CN100398152C - 新型人β2整联蛋白α亚基 - Google Patents

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Abstract

公开了用αd单克隆抗体治疗脊髓损伤的方法。

Description

新型人β2整联蛋白α亚基
本申请是1999年7月8日提交的未决的美国专利申请系列号09/350,259的继续部分，09/350,259是1998年11月16日提交的未决的美国专利申请系列号09/193,043的继续部分，09/193,043是1997年10月3日提交的未决的美国专利申请系列号08/943,363的继续部分，08/943,363是1996年2月22日提交的美国专利申请系列号08/605,672的继续部分，08/605,672于1998年10月6日授权为美国专利5,817,515，它是1994年12月21日提交的美国专利申请系列号08/362,652的继续部分，08/362,652于1998年6月16日授权为美国专利5,766,850，它是1994年8月5日提交的美国专利申请系列号08/286,889的继续部分，08/286,889于1995年11月28日授权为美国专利5,470,953，它是1993年12月23日提交的美国专利申请系列号08/173,497的继续部分，08/173,497于1995年8月1日授权为美国专利5,437,958。在此全文引入这些申请作为参考。
发明背景
整联蛋白是一类活跃参与细胞粘附的膜结合分子。整联蛋白是包含与β亚基非共价结合的α亚基的跨膜异二聚体。目前为止，已经鉴定了至少14种α亚基和8种β亚基[综述于Springer，Nature 346：425-434(1990)]。β亚基一般可以与一个以上的α亚基结合，具有一个共同的β亚基的异二聚体分类为整联蛋白群中的亚族。
一类限于在白细胞中表达的人整联蛋白的特征在于共同的β2亚基，作为这种细胞特异性表达的结果，这些整联蛋白通常称作白细胞整联蛋白或Leu-CAMs。由于这些共同的β2亚基，这一类也命名为β2整联蛋白。β2亚基(CD18)以前与三种不同的α亚基CD11a，CD11b或CD11c之一一起分离。编码人CD18的cDNA的分离描述于Kishimoto，etal.Cell 48：681-690(1987)。在WHO的官方命名中，该异二聚体蛋白称作CD11a/CD18，CD11b/CD18，和CD11c/CD 18；在常用命名中，它们分别被称为LFA-1，Mac-1或Mo1和p150，95或LeuM5[Cobbold，etal.in Leukocyte Typing III，McMichael(ed)，Oxford Press，p.788(1987)]。已经证明人β2整联蛋白的α亚基CD11a，CD11b和CD11c在电泳中的还原条件下迁移，表观分子量分别为180kD，155kD和150kD，并且已经克隆了编码这些亚基的DNA[CD11a，Larson，et al.J.Cell Biol.108：703-712(1989)；CD11b，Corbi，et al.J.Biol.Chem.263：12403-12411(1988)和CD11c，Corbi，et al.EMBOJ 6：40234028(1987)]。在其它物种，包括猴和其它灵长类动物[Letvin，etal.B1ood 61：408-410(1983)]、小鼠[Sanchez-Madrid，et al.J.Exp.Med.154：1517(1981)]以及狗[Moore，et al.Tissue Antigens36：211-220(1990)]中已经鉴定了人β2整联蛋白α和β链的推测同源物，是由分子量的近似而确定的。
已经证明其它物种的推测同源物的绝对分子量差异很大[见，例如Danilenko et al.Tissue Antigens 40：13-21(1992)]，在缺乏序列信息的情况下，不可能知道人整联蛋白亚基和在其它物种中鉴定的亚基的确切相关性。而且，在不同物种之间观察到了蛋白家族成员数目的变异。例如在兔中比在人中分离了更多的IgA同种型[Burnett，et al.EMBO J.8：4041-4047(1989)和Schneiderman，et al.Proc.Nat 1.Acad.Sci.(USA)86：75617565(1989)]。同样，在人中，已经鉴定了金属硫蛋白的至少6种变体[Karin and Richards，Nature299：797-802(1982)和Varshney，et al.Mol.Cell.Biol.6：26-37，(1986)]，而在小鼠中，只有两种这样的变体是明显的[Searle，et al.Mol.Cell.Viol.4：1221-1230(1984)]。因此，在一个物种中存在一个蛋白家族的多个成员并不一定表示在另一物种中存在相应的家族成员。
