CN100475205C - Ar-a014418在制备防治神经退行性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及AR-A014418在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用。该产品是含有AR-A014418和医学上可以接受的制剂辅料的药物组合物，其中的AR-A014418能与GSK-3β的ATP结合位点结合，抑制GSK-3β的活性，阻止神经元凋亡，从而达到防治神经退行性疾病的目的。该药物作用靶点明确，能有效阻止神经元的丢失，对防治神经退行性疾病有很好的疗效。

Description

AR-A014418在制备防治神经退行性疾病药物中的应用

技术领域：

本发明涉及一种防治神经退行性疾病的药物，具体涉及AR-A014418在制备防治神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术：

神经退行性疾病是指人体的神经元发生退行性变化而引起的一系列病症，多发于老年人群，大大影响了人们的生活质量。其中帕金森病(Parkinson′s disease，PD)和老年性痴呆症(Alzheimer′s disease，AD)是最为常见的两种神经退行性疾病。因神经元凋亡导致神经元丢失是神经退行性疾病的主要病理特征，但长期以来，由于找不到明确的药物作用靶点，人们只能采用“治标”的方法来治疗这类疾病，通过服用或静脉注射特定的化学药物来补充病人大脑神经元匮乏的物质。例如PD的症状和体征能够被提高多巴胺功能的药物缓解，其中最有效的药物是左旋多巴。但是，左旋多巴不能有效地控制PD的自然病变进程，而且还有不良的副作用，例如开关现象和运动障碍。更令人失望的是，左旋多巴的治疗作用只能维持两年左右。如果长期使用，左旋多巴还可损害神经元，加速神经元的凋亡；又如，针对AD脑内乙酰胆碱不足，用胆碱酯酶抑制剂提高其浓度。但是，同样地，由于不能阻止神经元的丢失，所以也无法控制疾病的发展。因此，在防治神经退行性疾病方面，找到一种作用靶点明确、能有效阻止神经元丢失、有效控制疾病发展的药物是人们长期以来所追求的目标。

AR-A014418即N-(4-Methoxybenzyl)-N′-(5-nitro-1，3-thiazol-2-yl)urea(N-(4-甲氧苄基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-烃))，其化学结构式为

AR-A014418是一种1，3-硫氮杂茂类化合物，常温下为白色固体，微溶于水，在二甲亚砜中的溶解度为5mg/ml，目前常在实验室内作为糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的特异性抑制剂应用于凋亡信号转导通路的研究，还在动物模型上作抑郁症治疗的研究工作。

发明内容：

GSK-3β是介导神经元凋亡多通路的汇聚点(convergence site)，它在多种神经退行性疾病中表现为活性水平升高，是神经元凋亡的关键性激酶，是神经退行性疾病治疗的理想的药物靶点。本发明者研究发现，AR-A014418能够有效抑制神经元里的糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的活性，具有阻止神经元凋亡的作用。

因此，本发明的目的在于提供AR-A014418在制药中的应用。

本发明涉及AR-A014418在制备防治神经退行性疾病药物中的应用。

本发明具体涉及AR-A014418在制备防治帕金森病或老年性痴呆症药物中的应用。

本发明所述的应用，是含有AR-A014418和医学上可以接受的制剂辅料的药物组合物。

所述的AR-A014418能够经过胃肠道吸收，易于通过血脑屏障，因而可以采用口服剂型如制成片剂、颗粒剂、胶囊剂，也可以制成注射剂，还可以制成透皮吸收制剂如膜剂、乳剂、悬浮剂等。AR-A014418与医学上可以接受的制剂辅料，按照常规的制剂方法制成上述各种制剂，还可以与左旋多巴制成复方剂，以减轻左旋多巴对黑质纹状体多巴胺能神经元的损害。所述的AR-A014418可直接从Calbiochem公司购得，纯度≥95％。

