CN100471529C - 用于修复和再生人硬膜的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明一种在硬膜组织因为损伤、肿瘤、手术等而受到损害时利用大体上无孔的马胶原薄片修复和再生哺乳动物的硬膜组织的方法。所述无孔的马胶原薄片包括胶原原纤维，它提供了替代硬膜组合物，所述组合物是弹性的、不透液体的，并且具有高抗张强度。另外，所述无孔的马胶原薄片是可再吸收的，并且提供了生物基质，其中，快速形成了新硬膜，它能在大约几周时间内变得无法与自体的硬膜区分。用于制备马胶原薄片的方法，降低了疾病传播的可能性。

Description

用于修复和再生人硬膜的组合物

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发明领域

本发明涉及大体上无孔的胶原薄片组合物用作移植材料，以修复和/或再生哺乳动物的硬膜组织的用途.更具体地讲，本发明涉及非人来源的胶原薄片组合物作为替代硬膜材料，并且作为硬膜再生的生物基质的用途.

发明背景

硬膜是在中枢神经系统解剖学中起着重要作用的结构，能形成包被整个中枢神经系统的膜系统，并且保护中枢神经系统免受外部影响.

硬膜可能由于多种原因而需要修复，所述原因包括外伤、炎症或肿瘤过程、手术过程或先天异常.特别是在手术之后以及在存在外伤后瘘管时对封闭硬膜缺陷的需要，提出了对理想的硬膜代用品的需要.上述缺陷可能导致手术后并发症，具体地讲，脑脊液渗出、感染和结果导致的脑性发作.一些形式的硬膜移植过程在几乎30％的颅骨切开术中都是需要的.由于硬膜缺陷的初步闭合通常是失败的，所以用于避免上述并发症的硬膜代用品的有效性具有重要的实际价值.

在颅骨损伤或手术干预以便取出大脑或脊柱中的恶性肿瘤之后，需要对硬膜实现永久性不透液体的闭合，以便避免脑脊液泄漏.神经外科医生通常使用可再吸收的或不可再吸收的硬膜代用品，并且通常用缝合线和/或血纤蛋白胶将其连接在颅骨或脊柱的硬膜。可再吸收的材料的例子包括人尸体硬膜、人阔筋膜、牛心包膜、异种胶原海绵和来自织物材料的植入物，其由可再吸收的聚酯(polyglactin和/或poly-p-di-oxanon)组成.不可再吸收的硬膜代用品的例子包括由聚四氟乙烯(PTFE)或聚酯型氨基甲酸酯制成的材料.

迄今为止研究过的几乎所有硬膜移植物都与并发症相关，一些相关较大。报道过的主要的并发症是慢性炎症和排斥反应，以及皮质脑膜(corticomeningeal)粘连的形成，其导致了致癫痫的病灶的发展.还观察到了血肿和脑脊液瘘管，后者反过来又提供了各种导致疾病的生物的进入点.

在过去几十年中业已对多种材料和方法进行了评估，以便寻找理想的硬膜移植物，包括各种金属、植入物、合成材料、自体组织移植物和保存的人尸体硬膜.上述产品中的大部分是不合适的，这是因为与之相关的手术后并发症，其中的某些并发症是严重的.并发症的例子包括慢性炎症和排斥反应、皮质脑膜粘连的发展、出血和硬膜移植物封装在结缔组织的厚层中.以前对合适硬膜置换的主题的研究表明，早期的移植物吸收与内源新硬膜(neodura)的形成偶联，是预示平静的和永久的硬膜融合的主要因素.

过去，业已将几种自体组织用作硬膜代用品.在1911年，Kostling用患者的疝囊形成硬膜移植物.Kostling，W.，Med Wochenschr，58，1042(1911).从那时候起业已使用了诸如颞筋膜，阔筋膜和骨膜瓣的其他自体组织.Barrow等用内源更大的网膜成功地重建了大的硬膜损伤。Barrow等，JNeurosurg.60；305-1(1987)。自体移植物的优点是，不存在病原体传播或组织排斥的危险。不过，额外的取出组织增加了手术创伤，并且可能延长了复杂手术过程的时间.

多年以来业已将保存的人尸体硬膜常规地用作硬膜代用品，用于人受试者的硬膜置换.所述制剂由结缔组织纤维组成，所述纤维是像身体自身的硬膜那样交织的.在人尸体硬膜被用于神经外科手术之后，它们被认为形成了不透液体的闭合，类似于身体自身的硬膜，并且在长时间降解过程中最终被身体自身的组织所取代.来自尸体的材料是通过冷冻干燥(冻干)和γ灭菌(Lyodura，B.Braun MelsungenAktiengesellschaft，Melsungen，德国)或通过多阶段化学过程(

process，

Dura，Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen am Brand，德国)保存的.不过，人尸体硬膜移植物一直与携带病毒和朊病毒的较大风险相关，所述病毒和朊病毒可能导致令人恐怖的疾病海绵状脑炎(Creutzfeldt-Jakob病或GerstmannStreussler综合征)。由于在植入人硬膜之后出现了大量的死亡事件，所以在很多国家人尸体硬膜移植物的使用受到了限制或禁止.

也已将人阔筋膜和心包膜制剂用作硬膜代用品材料，它具有比人尸体硬膜更小的传播传染剂的危险.尽管这种制剂具有较低的传播疾病的危险，但是它们再吸收缓慢，需要数月或数年的时间，这有可能导致疤痕的形成和硬膜代用品材料的封装。

硬膜代用品还来源于非人来源，如从皮肤或腱和牛心包膜组织中分离的牛或猪胶原.与人衍生的来源类似，一些牛硬膜代用品一直被认为能向接受硬膜移植物的患者传播疾病，即牛海绵状脑病(BSE).不过使用猪衍生的硬膜代用品导致了与下层大脑组织的粘连.

Narotam等，U.S.5,997,895公开了来自处理过的异种胶原的硬膜代用品，它是多孔胶原海绵、毡状或薄膜形式的.对胶原的处理使病毒和朊病毒污染失活，从而所述代用品不会包含传染量的病毒和朊病毒。据公开，硬膜代用品的孔隙率是允许脉管、细胞和脑膜组织渗透硬膜代用品所必需的。不过，在临床实践中，现有多孔材料的使用也有缺点，因为形状稳定性和主要的不透液体性并不能总是有保证。Narotam等还公开了硬膜代用品，它是两种或两种以上胶原海绵、毡状或薄膜形式的的夹层，其中，至少一种形式具有足够的孔，以便脑膜组织向内生长。

可再吸收的聚酯还可用于临床用途，不过具有低弹性和缓慢降解的缺点.在特殊场合下，这些植入物可能导致伤口愈合问题，并且可能增加感染.

业已将由诸如金、铂、银、镍、钽或钢的金属或诸如聚四氟乙烯(PTFE)或其他聚酯的聚合物组成的薄片或片层用作硬膜代用品.不过这些代用品不能被患者吸收，而是被封装在结缔组织的强韧层中，并且作为异物终生留在患者身体内，而不会被身体自身的结构所取代.这可能导致微生物在内孔中生长的高风险，由于PTFE薄片膜的多孔结构使得这种微生物生长不能得到身体自身的防御机制的控制。

基于胶原的产品越来越流行.可以用化学方法修饰具有高结缔组织成分的结构，如心包膜或真皮，从而只有非细胞的无抗原的胶原支架可以保存.可以得到完全由胶原原纤维或胶原包衣的合成材料组成的产品。在这两种场合下，胶原纤维网络都起着生长内源结缔组织的基质的作用.

Chaplin等在动物模型中实验了从豚鼠皮肤获得的产品(XenoDerm，Lifecell Corp.，The Woodlands，TX)。Neurosurgery，45：2，320-7(August 1999).对照物是自体颅骨膜。在所述生产过程中，将所述表皮、所有细胞成分和其他潜在的抗原性或传染性成分通过化学方法除去.保持皮肤的胶原纤维和结构体系不变。很快就报道了在存在轻度细胞反应的情况下，所述产品能整合到周围的硬膜中。入侵性成纤维细胞优选在植入部位观察到。移植物和原始硬膜被认为在为期6个月的手术后研究结束时几乎无法区分.

根据以上结果，Warren等(2000)研究了用

(LifeCellCorp.，The Woodlands，TX)在人受试者上进行硬膜置换.Neurosurgery46(6)：1391-96(2000)。在本研究中二百位患者接收了AlloDerm硬膜移植物。这种材料是从人真皮中获得的。其生产方法被认为与XenoDerm相同，产生了非细胞胶原生物基质，它是无主要组织相容性复合体(MHC)抗原的.200位患者中有7位发展了手术后并发症，如感染和脑脊液(CSF)瘘管，但是，没有一例被报道是由于移植物自身导致的.手术修复被认为显示了这些患者中无一在硬膜移植部位发展粘连或排斥反应。所述材料在肉眼检查时被认为与周围的硬膜非常相似。目前还没有本产品的长期研究数据.

