为一体的便携式生化分析系统，实现生化分析的全过程集成在一块芯片上完成，并实现生化分析的自动化、连续化和微缩化。现在DNA扩增、电泳分离等芯片的研究较多，样品预处理芯片研究缓慢。样品预处理是指处理天然生物样品(如血液、尿液等)，首先分离目标微粒或生物微粒(如血液中的白细胞、孕妇血液中的胎儿细胞、尿液中的某种细菌)，然后对分离后的目标微粒或生物微粒进一步分离纯化处理得到细胞组分(如目标细胞破胞后释放生物分子，再经提纯芯片获得DNA、RNA、蛋白质分子等)。对于复杂生物样品必须进行细胞分离和捕获以降低其分析的复杂性，样品预处理芯片的研究和开发对于集成化的微流控芯片的研究有着非常重要的意义。用于微芯片上分离和捕获细胞的方法主要有：微过滤法、介电电泳法、超声波法、场效应分离法和磁珠分离技术等。

微过滤原理是指通过制作柱状、弯曲沟道、梳状、堰状、筛等微结构，根据不同细胞尺寸的差异进行物理分离的一种方法，要求目标细胞与杂质细胞必须有明显的尺寸差异。

目前利用微过滤原理制作的分离芯片研究已有一定进展。但已报道分离芯片均是盲端过滤式分离芯片。盲端过滤(又称死端过滤，dead-flowfiltration)是指它的给水流方向垂直于过滤介质的表面流动，固体被过滤介质截流，逐步形成滤饼，随着过滤的持续进行和滤饼层的增厚，过滤速度明显减少，直至过滤介质完全堵塞、滤液停止流出，易造成芯片的堵塞，从而使分离颗粒的效率降低，同时芯片中微结构的间隙尺寸唯一，只能完成单一颗粒的分离过滤。

发明内容

本发明的目的在于制备一种过滤分离效果好，可进行循环流动分离，能进行多种颗粒分离过滤的微结构错流式分离芯片，该芯片中流体的流动平行于分离过滤结构表面，使滤出的微颗粒不会造成芯片的堵塞。

为达到上述目的，本发明的技术解决方案是提供一种微结构错流式分离芯片，由硅质基片、沟道和盖片组成，基于错流分离原理，沟道中有微柱，微柱和微柱间隙作为分离过滤结构，微柱的排列方向与沟道轴向平行，微柱将沟道沿轴向至少分为两条微通道，且沿沟道方向上微柱间的间隙大小由所需分离颗粒的尺寸决定，尺寸大于微柱间隙的颗粒被分离过滤结构所阻挡留在微通道中，尺寸小于微柱间隙的颗粒通过分离过滤结构进入另一微通道中，不同尺寸颗粒在不同的微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。

所述的错流式分离芯片，其所述硅质基片上至少有一个进样口，一个或多个出样口，出样口与相应的微通道相连通，作为收集不同尺寸颗粒的出口。

所述的错流式分离芯片，其所述盖片是玻璃盖片或玻璃一聚二甲基硅氧烷复合盖片。

所述的错流式分离芯片，其所述沟道中微柱结构是圆柱或方柱，其上端与盖片相连接。

所述的错流式分离芯片，其所述沟道中具有一列或多列微柱，排列方向与沟道轴向平行，每列微柱间的间隙相同，不同列的微柱间的间隙不同，且间隙依次减少或增大，不同列微柱间隙分别由所需分离颗粒的尺寸决定，尺寸大于微柱间隙的颗粒被分离过滤结构所阻挡留在微通道中，尺寸小于微柱间隙的颗粒通过分离过滤结构进入另一微通道中，不同尺寸颗粒在不同的微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。

所述错流式分离芯片，其所述出样口与进样口相连接，分离出的颗粒再次从进样口导入芯片，进行循环分离，提高分离颗粒纯度。

一种微结构错流式分离芯片，由硅质基片、沟道和盖片组成，基于错流分离原理，沟道中有微坝，微坝顶端与盖片间的间隙作为分离过滤结构，微坝与沟道轴向平行，微坝将沟道沿轴向至少分为两条微通道，且微坝顶端与盖片间的间隙大小由所需分离颗粒的尺寸决定，尺寸大于微坝与盖片的间隙的颗粒被分离过滤结构所阻挡留在微通道中，尺寸小于微坝与盖片的间隙的颗粒通过分离过滤结构进入另一微通道中，不同尺寸颗粒在不同的微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。

