CN100431504C

CN100431504C - 细胞涂层支架及其制备方法

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Publication number: CN100431504C
Application number: CNB2005100116916A
Authority: CN
Inventors: 侯东明; 张建军
Original assignee: BEIJING ZHONGFU YOUXIN MEDICAL SCI-TECH Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhongfu Youxin Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2005-05-09
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2025-05-09
Also published as: CN1861019A

Abstract

本发明提供一种细胞涂层支架，其特征在于支架表面附着有EPC或EC细胞层。组织工程细胞涂层支架由于被覆血管内皮祖细胞(EPC)或血管内皮细胞(EC)，在植入支架的同时，随着支架的扩张，EPC也到达了受损的血管内膜处，EPC分裂增生形成新的血管内皮细胞，故可快速修复损伤的血管内皮细胞，有效地消除了由于血管内皮细胞损伤引发的血管平滑肌细胞的增生与迁移，避免了血栓形成及血管再狭窄的发生。

Description

细胞涂层支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别是涉及一种医疗用支架。

背景技术

缺血性心脏病是最为常见的疾病，一般来说，冠状动脉血管狭窄低于50％时，对血流的影响不大，狭窄达到75％时就会明显影响血流的通畅而产生心绞痛症状。因此，两支以上狭窄大于50％时，就需要进行冠状动脉搭桥手术了。许多接受过冠脉成形治疗并在冠状动脉内安装支架的病人(俗称PTCA)，一旦再发生心绞痛，也需要进行搭桥手术。但搭桥手术费用高，病人生命危险大，在冠状动脉血管狭窄前期，冠心病患者可以通过在狭窄的心脏血管处植入支架，使狭窄部位得到扩张而得以治愈。然而，在植入普通的支架后，通过加压扩张发生病变的狭窄血管段时，可造成血管内膜损伤。受损的血管内膜刺激机体不仅产生血栓而且分泌多种生长因子及细胞因子，造成血管平滑肌细胞过度分裂增生并向内膜迁移，引发新生内膜过分增生，大概有20％～30％的病人会在几个月内发生再度狭窄，需要再次治疗。新型药物支架则在普通的金属支架上涂布一层药物，使再狭窄的可能性大幅降低至10％以内，因此被称为是“冠心病治疗史上的一次革命”。2003年美国FDA批准了洗脱性药物缓释支架(DES)上市。该类支架(DES)通过不断在局部病变血管处缓慢释放抑制细胞增生的药物来抑制血管平滑肌细胞的增生，从而达到降低了病变血管再狭窄的发生。但是，DES支架所释放抑制细胞增生的药物不仅抑制血管平滑肌细胞的增生，同时也抑制血管内皮细胞的增生，这样就使得植入支架的病变血管段由加压扩张导致损伤的血管内皮细胞难以愈合，从而引发血栓的形成及中远期冠状动脉再狭窄的发生。

发明内容

本发明针对上述产品的缺陷，提供一种细胞涂层支架，在支架表面附着有血管内皮细胞或血管内皮祖细胞，使损伤的内皮细胞得到快速修复，有效抑制血栓形成及抑制再狭窄的发生。

本发明还提供该支架的制备方法。

细胞涂层支架，其特征在于支架表面附着有EPC或EC细胞层。

所述EPC、EC细胞的分布密度大于5×10²个/cm²。

所述EPC、EC细胞来源于自体或异体的血液，脐血，脐动脉，静脉，骨髓或脂肪组织，通过粘合剂粘附在支架表面。

所述粘合剂层厚度为100-250μm，涂布顺序依次为可溶性明胶，多聚氨基甲酸乙酯胶，热敏性多聚水凝胶，聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)，各层厚度为5-100μm。

所述细胞涂层支架的制备方法步骤为：(1)支架表面涂布粘合剂层，(2)于去离子水中浸泡后风干，(3)将EPC细胞或EC细胞接种于支架上，在培养液中培养，形成EPC细胞或EC细胞层即可。

