CN100410665C

CN100410665C - 一种检测禽畜肉加热终点温度的酶联免疫试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN100410665C
Application number: CNB2006101372670A
Authority: CN
Inventors: 郑文杰; 贺艳; 刘烜; 赵卫东; 刘伟; 桂国春
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: CN1945334A

Abstract

用于酶联免疫检测禽畜肉加热终点温度的方法，属于食品卫生领域，具体涉及一种运用酶联免疫吸附检测方法检测加热终点温度的方法。其技术方案是利用抗原抗体的特异性反应检测加热终点温度的指示蛋白乳酸脱氢酶的变化。本发明包括加热终点温度指示蛋白提取方法、酶联免疫吸附检测方法以及与之配套的检测程序和结果判断方法。本发明填补了加热终点温度检测方法的空白，用于检验进出口禽畜肉加热的终点温度。该方法具有快速、高通量的特点。

Description

一种检测禽畜肉加热终点温度的酶联免疫试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明提供一种检测禽畜肉加热终点温度的试剂盒及其检测方法，属于食品卫生领域，具体地讲，涉及用酶联免疫吸附的方法来检测畜肉加热终点温度的技术。

背景技术

由于国际上各种食源性致病菌导致的恶性中毒事件接连发生，大多数中毒事件是由于生产中未按严格的卫生要求进行操作，如加热温度过低、时间过短造成的。研究表明，偶蹄动物即使感染了口蹄疫病毒等疫病，如果经一定的高温加热后，病原物即可被杀灭。研究还表明，如果对家禽肉或野生禽肉肉进行高温加热，即可杀灭禽流感病原体。因此，禽畜肉及其制品的热加工问题便引起了国际社会的关注。

因此，为了防止动物疫病的传播，保护易感动物的健康以及消费者食用安全和健康，美国、日本、韩国和国际兽疫局均对禽畜肉加热终点温度做出了规定。例如，日本要求出口热加工的偶蹄动物肉在完全去骨后通过沸水煮或100℃以上的蒸汽蒸，使肉的中心温度保持在70℃或以上不少于1分钟，或者通过水浴加热、热气干燥或者其他方式使肉的中心温度保持在70℃或者以上不少于30分钟。出口热加工肉制品也需要使肉的中心温度保持在70℃或以上不少于1分钟。

由于对加热终点温度提出了具体的规定和要求，在监督管理工作中就需要对其进行检测。美国USDA的FSIS规定的检测方法有：凝聚实验、牛催化酶实验和酸性磷酸酶活性试验等。其中，凝聚实验是用0.9％盐溶液提取产品中的蛋白质，然后将蛋白质抽提液暴露在高温下，由于蛋白质有热变性的特点，使得抽提液出现絮状物。使蛋白抽提液首先出现絮状物的温度就是该产品曾经加热到的最高温度。该方法可以用来检测牛肉产品和禽产品的加热终点温度。牛催化酶实验用来检测牛肉和猪肉产品是否被加热到65℃(USDA-FSIS，1986Vb)；酸性磷酸酯酶的活性试验检测罐装火腿、野餐肉类(USDA-FSIS，1986Va)。日本认可的加热终点温度检测方法为SDS-PAGE电泳方法。目前，我国还没有任何有关的法律和法规对此提出过要求，更没有相应的检测方法或方法的研究工作。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种应用酶联免疫吸附测定方法检测加热终点温度的方法，具体来讲就是，通过能与加热终点温度指示蛋白乳酸脱氢酶或其免疫原性亚基(片段)发生免疫反应来检测加热终点温度。