所述的注射剂可以按AR-A014418与注射用水以0.9～1.1克∶90～110ml的比例均匀混合制得，优选比例1.0克∶100ml。

所述的胶囊剂可以由36～44重量份的AR-A014418与下列重量份的辅料均匀混合制得：

磷酸氢钙        36～44

HPMC4000cp      7.2～8.8

HPMC100cp       7.2～8.8

EC100cp         1.8～2.2

硬脂酸镁        0.9～1.1

滑石粉          0.9～1.1

所述的胶囊剂优选配比(重量份)为：

AR-A014418      40

磷酸氢钙        40

HPMC4000cp      8

HPMC100cp       8

EC100cp         2

硬脂酸镁        1

滑石粉          1

所述的片剂可以由下列组分(重量份)混合制得：

AR-A014418      18～22

淀粉            5.4～6.6

枸椽酸          0.18～0.22

10％淀粉浆      适量

1％硬脂酸镁     适量

所述的片剂的最优配比(重量份)为：

AR-A014418         20

淀粉               6

枸椽酸             0.2

10％淀粉浆         适量

1％硬脂酸镁        适量

所述的透皮吸收剂可以由以下组分(重量份)制得：

AR-A014418         45～55

硬脂酸             135～165

白凡士林           90～110

单硬脂酸甘油酯     77～93

甘油               68～82

吐温-80            27～33

对羟基苯甲酸乙酯   0.9～1.1

蒸馏水             适量

使最后的制剂中AR-A014418的含量为4～6％

最优配比(重量份)为：

AR-A014418         50

硬脂酸             150

白凡士林           100

单硬脂酸甘油酯     85

甘油               75

吐温-80            30

对羟基苯甲酸乙酯   1

蒸馏水             适量

使最后的制剂中AR-A014418的含量为5％

所述的AR-A014418还可以与左旋多巴制成复方剂，组分(重量份)为：

AR-A014418         18～22

左旋多巴           36～44

淀粉               5.4～6.6

枸椽酸             0.18～0.22

10％淀粉浆          适量

1％硬脂酸镁         适量

最优配比(重量份)为：

AR-A014418          20

左旋多巴            40

淀粉                6

枸椽酸              0.2

10％淀粉浆          适量

1％硬脂酸镁         适量

本发明的AR-A014418的使用剂量为：口服剂量每天1～10mg/kg体重；注射剂量降低一半。

本发明所述的防治神经退行性疾病药物药物的作用机理为：AR-A014418与GSK-3β的三磷酸腺苷(ATP)竞争，挤占了ATP的结合位点，从而使GSK-3β失去了能量供应，抑制了GSk-3β的活性，阻止神经元凋亡，达到防治神经退行性疾病的目的。

本发明所涉及的AR-A014418在制备防治神经退行性疾病药物中的应用，不仅能有效地抑制GSK-3β的活性，阻止神经元凋亡，而且作用靶点明确，因此疗效确切且显著。

附图说明：

图1为AR-A014418对MPP+诱导的中脑腹侧多巴胺能神经元的丢失的抵抗作用效果图(放大：40×)，其中a为溶剂对照组，b为10μMMPP+处理组，c为10nMAR-A014418对MPP+的毒性无影响，d和e为0.1，1.0μM AR-A014418挽救了TH阳性细胞，f为10μMAR-A014418对神经元有一定的毒性(×200)；

图2为AR-A014418对TH-阳性细胞保护作用的量效曲线图。

图3为AR-A014418对MPTP诱导的黑质多巴胺能神经元的丢失的抵抗作用效果图(放大：40×)，其中(a)为溶剂对照组，(b)为MPTP处理组，(c)为MPTP和3mg/kg AR-A014418处理组，(d)为MPTP和10mg/kg AR-A014418处理组，(e)为MPTP和30mg/kg AR-A014418处理组；

图4为AR-A014418在帕金森模型鼠实验中对中脑黒质内多巴胺能神经元的保护作用效果图。

图5为AR-A014418对黑质多巴胺能神经元保护作用的量效曲线图。

图6为在MPTP末次注射后第十天进行实验鼠的行为学测试结果图。

具体实施方式：

以下通过药理和药效实验进一步说明AR-A014418对防治神经退行性疾病的有益效果。

实验一AR-A014418对MPP+诱导体外多巴胺能神经元凋亡的抵抗作用

MPP+即1-甲基4-苯基-吡啶离子，MPP+是MPTP经单胺氧化酶B转变成的具有毒性的代谢产物，经多巴胺载体转运至多巴胺能神经元内，它对黑质多巴胺能神经元具有高亲和力、选择性毒害的作用。