在β2整联蛋白的具体情况中，在狗中观察到，推测的人CD18的犬β2对应物能够与4个潜在不同的α亚基形成二聚体[Danilenko，etal.supra]。通过用犬脾细胞免疫小鼠产生的抗体导致单克隆抗体，它们免疫沉淀了暂时称作人CD18，CD11a，CD11b和CD11c的犬同源物的蛋白，这主要基于相似但不是等同的分子量。另一种抗犬脾细胞抗体Ca11.8H2识别并免疫沉淀一种第四α样犬亚基，该亚基也能与β2亚基结合，但具有独特的分子量并且限于在分化的组织巨噬细胞的一个亚型中表达。
通过用鼠树突细胞免疫仓鼠产生的抗体导致两种抗整联蛋白抗体[Metlay，et al.J.Exp.Med.171：1753-1771(1990)]。一种抗体2E6免疫沉淀含有近似分子量为180kD和90kD的亚基和分子量范围为150-160kD的次要条带的优势异二聚体。根据细胞粘附阻断研究，假定抗体2E6识别人CD18的鼠对应物。尽管N418抗原的分子量提示对人CD11c/CD18的鼠同源物的识别，进一步分析提示鼠抗原表现出与人CD11c/CD18所观察到的不同的组织分布模式。
由犬Ca11.8H2抗体和鼠N418抗体识别的抗原可以代表以前鉴定的犬或鼠α亚基的不同变异种类(如糖基化或剪切变异)。作为选择，这些抗原可以代表独特的犬或鼠α亚基。在没有一级结构的具体信息时，这些选择不能区分。
在人类中，CD11a/CD18在所有白细胞上表达。CD11b/CD18和CD11c/CD18基本限于在单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达，但CD11c/CD18也在一些B细胞类型上检测到。总体上，CD11a/CD18在淋巴细胞上占优势，CD11b/CD18在粒细胞上占优势，CD11b/CD18在巨噬细胞上占优势[参见综述，Arnaout，Blood 75：1037-1050(1990)]。然而，对于各个细胞类型的激活和分化状态，α链的表达是可变的[参见综述，Larson and Springer，Immunol.Rev.114：181-217(1990)]。
采用能够阻断β2整联蛋白相关细胞粘附的单克隆抗体已经证明了β2整联蛋白参与人免疫和炎症反应。例如，CD11a/CD18，CD11b/CD18和D11c/CD18活跃参与天然杀伤(NK)细胞与淋巴瘤和腺癌细胞的结合[Patarroyo，et al.Immunol.Rev.114：67-108(1990)]、粒细胞聚集[Nourshargh，et al.J.Immunol.142：3193-3198(1989)]、粒细胞非依赖性血浆渗漏[Arfors，et al.Blood 69：338-340(1987)]、被刺激白细胞的趋化反应[Arfors，et al.supra]和白细胞与血管内皮的粘附[Price，et al.J.Immunol.139：4174-4177(1987)和Smith，et al.J.Clin.Invest.83：2008-2017(1989)]。β2整联蛋白在免疫和炎症反应中的基本作用在称作白细胞粘附缺陷(LAD)的临床综合征中很明显，其中的临床表现包括复发的和通常威胁生命的细菌感染。LAD来自于β2亚基的异源突变[Kishimoto，et a1.Cell 50：193-202(1987)]，该疾病状态的严重性与β2亚基表达的缺陷程度成比例。β2突变损害完整整联蛋白异二聚体的形成。令人感兴趣的是，已经证明至少一种CD18的特异性抗体可以体外抑制1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)合胞体形成，但该抑制的确切机制还不清楚[Hildreth and Orentas，Science 244：1075-1078(1989)]。该观察结果与以下发现一致，即CD11a/CD18的主要反受体ICAM-1也是鼻病毒血清型主要族的表面受体[Greve，et al.Cell 56：839(1989)]。
β2整联蛋白结合活性在人免疫和炎症反应中的重要性强调了开发对该类表面蛋白的更完全理解的必要性。鉴定该亚家族的未知成员，以及它们的反受体，并且产生可以改变β2整联蛋白生物活性的多克隆抗体或其它可溶因子将为β2整联蛋白免疫和炎症反应的治疗干预提供实际的方法。
发明概述
在一个方面，本发明提供新型的纯化和分离的多核苷酸(例如DNA和RNA转录物，包括有义链和反义链)，这些多核苷酸编码具有αd固有的结合和/或免疫特性的新型人β2整联蛋白α亚基αd及其变体(即缺失、添加或取代类似物)。本发明的优选DNA分子包括cDNA、基因组DNA及全部或部分化学合成的DNA分子。目前一个优选的多核苷酸是SEQ ID NO：1中列出的DNA，它编码SEQ ID NO：2的多肽。本发明还提供包含αd编码序列的重组质粒和病毒DNA构建体(表达构建体)，其中αd编码序列可操作性与一个或多个同源或异源的转录调节元件连接。
本发明还提供与编码人αd的多核苷酸显示同源性的分离和纯化的小鼠和大鼠多核苷酸。一个优选的小鼠多核苷酸列于SEQ ID NO：52，一个优选的大鼠多核苷酸列于SEQ ID NO：54。
本发明的另一个方面是，提供用能表达αd多肽或其变体的本发明的DNA序列转化或转染的原核或真核宿主细胞。本发明的宿主细胞在大量制备αd多肽时特别有用，αd多肽可以从宿主细胞本身或宿主细胞生长的培养基中分离。在其细胞外膜表面表达αd多肽的宿主细胞作为免疫原在制备αd特异的抗体时也特别有用。优选地，用αd转染的宿主细胞也进行共转染来表达一种β2整联蛋白，使异二聚体在表面表达。