通过酶联免疫吸附测定方法检测畜禽肉加热终点温度的方法包括：制备加热终点温度指示蛋白和与该蛋白进行特异性反应的单克隆或多克隆抗体，完善检测方法和显色体系。加热终点温度指示蛋白为乳酸脱氢酶、乳酸脱氢酶全酶，乳酸脱氢酶的H和M亚基、源于乳酸脱氢酶氨基酸序列的具有免疫原性的肽段或其部分，以及含有乳酸脱氢酶的蛋白质混合物；抗体为与终点温度指示蛋白反应的抗体，包括通过直接免疫获得的多克隆抗体和通过杂交瘤细胞筛选的单克隆抗体；检测方法包括双抗夹心法和直接检测法；显色体系包括化学发光的检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的；

1.抗原的获得

(1)抗原的种类：检测畜肉加热终点温度中用到的指示蛋白为乳酸脱氢酶、乳酸脱氢酶全酶、乳酸脱氢酶的H和M亚基、源于乳酸脱氢酶氨基酸序列的具有免疫原性的肽段或其部分以及含有乳酸脱氢酶的蛋白质混合物。

(2)抗原的获得：可通过商业公司购买乳酸脱氢酶或基亚基或其免疫原性的部分，例如Sigma公司的乳酸脱氢酶纯品(产品目录号：Lot081K7420或Lot083K7410等)；也可通过实验室方法进行分离，参考文献如下：

Vander Jagt DL，Hunsaker LA，Heidrich JE，Partial purification and characterization of lactatedehydrogenase from Plasmodium falciparum.Mol Biochem Parasitol.1981 Dec 31；4(5-6)：255-64.

Masood H.Javed，Syed M.I.Azimuddin，Abida N.Hussain，1 Asifa Ahmed and

Mohammad Ishaq.Purification and characterization of lactate dehydrogenase

from Varanus liver.Experimental and Molecular Medicine，Vol.29，No 1，25-30，March 1997.

2.抗体的获得：通过常规免疫方法，从动物中产生多克隆抗体或单克隆抗体(参见：《实用单克隆抗体技术》，微生物学与免疫学家汪美先教授主编；《现代医学免疫学》，余传霖、叶天星任主编)。

3.包被抗体的载体的获得：其中载体是与抗体进行特异性反应的固相载体，所述抗体是乳酸脱氢酶或其免疫原性亚基、肽段或片段、或含有乳酸脱氢酶的蛋白质混合物的单克隆或多克隆抗体；固相载体可以是96孔板、试管或者膜(如：millipore膜：LotB4NN50347)；包被液为与乳酸脱氢酶或其亚基或其肽段或其部分反应的抗体缓中液，包括多克隆抗体和单克隆抗体(该缓冲液组分为碳酸盐缓冲液，pH：9.6)；封闭液为2％BSA[溶剂为0.01mol/LPBS(pH：72～7.4)]，每孔中加入200μL封闭液，4℃过夜，空干，用洗液洗1次，-20℃保存备用。

4.酶标抗体的获得：称取5mg辣根过氧化酶(HRP)溶解于1ml蒸馏水中。加入0.2ml新配的0.1mol/LNaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，用1mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜。加20μL 0.2mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上5mg/ml辣根过氧化酶(HRP)的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)到1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml氢硼化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时。将上述溶液装入透析袋中，用0.15mol/L PBS(pH7.4)透析，4℃过夜。经饱和硫酸铵纯化后，透析分装，-80℃保存。

此外，根据常规方法，可对ELISA系统进行各种修饰，如将酶标抗体进行生物素和/或亲和素修饰、链霉素化修饰等(参见，“酶联免疫吸附反应的技术进展及应用”，李文敏，《湖北职业技术学院学报》，2003.12)，或用常规方法对ELISA系统进行放大修饰，如碱性磷酸酶放大系统、凝血因子级联放大等(参见，“酶联免疫吸附测定技术新进展”，刘国霞，《河南畜牧兽医》，2001年第7期)。

