CN100462368C - 一种嗜盐菌素及其免疫蛋白和它们的编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种极端嗜盐古菌蛋白类抗生素-嗜盐菌素及其免疫蛋白和它们的编码基因与应用。它的原蛋白是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质。嗜盐菌素成熟蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID №：2的第208-283位所示。嗜盐菌素成熟蛋白在抑制或杀灭极端嗜盐古菌中具有重要的应用价值。

Description

一种嗜盐菌素及其免疫蛋白和它们的编码基因与应用

技术领域

本发明涉及极端嗜盐古菌产生的蛋白类抗生素-嗜盐菌素及其免疫蛋白和它们的编码基因与应用，特别是涉及一种嗜盐菌素及其免疫蛋白和它们的编码基因在极端嗜盐古菌遗传操作系统中的应用。

背景技术

地球上的生物可分为原核生物(Prokaryotes)和真核生物(Eukaryotes)两大类，原核生物由两个不同的系统群构成，即真细菌(Eubacteria)和古生菌(Archaebacteria)，古生菌现在称为古菌(Archaea)。

古菌现在已被看作是起源于共同祖先的单一进化系统群，根据生存的环境和对营养的需求不同，古菌一般可分为产甲烷古菌(Methanogens)、极端嗜盐古菌(Extremehalophiles)和极端嗜热古菌(Extreme thermophiles)三大类群。极端嗜盐古菌(Extremely halophilic archaea)通常简称为嗜盐古菌(haloarchaea)或嗜盐菌(halobacteria)，是古菌的一个重要类群。

嗜盐菌素(Halocin)是由极端嗜盐古菌(尤其是杆菌)分泌到胞外的对其相近属或种的微生物具有抑制或致死作用的蛋白类抗生素，它是研究极端嗜盐古菌基因表达调控、蛋白分泌及其结构和功能的理想材料。

最早的嗜盐菌素是由Rodriguez-Valera及其同事于1982年发现的(Rodriguez-Valera，et al.，1982，Can J Microbiol 28：151-154.)。目前，已发现有上百株极端嗜盐古菌可以产生不同种类的嗜盐菌素，但其中研究比较深入的嗜盐菌素仅为：H1(Platas et al.，2002，Int Microbiol 5：15-19)，H4(Cheung et al.，1997，J Bacteriol 179：548-551)，H6(Torreblanca et al.，1989，J Gen Microbiol135：2655-2661)和S8(Price et al.2000.J Bacteriol 182：4951-4958)。且国际上仅有H4和S8两种嗜盐菌素完成基因克隆，而嗜盐菌素的免疫蛋白(或抗性基因)的研究迄今为止在国际上尚无报道。

嗜盐菌素大多是极端嗜盐古菌在从对数生长末期向稳定期过渡时产生的，表明嗜盐菌素的产生对于极端嗜盐古菌具有重要的生态学意义：进入稳定期时，由于营养等的消耗，环境恶化，生长变缓，在这时产生的嗜盐菌素一方面可以裂解敏感细胞，释放出内容物，丰富环境中的营养；另一方面，溶菌或抑菌作用可以减少竞争。当环境中的营养重新变得丰富时，产嗜盐菌素的菌株就会在一个竞争相对减少的环境中优先利用这些营养，因此，嗜盐菌素在环境中的存留时间越长，性质越稳定，对其产生菌株越有利。而性质稳定、抑菌谱广的嗜盐菌素具有更好的应用前景。

嗜盐菌素的产生菌对其产生的嗜盐菌素具有抗性，这主要是由编码其免疫蛋白的抗性基因决定的。嗜盐菌素的抗性基因(即编码其免疫蛋白的基因)，可作为极端嗜盐古菌遗传转化系统中优良的抗性选择标记。极端嗜盐古菌由于其独特的生理生化和遗传特性及其细胞内的高盐浓度，使其对常规的抗生素不敏感。目前用于极端嗜盐古菌遗传转化系统抗性选择的抗生素主要是新生霉素(Novobiocin，Nb)和莫维诺林(Mevinolin，Mv)，不仅抗性标记单一，而且抗性标记基因易与染色体重组造成载体稳定性较差等，使得这些抗生素在嗜盐古菌中的应用受到一定的限制。此外，由于目前所用的莫维诺林抗性基因太大(3.5kb)，以其作为选择标记大大增加了载体的自身的大小，造成插入容量的降低。如能将嗜盐菌素的抗性基因克隆出来，并在极端嗜盐古菌的遗传转化系统中作为抗性的选择性标记，将解决极端嗜盐古菌遗传转化系统构建中的一大难题。因为用嗜盐菌素抗性基因作为抗性选择标记具有其它抗生素不可比拟的优越性：一是嗜盐菌素性质稳定、制备工艺简单、成本极低，而现在最常用的抗生素莫维诺林极其昂贵；二是嗜盐菌素抗性基因可能由质粒编码，敏感菌株不含此基因，因此不易与染色体基因重组，性质更稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜盐菌素及其免疫蛋白和它们的编码基因。