本发明还提供纯化和分离的αd多肽及其片段和变体。优选的αd多肽列于SEQ ID NO：2。本发明的新型αd产物可以从天然来源中分离，但与αd变体产物一样，优选用本发明的宿主细胞通过重组方法进行生产。可以通过改变选择用来进行重组过程的宿主细胞和/或分离后加工来制备完全糖基化、部分糖基化和完全去糖基化形式的αd多肽。本发明的αd多肽变体可以包含水溶性和不溶性的αd多肽，包括类似物，其中一个或多个氨基酸被去除或取代：(1)αd特异的生物学活性或免疫学特征没有丧失，并优选有一个或多个有增强；或(2)一个特定的配体/受体结合或信号功能被特异性地失活。本发明还提供融合的多肽，其中αd氨基酸序列与来自其他多肽的氨基酸序列顺序表达。这样的融合多肽与野生型的αd相比具有修饰的生物学、生物化学、和/或免疫学特性。本发明还包括包含额外的氨基酸残基(例如赖氨酸或半胱氨酸)从而便于多聚体形成的多肽类似物。
本发明还包括特异性地与αd结合的多肽或非肽类分子。优选的结合分子包括抗体(例如单克隆和多克隆抗体)、反受体(例如膜相关和可溶性形式)和其他配体(例如天然存在或合成的分子)，包括那些在αd单克隆抗体和/或特异性反受体存在下竞争性地与αd结合的分子。结合分子在纯化αd多肽和鉴定表达αd的细胞类型时非常有用。结合分子还可用于调节(即抑制、阻断或激活)αd的体内结合和/或信号传导活性。
本发明还提供鉴定αd结合分子的测定，包括体外测定例如固定配体结合测定、溶液结合测定和闪烁亲近测定；以及基于细胞的测定例如双杂交体筛选测定、分裂(split)杂交体筛选测定等等。基于细胞的测定在宿主细胞中提供表型改变作为特异性结合相互作用或特异性结合相互作用被破坏的结果，从而间接定量或测量某些特异性结合相互作用。
鉴定能调节αd活性的抗体或其他化合物的体外测定可以包括，例如，固定化αd或一种αd结合的天然配偶体(partner)，将非固定化的结合配体进行可检测标记，将结合配偶体一起温育，测定待测化合物对标记数量的影响，其中在有待测化合物的情况下比没有待测化合物的情况下，结合的标记减少，就说明待测试剂是一种αd结合的抑制剂。
另一种类型的鉴定能调节αd与配体相互作用的化合物的体外测定包括，将αd或其片段固定化于包被(或饱和)了一种荧光试剂的固相支持物上，配体用一种能激发荧光的化合物标记，将固定化的αd与标记的配体在存在或不存在一种推定的调节化合物的情况下接触，检测荧光试剂的光发射，与没有调节化合物存在时荧光试剂的光发射相比能够影响荧光试剂光发射的化合物就被鉴定为调节化合物。另外，在测定中也可以将αd配体固定化而将αd标记。
本发明包含的一种鉴定能调节αd与一种配体相互作用的化合物的基于细胞的方法包括：用一个DNA构建体转化或转染合适的宿主细胞，该DNA构建体中含有一个在启动子控制之下的报道基因，该启动子受含有一个DNA结合结构域和一个激活结构域的转录因子调节；在宿主细胞中表达编码部分或全部αd与转录因子的DNA结合结构域或激活结构域的第一种融合的第一种杂交DNA序列；在宿主细胞中表达编码配体的全部或部分与转录因子的DNA结合结构域或激活结构域的第二种杂交DNA序列，其不掺入第一种融合；通过测量在存在或没有推定调节剂的情况下，报道基因产物在宿主细胞中的产量，来检测配体与αd在特定宿主细胞中的结合，从而评价推定的调节化合物对αd与配体相互作用的影响，并且将相对于没有调节化合物时改变报道基因产量的化合物鉴定为调节化合物。这里优选在测定中使用的是lexA启动子、lexA DNA结合结构域、GAL4反式激活结构域、lacZ报道基因和一种酵母宿主细胞。
上述测定的一个修改版本可以用来分离编码一种能结合αd的蛋白的多核苷酸，包括：用一个DNA构建体转化或转染合适的宿主细胞，该DNA构建体中含有一个在启动子控制之下的报道基因，该启动子受含有一个DNA结合结构域和一个激活结构域的转录因子调节；在宿主细胞中表达编码部分或全部αd与转录因子的DNA结合结构域或激活结构域的第一种融合的第一种杂交DNA序列；在宿主细胞中表达编码配体的全部或部分与转录因子的DNA结合结构域或激活结构域的第二种杂交DNA序列，其不掺入第一种融合；通过检测宿主细胞中报道基因产物的产量来检测在特定宿主细胞中αd结合蛋白与αd的结合；并从特定宿主细胞中分离编码αd结合蛋白的第二种杂交DNA序列。