5.检测方法

(1)检测方法的类型：包括双抗夹心法和直接检测法(参见：《现代医学免疫学》，余传霖、叶天星任主编)。

(2)酶联免疫法检测加热终点温度的体系：

包被液：与乳酸脱氢酶或其亚基或其肽段或其部分反应的抗体缓冲液，包括多克隆抗体和单克隆抗体(该缓冲液组分为碳酸盐缓冲液，pH：9.6)；

封闭液：2％BSA，溶剂为0.01mol/L PBS(pH：7.2～7.4)；

洗液：PBST(在上述0.01mol/LPBS缓冲液中加入0.1％的Tween-20即是PBST)；

样品稀释液：1％BSA，溶剂为1×PBS(pH：7.2～7.4)；

底物：四甲基联苯胺(TMB)，溶于二甲亚砜(DMSO)配制成10mg/ml的母液，再用0.01mol/LPBS溶液50倍稀释后加入双氧水(终浓度为0.015％)；或者OPD。

(3)检测程序：

(1)加入稀释好的待分析的上清液样品于包被抗体的载体中，37℃放置1小时，空干，用洗液洗3遍；

(2)加入稀释好的酶标物，室温放置30min至45min；

(3)空干，用洗液洗6遍，加入100μL底物液，室温放置15min后；

(4)加入50μL终止液，室温放置15min后，用酶标仪测量底物对应的OD值；

(5)根据下列公式计算B/B0值：

样品B/未加热样品B0＝〔(样品OD-空白OD)/(未加热样品OD-空白OD)〕×100％，

6.结果判断

当样品的B/B₀值高于加热禽畜肉的标准B/B₀值，判断禽畜肉加热终点温度未达到标准B/B₀值所对应的加热温度；当样品的B/B₀值低于加热禽畜肉的标准B/B₀值，判断禽畜肉加热终点温度达到标准B/B₀值所对应的加热温度；

表1.部分畜肉在70℃时的标准B/B₀阈值(OD₄₅₀)

注意：^*表示当样品的B/B₀值大于其对应的阈值时，样品为阳性，即加热终点温度没有达到标准B/B₀值所对应的70℃；当B/B₀值小于或等于其对应的阈值时，样品为阴性，即加热终点温度达到标准B/B₀值所对应的70℃。

应当理解的是，由于不同禽畜肉的规定的加热温度不同，其标准B/B₀值也不同。但是对于某种禽畜肉而言，如果确定某个预期温度是要求的温度，并且由于测量标准B/B₀值方法属于本技术领域的常规方法，因此该温度下畜禽肉的B/B₀值可以也应是已知的。也就是说，根据以上原理和表1的提示，本领域技术人员使用常规方法可获得任何禽畜肉在任何温度下的B/B₀阈值。

另外，由于相同畜肉在不同的加工方式(如熏、烤、煮、腌、炸等)下其B/B₀值也不同。但是对于某种已知加工方式的禽畜肉而言，如果确定某种温度是符合要求的温度，因此该温度下禽畜肉的B/B₀值可以也应是已知的。

以预期温度是70℃的待检猪肉和牛肉为例，猪和牛酶联免疫检测方法加热终点温度达70℃要求后，用常规方法测量其肌肉组织中的乳酸脱氢酶(LDH)的B/B₀值分别为2.8±0.3％和3.5±0.5％，如果待测样品的B/B₀值高于上述值，则判断该样品的加热终点温度未达到预期规定的70℃。如果样品B/B₀值等于或低于上述值为阴性时，则样品加热终点温度达到70℃。在根据待测样品的B/B₀值与标准的B/B₀值判断是否达到规定的温度，还可以采用t检验来确定这两个样本是否具有显著差异，从而判断其是否达到规定的温度。