Filippi等(2001)将溶剂保存的γ灭菌的牛心包膜(

，Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen，德国)用于在32位受试者中进行硬膜置换的实验.Filippi等，Neurosurg.Rev.，24：103-107(2001)。除了一个患者之外，所有患者的手术后过程都被认为是平静无事的，所述一个患者在手术后不久死于心脏原因。所述移植物被说成是便于操纵、耐用和低成本的.尚没有排除可能的后期并发症的长期研究数据。

胶原产品适合用作生物材料取决于多种因素：趋化性相互作用，其中，它们促进了内皮细胞和成纤维细胞的快速渗透，后者反过来又产生并且沉积了新的胶原纤维；在周围结构中的同时发生的有限的淋巴细胞炎症反应，促进了胶原生物基质的吸收.胶原还具有止血特性，这一特性被用于治疗目的.血小板本身沉积在胶原结构上，分解，并且通过这种方式释放凝血因子，这种因子结合血浆因子能够促进血纤蛋白形成。

已知的硬膜代用品材料和使用所述材料的相关的方法，不能提供不透液体的、可再吸收的替代硬膜，所述替代硬膜能够避免封装化、硬膜疤痕形成或粘连在大脑组织上，并且，还具有传播微生物、病毒和朊病毒的较低的风险，所述微生物、病毒或朊病毒可能导致海绵状脑炎或其他疾病。理想的硬膜置换应当不会导致免疫防御反应，或者导致炎症并且必须是无毒的.它应当能被快速地吸收，并且与此同时使得可以形成结缔组织结构，从而发展内源新硬膜.在这一过程中，所述移植物应当不会与大脑组织或骨粘连或融合.所述材料应当能抗撕裂，保持其形状，并且阻挡脑脊液渗透.所述置换硬膜还应当是体积和形状稳定的，其中，在植入之后，它能够抗膨胀或收缩.其他重要的标准是病毒和朊病毒安全性、用户友善性和经济的生产成本.

发明概述

因此，在本发明的各个方面，提供了置换硬膜材料，这种材料是可再吸收的、不透液体的、弹性、体积和形状稳定的，并且提供了与疾病传播的风险相关的出色的安全特性.

因此，简单地讲，本发明涉及用于在哺乳动物中修复和/或再生硬膜组织的方法.让所述硬膜组织与包括胶原原纤维的生物基质的马胶原薄片接触.所述马胶原薄片是通过这样一种方法形成的，其中，使胶原原纤维的悬浮液沉淀，以便形成胶原原纤维薄片，并且，其中，所述胶原原纤维不是通过化学试剂或通过辐射交联的.

另一方面，本发明涉及用于修复哺乳动物硬膜组织的方法，包括让硬膜组织与包括胶原原纤维的非天然存在的生物基质的大体上无孔的马胶原薄片接触，其中，所述马胶原薄片基本上由非细胞成分组成，并且，其中，所述胶原原纤维不是通过化学试剂或辐射交联的.

另一方面，本发明涉及用于在哺乳动物中修复和/或再生硬膜组织的方法，包括让硬膜组织与基本上由胶原生物基质组成的大体上无孔的马胶原薄片接触，其中，所述胶原生物基质不是通过化学试剂或辐射交联的.

本发明的其他方面和特征部分是显而易见的，部分将在下文指出。

附图简述

图1是显示干燥的马胶原薄片表面的SEM(扫描电子显微镜)照片。清楚地示出了胶原原纤维.从照片上可以明显看出所述表面大体上的无孔性.

图2A和2B是在ESEM(环境扫描电子显微镜术)条件下拍摄的照片，这意味着是在略微潮湿的气氛中的接近天然的条件，示出了从马胶原薄片侧面看上去的上表面.从照片上可以明显看出大体上的无孔性.

图3A和3B是在ESEM条件下拍摄的照片，示出了马胶原薄片的下表面。胶原原纤维如图3A所示。从照片上可以明显看出所述表面大体上的无孔性.

图4是表示水合的马胶原薄片表面的SEM照片.在图4中清楚地示出了胶原原纤维.从照片上可以明显看出所述表面大体上的无孔性.

图5A、5B和5C是在ESEM条件(潮湿气氛)下拍摄的照片，示出了马胶原薄片的横截面.所述材料示出的结构类似于非常紧密地堆积在一起的一叠片层.在照片中示出了胶原层之间的间隙.

图6A和6B是表示干燥的马胶原薄片横截面的SEM照片。在照片中示出了多层胶原和胶原层之间的间隙。

图7是表示在插入马胶原薄片之后左侧硬膜缺陷的手术内面貌的照片，周围的硬膜边缘由血凝块覆盖。

图8是表示手术部位的Trichrom染色显微视图(额切面)的照片，示出了皮层结构和用两种移植物(位于右侧的马胶原薄片；位于左侧的

Dura)覆盖的硬膜(8X放大率).

图9是表示在手术之后八周的硬膜移植物的照片.在左侧，

Dura尸体硬膜移植物看上去没有改变，具有清晰可见的边缘.可以看见覆盖移植物的薄的结缔组织膜的剩余部分。在右侧，马胶原薄片生物基质移植物看上去完全整合到了周围的硬膜中。暗色斑点是由新硬膜中的小的血凝块残余物引起的.

图10是表示手术之后八周朝向皮层的马胶原薄片生物基质移植物的肉眼检查面貌的照片.所述移植物看上去光滑，可以移动，并且完全整合到了周围的硬膜中.看不到皮层损伤.

图11是表示手术之后八周朝向皮层的

 Dura尸体硬膜移植物的肉眼检查面貌的照片.所述移植物看上去光滑并且均匀，但没有出现移植物整合的迹象.没有皮质脑膜粘连.

图12是表示手术之后两周两个多核巨大细胞的照片，所述细胞具有马胶原薄片生物基质移植物的细胞内片段(苏木精(hematoxillin)-曙红(HE)染色；800X放大率)。

图13是表示在手术之后四周渗透了马胶原薄片生物基质移植物的成纤维细胞和吞噬细胞的照片.还可以看到具有红细胞的新毛细管(neocapillary)(HE染色，600X放大率).

图14是表示手术之后四周由吞噬细胞和温和的淋巴细胞炎症包围的马胶原薄片生物基质移植物的片段的照片(HE染色，600X放大率)。图15是表示手术之后四周

 Dura尸体硬膜的照片。所述尸体硬膜表现出最低的细胞渗透或移植物重塑迹象.在移植物上面和下面发现了致密的淋巴细胞炎症反应(HE染色，250X放大率)。

图16是手术之后八周新硬膜的显微面貌的照片，示出了新形成的胶原纤维、成纤维细胞以及马胶原薄片生物基质移植物的残余物层(Trichrom染色，150X放大率).

图17是植入马胶原薄片之后十六周新硬膜的显微面貌的照片，示出了致密的胶原纤维和新形成的毛细管，其中充满了红细胞(van Gieson染色，200X放大率).

图18是表示用于测量置换硬膜材料的不透水性、抗张强度和弹性/柔韧性的测试装置的图.测量由特定水柱高度得到的所述材料的凸出程度，以便确定弹性/柔韧性水平.测量加压通过所述测试材料的水的量，以便测定不透水性.

图19是表示在增加的静水压力(水柱高度)下马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)的凸出程度的曲线图.

图20是表示在增加的静水压力(水柱高度)下胶原薄片(胶原含量：4mg/cm²)的凸出程度的曲线图.

图21是表示在增加的静水压力(水柱高度)下DuraGen的凸出程度的曲线图.DuraGen在200cm H₂O静水压力下破裂.

图22是表示在增加的静水压力(水柱高度)下几种硬膜置换产品的凸出程度的曲线图.

图23是表示在增加的静水压力(水柱高度)下，马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)的凸出程度和水的丧失的曲线图.

图24是表示在增加的静水压力(水柱高度)下，胶原薄片(胶原含量：4mg/cm²)的凸出程度和水的丧失的曲线图.

图25是表示增加的静水压力(水柱高度)下，DuraGen的凸出程度和水的丧失的曲线图.

图26是表示增加的静水压力(水柱高度)下，若干种硬膜置换产品的凸出程度和水的丧失的曲线图.

图27是表示几种胶原植入物的抗撕强度/极限张力的曲线图.样品E是马胶原薄片.

优选实施方案的详细说明

根据本发明已惊奇地发现，在非天然存在的生物基质中由马胶原原纤维组成的大体上无孔的薄片可有效地用作可再吸收的硬膜代用品，以用于哺乳动物的硬膜修复、再生和复原，所述哺乳动物包括人、实验室动物等。本发明的马胶原薄片是不透液体的，并且提供了防止病毒或朊病毒传播的风险的高的安全特征.另外，所述马胶原薄片实际上是柔韧性和弹性的，同时保持了高的抗张强度.这种薄片，以下称之为“马胶原薄片”，在植入时，与人类硬膜的重要特性一致.所述马胶原薄片起着生物基质的支架的作用，用于体内细胞的向内生长，并且在再生和复原期间被新硬膜所取代.

在一种实施方案中，所述马胶原薄片生物基质由基本上由胶原原纤维组成的结缔组织蛋白组成.优选的是，所述马胶原薄片生物基质由结缔组织蛋白组成，所述结缔组织蛋白由胶原原纤维组成。更优选的是，所述马胶原薄片生物基质由结缔组织蛋白组成，所述结缔组织蛋白由I型胶原原纤维组成.

除了由胶原原纤维组成之外，所述马胶原薄片还可以包括赋形剂、防腐剂、生长因子或有助于最终产品的柔韧性和弹性的添加剂。

马胶原薄片

本发明的马胶原薄片是处理过的胶原原纤维的生物基质，通过处理除去了细胞成分，并且形成了胶原原纤维片层.

用于本发明一种实施方案中的马胶原薄片是非天然存在的多层胶原膜，其由多个多方向相互缠绕的胶原原纤维组成.在图1中示出了干燥的马胶原薄片的图.所述显微照片(SEM)表示马胶原薄片的表面，其中，包埋有胶原原纤维.在图2A-2B中可以看到在ESEM(环境扫描电子显微镜术)条件下的马胶原薄片上表面的照片，其中，略微潮湿的气氛提供了接近自然的条件.所述胶原原纤维在所述表面上可以看到.所述表面看上去是光滑的和大体上无孔的.在图3A和3B中提供了马胶原薄片下表面的照片(ESEM).所述下表面照片也示出了马胶原薄片的大体上的无孔性。

在使用所述马胶原薄片修复哺乳动物的硬膜组织之前，所述干燥的马胶原薄片材料可以是水合的.图4是表示水合的马胶原薄片的表面的SEM照片，其中，清楚地示出了胶原原纤维。从照片上可以看出所述表面大体上的无孔性.