所述粘合剂层上有小孔，孔径大小15-250μm，孔距1mm。

所述培养液的组成为M199或DMEM 400g/L，青霉素1×10⁵U/L，链霉素100mg/L，VEGF(血管内皮生长因子)10ug/L，10^-4mol/L抗坏血酸，1.6mmol/LL-谷氨酸。

所述EPC细胞、EC细胞层是自体或异体动脉或静脉血管内膜，通过手术线缝合在支架上。

细胞涂层支架，其特征在于支架表面粘附有能结合EPC或EC细胞的抗体，所述抗体为CD³⁴⁺抗体，CD¹³³抗体，KDR抗体或VIII因子抗体。

血管内皮细胞受损是冠状动脉再狭窄发生的主要原因。本发明在支架的涂层上种植血管内皮祖细胞(EPC)层或是血管内皮细胞(EC)层，当支架置入冠状动脉内后，细胞层紧帖血管内壁，可以补充动脉血管中受损的EPC或EC细胞。我们成功地从外周血中分离和纯化了EPC，将其种植于支架上，并在体外进行EPC的培养传代。EPC可以来源于自体或异体的血液，脐血，脐动脉血，脐静脉血，静脉，骨髓或脂肪组织。

为增加EPC层的牢固性，支架表面处理非常关键。应用明胶，多聚氨基甲酸乙酯，多聚热敏性凝胶高分子新材料等对支架进行表面处理，保证EPC紧密结合于支架上，不至于脱落。在处理过的支架表面可用CO₂激光均匀打上小孔，孔径大小15-250μm，孔距1mm。打孔后的涂层使EPC易于吸附在涂层的表面，且使支架植入体内后，EPC细胞易于往外生长，更贴紧于血管内壁。EPC属于较难培养的比较娇嫩的干细胞，本发明的培养液主成份为M199或DMEM，同时添加青霉素、链霉素等防菌杀菌。将含有支架的培养液置于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中。4天后更换培养基，每4-7天换液一次。14-29天后形成一层膜贴于支架表面。

血管内膜内含有丰富的EPC、EC细胞，是修复损伤的血管内皮细胞的最佳选择。血管内膜剥离后用手术线将其固定在支架上。手术线为可吸收或不可吸收线。利用血管内膜作为EPC、EC细胞的供体，该支架成本降低，手术风险减小，易于操作。

EPC膜表面存在特异性的抗原受体如CD34+，FIKI(血管内皮生长因子受体2阳性)，CD¹³³抗体或VIII因子抗体，这些特异性抗原受体能结合血液中的EPC、EC，将其吸附于表面。当支架表面种植有这些抗体时，在体内血液循环过程中，支架表面能逐渐形成EPC或EC细胞层。

组织工程细胞涂层支架由于被覆血管内皮祖细胞(EPC)或血管内皮细胞(EC)，在植入支架的同时，随着支架的扩张，EPC也到达了受损的血管内膜处，EPC分裂增生形成新的血管内皮细胞，故可快速修复损伤的血管内皮细胞，有效地消除了由于血管内皮细胞损伤引发的血管平滑肌细胞的增生与迁移，避免了血栓形成及血管再狭窄的发生，可解决药物洗脱性支架(DES)的不足。

本发明从人外周血液中分离培养出血管内皮祖细胞(EPC)，应用血管组织工程技术将体外培养的EPC种植于冠状动脉血管支架表面(种植前，支架用高分子材料进行涂层处理，以增加其黏附性)，使支架表面形成一完整的单层内皮细胞层；然后将这种新型的支架植入体内，从根本上解决了抑制血栓形成及血管再狭窄发生。血管内皮细胞支架(EPC-STENT)(如图5)是国际领先的新一代组织工程产品，具有极其广阔的市场前景。

附图说明

图1：抗体阳性细胞(X250)