所述的错流式分离芯片，其所述硅质基片上至少有一个进样口，一个或多个出样口，出样口与相应的微通道相连通，作为收集不同尺寸颗粒的出口。

所述的错流式分离芯片，其所述盖片是玻璃盖片或玻璃—聚二甲基硅氧烷复合盖片。

所述的错流式分离芯片，其所述沟道中具有一列或多列微坝，微坝与沟道轴向平行，不同列的微坝顶端与盖片间的间隙不同，且微坝顶端与盖片间的间隙依次减少或增大，微坝顶端与盖片间的间隙大小由所需分离颗粒的尺寸决定，尺寸大于微坝与盖片的间隙的颗粒被分离过滤结构所阻挡留在微通道中，尺寸小于微坝与盖片的间隙的颗粒通过分离过滤结构进入另一微通道中，不同尺寸颗粒在不同的微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。

所述错流式分离芯片，其所述出样口与进样口相连接，分离出的颗粒再次从进样口导入芯片，进行循环分离，提高分离颗粒纯度。

本发明利用微机电系统(MEMS)技术研制了一种基于错流过滤原理的分离芯片，采用错流式分离颗粒从原理上解决了芯片堵塞问题。另外，进行循环分离可以获得纯度更高的目标颗粒。更重要的是，该分离芯片的研究为微全分析系统的研制打下了良好的基础。对于采用错流式过滤原理分离颗粒、流体流动平行于分离过滤结构表面的芯片均落在本发明的保护范围内。沟道的宽度、长度或沟道中微柱的直径、高度或沟道中微坝的尺寸可以根据具体情况有所变化，沟道、微柱及微坝的任何形状和尺寸均落在本发明的保护范围内，此外，微结构分离芯片可同时采用微柱式分离过滤结构和微坝式分离过滤结构对不同尺寸颗粒进行分离。

附图说明

图1：为本发明错流分离(过滤)原理图；

图2：为本发明微柱式错流分离芯片示意图；其中：图2A为芯片整体示意图；图2B为微柱式结构俯视示意图；图2C为微柱式结构显微镜照片；

图3：为本发明微坝式错流分离芯片示意图；其中：图3A为芯片整体示意图，图3B为微坝式结构俯视示意图；图3C为图3B中f—f的微坝式结构截面图；图3D为微坝式结构显微镜照片；

图4：为本发明微结构多通道错流分离芯片示意图：其中：图4A为微柱式多通道错流分离芯片分离过滤结构俯视图，对称列微柱间隙相等，不同列微柱间隙不等；图4B为微坝式多通道错流分离芯片分离过滤结构俯视图；图4C为图4B中f—f的微坝式多通道错流分离芯片坝式结构截面图。

具体实施方式

本发明基于错流过滤原理分离细胞，错流过滤(又称交叉过滤或切流过滤，crossflow filtration)是指它的给水流方向平行于分离过滤结构表面流动，经过分离过滤结构的筛分与截流，小尺寸颗粒随液体通过分离过滤结构，大尺寸颗粒随液体向前继续流动并在切向流过程中带走被截留在分离过滤结构表面的固体。由于在错流过滤中，流动平行于分离过滤结构表面，在分离过滤结构表面可形成较大的剪切力，固体颗粒的运动受沿分离过滤结构表面平行流动的剪切流和垂直于分离过滤结构表面的过滤渗透流的共同作用，固体颗粒在分离过滤结构表面沉积程度大大减少，分离过滤结构阻塞物质始终处于悬浮状态，减少阻塞物质在分离过滤结构的聚集，从而提高过滤效率并能循环过滤。错流过滤原理如图1所示，其中，1为分离过滤结构，2为样品初始流向，3为小尺寸固体颗粒随液体流向，4为大尺寸固体颗粒随流体流向。待滤样品依初始流向2进入芯片主通道，其中小尺寸固体颗粒经过分离过滤结构1过滤后随液体流向3流走，大尺寸固体颗粒被分离过滤结构1截留后随流体流向4流走。