应当理解的是，由于在测量过程中存在系统差异，或受到不同加工条件下(或不同温度标准条件)、或是不同技术人员等客观因素的影响，某一禽畜肉测量的标准酶活值可能会不同(如上述的猪肉、牛肉)。但是使用同一试剂盒测定的际准酶活值和待测样品的酶活值的关系显然是固定不变的，因此其判断方法或原则也是固定不变的，也就是说在使用同一试剂盒测定的标准B/B₀值和待测样品的B/B₀值的基础上，当比较待测样品的B/B₀值与加热禽畜肉的标准B/B₀值时，只要待测样品B/B₀值高于标准B/B₀值，则判断禽畜肉加热终点温度未达到规定的温度；或只要待测样品B/B₀值低于标准B/B₀值，则判断禽畜肉加热终点温度达到规定的温度。另外，本发明的畜禽肉还可以是马肉、羊肉、鹿肉、驴肉、狗肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉、鹌鹑肉、火鸡肉、鸵鸟肉等。与猪、牛肉相比，由于这些其它禽畜肉的检测目标都是乳酸脱氢酶，并且检测原理、检测方法相同，因此根据以上所述以及表1的提示，本领域技术人员在理解本发明原理的基础上使用本发明的检测试剂盒显然可以获得任一种禽畜肉达到规定温度处理后的标准酶活值，并能推算出待检样品的加热终点温度。

本发明的第二个目的是提供根据上述检测方法和原理的检测试剂盒，包括：

包被抗体的载体：其中载体是与乳酸脱氢酶或其亚基或其肽段或其部分特异性反应的抗体包被的固相载体，其中固相载体可以是96孔酶标板或试管。

酶标物：乳酸脱氢酶或其亚基或其肽段或其部分的多克隆抗体或单克隆抗体的酶标物。

封闭液：2％BSA，溶剂为0.01mol/LPBS(pH：7.2～7.4)；

洗液：PBST(在0.01mol/LPBS缓冲液中加入0.1％的Tween-20即是PBST)；

样品稀释液：1％BSA，溶剂为1×PBS(pH：7.2～7.4)；

底物液：可以是四甲基联苯胺或OPD；

终止液：2mol/L H₂SO₄

本发明的第三个目的是提供上述检测方法在用于检测禽畜肉加热终点温度的用途。

本发明的第四个目的是提供上述检测试剂盒在用于检测禽畜肉加热终点温度的用途。

与现有技术相比，本发明涉具有以下优点：

1.仅仅针对单个温度指示蛋白(乳酸脱氢酶)，避免了现有技术中因同时针对多个温度指示蛋白的混和物而导致的检测误差。

2.既可通过商业途径购买抗原，又可通过常规实验室方法分离抗原；

3.可通过常规方法制备单克隆抗体，并且根据检测原理，所制备的单抗只要具有一定特异性水平即可，并不需要很高的特异性水平或重复再现某一水平的抗体；

4.可通过常规方法制备多克隆抗体，并且根据检测原理，所制备的多抗只要具有一定特异性水平即可，并不需要和单抗相同的特异性水平或重复某一特异水平。因此，在多克隆抗体的特异性水平足以满足检测温度指示蛋白的前提下，与使用单克隆抗体相比，使用多克隆抗体还具有低成本、操作简便的优点。

5.根据检测原理，检测目标可以是各种禽畜肉，克服了现有技术中检测目标过于单一的缺陷；

6.引入了预定的比较公式并联合ELISA法，因此在同一检测系统中检测结果非常稳定和准确，克服了现有技术中因抗体、待检物的差异导致结果在同一系统中不稳定；

7.可同时针对多种预期的温度进行比较、并检测最终温度，克服了现有技术中只能针对一种预期的温度进行比较、检测最终温度。

总之，由于完全利用免疫学方法，抗原抗体反应具有特异性高的特点，抗原抗体反应的特异性使测试结果准确。本发明的检测方法和检测试剂盒简便、易于操作。尤其是在同时检测大批量样品的情况下，其高通量的特点尤其明显。本发明的检测方法操作简便，检测迅速，填补了国内畜肉加热终点温度检测的空白，能有利地应用于我国食品卫生的检验检疫领域。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的分子生物学、细胞和分子免疫学等常规技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，Sambrook and Russell″Molecular Cloning：AIaboratory Manual″(2001)；Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)″；T.ABrown“Genome”BIOS ScientificPublishers Limited.：《细胞和分子免疫学》第2版，金伯泉，2001等。