图2：CD34⁺阳性细胞(X100)

图3：凋亡细胞(X100)

图4：打孔后的涂层支架(X24)

图5：完整的涂层支架及导管

图6：涂层支架(X24)

图7：涂层扫描电镜图(X1000)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下列实施例中所用抗体是市场所购，所用试剂均采用常规方法配制，所用试剂原料也是市场购得。

实施例1制备细胞涂层支架(EPC涂层)

1.1外周血液中分离MNC(单核细胞)：

从外周血管中抽取560ML血液，加复方枸橼酸钠注射液(ACD-A)按

1∶10加入抗凝，1∶1加入Histoque-1077细胞分离液，以400g/Min在室温离心10-30Min，用PBS清洗三次。

1.2CD34+细胞的分离纯化：

采用磁性活化细胞分选系统纯化CD34⁺细胞。1×10⁵-1×10¹⁰个MNC(单核细胞)悬浮于30ul，4℃去磁化PBE缓冲液中(含2mmol/L EDTA，0.5％牛血清白蛋白)，加50ul偶联于磁珠的鼠抗人CD34抗体，4℃孵育30Min。用上述缓冲液洗二次，100×g离心5Min，除去未结合抗体，用500ul PBE缓冲液悬浮。分离磁柱置于磁场中分选出磁珠阳性细胞(MNC^CD34+)。

1.3鉴定检测：

1.3.1免疫组织化学检查：

分离的单核细胞培养7天后，贴壁细胞片用4％多聚甲醛固定。10％马血清中和非特异性单克隆抗体结合位点，鼠抗人vWF、KDR、CD₃₄、CD₁₃₃单克隆抗体分别与受体结合。用IgG1_-K设阴性对照。PBS冲洗二遍，生物素标记的马抗鼠IgG1孵育，再用抗生素免疫过氧化酶处理即可观察。(如图1)从图1中可以看出得到的为抗体阳性细胞。

1.3.2流式细胞分析：

培养7天后的细胞用0.25％胰蛋白酶37℃消化10-15Min。加入含20％胎牛血清的M199培养液，调整细胞浓度为5×10⁶-1×10¹⁰细胞/L，取40uL分别加入FITC标记的CD34抗体和PE标记的AC133抗体孵育20Min，用流式细胞仪分析。(如图2)结果显示均为抗体阳性细胞即EPC。

1.3.3AC-LDL实验——细胞凋亡检测：

培养7天后的贴壁细胞加入DiI-Ac-LDL(乙酰化低密度脂蛋白)15mg/L，37℃孵育24h。在荧光显微镜下计数阳性细胞。

PI(碘化丙锭)和annexinV双染色标记细胞，后行流式细胞仪分析，PI^-/annexinV⁺为凋亡细胞。(如图3。)结果显示仅有少数凋亡细胞。

1.4支架涂布粘合剂

在支架表面涂一层可溶性明胶，其浓度为20mg/ml，厚度为：50um。自然风干后涂一层多聚氨基甲酸乙酯胶，浓度为30mg/ml，厚度为：20um。然后再涂一层热敏性多聚水凝胶，浓度为40mg/ml，厚度为：30um，聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)，浓度为50mg/ml，厚度为：50um。风干后用CO₂激光在支架涂层的表面均匀的打上小孔，孔径大小50μm，孔距1mm。

1.5细胞传代培养种植于支架上：

将已涂布好的支架完全置于去离子水中浸泡5-60Min，在无菌条件下取出风干。将EPC和/或EC接种于含有20％胎牛血清的M199培养液(400g/L)支架上，再加入青霉素(1×10⁵U/L)，链霉素(100mg/L)，VEGF(血管内皮生长因子)(10ug/L)，抗坏血酸(10^-4mol/L)，L-谷氨酸(1.6mmol/L)。将含有支架的培养基置于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中。4天后更换培养基，每5天换液一次。20天形成一层膜贴于支架表面(如图4)，EPC接种密度1×100²个/cm²。经扫描电镜(X1000)，可见EC呈“铺路石”样形态于支架上。(如图7)