图2为本发明微柱式错流分离芯片，A为芯片整体示意图；B为微柱式结构俯视示意图；C为微柱式结构显微镜照片。其中，a为样品进样口，b和c为出样口，5为主流通道，6为错流分离滤出液通道，7为微柱。微柱式错流分离芯片的结构如图2A所示，沟道呈之字型连续排列在芯片上，其一端连接于样品进样口a，另一端连接于出样口b、c。微柱式结构俯视示意图如图2B所示，沟道中设有依轴向排列的两列微柱7，两列微柱7间隙相同(一列微柱7即可完成两种尺寸范围颗粒的分离，两列微柱7对称排列增大分离面积，提高分离效率)，微柱7的结构是圆柱或方柱，其上端与盖片相连接。两列微柱7将沟道沿轴向分隔出主流通道5和两条错流分离滤出液通道6，主流通道5另一端连接于出样口b，两条滤出液通道6由出样口b两侧成环形连接于出样口c。上述芯片上的结构为盖片(图中没示出)所覆盖，盖片上与样品进样口a、出样口b、c相对的位置有通孔。

图3为本发明微坝式错流分离芯片，A为芯片整体示意图；B为微坝式结构俯视示意图；C为B图中f—f的微坝式结构截面图；D为微坝式结构显微镜照片。其中，a为样品进样口，d为缓冲液进样口，b和c为出样口，5为主流通道，6为错流分离滤出液通道，8为微坝，9为硅质基片，10为盖片。微坝式错流分离芯片的结构如图3A所示，沟道呈之字型连续排列在芯片上，其一端连接于样品进样口a和缓冲液进样口d，沟道另一端连接于出样口b、c。微坝式结构俯视示意图如图3B所示，沟道中设有依轴向排列的两列微坝8，两列微坝8与盖片的间隙相同(一列微坝8即可完成两种尺寸范围颗粒的分离，两列微坝8对称排列增大分离面积，提高分离效率)，两列微坝8将沟道沿轴向分隔出主流通道5和两条错流分离滤出液通道6，主流通道5另一端连接于出样口b，两条滤出液通道6由出样口b两侧成环形连接于出样口c。上述芯片上的结构为盖片10所覆盖，如图3C所示，盖片10上与样品进样口a、缓冲液进样口d、出样口b、c相对的位置有通孔。

图4为本发明微结构多通道错流分离芯片，A为微柱式多通道错流分离芯片分离过滤结构俯视图，对称列微柱间隙相等，不同列微柱间隙不等；B为微坝式多通道错流分离芯片分离过滤结构俯视图；C为B图中f—f的微坝式多通道错流分离芯片坝式结构截面图。其中，a为样品进样口，b、c和e为出样口，5为主流通道，6为错流分离滤出液通道，7为微柱I，7a为微柱II，微柱I7、微柱II7a的间隙依次减少，10为盖片，8为微坝I，8a为微坝II，微坝I8、微坝II8a分别与盖片10的间隙依次减少，9为硅质基片。图4所示多通道错流分离芯片的结构与图2、3相似，只是增加了错流分离滤出液通道6的条数，增加了微柱7和微坝8的列数。

图2、3所示的微柱式错流分离芯片和微坝式错流分离芯片可以分离两种尺寸范围的颗粒，而图4所示微结构多通道错流分离芯片则可以分离3种不同尺寸范围的颗粒。如果在图4芯片基础上再增加不同间隙的分离过滤分离结构(微柱或微坝)，可实现4种或以上不同尺寸范围的颗粒的分离。

如图2、3、4所示，本发明的一种微结构错流式分离芯片，由硅质基片9、沟道和盖片10组成，沟道中设有微柱7、7a，微柱7、7a将沟道分隔出主流通道5和滤出液通道6，如图2、4所示。其中的微柱7、7a结构作为分离过滤结构，基于错流分离原理，沟道中微柱7、7a结构的排列方向与沟道的轴向平行，且在与沟道轴向平行方向上，微柱7、7a组成若干列，每列微柱7、7a相互间的间隙尺寸为需分离颗粒的尺寸，微柱7、7a结构将沟道划分为多条微通道，如主流通道5和滤出液通道6，不同尺寸颗粒在不同微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。硅质基片9有一个或多个进样口，本实施例为一个进样口，多个出样口，出样口分别与相应的微通道相连通，作为收集不同尺寸颗粒的出口；或只有一个出样口，则分离出一种尺寸颗粒，其他颗粒留在芯片内。盖片10是玻璃盖片或玻璃—聚二甲基硅氧烷(PDMS)复合盖片。沟道中微柱7、7a结构是圆柱或方柱。分离芯片可以具有一列或多列微柱7、7a结构，排列方向与沟道轴向平行，每列微柱7、7a的间隙相同，不同列的微柱7、7a的间隙不同，分别为不同预分离颗粒尺寸大小，间隙依次减少或增大。出样口可以与进样口通过软管、通道等任意连接方式相连接，分离颗粒可以再次从进样口导入芯片，循环分离，提高分离颗粒纯度。