在所述多层中二维方向中独特取向的胶原纤维即使在高静水压力下也主要负责不透液体性，并且提供了具有高弹性的高的强度.由于马胶原薄片的多个平行取向的薄的胶原原纤维层，所以这种材料适合临时取代身体自身的硬膜，用于在植入之后覆盖缺陷，以便获得不透液体的脑脊液泄漏的闭合，并且提供供细胞向内生长的生物基质支架，以用于形成新硬膜.这种特性在伤口愈合过程中是重要的，因为它降低了患者发展脑脊液溢状况的风险.

马胶原薄片结构和再吸收特征

所述马胶原薄片是其所植入的哺乳动物可再吸收的.据信，通过马胶原薄片的结构可以增强这一特性。用于产生马胶原薄片的方法，形成了胶原原纤维的叠层.在每一层之间是间隙，患者的细胞和脉管系统可以迁移到这些间隙中，并且形成新硬膜组织.

每一层胶原原纤维大体上是无孔的.可能存在的少数几个孔通常是彼此分离的，并且不会通过多层胶原原纤维彼此连接.本发明的多层结构增强了马胶原薄片的不透液体的特征.图1-4所示扫描电子显微镜照片示出了马胶原薄片的无孔的性质.

尽管马胶原薄片是大体上无孔的，但在胶原原纤维层之间存在间隙。在图5A、5B和5C中可以方便地看出所述间隙和层状特征，所述图是马胶原薄片在ESEM条件(潮湿气氛)下的横截面照片。图6A和6B是干燥的马胶原薄片的SEM照片.因此，马胶原薄片类似于一叠纸张，其中，每一层纸是大体是光滑的和无孔的，在每一层纸之间具有间隙。在它的干燥形式(图6A和6B)下，所述间隙更为明显.当在略微潮湿气氛的接近天然的条件下观察马胶原薄片时，所述间隙变小。图5A、5B和5C是在潮湿气氛中马胶原薄片的横截面的照片，其中，示出了所述马胶原薄片的间隙的缩小.

除了促进不透液体的特性之外，马胶原薄片的多个平行取向的薄的胶原原纤维层同时起着供细胞向内生长的生物基质支架的作用，以便从头构建身体自身的硬膜.以前，普遍认为多孔支架结构是促进自主组织和脉管系统向内生长到置换硬膜组织中所必需的.业已惊奇地发现，马胶原薄片的无孔的层状结构能促进细胞、脉管系统向内生长，并且促进穿过马胶原薄片且在存在于其多层之间的间隙中形成新的胶原结构，从而形成新硬膜，其在植入数周之内具有天然硬膜的一般的层状结构.正如在下文和实施例1中所进一步描述的，细胞、脉管系统的向内生长，以及新的胶原结构在手术之后数周内是如此广泛，以至于新硬膜变得难于与以前存在的患者的硬膜组织区分。在手术之后大约4-8周，脑膜细胞的细胞组织为大约40％-70％.大约十六周之后，所述移植物是完全有组织的(100％).

动物实验表明了在多层马胶原薄片区域的快速细胞渗透.从组织学角度看，在植入之后14天，观察到了淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞对胶原生物基质的密集的渗透.随后在移植物上形成了毛细管.由于胶原纤维的新生而出现的马胶原薄片和周围的硬膜之间的连续的转变是显而易见的.在仅仅4周之后，所述马胶原薄片就部分被身体自身的疏松的结构组织所取代.在24周之后，难以区分以前存在的患者的硬膜和取代缺陷区域的植入的马胶原薄片的新形成的新硬膜-样结缔组织结构.

疾病传播/免疫反应

使用本发明的马胶原薄片的显著优点是具有对其所植入的患者明显较低的传播疾病的危险.在生产过程中用酸(例如，盐酸、乙酸等)，和碱，如氢氧化钠处理胶原原纤维，以便产生这样的马胶原薄片，这可有利地将可能存在的细菌、病毒和朊病毒灭活或降低其感染水平.用盐酸、氢氧化钠、氧化乙烯(ETO)等处理生物材料的做法业已得到了政府机构的认可，作为药物和生物材料管理中使朊病毒和病毒失活的许可的方法.在某些管理中，所述处理能够降低成批测定马胶原薄片的管理要求。因此，在生产过程中对胶原原纤维的处理提高了产品安全性，并且降低了将疾病传播给患者的风险.

业已进行过上述生产过程处理的马的材料没有发现能够将任何病原体传播给患者.因此，除了生产过程之外，基于马的胶原的利用还避免了传播海绵状脑炎的危险，这种病以前一直与人尸体代用品相关.使用源于马来源的胶原，例如源于马跟腱的胶原，避免了传播传染性海绵状脑病(TSE)的风险，这种病又被称作牛海绵状脑病(BSE)或瘙痒病.这种病的传播一直与使用从反刍动物来源获得的生物学材料相关(例如，来自牛、山羊、绵羊等的生物材料).

本发明的马胶原薄片额外地降低了引起免疫反应的风险，其中，所述胶原来自马来源并且处理过(例如，用酶).业已报道了在将基于马的胶原用于组织置换方法(置换除了硬膜以外的组织)的超过10年的时间段中没有出现免疫反应.

来源于马的胶原薄片还导致了减弱了的炎症反应.与包括来自诸如人阔筋膜的来源的胶原的硬膜代用品相比，由于植入替代马胶原薄片而导致的炎症细胞的数目明显更少.与来自其他来源的置换硬膜器械相比，通过植入马胶原薄片所引起的炎症过程的持续时间同样更短.上述特性显著降低了由患者免疫系统产生的对马胶原薄片的移植物排斥的风险，从而提高了需要硬膜置换的神经外科手术的成功率.

体积/尺寸稳定性

如果在水合时置换硬膜明显膨胀或收缩的话，可能会产生问题.在某些场合下，现有技术的多孔胶原硬膜置换产品在水合之后倾向于明显收缩.在这种场合下，置换硬膜可能拖拉将它连接在患者硬膜上的缝合线，从而导致对植入物和对自体硬膜和手术部位的损伤.其他并发症包括如果在植入置换硬膜之后所述置换硬膜持续膨胀的话，在手术部位产生的压力，从而会在相邻的神经组织上产生不希望的压力。

在水合时本发明的马胶原薄片的体积变化较小或微不足道.与多孔置换产品相反，所述马胶原薄片在水合后大体上能保持其尺寸和形状，具有良好的形状稳定性，即使在水合之后也能保持生物稳定，并且在植入之后不会在大脑中产生膨胀或收缩问题.一旦水合并且植入，马胶原薄片就不会在面积或厚度方面显著膨胀或收缩到会撕开手术缝合线或破坏将马胶原薄片保持在患者硬膜上的血纤蛋白胶密封的程度。

在一种实施方案中，在完全水合时，干燥的马胶原薄片的面积的收缩或膨胀可以在大约-5％-大约20％范围内。在另一种实施方案中，在完全水合时，干燥的马胶原薄片的面积可以在大约-5％-大约10％范围内。在另一种实施方案中，在完全水合时，干燥的马胶原薄片的面积在大约-5％-大约5％.在另一种实施方案中，在完全水合时，干燥的马胶原薄片的面积增加不超过大约4％。

在一种实施方案中，在完全水合时，所述马胶原薄片增加到其干燥厚度的最多大约4倍。在另一种实施方案中，在完全水合时，所述马胶原薄片增加到其干燥厚度的最多大约3倍.在另一个实施方案中，在完全水合时，所述马胶原薄片增加到其干燥厚度的大约2倍.

以颅骨为基础，成年人硬膜的厚度为大约0.5mm-大约2.0mm.硬膜的厚度也可以依赖于患者的年龄而改变，其中，预计婴儿和儿童的硬膜组织一般比成年人的更薄.本发明的马胶原薄片的厚度可以制备成根据需要的使用面积和治疗的患者而改变.

在一种实施方案中，本发明的马胶原薄片在它的干燥形式下的厚度为大约0.01mm-大约3.0mm.在另一种实施方案中，所述马胶原薄片的厚度为大约0.02mm-大约2.0mm.在另一种实施方案中，所述马胶原薄片的厚度为大约0.03mm-大约1.5mm.在另一种实施方案中，所述马胶原薄片的厚度为大约0.05mm-大约1mm。在另一种实施方案中，所述马胶原薄片的厚度为大约1.0mm或以下。

胶原薄片的干重取决于它的理想厚度.在一种实施方案中，马胶原薄片的干重为大约1mg/cm²-大约50mg/cm².在另一种实施方案中，马胶原薄片的干重为大约1.5mg/cm²-大约30mg/cm².在另一种实施方案中，马胶原薄片的干重为大约2mg/cm²-大约20mg/cm²。在另一种实施方案中，马胶原薄片的干重为大约2.5mg/cm²-大约15mg/cm²。在另一种实施方案中，马胶原薄片的干重为大约3mg/cm²-大约10mg/cm².