在一个使用分裂杂交体筛选测定的优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定αd蛋白或其片段与αd结合蛋白或其片段结合的抑制剂的方法，这种方法包含如下步骤：(a)用第一个DNA表达构建体转化或转染所述宿主细胞，该DNA表达构建体包含编码第一个选择标记蛋白的第一个选择标记基因和编码一个阻抑蛋白的阻抑基因，其中所述阻抑基因在一个启动子的转录控制之下，(b)用第二个DNA表达构建体转化或转染所述宿主细胞，该DNA表达构建体包含编码第二个选择标记蛋白的第二个选择标记基因和编码第三个选择标记蛋白的第三个选择标记基因，其中所述第三个标记基因在一个操纵子的转录控制之下，所述操纵子特异性地受所述阻抑蛋白作用，从而所述阻抑蛋白与所述启动子相互作用降低所述第三个选择标记蛋白的表达；(c)用第三个DNA表达构建体转化或转染所述宿主细胞，该DNA表达构建体包含编码第四个选择标记蛋白的第四个选择标记基因和编码一个αd蛋白或其片段与一个转录激活蛋白的DNA结合结构域或所述转录激活蛋白的反式作用结构域同框的αd融合蛋白基因；(d)用第四个DNA表达构建体转化或转染所述宿主细胞，该DNA表达构建体包含编码第五个选择标记蛋白的第五个选择标记基因和编码一个αd结合蛋白或其结合片段与所述转录激活蛋白的DNA结合结构域或所述转录激活蛋白的反式作用结构域同框的第二个融合蛋白基因，该DNA结合结构域或反式作用结构域不包含在第一个融合蛋白基因中；(e)将所述宿主细胞在允许所述αd蛋白或其片段和αd结合蛋白或其结合片段表达的条件下培养，从而使所述αd蛋白或其片段与αd结合蛋白或其结合片段相互作用，使所述DNA结合结构域与所述反式作用结构域接近，重组成所述转录激活蛋白；所述转录激活蛋白作用于所述启动子，使所述阻抑蛋白的表达提高；所述阻抑蛋白与所述启动子相互作用，使第三个选择标记蛋白不表达；(f)检测所述选择基因表达的缺乏；(g)将所述宿主细胞在存在一种所述αd蛋白或其片段与所述αd结合蛋白或其片段结合的待测抑制剂的条件下培养；(h)比较在存在和不存在所述待测抑制剂的情况下，所述选择标记蛋白的表达，其中所述选择标记蛋白的表达降低说明待测抑制剂能够抑制所述αd蛋白或其片段与所述αd结合蛋白或其结合片段的结合，从而使所述转录激活蛋白不能重组，所述阻抑蛋白的表达没有增加，而所说操纵子使所述选择标记蛋白的表达增加。
本发明包括不同的基因和调节序列编码在单一DNA分子的宿主细胞以及一个或多个阻抑基因、选择标记基因、αd融合蛋白基因和αd结合蛋白基因编码在不同DNA表达构建体的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞用编码阻抑基因、选择标记基因、αd融合蛋白基因和αd结合蛋白基因的DNA转化或转染，上述基因均编码在不同的表达构建体上。无论导入多少个DNA表达构建体，每个转化或转染的DNA表达构建体进一步包含一个选择标记基因序列，该选择标记基因序列的表达用来证明转化或转染已经确实完成。各转化或转染DNA表达构建体上编码的选择标记基因与tet操纵子转录调节选择标记不同，其差别在于tet操纵子调节下的选择标记基因的表达在该优选实施方案中是核心的，即tet操纵子对选择标记基因表达的调控在宿主细胞中提供可以测量的表型改变，用以鉴定结合蛋白抑制剂。各转化或转染DNA表达构建体上编码的选择标记基因是提供来作为各DNA表达构建体成功转化或转染的决定物。本发明的优选宿主细胞包括命名为YI596和YI584的酿酒酵母(S.cerevisiae)，这两种菌在1996年8月13日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive.Rockville.Maryland 20852，并分别被给予保藏号ATCC 74384和ATCC74385。
本发明的宿主细胞包括任何能够表达如上所需的αd蛋白和αd结合蛋白以及能被前述调节异源蛋白表达的有功能的启动子和操纵子序列转化或转染的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫或酵母来源的细胞。在此，最优选的细胞是酵母细胞。本发明的优选酵母细胞可以选自包括表1中介绍的酿酒酵母在内的各种菌株。其他的酵母种类包括粟酒裂殖酵母(S.pombe)、乳克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)和白色假丝酵母(C.albicans)。本发明的优选哺乳动物类宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS、HeLa、3T3、CV1、LTK、293T3、Rat1、PC12或任何其他人或啮齿类来源的转染细胞系。优选的昆虫细胞系包括SF9细胞。
在一个优选的实施方案中，选择标记基因受一个操纵子调节，并编码一个所述宿主细胞的营养所需的合成途径中的一个酶，这样，对于在缺乏所述必需营养的培养基上生长的所说宿主细胞来说，所述选择标记蛋白的表达是需要的。这样，在一个阻抑蛋白与操纵子相互作用的优选实施方案中，选择标记基因的转录被下调，而宿主细胞通过其不能在缺乏必需营养的培养基上生长但能在含有该必需营养的培养基上生长来进行鉴定。在一个最优选的实施方案中，选择标记基因编码HIS3蛋白，用编码HIS3的DNA表达构建体转化或转染的宿主细胞在存在或不含组氨酸的培养基上生长后进行选择。然而本发明可包括任何其他由一个操纵子调节的选择标记基因。其他基因包括，例如，URA3、LEU2、LYS2或那些编码任何产生可被完全地从生长培养基中去除的必需营养的各种途径中所需要的多种酶的基因。此外，传统的报道基因例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤火虫萤光素酶、β-半乳糖苷酶(β-ga1)、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、绿荧光蛋白(GFP)、人生长激素(hGH)、β-葡萄醛酸酶、新霉素、潮霉素、胸苷激酶(TK)等也可用于本发明。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞包含一个编码四环素抗性蛋白的阻抑蛋白基因，该蛋白作用于tet操纵子，使选择标记基因的表达降低。但本发明还包括tet阻抑物和操纵子以外的其他阻抑物和操纵子，例如大肠杆菌trp阻抑物和操纵子、his阻抑物和操纵子以及lac阻抑物和操纵子。