本发明还提供另一种错流式分离芯片，由硅质基片9、沟道和盖片10组成，沟道中设有微坝8、8a，微坝8、8a将沟道分隔出主流通道5和滤出液通道6，如图3、4所示。基于错流分离原理，沟道中具有多条微沟道，微沟道的方向与沟道轴向平行，多条微沟道由不同的微坝8、8a结构隔开，微坝8、8a结构与盖片10间的空隙作为分离过滤结构，且保证微坝8、8a结构与盖片10间的空隙尺寸为需分离颗粒尺寸，不同尺寸颗粒在不同微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。硅质基片9有一个或多个进样口，本实施例为一个进样口，多个出样口，出样口分别与相应的微通道相连通，作为收集不同尺寸颗粒的出口；或只有一个出样口，则分离出一种尺寸颗粒，其他颗粒留在芯片内。盖片10是玻璃盖片或玻璃—聚二甲基硅氧烷(PDMS)复合盖片。分离芯片可以具有一列或多列微坝8、8a结构，微坝8、8a走向与沟道轴向平行，微坝8、8a结构与盖片10的间隙尺寸为需分离颗粒的尺寸，不同列的微坝8、8a结构与盖片10的间隙不同，分别为不同预分离颗粒尺寸，间隙依次减少或增大。出样口可以与进样口通过软管、通道等任意连接方式相连接，分离颗粒可以再次从进样口导入芯片，循环分离，提高分离颗粒纯度。

已知老鼠外周血中红细胞呈双凹圆盘形，平均直径约为6微米，厚2微米；白细胞一般成球形，大部分白细胞直径大于10微米，满足过滤分离的要求，本发明以老鼠血为生物预分离样品，对红细胞和白细胞进行分离。

实施例1

根据老鼠外周血细胞尺寸设计柱式错流分离芯片，芯片如图2所示。芯片由玻璃—聚二甲基硅氧烷(PDMS)复合盖片10和硅质基片9封装而成，芯片尺寸为2cm×1cm。其中，玻璃—PDMS盖片10上包含进样孔和出样孔；硅质基片9上沟道总宽为200μm，微柱7直径为20μm，微柱7间隙为3～7μm，由于只是分离红细胞和白细胞两种颗粒，只需设计一列微柱7阵列，同时调整微柱7间隙即可达到两种细胞分离的效果。本实施例设计成两列对称排列的微柱7阵列(两列微柱7间隙相同，用于增大分离面积，提高分离效率)。

柱式错流分离芯片制备过程如下：清洗硅片，甩光刻胶，光刻显影，深刻蚀30μm制备主流通道(如图2中通道5)和错流分离滤出液通道(如图2中通道6)以及刻蚀出微柱式分离过滤结构(如图2中微柱7)，热氧化在硅片表面上形成1000厚SiO₂，最后硅质基片9与玻璃—PDMS复合盖片10封装完成芯片的制备。玻璃—PDMS复合盖片10制备过程如下：玻璃片与硅片进样口和出样口相对应位置超声波打孔，基质与固化剂按10：1比例混合制成PDMS前体，PDMS前体抽气后旋涂于打孔玻璃上，于80℃烘烤30min备用。

血液样品稀释后通过蠕动泵从进样口(图2中a进样口)导入芯片，白细胞尺寸较大不能从微柱7间隙通过，只能在中间微通道5中随着液体向前流动，最后从白细胞出样口(图2中b出样口)流出；红细胞尺寸较小则从微柱7间隙通过，同样由于泵力驱动在两侧微通道6中随着液体向前流动，最终从红细胞出样口(图2中c出样口)流出，分别收集白细胞和红细胞进行血细胞计数。结果表明，采用该细胞分离芯片分离老鼠外周血，红细胞出口收集液明显呈红色，其中含有占总红细胞约80％的红细胞和少量白细胞。分析原因有两个，一是白细胞在泵力驱动下变形后通过微柱7间隙；二是本身有部分白细胞尺寸较小可直接通过微柱7间隙。白细胞出口收集液几乎呈无色，其中含有大量白细胞和部分红细胞，分析原因在分离过程中红细胞还没有来得及通过微柱7间隙就随着白细胞一起流到了白细胞出口，可以把这部分收集液通过进样口与出样口间的连接软管再次从进样口导入进行循环分离，可以获得纯度更高的白细胞。