在一种实施方案中，在水合后马胶原薄片的重量增加到其干重的最多大约15倍.在另一种实施方案中，在水合后马胶原薄片的重量增加到其干重的最多大约10倍.在另一种实施方案中，在水合后马胶原薄片的重量增加到其干重的最多大约7倍.在另一种实施方案中，在水合后马胶原薄片的重量增加到其干燥状态的最多大约5倍。

为了用作合适的硬膜置换代用品，植入的硬膜代用品即使在水合时也应当不会变得不结实，相反，应当具有相当高的稳定性/抗张强度.本发明的马胶原薄片有利地具有高的抗张强度，这能够改善并且支撑在手术应用中对马胶原薄片的处理，并且提供在植入之后的增加的机械稳定性。在下面的实施例中提供了对照实验，其中，所述马胶原薄片的抗张强度与多孔胶原制剂(例如，胶原泡沫)相比更好。另外，增加马胶原薄片的厚度，能够显著提高抗张强度.

马胶原薄片材料在施加的压力下被撕裂的倾向可以被测量为它的“极限拉伸载荷”或“极限张力”，以下称之为“极限张力”.马胶原薄片的极限张力可以通过对具有特定宽度的一条马胶原薄片施加压力，并且测定导致所述马胶原薄片破坏(例如，撕裂或破裂)所施加的压力的量而确定.可以用以下等式对极限张力进行定量：

“极限张力”＝所施加的力/马胶原薄片条的宽度＝牛顿/cm-条.

在一种实施方案中，所述马胶原薄片的极限张力为大约1-大约30牛顿/cm-条，优选大约1.5-大约15牛顿/cm-条，优选大约2-大约10牛顿/cm-条，更优选大约3-大约6牛顿/cm-条。

尽管本发明的马胶原薄片具有高的抗张强度，在水合时它也能保持弹性和柔韧性。这一特征使得所述马胶原薄片最好地适合于出现在植入部位的解剖学条件(例如，弯曲).

在它的水合状态下，所述马胶原薄片能够容易地在手术部位周围移动，并且可最佳地进行模造为其所植入的缺陷的形状.一旦植入，所述马胶原薄片移植物就保持光滑和可移动性.随着时间推移，细胞和脉管系统迁移通过所述马胶原薄片，最终用硬膜样的新硬膜取代它。在与硬膜细胞发生细胞的组织之后，所述马胶原薄片不会粘连在神经、大脑、颅骨或脊柱组织上.

马胶原薄片的制备

本发明的马胶原薄片可以通过受控制的干燥方法用高分子量胶原原纤维的悬浮液制备.胶原原纤维悬浮液的分级沉淀是由于水的蒸发和pH的同时升高所导致的.所述受控制的干燥方法产生了胶原薄片的多层结构，这种多层结构可以由神经外科医生作为人硬膜代用品植入.所述多层胶原薄片结构提供了在硬膜代用品中有利的多种上述特性，并且提供作为生物基质以再生活的硬膜组织。

在一种实施方案中，用于生产本发明的马胶原薄片的方法去除了生产胶原原纤维的马胶原薄片的所有细胞成分，所述薄片基本上是由非细胞成分组成的.

利用胶原化学中建立的方法，将含有胶原的组织用作原材料以用于制备本发明的马胶原薄片.在一种实施方案中，将马腱用作原材料。在另一种实施方案中，将马跟腱用作原材料。

在一种实施方案中，所述原材料，例如马跟腱首先被粉碎，并且用1N氢氧化钠处理至少1小时，并且用盐酸中和.在pH2的酸性条件下处理所述胶原原材料。所用的酸可以是盐酸、乙酸等.然后，对存在于所述原材料中的非胶原蛋白和分子间交联键用胃蛋白酶进行酶促降解，以便形成胶原悬浮液.

然后中和所述悬浮液.在一种实施方案中，将所述悬浮液中和到大约pH6.5-大约pH8.0。在另一种实施方案中，将所述悬浮液中和到大约pH6.9-大约pH7.5。在另一种实施方案中，将所述悬浮液中和到大约pH7.

对所述胶原悬浮液进行离心，去掉上清液，并且将沉淀重新悬浮在大约pH2-4.5乙酸中。因此从胶原悬浮液中成功地去掉了非胶原蛋白。

可以根据所需重复上述步骤，以便除去存在于沉淀中的残余的非胶原蛋白.

所述马胶原薄片的生产方法的惊人的结果是，胶原在乙酸中的悬浮液的受控制的pH升高是由于通过长时间，例如，24小时的蒸发特定地去除水而实现的.所述pH的特定升高导致了多方向缠绕的胶原原纤维在二维方向的层中的沉淀，从而形成了所述马胶原薄片的多层结构.在一种实施方案中，所述过程是在大约20℃-大约55℃的温度下在干燥烘箱中进行的，其中用设备除去蒸汽，同时对乙酸进行蒸汽中和。在另一种实施方案中，所述过程是在温度为大约30℃-大约45℃的温度的干燥烘箱中进行的.

来自所述生产过程的所述马胶原薄片当检测不到水分的进一步丧失或者水分的进一步丧失可忽略不计时被认为处在它的干燥形式。马胶原薄片的“干燥形式”的含水量通常为以重量百分比计算的大约2％-大约18％。在所述马胶原薄片的“干燥形式”中存在相对高的残余含水量阻止或限制了构成所述马胶原薄片的胶原分子的变性。

上述过程决定着胶原原纤维从悬浮液中的沉淀，这是因为具有低可溶性的成分在低的pH值升高过程开始时沉降(fall out)。这种技术在水分蒸发和同时的pH升高期间导致了胶原原纤维的沉淀.

在所述沉淀过程中，随着所述原纤维从所述溶液中沉淀出来，所述胶原原纤维会发生天然交联，从而形成胶原薄片。与使用化学试剂或辐射(例如，电离或紫外线辐射)的胶原原纤维交联不同，这可能导致增加了再吸收时间，使得胶原原纤维天然交联能促进当所述马胶原薄片被植入时较短的再吸收时间.用于本发明的胶原薄片中的原纤维的天然交联可以通过天然、生理学样方式进行.首先，这种天然交联是通过非共价相互作用(例如，范德华相互作用或偶极-偶极相互作用)或通过在胶原分子的氨基酸侧链之间形成容易解离的希夫碱键实现.胶原的分子间交联决定物理和化学稳定性.胶原交联形成的关键步骤取决于赖氨酸或羟赖氨酸残基的酶促转化，并且产生了醛、ε-醛赖氨酸和6-醛基羟赖氨酸。所述醛基能自发地与活性氨基基团起反应，导致了包括具有不稳定的醛亚胺键(-CH＝N-)的不稳定的醛醇缩合产物的希夫碱成分的形成。因此，本发明产品的原纤维可以通过用诸如弱酸的处理而解离.通过使用化学交联剂而产生的交联可以根据稳定的共价交联的交联部分的存在进行检测。一般，这一目的是通过使用希夫-碱试剂(例如，戊二醛)形成希夫碱反应产物，然后通过Amadori重排或还原条件稳定所述键而实现的。另外，胶原可以通过各种双功能碳二亚胺试剂进行交联.通过使用辐射而产生的交联可以通过胶原原纤维之间稳定的共价键的存在进行检测，这种共价键是通过在辐射期间产生的自由基部分的反应而产生的。另一方面，本发明产品中的原纤维大体上不与任何稳定的共价键交联，并且没有用化学或辐射方法处理.因此，本发明产品中原纤维之间的任何结合大体上是非共价的或容易逆转的，并且不是稳定交联的.以往业已将诸如氰氨、戊二醛、甲醛、丙烯酰胺、碳二亚胺二酮、二亚氨酸酯(diimidates)、双丙烯酰胺等之类的化学试剂用于将胶原原纤维化学交联在硬膜代用品中.不过，使用这种化学试剂，可能导致与脑组织意外接触硬膜代用品中的残余化学试剂相关的毒性风险。因此，这种沉淀方法避免了交联化学试剂的毒性风险，以及与用化学试剂或辐射交联胶原原纤维相关的较长的再吸收时间。

所得到的干燥的、沉淀的胶原组合物形成了由高分子量多层胶原膜组成的马胶原薄片，所述胶原膜由多个多方向天然缠绕的胶原原纤维组成.所述马胶原薄片主要包括间隙的I型胶原.所述马胶原薄片基本上是无孔的，并且主要是不透液体的。可以在所述产品上进行免疫扩散实验，以便确保不存在异源蛋白.

用来生产用于本发明的所述马胶原薄片的上述方法还被ResorbaWundversorgung GmbH & Co.KG，Nuremberg，德国用于生产由Baxter AG，Vienna，奥地利商业出售的胶原薄片。所述商业化薄片被标明可用作止血剂，用作临时组织代用品，用于覆盖伤口，并且用作血纤蛋白封闭剂载体物质.

用于本发明的马胶原薄片的厚度可以根据特定应用的需要而改变.例如，在修复儿科硬膜组织时，可以使用较薄的马胶原薄片，而在修复成年人硬膜组织时，可以使用较厚的马胶原薄片。

通过改变用于生产特定尺寸马胶原薄片的原材料的量，可以控制马胶原薄片的厚度.

用氧化乙烯(ETO)或类似的灭菌气体或通过辐射对所述马胶原薄片进行气体灭菌.

附着方法

在使用之前，可以使干燥的马胶原薄片水合，例如，在生理盐水中水合。在一种实施方案中，所述生理盐水包括0.9％氯化钠溶液。在另一种实施方案中，所述马胶原薄片是在赋形剂或含有药物的溶液中水合的。使所述马胶原薄片水合所需要的时间长度与所述薄片的厚度相关。使所述马胶原薄片水合，直到它的厚度在整个面积上是均匀的。在一种实施方案中，在生理盐水中使所述马胶原薄片水合大约5秒-大约1小时.在另一种实施方案中，在生理盐水中使所述马胶原薄片水合大约5秒-大约30分钟.在另一种实施方案中，在生理盐水中使所述马胶原薄片水合大约5秒-大约20分钟。在另一种实施方案中，在生理盐水中使所述马胶原薄片水合大约5秒-大约10分钟.在另一种实施方案中，在生理盐水中使所述马胶原薄片水合大约1分钟-大约6分钟。在另一种实施方案中，在生理盐水中使所述马胶原薄片水合大约5分钟.在另一种实施方案中，在植入之前不对所述马胶原薄片进行水合.