融合蛋白的DNA结合结构域和反式激活结构域组分可来自同一个转录因子或来自不同的转录因子，只要在αd和αd结合蛋白结合时使这两种结构域接近形成一个有功能的转录激活蛋白，该蛋白高效率地提高阻抑蛋白的表达。一个高效率的转录激活蛋白被定义为同时含有一个能显示与被识别的启动子序列高亲和力结合的DNA结合结构域和一个对表达阻抑基因mRNA所需的转录机制蛋白有高亲和力的反式激活结构域。本发明的融合蛋白的DNA结合结构域组分可来自任何不同蛋白质，例如，LexA或Ga14。类似地，本发明的融合蛋白的反式激活组分可来自多种不同的转录激活蛋白，包括如Ga14或VP16。
本发明的调节阻抑蛋白转录的启动子序列可以是任何能在所选宿主细胞中驱动转录的序列。启动子可以是特异地被本发明的所选DNA结合结构域识别的DNA序列，或任何其他能与融合蛋白的DNA结合结构域以高亲和力相互作用的DNA序列。在本发明的一个优选实施方案中，本发明启动子序列是一个HIS3或一个醇脱氢酶(ADH)启动子。这里最优选的一个实施方案中，本发明使用了一个ADH启动子。但本发明包括大量的其他启动子，包括例如，来自从编码HIS3、ADH、URA3、LEU2等基因的启动子序列。
本发明的方法包括任何所有的上述宿主中的变化。特别地，本发明包括下面的方法：其中宿主细胞是一种酵母细胞；选择标记基因编码HIS3；选择标记基因的转录受tet操纵子的调节；阻抑蛋白基因编码四环素抗性蛋白；四环素抗性蛋白的转录受HIS3启动子的调节；DNA结合结构域来自LexA；反式激活结构域来自VP16。在另一个实施方案中，本发明包括如下的方法：宿主细胞是一种酵母细胞；选择标记基因编码HIS3；选择标记基因的转录受tet操纵子的调节；阻抑蛋白基因编码四环素抗性蛋白；四环素抗性蛋白的转录受醇脱氢酶启动子的调节；DNA结合结构域来自LexA；反式激活结构域来自VP16。
在本发明的另外的实施方案中，宿主细胞是一种哺乳动物细胞，其改变包括，使用哺乳动物DNA表达构建体来编码αd和αd结合融合蛋白基因、阻抑基因、和选择标记基因，并使用编码抗生素或药物抗性标记的选择标记基因(即，新霉素、潮霉素、胸苷激酶)。
至少有三种不同类型的文库用来鉴定小分子的调节剂。它们包括：(1)化学文库，(2)天然产物文库，(3)由随机肽、寡核苷酸或有机分子组成的组合文库。
化学文库由已知化合物或通过天然产物筛选而鉴定为“标的”的化合物的结构类似物组成。天然产物文库是微生物、动物、植物或水生生物体的收集物，上述生物体用来按下述方法制备用于筛选的混合物：(I)从土壤、植物或水生微生物中发酵和抽提培养液，(II)抽提植物或水生有机体。组合文库由大量的肽、寡核苷酸或有机化合物的混合物组成。它们可以相对容易地用传统的自动合成方法、PCR、克隆或适当的合成方法进行制备。其中最令人感兴趣的是肽和寡核苷酸组合文库。其他令人感兴趣的文库包括肽、蛋白、肽模拟物、多平行合成收集物、重组和多肽文库。
本发明还包括生产αd的特异性抗体的杂交瘤细胞系。生产能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术在本领域是熟知的。杂交瘤细胞系可以在用纯化的αd、αd变体或能在其细胞外膜表面表达αd或其变体的细胞免疫一种动物后进行制备。免疫原细胞类型包括在体内表达αd的细胞或通常不能在体内表达αd的转染的原核细胞或真核细胞系。这里本发明优选的抗体由命名为169A、169B、170D、170F、170E、170X、170H、188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R、188T、195A、195C、195D、195E、195H、197A-1、197A-2、197A-3、197A-4、199A、199H、199M、205A、205C、205E、212A、212D、217G、217H、217I、217K、217L、217M、226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H、226I、236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、237L、237L、236M、240F、240G和240H的杂交瘤分泌。
