CN100466910C - 棉粕水解物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种棉粕蛋白水解物与制备方法及其应用，涉及一种蛋白水解物，尤其是涉及一种利用动物饲料棉粕蛋白制备的水解多肽与制备方法及在杂草萌前控制的应用。提供一种对杂草种子萌发有抑制作用的棉粕蛋白水解物与制备方法，并将用于制备对杂草种子萌发有抑制作用的除草剂。外观：黄褐色冰淇淋状粉末，干物质＞90%，蛋白质＞75%，水溶性：可溶，灰分＜5%，pH＝6.8。制备时在棉粕中加入水在容器中震荡，加入氨水调节溶液pH成底物，加入碱性蛋白酶反应，再加入氨水维持反应体系pH值，将反应溶液置于水浴灭酶离心，取其上清液冷冻干燥成干粉。具有抑制杂草种子萌发的作用，用于制备对各种杂草种子萌发有抑制作用的除草剂。

Description

棉粕水解物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白水解物，尤其是涉及一种天然蛋白原料棉粕制备的水解物以及在杂草萌前控制中的应用。

背景技术

除草剂已广泛应用于农田、果园及城市草坪的杂草控制，除草剂的种类很多，但大多数除草剂是通过化学合成而生产的化学除草剂。尽管化学除草剂能有限控制杂草的生长和传播，但其对土壤、地下水的污染的问题也日益显露出来，同时多次反复使用化学除草剂也容易导致杂草的耐药性。因此，生产天然无毒副作用的除草剂是除草剂发展的必然趋势。而近年来人们相继发现一些生物体中的某些天然活性肽和蛋白质水解多肽具有除草的活性，为在环境要求日益苛刻的条件下如何进行除草剂研制的创新工作提供了一种全新的思路。天然除草活性多肽的分子的结构往往很复杂，因而在很大程度上限制了它们的推广应用。为此，人们通过两种方法作进一步改进：一种方法是试图通过构效关系研究获得一些指导性的信息以设计合成结构简单、易于合成的除草活性肽的类似物；另一种方法是通过蛋白质水解筛选具有除草活性的多肽，这种方法更为简便可行。国外，尤其是美国，在蛋白质水解除草活性的多肽方面作了不少具有开拓性的工作，他们以玉米蛋白粉为原料来制备玉米蛋白粉水解物，而这些水解多肽能抑制种子萌发时根系的形成。活性多肽的除草机制是通过阻断种子根系分生组织的有丝分裂来抑制种子根系的形成。更为有意义的是，这些除草活性肽只对萌发中的种子的根系的形成有抑制作用，这种抑制作用不论是对双子叶植物杂草还是单子叶植物杂草都有效果，而对萌后的成熟根系则没有影响。根据玉米蛋白粉水解多肽只对种子萌发生根有抑制作用这一特点，可开发出萌前除草剂，而这种除草剂对环境不产生任何的污染作用并可作为农作物及草坪植物的肥源。国内还没有开展此方面的研究和产品开发，而应用天然蛋白饲料棉粕为原料制备出的水解物应用杂草的萌前除草剂还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对杂草种子萌发有抑制作用的棉粕水解物与制备方法及其在制备天然环境友好型的除草剂中的应用。

本发明所述的棉粕蛋白水解物其外观为黄褐色冰淇淋状粉末，干物质的含量>95％，蛋白质的含量>78％，水溶性：可溶，灰分<5％，pH＝6.80～7.06。

本发明所述的棉粕蛋白水解物的制备方法，其步骤为：

1)在棉粕中加入水后在容器中震荡，再加入氨水调节溶液的pH至7.8～8.5成为底物，按质量比棉粕:水＝1:(8～10)；

2)在底物中加入碱性蛋白酶反应，再加入氨水维持反应体系的pH值在7.8～8.5，反应时间为5～8h，得反应溶液，按质量比底物:碱性蛋白酶＝1:(1～3)；

3)将反应溶液放置于100℃水浴灭酶，离心取其上清液冷冻，干燥成干粉，冷藏备用。

在步骤1)中，在棉粕中加入的水为去离子水，在容器中震荡的温度最好为60℃。最好用20％氨水调节溶液的pH至8.0。

在步骤2)中，在反应过程中不断震荡，最好温度保持在60℃，并滴加20％氨水维持反应体系的pH值在8.0，反应时间为6h。

在步骤3)中，将反应溶液置于100℃水浴锅中加热15min进行灭酶，然后4000r/min离心20min，取其上清液浓缩后冷冻干燥成干粉冷藏备用。

本发明所述的棉粕蛋白水解物具有抑制杂草种子萌发的作用，可将其用于制备对各种杂草种子萌发有抑制作用的除草剂。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明。

实施例1

在棉粕中加入去离子水后在60℃的恒温振荡器中震荡，三角瓶中溶液温度恒温后，用20％氨水调节溶液的pH至8.0成为底物，按质量比棉粕:去离子水＝1:9；在底物中加入碱性蛋白酶反应，在反应过程中不断震荡，温度保持在60℃，并滴加20％氨水维持反应体系的pH值在8.0，反应时间为6h，按质量比底物:碱性蛋白酶＝1:2；将反应溶液放置于100℃水浴锅中加热15min灭酶，然后4000r/min离心20min，取其上清液冷冻，干燥成干粉。冷藏备用。碱性蛋白酶选用Alcalase 2.4L丹麦Novo Nodisk公司生产，标定活力2.4AU/g。