所述马胶原薄片可以通过确定的外科技术附着在患者硬膜上，例如，通过血纤蛋白封闭剂、组织胶、手术缝合线或通过压力配合手术技术。另外，可以利用马胶原薄片和硬膜组织之间的天然吸引力将所述马胶原薄片附着在硬膜组织上，而不用使用任何封闭剂、胶、缝合线或压力配合技术.一旦水合，所述马胶原薄片可以被切割成略微比患者硬膜上的手术开口大一些。因此，将所述马胶原薄片略微叠盖在其所附着的患者硬膜上.在一种实施方案中，水合的马胶原薄片的尺寸与硬膜重叠大约0.5cm-大约1cm.重叠的量可以根据神经外科医生的偏好和技能而改变。

在一种实施方案中，根据众所周知的胶原与血纤蛋白的相互作用，可以使用得到批准的可用于神经学用途的血纤蛋白封闭剂将所述马胶原薄片附着在硬膜上.被批准可用于神经学用途的血纤蛋白封闭剂的例子包括Tissucol和Tisseel血纤蛋白封闭剂(Baxter AG，Vienna，奥地利).另外，还可以使用被批准用于神经学用途的组织胶.血纤蛋白封闭剂或组织胶可以以围绕叠盖硬膜的马胶原薄片部分的连续线条的形式使用，以???便形成不透液体的密封。如上文所述，不透液体的密封是有利的，因为它避免了与脑脊液丧失相关的并发症，如脑脊液溢.

在另一种实施方案中，所述马胶原薄片在通过连续的血纤蛋白封闭剂或组织胶的线与自体的硬膜附着时，产生了不透液体的密封。

在另一种实施方案中，叠盖硬膜的所述马胶原薄片可以用斑点状使用的血纤蛋白封闭剂或组织胶附着在硬膜上.

在另一种实施方案中，所述马胶原薄片一旦被放置在理想的植入部位，就通过手术缝合附着在硬膜上.尽管该实施方案可用于将所述马胶原薄片附着在患者的自体的硬膜上，但所述缝合线可能导致分支的管，后者反过来又可能导致瘘管，并导致脑脊液泄漏。如果缝合所述马胶原薄片的话，必须使用无张力缝合技术，以便避免撕裂所述薄片。推荐密封缝合线，例如，使用血纤蛋白封闭剂.

在另一种实施方案中，所述马胶原薄片是按照本领城已知的压力配合技术定位和植入的。在该技术中，将所述马胶原薄片放置在需要的植入部位，并且通过存在于颅骨或脊柱中的天然内部压力保持在适当位置。因此，在不使用手术缝合线、血纤蛋白封闭剂或组织胶的情况下移植物仍保持在适当位置.

在另一种实施方案中，在不使用任何封闭剂、胶、缝合线或压力配合技术的情况下对所述马胶原薄片进行定位和植入.在该技术中，将所述马胶原薄片放置在需要的植入部位，并且通过所述马胶原薄片和硬膜组织之间的天然吸引力或附着力保持在适当位置。

本发明的马胶原薄片可以用作置换硬膜移植物以修复由于先天状况、出生缺陷、疾病、损伤、肿瘤切除或可能破坏或穿透患者硬膜的其他手术过程，或需要修复硬膜的任何其他状况而导致的人类硬膜组织。所述马胶原薄片还可用于修复其他哺乳动物的硬膜组织，包括，但不局限于羊、猴、马、实验室动物或其他哺乳动物。所述马胶原薄片可用于修复颅骨或沿着脊柱的硬膜组织.

本发明还涉及包括马胶原薄片和指导它的制备和用作置换硬膜的说明书的试剂盒.

禁忌症

已知对马或马产品具有变态反应的患者禁止接受马胶原薄片。

其他禁忌症可以包括在手术之后不久进行放射治疗的患者。例如，在脑肿瘤切除手术之后不久接受放射治疗的患者，不是接收本发明的马胶原薄片的好的候选人.所述放射治疗可能延缓或抑制新硬膜的生长，所述新硬膜是由快速分裂的细胞组成的，其中，所述马胶原薄片被再吸收.在这种场合下，不可再吸收的置换硬膜，如Teflon可能更适合.不过，熟练的外科医生能够辨认需要不可再吸收的置换的治疗。

定义

“马胶原薄片”表示马胶原原纤维的生物基质(即生物相容材料的基质)，对它进行了处理以便除去细胞成分，以便形成胶原原纤维片层。术语“马胶原薄片”不包括结合在一个或多个多孔胶原片层上的一个或多个大体上无孔的胶原原纤维片层的复合薄片.

“硬膜组织”表示哺乳动物的自体的硬膜组织.

“非天然存在的生物基质”表示制造的基质或支架，其包括由以下各项形成的胶原原纤维：(1)天然存在的材料(即，天然材料)，业已通过一定方式对它进行过处理或加工，其中使得所述天然材料中所包含的胶原原纤维业已相对在天然材料的胶原结构中的天然排列发生了移动或复位；或(2)用胶原原纤维处理或加工过的非天然存在的材料(即，非天然材料)。例如，非天然存在的生物基质可以用包括已进行了机械或化学处理(例如，粉碎、切碎等)的胶原的原材料制成。相反，通过以一定方式处理或加工原材料而制成的胶原生物基质不是非天然存在的生物基质，所述方式保持胶原支架的结构(例如，对表皮组织进行处理，以便除掉细胞成分，同时保持天然存在的胶原结构)。

“大体上无孔的”表示存在于马胶原薄片上的任何孔是形成胶原片层的胶原原纤维沉淀的结果，它们主要是彼此隔离的.可以相互连接的孔不是以穿过马胶原薄片的厚度的形式相互连接的.在所述马胶原薄片上形成孔的机械穿孔不是孔.优选的是，看上去大体上无孔的材料在使用扫描电子显微镜以1500x放大率检查时可以看到孔.

下面的实施例将进一步说明本发明.

实施例1

本实施例提供了用羊进行的评估马胶原薄片作为硬膜代用品用于修复硬膜组织以及作为生物基质用于硬膜再生的合适性的实验结果.

进行实验，以便评估马胶原薄片用作颅骨硬膜代用品的特性，如用羊模型进行研究的.所述马胶原薄片包括从切碎的马跟腱中纯化的天然马胶原原纤维(5.6mg/cm²)并且不包括细胞成分。

所使用的参考产品是保存的人尸体硬膜(

 Dura)。仅使用血纤蛋白胶(Tissucol Duo S Immuno，Baxter AG，Vienna，奥地利)将这两种产品附着在适当位置.

研究了以下项目：

这两种移植物整合的肉眼检查面貌；

相邻的组织结构的反应(炎症、粘连、纤维化、坏死)；和

对整合过程和结缔组织的组织进行的组织学评估

用于生产马胶原薄片的纯化过程开始于用氢氧化钠溶液处理所述腱原材料至少1小时，然后用盐酸中和.然后用胃蛋白酶分解所述腱.由此产生的胶体状胶原以原纤维形式沉淀.然后通过干燥和气体灭菌产生了马胶原薄片，其中每平方厘米具有5.6mg的天然胶原原纤维.不添加任何其他成分，并且不通过人工方法进行交联(即涉及化学试剂或辐射).免疫扩散测试确保不存在外源蛋白。

材料和方法

实验动物

本研究是用25只成年羊进行的.所述羊是用于农业的混种(mixed-breed)家畜.在手术时这些动物的平均体重为53.0kg，且它们的平均年龄为2岁。所有动物都是雌性。这些动物保持在LuebeckMedical University的动物围栏中，所述围栏装有屋顶结构和露天围栏.为这些动物提供常规混合饲料.将这些动物分成五组进行组织学实验，并且对移植物整合的不同阶段进行表征(第一组-第五组).每组的存活时间为2、4、8、16和24周.

研究产品

研究的马胶原薄片是用天然马胶原原纤维制成的(主要为间隙的I型胶原)。一平方厘米的材料包括5.6毫克胶原原纤维，不含细胞成分。对照物(

 Dura，Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen a.Brand，德国)是通过组织节约方法保存的人尸体硬膜.

将血纤蛋白胶，Tissucol Duo S，用于将移植物附着在硬膜上。这种生物学双组份胶由预先填充的装有人血浆蛋白、血纤蛋白原、凝血因子XIII、血浆纤连蛋白和抑肽酶的注射器，和装有凝血酶和氯化钙的另一个预先填充的注射器组成.

麻醉

通过以注射混合物肌内注射下述成分对所述动物进行手术前用药：盐酸甲苯噻嗪(盐酸甲苯噻嗪2％，Bayer AG，Leverkusen，德国)，剂量：0.1mg/kg体重，(S)-氯胺酮(氯???胺酮S，Parke-Davis GmbH，Karlsruhe，德国)剂量：2mg/kg体重，和0.5mg阿托品，1ml注射溶液(Atropinsulfat Braun 0.5mg，B.Braun Melsungen AG，Melsungen，德国).在右侧耳朵插入静脉和动脉管.以1mg/kg体重施用丙扑佛(Disoprivan 2％，AstraZeneca GmbH，Wedel，德国)用于麻醉.对所述动物进行气管内插管(I.D.7.0mm)，并且施用100％的氧气，以便控制正常换气(normoventilation)(Sulla 808V麻醉呼吸器，

Luebeck，德国).