通过αd的DNA和氨基酸序列公开而提供的信息的价值也被指明。在一系列实例中，公开的αd cDNA序列使分离人αd基因组序列，包括基因组序列的转录控制元件成为可能。本发明还包括αd等位基因变体和异源物种(例如大鼠和小鼠)的DNA的鉴定。人αd基因组DNA和异源物种DNA的分离可以用标准的DNA/DNA杂交技术，在适度严格的条件下，使用全部或部分αd cDNA序列作为探针对一个合适的文库进行筛选来完成。另外，使用基于已知的cDNA序列设计的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应(PCR)也可用来扩增和鉴定基因组αdDNA序列。编码αd多肽，包括其片段和其他变体的合成DNA可用传统的合成方法进行生产。
本发明的DNA序列信息还可用来通过同源重组或“敲除”策略[见诸如，Kapecchi，Science 244：1288-1292(1989)]产生不能表达有功能的αd多肽或表达一种变异的αd多肽的啮齿类动物。这样的啮齿类动物可用作体内研究αd和αd调节剂的模型。
本发明的DNA和氨基酸序列还使分析αd中活跃地参与反受体结合的表位以及调节而不是活跃地参与结合的表位成为可能。参与膜信号传导的表位的鉴定也包含在本发明的范围内。
本发明的DNA还可用来检测表达αd多肽的细胞类型。使用αd DNA检测αd bRNA的标准DNA/RNA杂交技术可用来确定一种细胞中αd转录的组成水平以及应答于内部或外部试剂的转录水平改变。而接着，能修饰αd转录或翻译的试剂的鉴定又能用来评估其潜在的治疗或预防价值。本发明的DNA还可以用αd DNA对细胞RNA进行原位杂交来确定在复杂的细胞群和组织中αd特异性信息的细胞定位。
本发明的DNA还可用来鉴定显示与人αd序列同源的非人多核苷酸序列。获得了非人αd DNA序列就可建立人系统的动物模型(包括，例如，转基因模型)。
作为本发明的另一个方面，αd的特异性单克隆抗体和多克隆抗体可用于将αd定位于亚细胞腔室或组织中各个细胞的免疫组化分析。这类免疫组化分析在与原位杂交联用来定位αd基因的αd mRNA和多肽产物两者时特别有用。
鉴定能表达αd的细胞类型对开发治疗性和预防性试剂有显著的衍生效果。预期本发明的αd相关产物可用于治疗在其疾病过程中巨噬细胞为基本因素的疾病。在本领域中，许多与巨噬细胞活性相关的病理状态的动物模型已经得到介绍。例如，Jutila，et al.J.LeukocyteBiol.54：30-39(1993)报道了在小鼠中，在慢性和急性炎症的位点募集巨噬细胞。Adams，et al.[Transplantation 53：1115-1119(1992)和Transplantation 56：794-799(1993)]描述了在大鼠中，异向性腹部心脏同种异体移植后的移植动脉硬化的模型。Rosenfeld，et al.[Arteriosclerosis 7：9-23(1987)和Arteriosclerosis 7：24-34(1987)]介绍了用一种添加胆固醇的食物喂养，在兔中诱导动脉粥样硬化。Hanenberg，et al.[Diabetologia 32：126-134(1989)]报道了BB大鼠中胰岛素依赖型糖尿病的自发发展。Yamada et al.[Gastroenterology 104：759-771(1993)]介绍了在大鼠中注射链球菌肽聚糖-多糖多聚体后诱导炎性肠病、慢性肉牙肿。Cromartie，etal.[J.Exp.Med.146：1585-1602(1977)]和Schwab，et al.[Infection and Immunity 59：4436-4442(1991)]报道了在大鼠中注射链球菌细胞壁蛋白导致特征为外周关节炎症及后续关节破坏的关节炎。最后，Huitinga，et al.[Eur.J.Immunol 23：709-715(1993)介绍了Lewis大鼠的实验型过敏性脑脊髓炎，这是多发性硬化的一种模型。在上述每种模型中，αd抗体、其他αd结合蛋白或αd的可溶性形式被用来缓解疾病状态，推测是通过巨噬细胞灭活。
本发明提供治疗这些疾病和其他疾病状态的药物组合物。药物组合物的设计目的是抑制αd与其配体之间的相互作用，包括αd的各种可溶性和膜结合形式(包括活跃地参与αd结合的完整的αd多肽或其片段)、可溶性和膜结合形式的αd结合蛋白(包括抗体、配体等)、αd结合活性的细胞内或细胞外调节剂、和/或αd和/或αd配体多肽表达的调节剂，包括转录、翻译、翻译后加工和/或细胞内运输的调节剂。
本发明还包括治疗涉及αd结合或表达αd的细胞局部集聚的疾病的方法，在该方法中，向患有所说疾病的病人提供一定数量的本发明的药物组合物，其数量足够调节αd结合水平或调节表达αd的细胞类型的集聚。本发明的治疗方法应用于以下疾病状态，包括但不限于I型糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化、哮喘、牛皮癣、肺炎、急性呼吸窘迫综合征和类风湿关节炎。
本发明还提供抑制中枢神经系统损伤位点的巨噬细胞浸润的方法，包括给予个体有效量的抗αd单克隆抗体的步骤。一方面，该方法包括使用阻断αd和结合配偶体之间的结合的抗αd单克隆抗体。在一个实施方案中，结合配偶体是VCAM-1。在一个优选实施方案中，抗αd单克隆抗体选自由杂交瘤226H分泌的单克隆抗体和由杂交瘤236L分泌的单克隆抗体。在一个最优选的实施方案中，本发明的方法用于中枢神经损伤，该损伤为脊髓损伤。