1.取孕14天的大鼠，用CO₂窒息后颈椎脱臼致死。无菌条件下取出子宫，用冰D-Hank平衡盐液(Hyclone公司)洗净，再经75％酒精洗浴30s，置于盛有冰D-Hank液的平皿中。取出胚胎，于解剖显微镜下检查胎鼠的顶臀距(CRL)为10-12mm，置于盛有冰D-Hank液的平皿中待用。用解剖刀从眼睛经过嘴巴直到腹侧的中脑褶缝切一刀；滚动胎儿使其背向下，从脑干祛除前脑，暴露侧脑室系统和它作为第三脑室及中央导水管在脑干的延伸；用分离剪向背面剪去两边的脑室，接着近尾部剪一刀，在中脑皱褶的底部再剪一刀；腹侧中脑(ventralmesencephalon，VM)的残余就与脑的其他部分分离了。用镊子将上面的脑膜清除后将分离的VM放入另一个装有冷解剖液(500ml中含有氯化钠36.25g，氯化钾2g，NaH₂PO₄·2H₂O0.91g，葡萄糖13g，酚红50mg，HEPES 29.7g，pH 7.4)的皿中。剥去脑膜，用组织切片机切碎组织后加入0.1％胰酶溶液(必须在37℃浴槽内预热)20ml，在37℃下消化15min后加入10ml预热的DNA酶和胰酶抑制剂终止反应。1500rpm离心5min后吸去上清液，加入破碎液15ml(含1.2mg DNase I，7.8mg胰酶抑制剂，15ml解剖液，150μl 3.82％MgSO₄)；用吸管轻轻吹打10次，制成细胞悬液。静置15min，将上清(约为总体积的9/10)吸至另一试管中。1500rpm离心5min，用培养基稀释细胞悬液至5×10⁵个/ml。将细胞悬液接种在预先用多聚赖氨酸包被的24孔板(每孔0.5ml)内。置37℃，5％CO₂培养箱内培养，24小时后在培养液内加入5μM阿糖胞苷(Ara-C)以抑制胶质细胞生长。每3天换一次培养液，在倒置相差显微镜下动态观察细胞生长情况。所以相关制剂均购自Sigma公司。

2.将体外培养的多巴胺能神经元分成3个实验组(MPP+组、AR-A014418组和对照组)，AR-A014418实验组又分成6个浓度组，分别加入0.5μl 1000倍AR-A014418储存液，使终浓度分别为10nM、100nM、1μM、5μM、10μM和20μM；MPP+组和对照组加入等体积(0.5μl)的二甲基亚砜(DMSO)。2小时后，MPP+组和AR-A014418组加入0.5μl 10mM的MPP+(终浓度为10μM)，对照组加入等体积溶剂中。48小时后，细胞固定作酪氨酸羟化酶(TH)的免疫细胞化学染色，观察多巴胺能神经元的数量。结果发现，对照组中每高倍(20×)视野有12个TH-阳性细胞，MPP+组中多巴胺能神经元数量显著减少，每高倍(20×)视野有6个TH-阳性细胞；AR-A014418组中，100nM、1μM、5μM和10μM浓度组TH-阳性细胞明显增多，说明AR-A014418对MPP+诱导体外多巴胺能神经元凋亡具有很强的抵抗作用(见图1)。量效曲线显示AR-A014418对神经元的保护作用呈现明显的剂量依赖性，r＝0.9918(见图2)。

将图1a与b进行对比可以看出：MPP+使用后，黒质TH阳性细胞明显减少，而从图1f可看出：AR-A014418可浓度依赖性地增加黒质TH-阳性细胞数。

实验二AR-A014418对MPTP诱导的帕金森氏病的治疗作用

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种白色粉末状神经毒素，可特异地破坏多巴胺能神经细胞，从而损害大脑内黑质纹状体通路，使人与动物出现帕金森氏病的症状。