施用丙扑佛、(S)-氯胺酮和七氟醚以便保持平衡的麻醉。在手术期间监控呼吸循环内的压力和体积比例、吸入的氧气分数(Oxydig，

Luebeck，德国)、最终呼气的碳水化合物浓度(Kapnodig，

Luebeck，德国)、心电图和入侵性动脉血压.

手术前的抗生素预防

在即将进行手术之前，每一只动物静脉内接收2.0g头孢菌素V的剂量(Basocef 2.0g，Curasan AG，Kleinostheim，德国).在手术之后通过两次皮下给药的长效产品(depot product)，Strepdipen-悬浮液(1.0ml，包括100000IU苄星青霉素和100000IU硫酸双氢链霉素；剂量1.0ml/kg体重)再保持四天抗生素预防.所述皮下注射是在手术结束之后马上进行并且在48小时之后再次进行的.

手术技水

将业已插管的动物以左侧位置放置.然后将头转向右侧，并且通过夹在手术台上来保持在水平位置.然后对颅骨进行彻底剔毛，用汽油对皮肤进行脱脂，然后消毒.固定具有暴露出要进行手术的部位开口的无菌片层，并且用无菌覆盖物覆盖整个动物。

在中间线左侧形成1.5cm的皮肤切口，并且延长大约6cm.使用有两极的镊子凝固来自剥落的头皮的出血。使用拉钩，并且通过收缩和展开帽状腱膜使颅骨的颞顶区暴露。然后使用手工操纵的钻子钻两个孔(直径0.8cm)，其间隔大约5cm.用锯子(Mikrotom，Aesculap，Melsungen，德国)去除钻孔之间的颅骨上的长椭圆形的骨盘.

通过使用骨蜡阻止来自颅骨的任何出血.用手术刀在硬膜上切开大约0.5cm长的切口.然后用硬膜剪刀沿所述骨头的边缘剪掉大约3x2cm的椭圆形硬膜片.特别注意以便不损伤蛛网膜.使用止血剂，(Nycomed Austria GmbH，Linz，奥地利)阻止来自硬膜血管的任何出血。

然后切割椭圆形马胶原薄片(尺寸为3.5 x 2.5cm)至一定大小，并且在无菌的0.9％的盐水中浸泡5分钟.为了封闭所述缺陷，将所述马胶原薄片沿着硬膜的整个边缘塞入，并且点上血纤蛋白胶，以便将其保持在一定位置.参见图7.

然后用两个小板(miniplate)(Bioplates，Codman，Norderstedt，德国)重新附着颅骨盘.用可以吸收的缝合线(Vicryl 2.0)封闭所述帽状膜，并且用Ethilon 3.0缝合皮肤。

将

Dura产品以类似方式应用在颅骨的右侧。参见图8。这两个伤口最终都用喷射敷料(Hansaplast Sprühpflaster，BeiersdorfAG，Hamburg，德国)处理.

平均手术时间为120分钟.从诱导麻醉到开始手术的平均时间段为大约60分钟，且从缝合结束到麻醉结束的平均时间为5-10分钟。

动物的手术后观察

在拔掉插管之后大约30分钟将所述动物送回它们的围栏.由外科医生、兽医和动物护理员定期检查这些动物的炎症或神经学异常的病征。在手术之后八天将所述动物放入露天围栏中.

动物安死术

在手术之后2、4、8、16和24周的预定的存活时间杀死动物以便取样.

在宰杀之前，通过肌内注射1mg/kg体重的盐酸甲苯噻嗪2％对所述动物实行镇静.扣好心电图(ECG)监测仪，并且将静脉或动脉管放入右侧耳朵.然后通过静脉内注射

(Hoechst Roussel Vet，Somerville，New Jersey)宰杀深度镇静的动物；1ml的注射溶液包括0.2g乙甲丁酰胺、0.05g碘环已铵和0.005g盐酸丁卡因；剂量为0.3ml/kg体重).通过ECG和动脉血压的测量监控所述过程。

取样

剔掉所述动物头上的毛，并且按手术方法所述进行定位.在两个手术疤痕周围的皮肤上形成直径为大约9cm的圆形切口。收缩帽状腱膜，以便暴露出颅骨盖的大切片，并且在右侧前面区域钻孔.用锯子取出大约为8cm的圆形颅骨盘.整个移植部位由骨、硬膜和大脑实质组成，通过用解剖刀沿骨边缘切割进入该部位。然后小心地将硬膜和脑组织与覆盖的骨分离，并且在福尔马林中固定，以便进行组织学研究.所述移植物样品的直径大约为7cm。

组织学方法

对所述移植物样品进行肉眼检查，并且划分成额切片(frontalslice).同时准备两个手术部位。从每一个样品中取出厚度为大约2-3μm的五个切片.

利用标准染色方法评估变化，包括用苏木精-曙红评估细胞成分，用Elastica van Gieson评估间充质结构，用Trichrome评估间充质结构，并且评估胶原纤维新生，并且用铁染料确定出血的程度

结果

手术内和手术后过程

除了两只动物之外所有动物的麻醉、手术和手术后随访期都是平静无事的.一只动物在诱导麻醉期间死亡，这是由于难治性心律失常.另一只动物在手术之后14天突然且出乎意料地死亡，在此之前一直是平安无事的手术后过程.对脑进行的显微检查示出了广泛的皮质坏死，具有出现疤痕的迹象.因此，导致死亡的最可能的原因是由于未知的病因而导致的长期大脑局部缺血。

很少出现手术内出血，这种出血是轻度的，并且在大部分场合下来自硬膜的小血管.使用具有双极的镊子或止血剂迅速控制出血.

在手术后随访过程中，没有一只动物表现出神经学异常.同样，没有动物表现出炎症、脑脊液泄漏或受到损伤的伤口愈合的病征.

肉眼检查

在从手术部位取出样品期间对以下参数进行检查和定量：

-颅骨和硬膜之间粘连的形成；

-脑脊液泄漏和炎症变化；

-硬膜移植物的可见的变化；和

-脑膜皮层粘连和皮层反应.

显微镜检查

按照以下方法对组织学切片进行系统性评估：

-对移植部位的炎症反应进行描述和定量(硬膜外、硬膜下、位于硬膜和移植物之间的过渡区)；

-移植物结缔组织的组织的程度；

-异物反应的程度；

-蛛网膜下隙的改变(炎症过程；纤维化对开放的蛛网膜下隙)；和

-皮层的改变(炎症，坏死).

肉眼检查和组织学研究结果

下面所描述的组织学研究结果在细胞组成方面相同，而在强度方面不同，所述研究是用来自相同动物的不同的额切片以及在相同组的所有动物进行的。

移植物整合的肉眼检查评估

在2周时间段之后取出颅骨，在血纤蛋白胶残余物和覆盖的骨之间发现了双侧的最小的粘连.这种粘连是容易松开的。在任一个硬膜移植部位都没有出现炎症或脑脊液渗出的迹象.在两种移植物上都分散有斑点状独立的血凝块，其直径为几个毫米.

在左半球上，所述马胶原薄片仍然同样是局限的，并且看上去比最初的磨砂玻璃外观变得透明度更差一些。在将所述硬膜小心地从皮层上取下时，所述胶原产品保持与所述硬膜边缘附着.存在少数几个非常轻微的粘连，这些粘连很容易松开而又不损伤皮层。

用肉眼看上去右半球中的

 Dura没有改变.在取出所述产品时，在移植物-硬膜接触区中，

 Dura在一定位置上发生分离.在将硬膜从皮层上取下时，有很少的蛛网膜下粘连，不过，很容易用镊子将这些粘连松开。

手术之后四周，在叠盖骨和下面的硬膜的边缘之间存在少数的粘连；这些粘连是由于血纤蛋白胶的残余物造成的.所述骨能够在没有拖拉的情况下很容易地从硬膜上松开，从而不会导致对硬膜或移植物的损伤。在位于左半球上的所述马胶原薄片部位，硬膜和移植物之间的分界区不再明确。所述移植物与以前相比变得不太透明，并且呈现浅红色.所述移植物朝向脑的表面的面貌是均匀的、光滑的和可以移动的.不再存在硬膜下粘连.可以看到少数几个血凝块残余物.

用肉眼看上去 Dura同样没有改变.检查移植物和硬膜之间的接触区发现了不充分的、容易松开的结合.

手术之后八周，位于左半球上的硬膜和马胶原薄片移植物之间的过渡区不再存在.在脑膜两侧的结构连续性是明显的。放置所述马胶原薄片的区域仅仅出现在略微变薄的膜上，并且呈现浅红色外观.参见图9和10.此时位于右半球中的

 Dura移植物的两侧都被薄的结缔组织膜覆盖.参见图11.在重叠的硬膜下面，移植物的边缘仍然清晰可见。对

 Dura轻微的拖拉就足以使它与预先形成的硬膜分离。

在16周之后，新硬膜形成在所述马胶原薄片部位进一步发展，并且所述硬膜和新硬膜几乎不可区分.

位于右半球上的

 Dura移植物的结缔组织封装变得更清晰.

在24周时间段之后，两个移植部位的切片与前一组的切片在肉眼检查上没有差别.