本发明进一步提供了减少中枢神经系统损伤位点的炎症的方法，包括给予个体有效量的抗αd单克隆抗体的步骤。一方面，该方法包括使用阻断αd和结合配偶体之间的结合的抗αd单克隆抗体。在一个实施方案中，结合配偶体是VCAM-1。在一个优选实施方案中，抗αd单克隆抗体选自由杂交瘤226H分泌的单克隆抗体和由杂交瘤236L分泌的单克隆抗体。在一个最优选的实施方案中，本发明的方法用于中枢神经损伤，该损伤为脊髓损伤。
杂交瘤226H和236L由美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Masassas，VA 20110-2209在布达佩斯条约下于1998年11月11日接收，保藏号分别为HB12592和HB-12593。
本发明也提供了调节巨噬细胞或脾吞噬细胞释放TNFα的方法，包括使所述吞噬细胞接触有效量的免疫特异性αd单克隆抗体的步骤。在一个优选的方面，本发明的方法包括使用免疫特异性抗αd单克隆抗体，所述抗αd单克隆抗体选自由杂交瘤205C分泌的单克隆抗体和由杂交瘤205E分泌的单克隆抗体。
在所考虑的本发明的方法中，有用的抗体包括抗αd单克隆抗体的片段，包括例如Fab或F(ab′)2片段。本发明也包括利用修饰抗体的方法。修饰的抗体包括，例如，单链抗体、嵌合抗体和CDR嫁接的抗体，包括含有特异性识别本发明的多肽的CDR序列的化合物，以及人源化抗体。也考虑了包括使用人抗体的方法。鉴定和分离人抗体的技术在下文中公开。
本发明还提供抑制中枢神经系统损伤位点的巨噬细胞浸润的方法，包括给予个体有效量的抑制αd结合的小分子的步骤。具体地，本发明的方法涉及中枢神经系统损伤，该损伤为脊髓损伤。从前面所述的文库中鉴定和分离了特异于αd结合的小分子。
本发明进一步提供减少中枢神经系统损伤位点的炎症的方法，包括给予个体有效量的抑制αd结合的小分子的步骤。具体地，本发明的方法涉及中枢神经系统损伤，该损伤为脊髓损伤。从前面所述的文库中鉴定和分离了特异于αd结合的小分子。
本发明进一步包括检测和诊断克隆氏病的方法，包括以下步骤：从患者获得组织样品；用抗αd单克隆抗体对样品染色，并且将染色模式与从已知的正常供体中获得组织的染色模式进行比较。当可以检测到两种组织样品之间的染色差异时，可以进一步检验患者是否可能患有克隆氏病。
本发明也考虑将αd用作去除在细胞表面表达αd的致病细胞群的靶。一方面，在补体固定的人同种型的范围内克隆并表达了αd单克隆抗体的高变区。以这种方法克隆高变区将为αd提供结合配偶体，当其进行体内结合时，将导致补体结合和随后的细胞死亡。或者，将抗αd单克隆抗体与细胞毒性化合物偶联，抗体与致病细胞类型上的αd的结合将导致细胞死亡。
本发明也提供了通过给予脊髓损伤的受害者有效量的抗αd单克隆抗体而促进脊髓损伤后的运动恢复或抑制运动损害或限制运动障碍的方法。也涉及通过给予脊髓损伤的受害者有效量的抗αd单克隆抗体而限制脊髓损伤后的自主神经和感觉功能障碍的方法。在一个实施方案中，抗αd单克隆抗体是217L或226H抗体。在另一实施方案中，抗αd单克隆抗体与217L或226H竞争结合αd。在另一实施方案中，抗αd单克隆抗体抑制αd与αd配体结合。涉及的抗αd单克隆抗体包括ICAM-R和VCAM-1。由这些方法治疗的示例性脊髓损伤包括涉及脊髓压缩的损伤。
附图简述
本发明的大量其他方面和优点将用下面的描述参考附图而显示，在附图中：
图1A至1D包含人氨基酸序列CD11b(SEQ ID NO：3)、CD11c(SEQID NO：4)、和αd(SEQ ID NO：2)的比对。
发明详述
本发明用下列与从一个人脾细胞cDNA文库中分离编码αd的cDNA有关的实施例来说明。更具体地说，实施例1说明了使用抗犬αTM1抗体来设法检测一种同源的人蛋白。实施例2详细介绍了纯化犬αTM1和多肽的N末端测序来设计用于PCR扩增犬αTM1基因的寡核苷酸引物。实施例3谈到了大规模纯化用于内部测序的犬αTM1，用来设计其它PCR引物。实施例4介绍了使用PCR和内部引物来扩增犬αTM1基因的一个片段。实施例5谈到了编码人αd的cDNA序列的克隆。实施例6介绍了表达αd mRNA的人组织和细胞的Northern印迹杂交。实施例7详细介绍了人αd表达质粒的构建和用获得的质粒转染COS细胞。实施例8谈到了转染COS细胞中αd表达的ELISA分析。实施例9介绍了用人αd表达质粒转染的COS细胞的FACS分析。实施例10谈到了CD18与共转染的COS细胞中αd结合的免疫沉淀。实施例11涉及αd表达结构在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定转染。实施例12谈到了αd CD18依赖的与细胞间粘附分子ICAM-R、一种ICAM-R突变蛋白和补体因子iC3b的结合。实施例13介绍了鉴定αd配体/抗配体相互作用的抑制剂或增强剂(即调节剂)的闪烁亲近筛选测定。实施例14谈到了构建编码αd可溶性形式的表达质粒的构建和表达产物的结合分析。实施例15涉及αd特异性多克隆血清和单克隆抗体的制备。实施例16介绍了使用αd单克隆抗体的流式细胞术分析。实施例17谈到了αd在人单核细胞上的表达。