实施例1

样品：某牛肉热加工产品。该产品在加工过程中曾加热到70℃，生产成产品后冻存于-20℃冰箱内。用酶联免疫吸附检测方法检测其加热终点温度。

1、所用的抗体：

选择成年雄性新西兰白兔，在双侧后足注射福氏完全佐剂0.5ml，约一周后取牛肌肉乳酸脱氢酶和等量福氏不完全佐剂混合注入双侧耳窝肿大的淋巴结，3周后加强免疫，肌注抗原牛肌肉乳酸脱氢酶。测定抗体滴度，心脏采血分离血清。饱和硫酸铵沉淀法纯化后再用protein-G免疫亲和柱纯化，透析3天后分装，-80℃保存备用。

2、待分析样品的制备：称取10g样品，加入30ml 0.01mol/L PBS，用均质器均质，12000r/min离心10min，真空抽滤，取上清液待分析。

3、加热终点温度的检测方法(双抗夹心法)及检测程序：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释多克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，再加入200μL2％BAS室温放置2小时，空干，PBST洗1次，用1％BSA-PBS以1∶3稀释样品，取100μL置于孔中，37℃放置1小时，用PBST(含0.1％Tween-20)洗3次，加入酶标抗体，室温放置30分钟；加入50μL底物液(50μL 5mg/mL TMB+950μLPBS+0.5μLH₂O₂混匀，注H₂O₂在使用前加入)，显色15分钟后加入50μL 2mol/L H2SO4，用酶标仪测量其OD₄₅₀。其测量结果如下：

表2：ELISA后酶标检测结果

重复样品号	未加热样品OD	65℃样品OD	70℃样品OD	75℃样品OD	待分析样品OD	空白样品OD
重复样品号	未加热样品OD	65℃样品OD	70℃样品OD	75℃样品OD	待分析样品OD	空白样品OD	1	1.352	0.676	0.165	0.135	0.163	0.125
2	1.350	0.675	0.168	0.132	0.160	0.120	1	1.352	0.676	0.165	0.135	0.163	0.125
2	1.350	0.675	0.168	0.132	0.160	0.120	3	1.351	0.675	0.165	0.134	0.162	0.124
4	1351	0.675	0.167	0.130	0.164	0.122	3	1.351	0.675	0.165	0.134	0.162	0.124
4	1351	0.675	0.167	0.130	0.164	0.122	均值	1.351	0.675	0.166	0.133	0.162	0.123

3、计算B/B₀未加热值。

B65/B₀未加热＝〔(0.675-0.123)/(1.351-0.123)〕×100％＝44.96％

B70/B₀未加热＝〔(0.166-0.123)/(1.351-0.123)〕×100％＝3.52％

B75/B₀未加热＝〔(0.133-0.123)/(1.351-0.123)〕×100％＝0.79％

B样品/B₀未加热＝〔(0.162-0.123)/(1.351-0.123)〕×100％＝3.22％

4、结果的判断：该B样品/B₀未加热值为3.22％，处于(3.5±0.5)％内，因此样品为阴性，即加热终点温度达到70℃。根据其生产记录，该产品曾经加热到70℃，因此该检测能反映出其曾经加热到的温度。