移植物整合的显微镜评估

正如所预料的，在手术之后两周，所述马胶原薄片移植物部位出现了广泛的炎症改变区域.整个蛛网膜下隙是通过粘连闭合的，这种粘连是由于来自淋巴细胞、分割的粒细胞和巨噬细胞的大量渗出物造成的.在所述移植物上，具有非常广泛的炎症渗出物的某些区城同样是明显的。除了淋巴细胞和单核细胞成分之外，还有小的骨碎片具有多核巨大细胞与相应的异物的反应.

所述马胶原薄片移植物本身表现出均匀结构的疏松和炎症细胞的入侵，是心形的或广泛的.参见图12.在少数场合下，存在(与手术相关的)大脑皮层的浅表区的缺血性坏死.

 Dura样品同样表现出广泛的炎症反应，特别是在蛛网膜下隙.移植物本身不会被炎症细胞渗透，但是，在两端炎症淋巴细胞和单核细胞和异物反应是可以确认的.

在四周时间段之后，所述马胶原薄片移植部位的炎性改变发生了明显衰退，但是，仍然存在草坪样淋巴细胞和单核细胞渗出物。参见图13和14。多核异物巨大细胞更为常见，特别是在靠近骨碎片处。在最初的马胶原薄片移植物中可以看到多个成纤维细胞。在HE(苏木精-曙红-染色)切片上，移植物的一般的均匀结构是检测不到的.用BVG(Elasticavon Gieson)和trichrome染色的样品在以前的移植部位表现出广泛的胶原纤维新生.实际的硬膜顺利地让路于松散结构的组织，这种组织由表现出炎性渗透的新形成的胶原纤维组成。不再存在以前观察到的柔脑膜的炎性粘连.同样存在蛛网膜下隙，从而产生裂口.软脑膜继续表现出淋巴细胞-单核细胞在一定位置渗透的小的结节.

在

 Dura部位没有结缔组织的组织的迹象.在植入的组织的上面和下面存在炎性渗出，并且在预先成型的硬膜的过渡区存在炎性渗透.蛛网膜下隙是可检测的和明显的.参见图15.

在手术之后八周，在所述马胶原薄片组中，在新硬膜中的炎症过程进一步衰退.只有小的淋巴细胞和单核细胞渗透丛仍然存在.所述蛛网膜下隙是清晰的，并且同样只存在小的炎症活性病灶.用EVG和trichrome染色的切片在高度胶原的内源硬膜和新形成的新硬膜的胶原纤维之间表现出明显的连续性.这种新的膜看上去厚度不同，并且部分地表现出结构疏松。参见图16.

在

 Dura部位，也已很好地消除了炎症活性.在一定位置不存在与相邻的硬膜的整合，而在其他位置，存在与相邻的硬膜的炎性渗透和粘连的迹象.

在16周之后，在所述马胶原薄片组中，仍然可以看到淋巴细胞和单核细胞结节状炎性渗透物的丛.高度胶原的实际硬膜和新硬膜之间的连续性没有改变，其中相对于在8周的发现没有出现重大的结构改变.存在不同厚度的胶原纤维，其中在一定位置存在某些结构疏松。

 Dura部位同样显示了与周围硬膜的炎性变化和粘连；这些发现的强度不同.

在24周之后，在所述马胶原薄片组中，除了细胞炎症反应的进一步衰退之外，与16周的移植物整合阶段相比，不存在相关的组织学差异.

参见图17.

组织学结果

在下面的表1中提供了在移植部位和硬膜下和硬膜外隙的炎症反应、结缔组织的组织和异物反应程度的定量。

炎症(炎症反应)：

--   没有可见的炎症反应的迹象

u    仅仅局限的炎性渗透

+    轻度炎症反应

++   显著炎症反应

+++  严重的炎性渗透

移植物的组织：

--   结缔组织的组织缺乏或轻微

+    移植物内隔离的成纤维细胞

u    局限的组织的组织(40％-70％)

u/K  组织的组织>70％

K    新硬膜和硬膜的可见的连续性，移植物的完全组织(100％)

异物与多核巨大细胞的反应：

--   没有异物反应

u    仅有局限的异物反应

+    中度异物反应

++   显著的异物反应

+++  广泛的异物反应

在下面的表2中提供了两个移植部位的蛛网膜下隙的组织学检查结果。

炎症：

--    无炎症反应

+     中度炎症反应

++    显著炎症反应

严重炎症反应

SAS(蛛网膜下隙)闭合：

--    分散的炎症细胞

+     由细胞渗透闭合的SAS

u     在SAS中隔离的炎性渗透

pF/F SAS的部分纤维化/纤维化

SAS开放：

—  SAS主要是清晰的，具有隔离的细胞组

+   蛛网膜下隙清晰

讨论

手术方法的评估和两种移植物的处理

所述马胶原薄片以不存在问题的手术内的处理为特征.在生理盐水中再次水合5分钟，产生了大约2mm厚的非常坚硬的薄膜，它不会丧失其形状，不会粘聚，并且非常容易切割成型。很容易用镊子和平头钩子将这种材料放入硬膜缺陷中.由于它的活动性，在固定在一定位置之前还很容易纠正所述马胶原薄片在脑表面上的位置.没有必要缝合所述薄膜，因为使用血纤蛋白胶能够将所述移植物快速而且容易地附着在所述硬膜边界上.以前的研究同样也已证实，血纤蛋白胶是用于硬膜闭合的可靠的封闭剂.

用最小的拖拉就能将实验性施用的固定缝合线从所述马胶原薄片上拉开，从而表明了血纤蛋白胶是这种移植物的更好的选择。

在随后取出所述产品时，在某些场合下存在过于随意的施用血纤蛋白胶业已导致了与一定位置的覆盖骨粘连的迹象。这些粘连必须用解剖器小心地松开，以便避免拉动脑膜和皮层.这一问题可以通过使用或点上少量的血纤蛋白胶而避免.在取出所述产品时，很明显，血纤蛋白胶自身的施用产生了牢固的硬膜闭合，并且避免了脑脊液渗出。这种现象在手术后2周就开始出现，此时，没有动物发展皮下CSF泄漏或脑脊液瘘管。

在经过几分钟的短时间的再水合之后，

 Dura产品同样很容易处理，不过它是更坚硬的，并且在口径方面表现出大的波动.

血纤蛋白胶产生适度的粘连，以便将

 Dura保持在最初的位置上，但是在量新打开手术部位时，原始硬膜和移植物之间的连接是疏松的.在手术之后24周依然是这种情况，这是由于

 Dura本身没有与自体的硬膜融合的结果.因此，使这种移植物与单个缝合线附着的实践似乎好于使用血纤蛋白胶，因为观察表明，在其他场合下不会出现适当的整合.在

 Dura和皮层之间的过渡区很少出现粘连，这些粘连使用解剖器很容易分开.

用于将所述马胶原薄片插入硬膜和皮层之间的技术似乎在某些手术场合下是不适合的.具体地讲，用这种方法在涉及大脑实质的大的缺陷，例如，肿瘤腔的手术中似乎不能适当地固定.

在肉眼检查水平上，所有动物都表现出硬膜缺陷的可靠的闭合，其中没有移植物排斥反应.在少数场合下发展了移植物和皮层结构之间的小的粘连，这可能是由于在手术期间对蛛网膜的微小的损伤造成的.过度滥用血纤蛋白胶，导致某些动物在小的区域具有容易松开的与叠盖的骨的粘连.

从组织学角度看，在植入之后14天出现了淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞对所述马胶原薄片的密集的渗透.随后在移植物中形成了毛细管.在手术后仅4周，在蛛网膜下和硬膜下/硬膜外隙的伴随的炎性改变就充分衰退。由于胶原纤维新生而在所述马胶原薄片移植物和周围的硬膜之间出现的连续的过渡此时同样是可见的.

通过所述马胶原薄片诱导的这种新硬膜在手术之后24周不如原始硬膜厚，这可能是由于所述硬膜薄片从开始仅提供了某种厚度。不过这种差异可能随着更多胶原纤维的产生在随后被抵消。

在手术之后两周，

 Dura在薄层结缔组织中表现出所述产品的肉眼可见的封装，所述薄层随着时间的推移变厚。另外，所有动物都表现出适当的硬膜闭合，没有CSF瘘管，并且在移植物和皮层或骨之间出现少许粘连.

尽管在移植物周围的结构中存在类似的炎症反应，但没有手术后进行组织的迹象，并且少有移植物的细胞渗透和复苏的迹象。

除了预期的局部包含的淋巴细胞和单核细胞炎症反应之外，没有动物发展神经学异常或伤口感染.

实施例2-马胶原薄片的膨胀能力

涉及所述马胶原薄片的膨胀能力的研究是按以下方法进行的：

1)首先将所述马胶原薄片切割成1cm²的方形片。

2)在常规扫描显微镜下检查这些切割片的样品，以便确定所述材料的总体形态学一致性和厚度，作为膨胀过程的参考。

3)然后将这些切割片放入塑料培养皿中。

4)然后通过以下方式检查流体吸收能力和膨胀能力：用生理盐水溶液连续滴定，用Eppendorf微量移液管施用，其中使用逐渐加大量的流体，从10μl/cm²开始直到最高150μl/cm²(参见表3).

结果：

在如上表所示的1、2和3小时之后测定被渗透到所述马胶原薄片中的流体量.

一片大小为1cm²的马胶原薄片材料能完全吸收10μl量的盐水流体，而又并不会有厚度的明显可见的膨胀。

20μl量的盐水流体能够用1cm²的马胶原薄片完全吸收，并且导致该材料厚度的略微增加.

在整个系列中只观察到了马胶原薄片厚度的最小的增加.据估计，厚度的最大增加仅为初始体积的大约2倍，即使在3小时之后。

在第一小时之后没有发现厚度或流体吸收的显著增加.