1.选取雄性C₅₇BL型小黑鼠100只，随机分为生理盐水组(NS组)、MPTP组和三个AR-A014418+MPTP组(AR组，分3、10、30mg/kg三个剂量组)，每组20只。用生理盐水配成浓度为6mg/ml的MPTP溶液。实验第一天，AR组分别腹腔注射0.3mg/ml、1mg/ml、3mg/mlAR-A014418 10ml/kg，NS组和MPTP组均腹腔注射3％DMSO 10ml/kg；第二天AR组先腹腔注射AR-A014418(剂量均同第一天)，其余组腹腔注射3％DMSO 10ml/kg。30min后AR组和MPTP组一起腹腔注射6mg/ml MPTP 5ml/kg，NS组腹腔注射等容量的生理盐水，连续5天(共6天)。

2.在MPTP末次注射后第7天，每实验组取两只小鼠，用10％水合氯醛麻醉，从左心室进针入主动脉，依次灌注血管冲洗液和4％PFA各50ml。血管冲洗液成分为：PBS 1000ml，1％NaNO₂ 2ml，肝素0.02g和NaCl 9g；

3.小鼠断头取全脑，在4％PFA中室温浸泡2小时，转移至30％蔗糖溶液中，4℃条件下静置12小时；

4.用冰冻切片机于黑质致密部切取35μm的脑片，悬浮于24孔板内的PBS液中。每隔5片取一片做酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化，观察黑质内残余多巴胺能神经元的情况。在MPTP末次注射后第10天，各实验组的小鼠在完成了行为学的检测后，颈椎脱臼致死。取全脑，沸水中煮2分钟后小心地剥离纹状体，称重，保存于-70℃，准备利用高效液相分析纹状体内多巴胺含量。

观察指标：黑质残存多巴胺能神经元计数、纹状体多巴胺含量和行为学的评分。

(1)AR-A014418对MPTP诱导黑质多巴胺能神经元的丢失具有很强的对抗作用

在MPTP末次注射后第7天，用ABC法检测黑质内残余多巴胺能神经元的数目。结果表明：与溶剂组对照，MPTP注射后，黒质TH阳性细胞明显减少，说明MPTP导致黑质内多巴胺能神经元的大量丢失(即图3(a)与(b)对比)，大约只残留对照组的57.06±6.35(P＜0.01)(见图1f)，而AR-A014418明显减少了因MPTP毒性所引起的多巴胺能神经元的丢失，并且可浓度依赖性地增加黒质TH-阳性细胞数(见图3(c)、(d)、(e))，说明AR-A014418的保护作用呈典型的剂量依赖性，r＝0.9857(见图5)。在AR-A014418的30mg/kg剂量组，黑质内多巴胺能神经元的数目与生理盐水组的相近，即达到了正常水平(见图3(e))。图4表明AR-A014418在10和30mg/kg的浓度时可以明显保护MPTP诱导死亡的TH-阳性细胞(^*P＜0.01，AR-A014418组与MPTP组相比)。

(2)AR-A014418提高了被MPTP降低的纹状体多巴胺的水平

在MPTP末次注射后第十天，检测纹状体内多巴胺的浓度。与生理盐水组(0.70±0.22ng/mg)相比，MPTP引起了纹状体多巴胺浓度的大幅度下降，只有0.21±0.06ng/mg(P＜0.01)；而AR-A014418却能浓度依赖性地提高纹状体多巴胺的含量(表1)，AR-A0144183、10、30mg/kg分别使多巴胺浓度上升至0.33±0.05(P＜0.01)、0.40±0.14(P＜0.05)和0.54±0.12(P＜0.01)。r＝0.9857。

AR-A014418提高了MPTP降低的纹状体多巴胺浓度

在MPTP末次注射后第十天，用高效液相测定纹状体多巴胺浓度，数据以平均值±标准误的形式表达，与溶剂对照组相比，^*P＜0.01；与MPTP处理组相比，^**P＜0.01，^***P＜0.05。

