CN100478672C - 乳链菌肽生物效价的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳链菌肽生物效价的测定方法，属于包含微生物的测定方法。该方法首先确定标准曲线A＝aInY+b；并经检测培养基对检测菌—藤黄八叠球菌进行活化；制备菌悬液，然后将菌悬液在检测培养液中培养，用752分光光度计在600nm的波长下以空白检测培养基为参比，测定培养后的检测培养液吸光值A，然后根据吸光值与溶液中乳链菌肽生物效价的标准曲线关系，计算出乳链菌肽样品生物效价。本发明与目前的琼脂扩散法相比，测定时间由24小时减少到5小时，显著提高工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及包含微生物的测定方法，具体是一种应用分光光度法测定发酵液或产品中乳链菌肽生物效价的乳链菌肽生物效价的测定方法。
背景技术
乳链球菌肽(Nisin)是一种由微生物发酵生产的有效生物防腐剂，已在50多个国家广泛应用于乳及乳制品、发酵饮料、罐藏食品、肉类及肉制品的防腐。
目前，乳链菌肽通常是通过微生物发酵法进行生产。发酵过程中的乳链菌肽生物效价、产品乳链菌肽生物效价以及含有乳链菌肽的复合防腐剂生物效价都是用琼脂扩散法进行测定。其原理是在琼脂表面利用检测菌—藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)生长显示乳链菌肽的抑菌圈反映乳链菌肽的生物效价。该方法操作过程复杂，影响因素很多，要准确掌握其测定方法是一件难事。而且更主要的问题是这种测定方法需要一天即24小时才能得出测定结果。因此，为了对微生物发酵法生产过程进行更好控制，加快复合防腐剂的开发，迫切需要开发一种快速测定发酵液或产品中乳链菌肽生物效价方法。
发明内容
本发明目的就是为了解决目前使用琼脂扩散法测定乳链菌肽生物效价操作过程复杂和时间长的问题，而提供一种快速的乳链菌肽生物效价的测定方法。
本发明是根据在具有不同浓度的乳链菌肽培养溶液中检测菌在生长对数中期具有对应的细胞浓度，而溶液中的细胞浓度由分光光度计精确测定，从而确定所测的样品中乳链菌肽效价。
本发明是按以下技术方案实现的。
一种乳链菌肽生物效价的测定方法，
①标准曲线为：A＝a InY+b；其中，Y为乳链菌肽标准品的生物效价，A为对应的吸光值，a和b为稀释样品和再稀释1倍后的样品所确定的常数；
②乳链菌肽样品生物效价的测定：
a.检测菌的活化：检测培养基对检测菌—藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)进行活化，固体斜面培养16-24小时，然后4℃保藏；
b.菌悬液的制备：灭菌蒸馏水接入活化的检测菌，使菌悬液的吸光值为0.1-0.3；
c.样品在检测培养液中培养：在检测培养液中按20∶1比例接入菌悬液，估计样品的生物效价，对样品进行稀释，接入稀释样品和再稀释1倍后的样品各1毫升，摇床转速120转/分，36℃分别培养5小时；
d.分光光度法测定样品：用752分光光度计在600nm的波长下以空白检测培养基为参比，测定培养后的检测培养液吸光值A，然后根据吸光值与溶液中乳链菌肽生物效价的标准曲线关系，计算出乳链菌肽样品生物效价。
所述的测定方法，将乳链菌肽标准品用pH为2.5的盐酸水溶液配成生物效价分别为6.66u/ml和3.33u/ml各100毫升，按与这两个乳链菌肽标准溶液对应样品的生物效价测定吸光值，从而确定标准曲线。
所述的测定方法，其检测培养基由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％、琼脂粉1.5％，加水至100％制备的。
所述的测定方法，其检测培养液由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％，加水至100％制备的。
本发明的主要优点：
3.大幅度减少测定时间，由目前的琼脂扩散法24小时减少到本应用发明的5小时；
4.操作更加简便，容易掌握，显著提高工作效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体的说明。
实施例1：发酵液乳链菌肽生物效价
(1)在由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％、琼脂粉1.5％制备的固体斜面检测培养基中活化检测菌—藤黄八叠球菌，培养16-24小时，4℃保藏，3天之内可使用。
(2)菌悬液的制备：蒸馏水在120℃下灭菌20分钟，然后接入检测菌—藤黄八叠球菌，使菌悬液的吸光值为0.2。
(3)将乳链菌肽标准品用pH为2.5的盐酸水溶液配成生物效价分别为6.66u/ml和3.33u/ml各100毫升，按与这两个乳链菌肽标准溶液对应的稀释样品和再稀释1倍后样品的生物效价测定吸光值为0.280和0.304，从而确定的标准曲线为A＝-0.0797InY+0.202。
(4)检测培养液的制备：检测培养液的配方为水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaC1 0.5％。100毫升的三角瓶装入60毫升检测培养液，在115-120℃下灭菌20分钟。
(5)发酵液在检测培养液中的培养：在检测培养液中按60毫升培养液中接入菌悬液3毫升，估计发酵液的生物效价为4000u/ml，对发酵液进行稀释600倍和1200倍，接入1毫升稀释后的发酵液，在36℃摇床转速为120转/分培养5小时。
(6)发酵液乳链菌肽生物效价：用752分光光度计在600nm的波长下测定发酵液检测培养后的检测培养液吸光值A为0.28l和0.304，然后根据吸光值与溶液中乳链菌肽生物效价的标准曲线关系，计算出发酵液乳链菌肽生物效价为3941u/ml。
(7)与琼脂扩散法比较：琼脂扩散法测得的乳链菌肽发酵液生物效价为4056u/ml，与琼脂扩散法测得的乳链菌肽发酵液生物效价相比，本法相对误差在2.8％。