本发明所提供的嗜盐菌素(名称为嗜盐菌素C8)及其免疫蛋白(Hal I)，来源于极端嗜盐古菌盐杆菌AS7092菌株(Halobacterium sp.AS7092)。

该嗜盐菌素C8，是由嗜盐菌素C8原蛋白(ProC8)经过翻译后加工形成的嗜盐菌素C8的成熟蛋白(HalC8)。

嗜盐菌素C8原蛋白是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2由283个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-207位氨基酸残基为嗜盐菌素C8的免疫蛋白HalI，自羧基端(C端)第208-283位氨基酸残基为嗜盐菌素C8的成熟蛋白HalC8。

嗜盐菌素C8的成熟蛋白HalC8，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID №：2的第208-283位；

2)将序列表中SEQ ID №：2的第208-283位氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制极端嗜盐古菌Halobacterium sp.AS7092相近属或种的微生物作用的蛋白质。

嗜盐菌素C8的免疫蛋白Hal I，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID №：2的第1-207位；

2)将序列表中SEQ ID №：2的第1-52位氨基酸残基序列中的任意几个进行取代、缺失或添加且对所述嗜盐菌素具有抗性的蛋白质；

3)将序列表中SEQ ID №：2的第1-52位氨基酸残基序列中的任意几个进行取代、缺失或添加；将第53-207位氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且对所述嗜盐菌素具有抗性的蛋白质；

4)具有序列表SEQ ID №：2的第53-207位氨基酸残基序列的蛋白，或将第53-207位氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且对所述嗜盐菌素具有抗性的蛋白质。

序列表中SEQ ID №：2的第53-207位氨基酸残基序列为Hal I活性区。

嗜盐菌素C8及其免疫蛋白的编码基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID №：1由852个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-852位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

序列表中SEQ ID №：1的自5’端第1-852位DNA(嗜盐菌素C8原蛋白的编码基因(proC8))编码嗜盐菌素原蛋白ProC8。序列表中SEQ ID №：1的第622-849位DNA(halC8)编码嗜盐菌素成熟蛋白HalC8。序列表中SEQ ID №：1的第1-621位DNA(halI)编码嗜盐菌素免疫蛋白HalI。

序列表中SEQ ID №：1的第157-621位DNA序列为Hal I活性区的编码基因。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增本发明基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一种极端嗜盐古菌蛋白类抗生素—嗜盐菌素C8及其免疫蛋白HalI。嗜盐菌素C8是一种具有独特氨基酸序列的蛋白类抗生素，其性质稳定，经脱盐、煮沸或冻干处理都不会使其失活，同时C8在极端嗜盐古菌中具有广泛的抑菌谱，对多数极端嗜盐古菌(包括部分嗜盐碱古菌)具有抑制作用。C8免疫蛋白的编码基因halI(抗性基因)可作为抗性选择标记用于构建极端嗜盐古菌的新型遗传操作平台，将降低极端嗜盐古菌进行遗传改造的成本，同时该系统在进行抗性筛选时使用嗜盐菌素C8代替传统抗生素，可避免传统抗生素对环境的污染，使在极端环境中原位使用其工程菌改造或治理相应环境成为可能，为在极端嗜盐碱古菌中进行蛋白表达提供了一种新型有效的工具系统。此外，halI的长度仅为600多bp，且由质粒编码，嗜盐菌素C8敏感菌株不含此基因，因此不易与染色体基因重组，性质更稳定。嗜盐菌素C8的制备工艺简单、生产成本极低，相对于价格昂贵的莫维诺林，用嗜盐菌素C8作为筛选抗生素，以halI作为选择标记的遗传操作系统更具有优势。

附图说明

图1为用质谱仪精确测定嗜盐菌素C8分子量的结果

图2为GST-ProC8，GST-HalI，GST-Δ I 1，GST-Δ I 2，GST-Δ I 3，GST-HalR及GST对C8的免疫试验结果

图3为HalI表达质粒pHalI的物理图谱

图4为嗜盐菌素C8对Haloarcula hispanica ATCC33960/pPbop和Haloarcula.hispanica ATCC33960/pHalI的抑菌试验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、嗜盐菌素C8及其免疫蛋白编码基因的克隆及它们的氨基酸序列分析