实施例2

样品：某猪肉热加工产品。该产品在加工过程中曾加热到70℃，生产成产品后冻存于-20℃冰箱内。用酶联免疫吸附检测方法检测其加热终点温度。

1、样品的制备：称取10g样品，加入30ml 0.01mol/L PBS，用均质器均质，12000r/m离心10min，真空抽滤，取上清液待分析。

2、所用的抗体：将牛肌肉乳酸脱氢酶直接免疫新西兰大白兔所获得的多克隆抗体，制备方法同实施例1。检测时用的酶标抗体为过碘酸钠法标记的多克隆抗体。标记方法如下：

称取5mg辣根过氧化酶(HRP)溶解于1ml蒸馏水中。加入0.2ml新配的0.1mol/LNaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，用1m mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜。加20μL 0.2mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上5mg/ml辣根过氧化酶(HRP)的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)到1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml氢硼化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时。将上述溶液装入透析袋中，用0.15mol/LPBS(pH7.4)透析，4℃过夜。经饱和硫酸铵纯化后，透析分装，-80℃保存。

3、加热终点温度的检测方法(双抗夹心法)及检测程序：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释多克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，再加入200μL2％牛血清白蛋白(BSA)室温放置2h，扣干，PBST洗1次，取100μL上清液置于孔中，37℃放置1h，用PBST(含0.1％Tween-20)洗3次，加入酶标抗体，室温放置30min；加入50μL 底物液(50μL 5mg/mLTMB+950μL PBS+0.5μL H₂O₂混匀，注H₂O₂在使用前加入)，显色15min后加入50μL 2mol/LH2SO4，用酶标仪测量其OD₄₅₀。

表3：ELISA后酶标检测结果

计算B/B₀未加热值。

B65/B₀未加热＝〔(0.211-0.119)/(1.453-0.119)〕×100％＝6.92％

B70/B₀未加热＝〔(0.156-0.119)/(1.453-0.119)〕×100％＝2.77％

B75/B₀未加热＝〔(0.120-0.119)/(1.453-0.119)〕×100％＝0.05％

B样品/B₀未加热＝〔(0.157-0.119)/(1.453-0.119)〕×100％＝2.8％

4、结果的判断：B样品/B未加热值等于2.8％时，处于(2.80±0.3)％范围内，样品为阴性，即加热终点温度达到70℃。根据其生产记录，该产品曾经加热到70℃。

实施例3

样品：某兔肉热加工产品。该产品在加工过程中曾加热到70℃，生产成产品后冻存于-20℃冰箱内。用酶联免疫吸附检测方法检测其加热终点温度。

1、所用的抗体及制备方法：将兔肉上清液直接免疫BALB/C小鼠所获得的抗体与瘤细胞SP2/0融合，用选择培养基选择出单克隆抗体。

免疫动物：腹腔免疫，1次/周，4-6周。将BALB/c小鼠10只，随机分成A、B两组，A组每次免疫200μL原浓度的兔肉上清液，B组每次免疫200μL 10倍稀释的兔肉上清液。2周后注射同样的量加强免疫。2～4周后，在融合前3～4天静脉注射200μL抗原加强免疫。小鼠尾血血清对流电泳检测血清抗体效价。

细胞融合：将状态良好的SP2/0细胞传代，25ml培养瓶2瓶，供2天后用于融合；取BABL/C小鼠，收集腹腔巨噬细胞，接种于24孔培养板，共需4-5块，0.5ml/孔。

将免疫好的小鼠脾细胞(3-5×106)和SP2/0细胞(5-10×106)按2-10∶1的比例混合于离心管中，离心，1000r/min，10min。弃上清，将沉淀物混匀。向沉淀无缓慢加入0.6ml 50％PEG，此过程控制在90秒。缓慢加入10ml 1640以中和PEG的作用，轻轻混匀。离心，1000r/min，10min，吸弃上清，加入适当体积的全血清HAT培养基，将其加入24孔板中，0.5ml/孔。

融合后的第2-3天可见大部分细胞(包括脾细胞和SP2/0细胞)死亡，少量细胞存活，存活的细胞分裂增殖逐渐形成小的克隆。融合后的第5-7天，半量换液，培养基为10％HAT。融合后10-14天，半量换液，培养基为10％1640。