棉籽粕是棉籽榨油后的副产物，经过一系列加工后制成高蛋白质动物饲料，其质量稳定，其质量标准如下：粗蛋白质(Crude protein)≥42％，粗脂肪(Crude fat)≤1.1％，粗纤维(Crude fiber)≤10％，粗灰粉(Crude ash)≤7％，水分(Moisture)≤11％。

以下给出棉粕蛋白水解物的除草活性检测方法实例：

取杂草胜红蓟(Ageratum conyzoides)及其它7种植物种子用75％酒精杀菌并用蒸馏水冲洗3次后放在双层滤纸上置于6cm的培养皿中，对所设置实验处理分别加入2ml相应浓度的多肽液后用Parafilm封口胶封口培养。培养条件：每天光照16h，温度25℃，光照强度15001x。培养时间共7天。本实验设4个浓度处理，分别为0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/l，2.0mg/ml，以去离子水为对照，各处理和对照选用20粒种子，重复3次。培养时间结束后用数显游标卡尺测量各幼苗根系中最长根的长度作为统计标准。

以下给出实验结果及应用。

抑制率如下式计算：

抑制率(％)＝(对照组根长—处理组根长)/对照组根长×100％

所有定量指标均用x±s表示。实验结果见表1，不同浓度的水解物溶液对杂草胜红蓟种子萌发生根均有明显的抑制作用，当水解物浓度达到2mg/l时，能将杂草胜红蓟(Ager种子生根完全抑制。此外，进一步的实验还表明棉粕蛋白水解物还对其它7种植物种子萌发时根系的形成也有明显的抑制作用(参见表1)。由于棉粕蛋白水解产物对植物种子萌发时根系形成的抑制作用，而且对植物的成熟根系没有任何影响，因此它可以作为一种天然萌前除草剂应用在农田，特别是有机转换型蔬菜、城市草坪的杂草防治上有着重要的应用，这样可以减少使用化学除草剂对环境产生的污染，具有良好的经济效益、生态效益和社会效益。

表1 不同浓度的棉粕水解物对几种植物种子萌发生根抑制率            (％)

实施例2

与实施例1类似，其区别在于在棉粕中加入去离子水后在60℃的恒温振荡器中震荡，三角瓶中溶液温度恒温后，用20％氨水调节溶液的pH至7.8成为底物，按质量比棉粕:去离子水＝1:8；在底物中加入碱性蛋白酶反应，在反应过程中不断震荡，温度保持在60℃，并滴加20％氨水维持反应体系的pH值在7.8，反应时间为5h，按质量比底物:碱性蛋白酶＝1:1；将反应溶液放置于100℃水浴锅中加热10min灭酶，然后3800r/min离心15min，取其上清液冷冻，干燥成干粉，冷藏备用。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于在棉粕中加入去离子水后在60℃的恒温振荡器中震荡，三角瓶中溶液温度恒温后，用20％氨水调节溶液的pH至8.5成为底物，按质量比棉粕:去离子水＝1:10；在底物中加入碱性蛋白酶反应，在反应过程中不断震荡，温度保持在60℃，并滴加20％氨水维持反应体系的pH值在8.5，反应时间为8h，按质量比底物:碱性蛋白酶＝1:3；将反应溶液放置于100℃水浴锅中加热20min灭酶，然后4200r/min离心25min，取其上清液冷冻，干燥成干粉，冷藏备用。

实施例4

与实施例1类似，其区别在于在棉粕中加入去离子水后在60℃的恒温振荡器中震荡，三角瓶中溶液温度恒温后，用20％氨水调节溶液的pH至8.2成为底物，按质量比棉粕:去离子水＝1:9.5；在底物中加入碱性蛋白酶反应，在反应过程中不断震荡，温度保持在60℃，并滴加20％氨水维持反应体系的pH值在8.2，反应时间为7h，按质量比底物:碱性蛋白酶＝1:2.5；将反应溶液放置于100℃水浴锅中加热20min灭酶，然后4000r/min离心25min，取其上清液冷冻，干燥成干粉，冷藏备用。

Claims (9)

1.棉粕水解物，其特征在于其外观为黄褐色冰淇淋状粉末，按质量百分比，干物质的含量>95％，蛋白质的含量>78％，水溶性：可溶，灰分<5％，pH＝6.8～7.06；

其制备方法包括以下步骤：

1)在棉粕中加入水后在容器中震荡，再加入氨水调节溶液的pH至7.8～8.5成为底物，按质量比棉粕:水＝1:8～10；

2)在底物中加入碱性蛋白酶反应，再加入氨水维持反应体系的pH值在7.8～8.5，反应时间为5～8h，得反应溶液，按质量比底物:碱性蛋白酶＝1:1～3；

3)将反应溶液放置于100℃水浴灭酶，离心取其上清液冷冻，干燥成干粉，冷藏备用。

2.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤1)中，在棉粕中加入的水为去离子水。

3.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤1)中，在容器中震荡的温度为60℃。

4.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤1)中，用20％氨水调节溶液的pH至8.0。

5.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤2)中，在反应过程中不断震荡，温度保持在60℃。

6.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤2)中，滴加20％氨水维持反应体系的pH值在8.0。

7.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤2)中，反应时间为6h。

8.如权利要求1所述的棉粕水解物，其特征在于在制备方法的步骤3)中，将反应溶液置于100℃水浴锅中加热15min进行灭酶，然后4000r/min离心20min，取其上清液浓缩后冷冻干燥成干粉冷藏备用。

9.如权利要求1所述的棉粕水解物在制备对杂草种子萌发有抑制作用的除草剂中的应用。