实施例2

根据老鼠外周血细胞尺寸设计微坝式错流分离芯片，芯片如图3所示。芯片由玻璃盖片10和硅质基片9阳极键合而成，芯片尺寸为2cm×1cm。其中，玻璃盖片10上包含进样孔和出样孔；硅质基片9上沟道总宽为200μm，微坝8宽20μm，微坝8与玻璃盖片10间隙为3～7μm。由于只是分离红细胞和白细胞两种颗粒，只需设计一个微坝8式结构，同时调整微坝8式结构与盖片10的间隙即可达到两种细胞分离的效果。本实施例设计成一组两列微坝8式结构，对称排列(用于增大分离面积，提高分离效率)。微坝式错流分离芯片制备过程如下：清洗硅片9，甩光刻胶，光刻显影，深刻蚀3～7μm制备微坝8式结构，然后第二次光刻显影，深刻蚀30μm制备主流通道5(如图3中通道5)和错流分离滤出液通道6(如图3中通道6)，然后硅片9背面蒸铝作为掩膜，背面光刻显影，深刻蚀进样孔a、d和出样孔b、c，去掉铝掩膜，热氧化在硅片表面形成

厚SiO₂，最后硅质基片与玻璃阳极键合完成细胞分离芯片的制备。

血液样品稀释后通过蠕动泵从进样口a(图3中进样口a)导入芯片，空白缓冲液通过蠕动泵从进样口d(图3中进样口d)导入芯片用于促进红细胞流动，白细胞从出样口b(图3中出样口b)流出；红细胞从出样口c(图3中出样口c)流出。分离结果同样表明，采用微坝式结构的错流分离芯片同样具有良好的分离效果，红细胞出口收集液明显呈红色，白细胞出口收集液几乎呈无色。

Claims (11)

1.一种微结构错流式分离芯片，由硅质基片、沟道和盖片组成，其特征在于：基于错流分离原理，沟道中有微柱，微柱的排列方向与沟道轴向平行，微柱将沟道沿轴向至少分为两条微通道，且沿沟道方向上微柱间的间隙大小由所需分离颗粒的尺寸决定，微柱和微柱间隙作为分离过滤结构，尺寸大于微柱间隙的颗粒被分离过滤结构所阻挡留在微通道中，尺寸小于微柱间隙的颗粒通过分离过滤结构进入另一微通道中，不同尺寸颗粒在不同的微通道中流动，实现不同尺寸颗粒的分离和收集。

2.如权利要求1所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述硅质基片上至少有一个进样口，一个或多个出样口，出样口与相应的微通道相连通，作为收集不同尺寸颗粒的出口。

3.如权利要求1所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述盖片是玻璃盖片或玻璃—聚二甲基硅氧烷复合盖片，

4.如权利要求1所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述沟道中微柱是圆柱或方柱，其上端与盖片相连接。

5.如权利要求1所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述沟道中具有一列或多列微柱，排列方向与沟道轴向平行，每列微柱间的间隙相同.不同列的微柱间的间隙不同，且间隙依次减少或增大，不同列微柱间隙分别由所需分离颗粒的尺寸决定。

6.如权利要求1、2、3、4或5所述错流式分离芯片.其特征在于：所述出样口与进样口相连接，分离出的颗粒再次从进样口导入芯片，进行循环分离，提高分离颗粒纯度。

7.一种微结构错流式分离芯片，由硅质基片、沟道和盖片组成，其特征在于：基于错流分离原理，沟道中有微坝，微坝顶端与盖片间的间隙作为分离过滤结构，微坝与沟道轴向平行，微坝将沟道沿轴向至少分为两条微通道，且微坝顶端与盖片间的间隙大小由所需分离颗粒的尺寸决定，流体流动方向与分离过滤结构平行。

8.如权利要求7所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述硅质基片上至少有一个进样口，一个或多个出样口，出样口与相应的微通道相连通，作为收集不同尺寸颗粒的出口。

9.如权利要求7所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述盖片是玻璃盖片或玻璃—聚二甲基硅氧烷复合盖片。

10.如权利要求7所述的错流式分离芯片，其特征在于：所述沟道中具有一列或多列微坝，微坝与沟道轴向平行，不同列的微坝顶端与盖片间的间隙不同，且微坝顶端与盖片间的间隙依次减少或增大，不同列的微坝顶端与盖片间的间隙分别由所需分离颗粒的尺寸决定。

11.如权利要求7、8、9或10所述错流式分离芯片，其特征在于：所述出样口与进样口相连接，分离出的颗粒再次从进样口导入芯片，进行循环分离，提高分离颗粒纯度。

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