ELISA检测融合细胞培养上清中有无LDH抗体：

以纯抗原包被酶标板(1∶3000)，4度过夜；封闭，以1mg/ml BSA封闭，4度过夜。弃去内容物，加入待检培养上清原液，37℃ 2h。以PBS-0.1％TWEEN-20洗板3次。加入酶标抗体(1∶1000)，25-37℃1h。加入底物OPD(10ml底物缓冲液+4mgOPD+15μL30％H2O2)。5分钟左右待显色后，酶标仪检测。

33％饱和(NH₄)₂SO₄沉淀一次，溶于15ml 0.01mol/LPBS。将上述样品分2-3次过G-50层析柱，以去除NH4+。收集洗脱峰(各50ml)，以8000-10000D的透析袋对PEG(MW：8000)浓缩至原腹水体积。-80℃保存备用。

制备腹水：BABL/C小鼠腹腔注射液体石蜡(0.5ml/鼠)，10天后腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/鼠，7-12天后取腹水。

腹水的纯化：33％饱和(NH₄)₂SO₄沉淀一次，溶于15mL 0.1mol/LPBS。将上述样品分2-3次过G-50层析柱，以去除NH4+。收集洗脱峰(各50ml)，以8000-10000D的透析袋对PEG(MW：8000)浓缩至原腹水体积。

检测时用的酶标抗体为过碘酸钠法标记的单克隆抗体。标记方法如下：

称取5mg辣根过氧化酶(HRP)溶解于1ml蒸馏水中。加入0.2ml新配的0.1mol/LNalO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，用1mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜。加20μL 0.2mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上5mg/ml辣根过氧化酶(HRP)的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)到1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml氢硼化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时。将上述溶液装入透析袋中，用0.15mol/L PBS(pH7.4)透析，4℃过夜。经饱和硫酸铵纯化后，透析分装，-80℃保存。

2、样品的制备：称取10g样品，加入30ml 0.9％NaCl，用均质器均质，12000r/m离心10min，真空抽滤，取上清液待分析。

3、加热终点温度的检测方法(直接法)及检测程序：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)以1∶3稀释样品，取100μL置于孔中，37℃放置1h，用PBST(含0.1％Tween-20)洗3次，加入上述的酶标抗体，室温放置30min；加入50μL底物(50μL 5mg/mL TMB+950μL PBS+0.5μL H2O2混匀，注意：H2O2在使用前加入)，显色15min后加入50μL 2mol/LH2SO4，用酶标仪测量其OD450nm。其测量结果如下：

表4：ELISA后酶标检测结果

计算B/B₀未加热值。

B65/B₀未加热＝〔(0.352-0.123)/(1.217-0.123)〕×100％＝20.9％

B70/B₀未加热＝〔(0.231-0.123)/(1.217-0.123)〕×100％＝9.9％

B75/B₀未加热＝〔(0.191-0.123)/(1.217-0.123)〕×100％＝6.1％

B样品/B₀未加热＝〔(0.233-0.123)/(1.217-0.123)〕×100％＝10％

4、结果的判断：该B样品/B未加热值为10％，处于(9.90±0.6)％内，因此样品为阴性，即加热终点温度达到70℃。根据其生产记录，该产品曾经加热到70℃。

实施例4

样品：某驴肉热加工产品。该产品在加工过程中曾加热到65℃，生产成产品后冻存于-20℃冰箱内。用酶联兔疫吸附检测方法检测其加热终点温度。

1、样品的制备：称取10g样品，加入30ml蒸馏水，用均质器均质，12000r/m离心10min，真空抽滤，取上清液待分析。

2、所用的抗体：将牛肌肉乳酸脱氢酶直接免疫BALB/C小鼠所获得的抗体与瘤细胞SP2/0融合，用选择培养基选择出单克隆抗体。具体制备方法同实施例3。检测时用的酶标抗体为过碘酸钠法标记的单克隆抗体。标记方法如下：