实施例2制备细胞涂层支架(血管内膜)

2.1剥离血管内膜

取一段动物的动脉血管，洗净，将其固定在平板上，在解剖目镜下，用手术刀划开血管壁，将其展平后固定，然后小心地剥离下血管内膜，去除多余组织，将其清洗干净。

2.1固定于支架上

用手术线固定血管内膜片于支架上，手术线为可吸收线或不可吸收线。

实施例3制备抗体涂层支架(CD34⁺抗体)

3.1明胶，聚异丙基丙烯酰胺凝胶制备

将20g明胶，50g N-异丙基丙烯酰胺，40ul四甲基二乙胺，50g N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)及50ml聚二乙醇致孔剂溶解于1L去离子水中，等完全溶解后，加入30ml过硫酸氨，同时通入N₂，再加入10ml戊二醛并快速搅拌均匀。

3.2涂胶于支架上

将支架置入正在快速搅拌的胶液中，室温下静置2小时，取出支架，将支架再放入40℃去离子水中浸泡，反复换水三次，去掉杂质后，自然风干。

3.3抗体吸附于支架上(如图6)

将风干的涂胶支架置于含12mg/mlCD34⁺抗体中，在10℃下静置50分钟，取出支架，在15℃下放置2小时，紫外线照射消毒即可获得抗体涂层支架。实施例4制备抗体涂层支架(CD133抗体)

4.1明胶，聚异丙基丙烯酰胺凝胶制备

将22g明胶，45g N-异丙基丙烯酰胺，40ul四甲基二乙胺，50g N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)及50ml聚二乙醇致孔剂溶解于1L去离子水中，等完全溶解后，加入30ml过硫酸氨，同时通入N₂，再加入10ml戊二醛并快速搅拌均匀。

4.2涂胶于支架上

4.3抗体吸附于支架上

将风干的涂胶支架置于含15mg/mlCD133抗体中，在15℃下静置40分钟，取出支架，在10℃下放置3小时，紫外线照射消毒即可获得抗体涂层支架。

Claims

1、细胞涂层支架，其特征在于支架表面粘附有EPC或EC细胞层，所述EPC或EC细胞层通过粘合剂粘附于支架表面，所述粘合剂层厚度为100-250μm，涂布顺序依次为可溶性明胶，多聚氨基甲酸乙酯胶，热敏性多聚水凝胶，聚异丙基丙烯酰胺凝胶，各胶层厚度为5-100μm。

2、根据权利要求1所述的细胞涂层支架，所述EPC、EC细胞分布密度大于5×10²个/cm²。

3、根据权利要求1所述的细胞涂层支架，所述EPC细胞、EC细胞来源于自体或异体的血液，脐血，脐动脉，静脉，骨髓或脂肪组织。

4、根据权利要求1所述的细胞涂层支架，其特征在于支架表面粘附有能结合EPC或EC细胞的抗体，所述抗体为CD34+抗体，CD133抗体，KDR抗体或VIII因子抗体。

5、根据权利要求1所述的细胞涂层支架的制备方法，该方法步骤为：(1)在支架表面涂布粘合剂层，(2)置于去离子水中浸泡后风干，(3)将EPC细胞或EC细胞接种于支架上，在培养液中培养，形成EPC细胞或EC细胞层即可。

6、根据权利要求5所述的细胞涂层支架的制备方法，所述粘合剂层上有小孔，孔径大小15-250μm，孔距1mm。

7、根据权利要求5所述的细胞涂层支架的制备方法，所述培养液的组成为M199或DMEM 400g/L，青霉素1×10⁵U/L，链霉素100mg/L，血管内皮生长因子10ug/L，10^-4mol/L抗坏血酸，1.6mmol/L L-谷氨酸。