从极端嗜盐古菌Halobacterium sp.AS7092的培养液中纯化分泌到胞外的嗜盐菌素C8(Li et al，2003，Extremophiles 7：401-407)，用常规方法测定其N端氨基酸序列。然后，根据嗜盐菌素C8的N端15个氨基酸残基序列“DIDITGCSACKYAAG”(序列表中SEQ ID №：2自N端第208-222位)，并利用氨基酸密码子的简并性及极端嗜盐古菌中G/C含量高的特点，设计扩增嗜盐菌素C8 N端氨基酸序列编码基因的一对简并引物，引物序列为：C8-2：5’GAYATYGAYATYACSGG3’(Y＝C或T，S＝C或G)；C8-4：5’CCSGCSGCRTAYTTRCASGC3’(Y＝C或T，R＝A或G，S＝C或G)。利用C8-2和C8-4，以极端嗜盐古菌Halobacterium sp.AS7092的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果扩增出一条长度为44bp的DNA片段，将该DNA片段与载体pUCm-T(上海生工生物工程公司)进行连接，经筛选得到含有该长度为44bp DNA片段的重组载体，命名为pUCm-T-44，对其进行测序，测序结果表明该长度为44bp的DNA片段所编码的氨基酸残基序列“DIDITGCSACKYAAG”与嗜盐菌素C8的N端15个氨基酸残基序列完全一致。以质粒载体pUCm-T-44为模板，利用T7RNA聚合酶(Progema公司)转录出一条对应于该44bp DNA片段的RNA片段，并以该RNA片段为探针与经不同限制性内切酶酶切的极端嗜盐古菌Halobacterium AS7092的基因组DNA进行Southern杂交，结果表明，在BamHI的完全酶切产物中可得到一条大小约为6.3kb的杂交信号条带。因此用BamHI酶切极端嗜盐古菌Halobacterium AS7092的基因组总DNA，并回收长度为6.3kb的DNA片段，将该回收DNA片段克隆入载体pUC18中，将含有回收片段的重组载体转化大肠杆菌DH5α构建部分基因组文库。对该基因文库采用PCR法进行筛选(引物为上述C8-2和C8-4)，将获得的阳性克隆质粒命名为pB03，它是在载体pUC18的BamHI酶切位点上插入了上述长度为6.3kb的DNA片段，然后以M13(+)/M13(-)为引物进行双向测序反应，进而根据所得的已知序列再设计引物继续往下游测序，直至完成对所获阳性克隆的全部序列测定工作。

对该测序结果进行分析，分析结果表明，该条长度为6.3kb的DNA片段是一段包括多个基因的基因簇，其中嗜盐菌素C8及其免疫蛋白由同一个基因的不同DNA片段编码，并经翻译后剪切获得，将该基因命名为proC8。proC8具有序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸序列，由852个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-852位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质(29.38kDa)，该蛋白被称为嗜盐菌素C8原蛋白(ProC8)。序列表中的SEQ ID №：2由283个氨基酸残基组成。根据嗜盐菌素C8的N端15个氨基酸残基序列“DIDITGCSACKYAAG”推断ProC8剪切掉其N端的207个氨基酸(序列表中SEQ ID №：2的第1-207位)才能成为成熟的嗜盐菌素C8，将嗜盐菌素C8的成熟蛋白命名为HalC8，若此推论正确，则嗜盐菌素C8的成熟蛋白应由ProC8的C端76个氨基酸组成(序列表中SEQ ID №：2的第208-283位)，分子量为7.4kDa。将从极端嗜盐古菌Halobacterium AS7092纯化的嗜盐菌素C8用MALDI-TOF-MS质谱仪进行分子量测定，结果其分子量恰好为7.4kDa(图1)，与预期结果一致。通过上述基因序列、蛋白N端测序及分子量测定，确定了嗜盐菌素C8成熟蛋白的氨基酸序列确为序列表中SEQ ID №：2的第208-283位，由76个氨基酸残基组成，属于极端嗜盐古菌蛋白类抗生素，其编码基因命名为halC8，具有序列表中SEQ ID №：1的第622-849位核苷酸序列。序列表中SEQ ID №：2的第1-207位的多肽为嗜盐菌素C8的免疫蛋白，命名为HalI，其编码基因命名为halI，具有序列表中SEQ ID №：1的第1-621位核苷酸序列。