(3)AR-A014418改善了PD小鼠的行为学异常

在MPTP末次注射后第十天，对PD小鼠实施行为学检查。检查内容为爬杆试验(pole test)和悬挂实验(traction test)。

①爬杆试验(pole test)：

目的：检测小鼠肢体运动协调情况。

方法：将一直径为2.5厘米的软木小球固定于一根长50厘米直径1厘米的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下几个时间：小鼠在顶球上停留的时间；小鼠爬完杆子的上半部分所用的时间；小鼠爬完杆子的下半部分所用的时间。然后按以下标准计分：3秒内完成上述某一动作的记3分；6秒内完成的记2分；超过6秒的记1分。最后计算三项累计得分情况，并作统计学分析。爬杆实验的实施和评分按照方法学介绍的进行，数据以平均值±标准误的形式表示。与溶剂对照组相比：^*P＜0.01；与MPTP实验组相比：^**P＜0.01。

②悬挂实验(traction test)：

目的：检测小鼠肢体运动协调情况。

方法：将受试小鼠两前爪悬于一水平电线上，如小鼠用两后爪抓住电线则记3分；如用一后爪抓住电线则记2分。如果小鼠两后爪均抓不住电线则记1分，最后计算得分情况，并作统计学分析。

实验结果：在爬杆试验中，对照组小鼠爬完杆子的上半部分和下半部分所用的时间分别为2.61秒和3.94秒；而MPTP组小鼠则分别用了7.21秒和8.63秒(P＜0.01)。与MPTP组相比，AR-A014418+MPTP的三组使所用时间明显要少，其中10mg/kg剂量组所用的时间与对照组十分相近(见表2)。在悬挂试验中，对照组小鼠用四肢抓住电线，而MPTP组小鼠却只能用前爪抓住电线，后爪无力；AR-A014418处理的小鼠虽然有的后爪仍然运动受阻，但至少可以用一只后爪抓住电线，表明后肢运动有所改善。

表2.AR-A014418改善了MPTP处理鼠的行为学异常

在MPTP末次注射后十天进行实验鼠的行为学测试。爬杆试验和悬挂试验的实施和评分按照方法学介绍的进行，数据以平均值±标准误的形式表示。与对照组相比^*P＜0.01；与MPTP实验组相比，^**P＜0.01(见图6)。

实验三AR-A014418的急性毒性实验：

按国家药政管理规定，用昆明种封闭群健康小白鼠，体重20.0±0.5g，雌雄各25只，中山医科大学动物中心提供。随机分为五组，雌雄各5只，经口服灌胃一次性给药，剂量分别为1、10、100、1000、5000mg/kg，记录小鼠毒性反应情况和死亡动物分布，以Bliss统计法测定LD₅₀值。LD₅₀约为2200mg/kg，95％可信区间为1943～2457mg/kg；治疗指数约为90。实验结果表明：AR-A014418毒性低，安全性好。

实验四AR-A014418的慢性毒性实验：

实验动物：Wistar大白鼠，6周龄，100～120g，80只，雌雄各半。

实验方法：随机将大白鼠分成4组，每组各20只，雌雄各半，分为对照组及三个实验组(30mg/日，90mg/日，270mg/日，灌胃)。一次性腹腔注射，连续观察90天。

检测方法：(1)动物一般表现。(2)血常规及血生化指标。血红蛋白，红细胞，白细胞及分类。转氨酶，尿素氮，肌酐，胆固醇，甘油三酯，血糖，总蛋白，白蛋白。(3)病理学检查：肝，肾，胃，睾丸，卵巢。

实验结果：

(1)对大白鼠食欲、生长发育无影响，与对照组一样，体重增加，生长曲线为递增状态，而且毛发光洁，无脱毛，皮肤健康，活动正常，与对照组比较，无组间差异，P值＞0.05。