实施例2：盐析废液乳链菌肽生物效价
(1)在由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％、琼脂粉1.5％制备的固体斜面检测培养基中活化检测菌—藤黄八叠球菌，培养16-24小时，4℃保藏，3天之内可使用。
(2)菌悬液的制备：蒸馏水在120℃下灭菌20分钟，然后接入检测菌—藤黄八叠球菌，使菌悬液的吸光值为0.1。
(3)将乳链菌肽标准品用pH为2.5的盐酸水溶液配成生物效价分别为300和600各100毫升；按与这两个乳链菌肽标准溶液对应的稀释样品和再稀释1倍后样品的生物效价测定吸光值，而确定的标准曲线为A＝-0.0797InY+0.202。
(4)检测培养液的制备：检测培养液的配方为水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％。100毫升的三角瓶装入60毫升检测培养基，在115-120℃下灭菌20分钟。
(5)盐析废液在检测培养液中的培养：在检测培养液中按60毫升培养液中接入菌悬液3毫升，估计发酵液的生物效价为150u/ml，对盐析废液进行稀释100倍和200倍，接入1毫升稀释后的盐析废液，在36℃摇床转速为120转/分培养5小时。
(6)盐析废液乳链菌肽生物效价：用7.52分光光度计在600nm的波长下测定发酵液检测培养后的检测培养液吸光值A为0.372和0.428，然后根据吸光值与溶液中乳链菌肽生物效价的标准曲线关系，计算出盐析废液乳链菌肽生物效价为112u/ml。
(7)与琼脂扩散法比较：琼脂扩散法测得的盐析废液乳链菌肽生物效价为115u/ml，与琼脂扩散法测得的盐析废液乳链菌肽生物效价相比，本法相对误差在2.3％。
实施例3：产品乳链菌肽生物效价
(1)在由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％、琼脂粉1.5％制备的固体斜面检测培养基中活化检测菌—藤黄八叠球菌，培养16-24小时，4℃保藏，3天之内可使用。
(2)菌悬液的制备：蒸馏水在120℃下灭菌20分钟，然后接入检测菌—藤黄八叠球菌，使菌悬液的吸光值为0.1。
(3)将乳链菌肽标准品用pH为2.5的盐酸水溶液配成生物效价分别为300和600各100毫升，按与这两个乳链菌肽标准溶液对应的稀释样品和再稀释1倍后样品的生物效价测定吸光值，而确定的标准曲线为A＝-0.0797InY+0.202。
(4)检测培养液的制备：检测培养液的配方为水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％。100毫升的三角瓶装入60毫升检测培养基，在115-120℃下灭菌20分钟。
(5)产品在检测培养液中的培养：在检测培养液中按60毫升培养液中接入菌悬液3毫升，估计产品的生物效价为1000u/mg，将5mg产品溶解在用pH＝2.5的5毫升盐酸中，然后分别稀释300倍和600倍，接入1毫升产品盐酸液，在36℃摇床转速为120转/分培养5小时。
(6)产品液乳链菌肽生物效价：用752分光光度计在600nm的波长下测定产品检测培养后的检测培养液吸光值A为0.279和0.307，然后根据吸光值与溶液中乳链菌肽生物效价的标准曲线关系，计算出本溶液的效价为2118u/mg，由此得出产品乳链菌肽生物效价为1059u/mg。
(7)与琼脂扩散法比较：琼脂扩散法测得产品乳链菌肽生物效价为1045u/mg，与琼脂扩散法测得产品乳链菌肽生物效价相比，本法相对误差在1.4％。
Claims (4)
1.一种乳链菌肽生物效价的测定方法，其特征在于
①设定的标准曲线为：A＝aInY+b；其中，Y为乳链菌肽标准品的生物效价，A为对应的吸光值，a和b为稀释样品和再稀释1倍后的样品所确定的常数；
②乳链菌肽样品生物效价的测定：
a.检测菌的活化：检测培养基对检测菌—藤黄八叠球菌进行活化，固体斜面培养16-24小时，4℃保藏；
b.菌悬液的制备：灭菌蒸馏水接入活化的检测菌，使菌悬液的吸光值为0.1-0.3；
c.样品在检测培养液中培养：在检测培养液中按20∶1比例接入菌悬液，估计样品的生物效价，对样品进行稀释，接入稀释样品和再稀释1倍后的样品各1毫升，摇床转速120转/分，36℃分别培养5小时；
d.分光光度法测定样品：用752分光光度计在600nm的波长下以空白检测培养基为参比，测定培养后的检测培养液吸光值A，然后根据吸光值与溶液中乳链菌肽生物效价的标准曲线关系，计算出乳链菌肽样品生物效价。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于将乳链菌肽标准品用pH为2.5的盐酸水溶液配成生物效价分别为6.66u/ml和3.33u/ml各100毫升，按与这两个乳链菌肽标准溶液对应的稀释样品和再稀释1倍后的样品的生物效价测定吸光值，从而确定标准曲线。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于检测培养基由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％、琼脂粉1.5％，加水至100％制备的。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于检测培养液由水解酪蛋白1％、牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、NaCl 0.5％，加水至100％制备的。
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| 管碟法测定Nisin效价. 伊守亮，肖林，顾正华，章克昌.无锡轻工大学学报，第23卷第4期. 2004 |
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