实施例2、嗜盐菌素C8的免疫蛋白HalI对C8的免疫作用验证

在细菌当中，目前发现的细菌素基因和细菌素免疫基因都是由独立的基因编码的，但经常能够发现编码细菌素免疫蛋白的基因往往就紧邻细菌素编码基因，从而对自身起到保护作用。

以极端嗜盐古菌Halobacterium AS7092的基因组DNA为模板，PCR扩增proC8(SEQID №：1自5’端第1-852位核苷酸序列)，halI(SEQ ID №：1自5’端第1-621位核苷酸序列)，halI不同的缩短片段[包括halI-1(SEQ ID №：1自5’端第76-621位核苷酸序列)，halI-2(SEQ ID №：1自5’端第157-621位核苷酸序列)，halI-3(SEQ ID №：1自5’端第310-621位核苷酸序列)]，所用的引物序列如下(上、下游引物中分别引入BamH I和EcoR I识别位点(划线部分碱基))：

扩增proC8的引物：

C8-14：(上游引物)5’TTGGATCCATGAAGGAAGATAAT3’；

C8-16：(下游引物)5’GGGAATTCGCCGTCTAACAGAGC3’。

扩增halI的引物：

C8-14：(上游引物)5’TTGGATCCATGAAGGAAGATAAT3’；

C8-25：(下游引物)5’GCGAATTCTGTCGATATCCGCCG。

扩增halI-1的引物：

C8-14-1：(上游引物)5’ATGGATCCGCTGGGCTATTCGCT3’；

C8-25：(下游引物)5’GCGAATTCTGTCGATATCCGCCG。

扩增halI-2的引物：

C8-14-2：(上游引物)5’TAGGATCCACCGGCACCGAGAAA3’；

C8-25：(下游引物)5’GCGAATTCTGTCGATATCCGCCG。

扩增halI-3的引物：

C8-14-3：(上游引物)5’CGGGATCCGAGGTCGTCCAATAC3’；

C8-25：(下游引物)5’GCGAATTCTGTCGATATCCGCCG。

将上述PCR扩增的DNA片段用限制性内切酶BamH I和EcoR I酶切后分别克隆入经相同酶酶切的表达载体pGEX-4T-1(Pharmacia公司)中，然后转化大肠杆菌DH5α，用PCR和酶切的方法筛选出插入序列及位置正确的阳性克隆，然后将含有不同DNA片段的阳性克隆在37℃下培养至对数中期后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂，在37℃下继续培养3-4小时，使蛋白表达。培养结束后，离心收集菌体，对所收集的菌体进行超声破碎处理，并用GST亲和层析柱对所表达的蛋白进行纯化，得到经纯化的GST-ProC8，GST-HalI，GST-Δ I-1，GST-Δ I-2，GST-Δ I-3，及GST。

在涂布有对嗜盐菌素C8敏感菌株Halorubrum saccharovorum ATCC29252的AS-168(Li et al，2003，Extremophiles 7：401-407)固体平板上，分别打间隔距离相同(0.8cm)的两行孔洞，其中一行每孔加入1nmol的嗜盐菌素C8，另一行分别加入相同摩尔量(1nmol)的GST-ProC8，GST-HalI，GST-Δ I-1，GST-Δ I-2，GST-Δ I-3，及GST，观察上述诱导表达的蛋白对嗜盐菌素C8敏感菌株Hrr.SaccharovorumATCC29252生长的影响，结果如图2所示，嗜盐菌素C8成熟蛋白HalC8抑菌圈的扩散在GST-ProC8，GST-HalI，GST-Δ I-1，GST-Δ I-2的相对位置呈现明显的被抑制状态，而在GST-ΔI-3及GST的相对位置则没有被抑制的现象产生，排除了抑制现象由GST大小引起的可能。GST-ProC8和GST-HalI对嗜盐菌素C8在嗜盐古菌体外均有免疫作用，而GST-Δ I-3丧失免疫作用，表明该种免疫活性由HalI片段中的相应序列提供，因此HalI被称为嗜盐菌素C8的免疫蛋白，其编码基因halI被称为嗜盐菌素C8的抗性基因。由于GST-Δ I-2是目前已知具有C8免疫活性的最小肽段，因此其对应的序列(SEQ ID №：2自N端第53-207位氨基酸序列)称为HalI的活性区。