(2)大白鼠尿液、血液、生化等各项规定指标均在正常值范围内，与对照组比较，无组间差异，P值＞0.05。

(3)对大白鼠的心、肝、脾、肺、肾等各器官未引起器质性改变。

慢性毒性实验结果表明：AR-A014418毒性小，使用安全。

以下是用AR-A014418制备防治神经退行性疾病药物的具体实施例，但是本发明并非仅仅限制在这些实施例范围内。

实施例一注射液的制备

称取10克AR-A014418，溶于1000毫升注射用水中，溶解、超微滤膜过滤，即制成浓度为1克/100毫升(1％)的注射液，灭菌、分装。

对帕金森病患者和老年性痴呆症患者：皮下注射、肌注、缓慢静注的给药剂量均相同，一次50～100mg，一日2～3次。

实施例二片剂的制备

组方：AR-A014418      20g

      淀粉            6g

      枸椽酸          0.2g

      10％淀粉浆      适量

      1％硬脂酸镁     适量

将0.2g枸椽酸溶于20ml的10％淀粉浆中。取配比量AR-A014418、淀粉混合均匀，加适量含枸橼酸的10％淀粉浆制软材，过16目筛制粒，将湿颗粒于40-60℃干燥；16目筛整粒，加入适量1％硬脂酸镁后压片形成每片含100mg AR-A014418的片剂。

对帕金森病患者和老年性痴呆症患者：口服1日0.5～1.0g，分2～4次给予。

实施例三缓释胶囊剂的制备

组方：AR-A014418     10g

      磷酸氢钙       10g

      HPMC4000cp    2g

      HPMC100cp     2g

      EC100cp       0.5g

      硬脂酸镁      0.25g

      滑石粉        0.25g

胶囊包含的组成及重量百分比为：AR-A01441840％，磷酸氢钙40％，HPMC-4000cp 8％，HPMC100cp 8％，EC100cp 2％，硬脂酸镁1％，滑石粉1％。其制备方法为：将配比量AR-A014418、磷酸氢钙、HPMC4000cp、HPMC 100cp和EC 100cp分别过60目～100目筛，置混合机混匀，加入浓度为50％～75％乙醇作为润湿剂并搅拌制成软材，过14目～20目筛制粒，颗粒50℃～60℃干燥，14目～20目筛整粒，再加入硬脂酸镁和滑石粉，混匀、装胶囊、分装即得每个含100mg AR-A014418的胶囊剂。

对帕金森病患者和老年性痴呆症患者：口服1日0.5～1.0g，分2～4次给予。

实施例四乳剂的制备

组方：

AR-A014418       50g

硬脂酸           150g

白凡士林         100g

单硬脂酸甘油酯   85g

甘油             75g

吐温-80          30g

对羟基苯甲酸乙酯 1g

蒸馏水           适量

                           

制成             1000g

将AR-A014418、硬脂酸、白凡士林和单硬脂酸甘油酯置容器内加热熔化，另将甘油、吐温-80、对羟基苯甲酸乙酯与蒸馏水加热至全部溶解。在保持温度70℃左右，两相混合，搅至冷凝，即得含量5％的乳剂。

对帕金森病患者和老年性痴呆症患者：外用，适量，每日2～4次。

实施例五与左旋多巴配伍制成复方制剂

组方：AR-A014418       20g

      左旋多巴         40g

      淀粉             6g

      枸椽酸            0.2g

      10％淀粉浆        适量

      1％硬脂酸镁       适量

将0.2g枸椽酸溶于20ml的10％淀粉浆中。取处方量AR-A014418、左旋多巴、淀粉混合均匀，加适量含枸橼酸的10％淀粉浆制软材，过16目筛制粒，将湿颗粒于40-60℃干燥；16目筛整粒，加入适量1％硬脂酸镁后压片形成每片含50mg AR-A014418和100mg左旋多巴的片剂。

对帕金森病患者和老年性痴呆症患者：口服1日0.75～1.5g，分2～4次给予。

Claims (2)

1、N-(4-甲氧苄基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-烃)在制备防治帕金森病的药物中的应用。

2、权利要求1所述的应用，其特征是所述的药物为含有N-(4-甲氧苄基)-N’-(5-硝基-1，3-噻唑-2-烃)和医学上可以接受的制剂辅料的药物组合物。

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