称取5mg辣根过氧化酶(HRP)溶解于1ml蒸馏水中。加入0.2ml新配的0.1mol/LNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，用1m mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜。加20μL 0.2mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上5mg/ml辣根过氧化酶(HRP)的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)到1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml氢硼化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时。将上述溶液装入透析袋中，用0.15mol/LPBS(pH7.4)透析，4℃过夜。经饱和硫酸铵纯化后，透析分装，-80℃保存。

3、加热终点温度的检测方法(直接法)及检测程序：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)以1∶3稀释样品，取100μL置于孔中，37℃放置1h，用PBST(含0.1％Tweem-20)洗3次，加入酶标抗体，室温放置30min；加入底物TMB，显色15min后加入2mol/LH2SO4，用酶标仪测量其OD450nm。其测量结果如下：

表5：ELISA后酶标检测结果

计算B/B₀未加热值。

B65/B₀未加热＝〔(0.209-0.114)/(1.215-0.114)〕×100％＝8.56％

B70/B₀未加热＝〔(0.121-0.114)/(1.215-0.114)〕×100％＝0.64％

B75/B₀未加热＝〔(0.119-0.123)/(1.215-0.114)〕×100％＝0.47％

B样品/B₀未加热＝〔(0.135-0.114)/(1.215-0.114)〕×100％＝2.0％

4、结果的判断：该B/B0值为2.0％，大于(0.70±0.1)％，因此样品为阳性，即加热终点温度未达到70℃。根据其生产记录，该产品曾经加热到65℃。

Claims

1. 一种用于检测禽畜肉加热终点温度的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于包括：

(1)包被抗体的载体：其中载体是与抗体进行特异性反应的固相载体，所述抗体是乳酸脱氢酶或其免疫原性亚基、肽段或片段、或含有乳酸脱氢酶的蛋白质混合物的单克隆或多克隆抗体；和

(2)上述(1)中所述的抗体的酶标物；和

(3)封闭液：2％BSA，溶剂为0.01mol/LPBS，pH7.2～7.4；和

(4)洗液：在0.01mol/LPBS缓冲液中加入0.1％的Tween-20而制成；和

(5)样品稀释液：1％BSA，溶剂为1×PBS，pH7.2～7.4；

(6)底物液：四甲基联苯胺或OPD；

(7)终止液：2mol/LH₂SO₄。

2. 权利要求1所述的试剂盒，其中固相载体可以是96孔酶标板、试管或膜。

3. 权利要求1所述的试剂盒，其中酶标物是辣根过氧化物酶标记的抗体。

4. 权利要求1至3中任何一项所述的试剂盒，其中酶标物是通过亲和素-生物素系统、链霉素-亲和素系统、碱性磷酸酶放大系统系统、凝血因子级联放大系统修饰的酶标物。

5. 权利要求1至4中任一项所述的试剂盒用于检测禽畜肉加热终点温度的方法，其中步骤包括：

(2)加入稀释好的酶标物，室温放置30min至45min；

(3)空干，用洗液洗6遍，加入100μL底物液，室温放置15min后；

(5)根据下列公式计算B/B0值：

(6)结果判断：当样品的B/B0值高于加热禽畜肉的标准B/B0值，判断禽畜肉加热终点温度未达到标准B/B0值所对应的加热温度；当样品的B/B0值低于加热禽畜肉的标准B/B0值，判断禽畜肉加热终点温度达到标准B/B0值所对应的加热温度。

6. 权利要求5所述方法，其中禽畜肉可以是猪肉、牛肉、羊肉、马肉、鹿肉、驴肉、狗肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉、鹌鹑肉、火鸡肉或鸵鸟肉。

7. 权利要求5所述方法，其中当标准B/B0值所对应的加热温度达到70℃时，猪肉、牛肉、兔肉和驴肉的标准B/B0值分别为(2.8±0.3)％、(3.5±0.5)％、(9.90±0.6)％和(0.70±0.1)％。