实施例3、嗜盐菌素C8的抗性基因halI对敏感菌株的保护作用及其在遗传操作系统中的应用

一、嗜盐菌素C8的抗性基因halI对敏感菌株的保护实验

以质粒pSCM201(参见专利申请“一种极端嗜盐古菌质粒及其衍生质粒载体”，专利申请号为200410049751.9)为模板，在引物SCMF：5’-TCCCCATCACTGTGCTGC-3’和引物SCMR：5’-CCCCAGTGAATGTTATGC-3’的引导下，PCR扩增载体pSCM201的DNA片段，然后将PCR扩增的pSCM201与载体pUCm-T连接，将该重组载体命名为pUCm-T/pSCM201，再将穿梭克隆载体pUBP2(Woods et al.，1997，Mol Microbiol23(4)：791-797)中的MevR用限制性内切酶EcoR I和Kpn I切下后，连接到经相同酶双酶切的重组载体pUCm-T/pSCM201上，将获得的重组载体命名为pUCm-T/pSCM201/MevR。在载体pUCm-T/pSCM201/MevR的BglII和BamH I酶切位点之间插入bop启动子(Patenge et al.，2000，Mol Microbiol 36：105-113)，得到重组载体pPbop，再在pPbop的BamH I和Xba I酶切位点之间插入halI，得到HalI的穿梭表达质粒pHalI，其物理图谱如图3所示。

将载体pHalI和未插入halI的载体pPbop(阴性对照)用原生质体转化法分别转化对嗜盐菌素C8敏感的嗜盐古菌菌株Haloarcula.hispanica(ATCC33960)，用酶切和回转大肠杆菌的方法进行验证得到阳性克隆，将转化有pHalI的阳性克隆命名为Haloarcula.hispanica ATCC33960/pHalI，将转化有pPbop的阳性克隆命名为Haloarcula.hispanica ATCC33960/pPbop，将上述两种阳性克隆菌株作为指示菌株测定其对嗜盐菌素C8的敏感性，方法为：在分别涂布有等量Haloarcula.hispanica(ATCC33960)/pPbop及Haloarcula.hispanica ATCC33960/pHalI的AS-168固体指示平板(含莫维诺林3μg/ml)，在37℃、光照及减少通气量的条件下，诱导48h后，在每个平板上打间隔距离相同(0.8cm)的4个孔洞，每个平板的4个孔洞中分别点入8μg、5μg、3μg和1.5μg的嗜盐菌素C8，观察嗜盐菌素C8对上述两种重组菌株生长的影响，结果如图4所示，表明含有Haloarcula.hispanica ATCC33960/pPbop的指示平板上的抑菌圈明显大于含有Haloarcula.hispanica ATCC33960/pHalI的指示平板；在Haloarcula.hispanica ATCC33960/pPbop的指示平板中，嗜盐菌素C8在5μg以上形成明显的抑菌圈；在Haloarcula.hispanica ATCC33960/pHalI的指示平板中，嗜盐菌素C8在5μg不形成抑菌圈；证明HalI使Haloarcula.hispanica ATCC33960对嗜盐菌素C8产生了免疫作用，且在低浓度(5μg/孔)时，含halI的工程菌即可对抗嗜盐菌素C8的杀菌作用。本实验将halI在嗜盐古菌菌株Haloarcula.hispanica(ATCC33960)体内表达使其对嗜盐菌素C8的敏感性大大降低，证明HalI在非宿主菌的嗜盐古菌体内也能起到免疫嗜盐菌素C8的作用。

二、嗜盐菌素C8的抗性基因halI在遗传操作系统中的应用

将HalI穿梭表达质粒pHalI中的MevR用限制性内切酶EcoR I和Kpn I酶切去除，将酶切后的质粒经Klenow酶补平后连接，得到以halI作为抗性选择标记的极端嗜盐古菌基因克隆表达载体，命名为pHI-1。该载体可用于转化Haloarcula hispanica(ATCC33960)等极端嗜盐古菌，在含10-30μg/ml嗜盐菌素C8的培养基中筛选阳性克隆。在pHI-1的Nde I和Xba I等插入待表达的外源基因可实现外源基因在该载体中的表达。在上述选择压力下(10-30μg/mlμg/ml嗜盐菌素C8)培养转化子Haloarcula hispanica/pHI-1共100代，质粒pHI-1不丢失，证明halI是一个成功的抗性选择标记。

                              序列表

<160>2

<210>1

<211>852

<212>DNA

<213>极端嗜盐古菌盐杆菌AS7092(Halobacterium sp.AS7092)

<400>1

<210>2

<211>283

<212>PRT

<213>极端嗜盐古菌盐杆菌AS7092(Halobacterium sp.AS7092)

<400>2

Claims (2)

1.嗜盐菌素成熟蛋白在抑制或杀灭极端嗜盐古菌中的应用；所述嗜盐菌素成熟蛋白的氨基酸残基序列如SEQ ID NO：2的第208-283位所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述嗜盐菌素成熟蛋白编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1的第622-849位所示。

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