实施例3-水合的马胶原薄片的长度的增加

1.0cm²大小的七个干燥马胶原薄片放在等渗氯化钠中水合1小时。由于干燥马胶原薄片水合而导致的平均长度增加为大约3.4％.

表4

 

片编号	干燥长度(mm)	水合长度(mm)
			1	17.5	18
2	17.7	18.3
			3	17	17.9
4	17.8	18.5
			5	18.1	18.7
6	18.6	19.5
			7	17.7	18.2
平均	17.8	18.4

实施例4-水合的马胶原薄片重量的增加

将大小为1.0cm²的七个干燥的马胶原薄片放在等渗氯化钠中水合1小时。水合的马胶原薄片的重量大约为干燥状态的五倍。

表5

 

片编号	干燥长度(mg)	水合长度(mg)
			1	8.4	40.2
2	7.6	37.9
			3	8	39.3
4	8.1	39.6
			5	8.6	41.9
6	8.7	46.8
			7	7.7	38.3
平均	8.2	40.6

实施例5-马胶原薄片的抗张强度和弹性/柔韧性

测量了若干硬膜产品和本发明的马胶原薄片的抗张强度。将样品安装在管子的下端，并且将水柱连续增加到最大为300cm来提高抗张强度.图18提供了试验室的说明.

所述试验室能够通过鉴定产品由于超出该产品抗张强度的压力而损坏的点，来测定所述硬膜代用品的强度.本发明的马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)和胶原薄片(胶原含量：4.0mg/cm²)与Duragen(IntegraNeuroSciences，Plainsboro，NJ)进行比较。

试验结果表明，所述马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)和胶原薄片(胶原含量：4.0mg/cm²)能承受最高达300cm的水柱而不损坏.参见图19和20.比较而言，在健康颅骨中产生的压力不会超过大约15cm高的水柱；在病理学状态下，所述压力可以提高到最高大约50cm.

DuraGen测量了明显更低的抗张强度，在200cm水柱的压力下破裂。参见图21.所述试验室还能够通过鉴定所述产品在压力下伸展的程度来比较所述产品的弹性.因此，产品的弹性/柔韧性是通过测量产品在所述水柱重量下的凸出确定的.

将所述马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)和胶原薄片(胶原含量：4.0mg/cm²)的弹性/柔韧性与DuraGen、胶原测试薄片、Tutoplast阔筋膜(Tutogen Medical GmbH，Neunkirchen am Brand，德国)，和Ethisorb Dura Patch(Ethicon GmbH & Co.KG，Nordrstedt.德国)进行比较.参见图22-25。

与其他产品相比，所述马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)表现为较大的抗张强度和弹性/柔韧性偶联的混合物.这使得它能够承受作为硬膜代用品在它上面产生的压力，同时保持柔韧性和弹性，从而使它适合脑和颅骨的轮廓。相反，Ethisorb和Tutoplast在水柱试验中表现出高的抗张强度，但是具有低得多的弹性/柔韧性。

实施例6-不透液体的特性

置换硬膜产品的不透液体的特性的测量是使用与实施例5所讨论的相同的实验设置测定的.

在本实验中，相对水柱高度测量水滴的发展和丧失的水的体积.该实验的结果如图23-26所示。

在本实验中，所述马胶原薄片(胶原含量：5.6mg/cm²)在超过300cm高的水柱下保持是不透液体的。所述胶原薄片(胶原含量：4.0mg/cm²)在300cm高的水柱下表现出小水滴的丧失.由于具有多孔结构，DuraGen不是不透水的，而是甚至在低的水压力下也表现出明显的水的丧失。类似地，Tutoplast阔筋膜同样不是不透水的，在低压力下表现出水的丧失.

实施例7-稳定性和抗撕强度

只有在潮湿和干燥环境下足够稳定、有弹性和抗撕裂的材料适合用作特殊手术场合的植入物，如用于替代硬膜。因此，测定潮湿材料的抗撕强度/极限张力，提供了关于结构、稳定性和保持在手术部位的可能性的有价值的信息.

用水合样品测试胶原手术植入物的抗撕强度，以便模拟在身体中占优势的条件。将所述材料放入等渗盐水溶液中5分钟.

为了测量抗撕强度/极限张力，将胶原植入物条在Zwick Model 1120All-Purpose Testing Machine(Zwick GmbH & Co.KG，Ulm，德国)中夹住。在表6中提供了测试过的胶原植入物。

表6-胶原植入物

 

测试条	试剂	浓度	来源
				A	胶原“压缩”海绵	10.0mg/cm<sup>2</sup>	牛真皮
B	胶原“泡沫”海绵	大约2.6mg/cm<sup>2</sup>	马跟腱
				C	胶原海绵	2.8mg/cm<sup>2</sup>	马跟腱
D	胶原薄片	4.0mg/cm	马跟腱
				E	马胶原薄片	5.6mg/cm	马跟腱

机器控制、数据获取和测试，包括统计学估计是使用TestExpert软件(Zwick GmbH & Co.KG，Ulm，德国)进行的.试验海绵样品A、B和C看来相当脆弱.将样品A、B和C切割成宽度为1.4cm的4cm的条。按比例计算所有样品的1.0cm宽度条的测试结果。测试条的极限张力值是以牛顿/cm-条为单位测量的.在表7和图27中提供了测试结果。

表7-抗撕强度/极限张力

 

测试条	抗撕强度/极限张力(顿/cm-条)	标准差
			A	0.46	0.19
B	0.45	0.11
			C	1.64	0.69
D	3.21	0.69
			E	4.09	0.24

结论

所述马胶原薄片的独特的生产方法，提高了它的抗撕强度/极限张力.

与胶原海绵相比，胶原薄片表现出明显更高的抗撕强度/极限张力.

胶原薄片的抗撕强度随着每平方厘米的胶原含量的提高而提高(例如，胶原含量为4.0mg/cm²：3.21N/cm-条；胶原含量为5.6mg/cm²：4.09N/cm-条).

综上所述，可以看出实现了本发明的若干目的.

由于在不背离本发明范围的前提下可以对上述组合物和方法进行多种改变，所以希望在上述说明书中所包含的所有事项都被理解成说明性质的而不是限制性质的.

关于在整个说明书(包括下面的权利要求书)中所使用的词语“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，申请人指出，除非在上下文中有其他需要，这些词语是以基本的和清楚的理解使用的，即它们被解释成包含性质的，而不是排他性质的，并且申请人希望上述每一个词语在理解整个说明书中都以这种方式解释.

Claims (27)

1.马胶原薄片在生产用来通过使所述硬膜组织与所述薄片接触而修复和再生哺乳动物中硬膜组织的药物中的用途，其中，所述马胶原薄片包括天然交联的马胶原原纤维的非天然存在的生物基质，所述生物基质是大体上无孔的，并且基本上由非细胞成分组成，所述成分包括结缔组织蛋白。

2.如权利要求1的用途，其中，所述马胶原薄片包括多层胶原原纤维。

3.如权利要求1或2的用途，其中，所述马胶原原纤维源于腱。

4.如权利要求3的用途，其中，所述腱是跟腱。

5.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片是可再吸收的。

6.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述硬膜组织因为先天性状况、出生缺陷、疾病、损伤或手术过程而需要修复和再生。

7.如权利要求6的用途，其中，所述手术过程是肿瘤切除。

8.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述硬膜组织位于颅骨内。

9.如上述权利要求1-7中任意一项的用途，其中，所述硬膜组织位于脊柱内。

10.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在干燥形式下的厚度为0.01mm-3.0mm，例如0.02mm-2.0mm，0.03mm-1.5mm或0.05mm-1.0mm。

11.如上述权利要求1-9中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在它的干燥形式下的厚度为1.0mm或更薄。

12.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述接触步骤包括利用血纤蛋白封闭剂、组织胶和/或外科缝合线，和/或利用压力配合技术或利用马胶原薄片和硬膜组织之间的天然粘连将所述马胶原薄片附着在硬膜组织上。

13.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片大体是不透液体的。

14.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在所述接触步骤之前水合例如5秒钟至10分钟，优选在所述接触步骤之前在生理盐水中水合1-6分钟。

15.如上述权利要求1-13中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在所述接触步骤之前不进行水合。

16.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在完全水合时，重量达到其干重的最多15倍，优选仅达到它的干重的最多10-最多5倍。

17.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在干燥时其重量为1mg/cm²-50mg/cm²，例如，2.5mg/cm²-10mg/cm²。

18.如上述权利要求1-16中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在完全水合时的表面积比它的干燥形式的表面积大-5％-20％，优选大-5％-10％或-5％-5％，例如比它的干燥形式大大约4％。

19.如权利要求1的用途，其中，所述马胶原薄片的厚度在完全水合时大约是它的干燥形式的厚度的大约2倍或3倍。

20.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在与脑膜细胞进行细胞组织之后不会附着在神经组织或脑组织上。

21.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片在与脑膜细胞发生细胞组织之后不会附着在颅骨或脊柱组织上。

22.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述哺乳动物选自：人、马、羊、猴和实验室动物。

23.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片还包括选自下列一组的赋形剂：防腐剂、生长因子、有助于马胶原薄片的柔韧性和弹性的添加剂，以及它们的组合。

24.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片不包含病毒或朊病毒。

25.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述胶原原纤维基本上由I型胶原组成。

26.如上述权利要求中任意一项的用途，其中脑膜细胞的细胞组织是在手术后大约六周完全组织的。

27.如上述权利要求中任意一项的用途，其中，所述马胶原薄片的极限张力为0.5牛顿/cm-条-30牛顿/cm-条，例如，1牛顿/cm-条-6牛顿/cm-条。

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