实施例18介绍了使用抗αd多克隆血清分析αd组织分布、αd在外周血淋巴细胞上的表达、在炎症和非炎症滑膜中的表达，在来自乳腺癌病人的病态肺和肝、人骨髓和PBMC中的表达。实施例19谈到了αd在体内和体外表达的上调。实施例20介绍了显示与人αd基因序列同源的大鼠cDNA序列的分离。实施例21谈到了大鼠αd mRNA的组织特异性表达。实施例22涉及全长的大鼠αd表达质粒、大鼠αd I结构域表达质粒包括I结构域/IgG融合蛋白的构建，针对全长和I结构域融合蛋白的单克隆抗体的制备，和针对与人IgG4融合的大鼠αd I结构域序列的多克隆抗血清的制备。实施例23介绍了单克隆抗体199M的特异性。实施例24显示了使用表达大鼠αd的巨噬细胞的T细胞增殖试验的结果。实施例25介绍了来自骨髓的大鼠αd的免疫沉淀。实施例26介绍了大鼠αd在多种动物模型中的表达。实施例27涉及一种使用αd单克隆抗体抑制NK-肿瘤细胞诱导的靶细胞裂解的试验。实施例28谈到了显示与人αd基因序列同源的小鼠cDNA序列的分离。实施例29介绍了另外的用于证明序列分析的小鼠αd cDNA克隆的分离。实施例30涉及多种小鼠组织的原位杂交分析，来确定推定的人αd小鼠同源物的组织和细胞特异性表达。实施例31介绍编码推定的人αd小鼠同源物的表达构建体的制备。实施例32谈到了“敲除”小鼠的设计，其中编码推定的人αd小鼠同源物的基因被破坏。实施例33介绍了显示与人αd同源的兔cDNA克隆的分离。实施例35涉及单克隆抗体217L识别的抗原的表征。实施例36介绍了人疾病状态的动物模型，其中分析了αd调节的治疗能力。实施例37介绍了αd在动物模型疾病状态中的表达。实施例38谈到αd在脊髓损伤中的作用。实施例39描述了αd在克隆氏病中的表达。实施例40涉及从表达αd的大鼠脾细胞释放TNFα。实施例41描述了用αd单克隆抗体调节TNFα从脾细胞的释放。实施例42鉴定了αd在嗜酸性粒细胞上的表达。实施例43涉及进一步鉴定αd与VCAM-1的结合。实施例44描述了将αd作为去除致病细胞群的靶。
实施例1
尝试检测犬αTM1的人同源物
检测针对犬αTM1的单克隆抗体Ca11.8H2(Moore，等上文)对人外周血淋巴细胞的交叉反应，来设法鉴定一种犬αTM1的人同源物。细胞制备物(通常为1×106细胞)与未稀释的杂交瘤上清液或一种纯化的鼠IgG阴性的对照抗体(10μg/ml)在冰上于存在0.1％叠氮化钠的条件下温育。结合的单克隆抗体用随后与6μg/ml的FITC偶联的马抗鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育来进行检测。染色的细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)中的2％ w/v低聚甲醛进行固定，并用Facstar Plus荧光激活细胞分选仪(Becton Dickinson，Mountain View，CA)进行分析。通常，用对数放大分析10,000个细胞来测量荧光密度。
结果显示，Ca11.8H2不与人外周血淋巴细胞表面表达的蛋白交叉反应，而对照细胞赘生性犬外周血淋巴细胞基本上都是犬αTM1阳性。
由于针对犬α亚基的单克隆抗体Ca11.8H2不与人同源物交叉反应，分离犬αTM1 DNA对于分离可能存在的对应的人基因来说是据信是必要的。
实施例2
亲和纯化犬αTM1用于N末端测序
亲和纯化犬αTM1来测定N末端氨基酸序列，用于寡核苷酸探针/引物设计。简而言之，将抗αTM1单克隆抗体Ca11.8H2偶联到Affigel
Figure C0182025000191
10色谱树脂上(BioRad，Hercules，CA)，蛋白通过特异性的蛋白-蛋白相互作用进行分离。根据BioRad推荐的程序，将抗体按约5mg抗体每ml树脂的浓度偶联到树脂上。偶联反应后，去除多余的抗体，树脂用三倍体积的0.1M的乙醇胺进行封闭。然后用三十倍体积的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤树脂。
25克的一只狗脾脏在250ml 25mM Tris-HCl、pH 8.0、含有0.32M蔗糖并含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中匀浆。在1000g离心15分钟使核和细胞残渣沉淀。在100,000g离心30分钟使膜从上清液中沉淀。将膜沉淀在200ml裂解缓冲液(50mM NaCl、50mM硼酸盐、pH 8.0、2％NP-40)中重新悬浮，并在冰上温育1小时。然后在100,000g离心60分钟沉淀不溶物质。将10毫升清亮的上清液转入含有0.5ml上述Ca11.8H2偶联的Affigel10树脂的一个15ml的聚丙烯试管中。然后将试管在4℃旋转温育过夜，接着用50倍体积的D-PBS洗涤树脂。然后将树脂转入一个微量离心管中，在1ml含有0.1M Tris-HCl、pH6.8、2％ SDS、20％甘油和0.002％溴酚蓝的Laemmli(非还原性)样品缓冲液中煮沸10分钟。离心沉淀树脂并弃去，上清液用1/15体积的β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)处理，并上7％聚丙烯酰胺凝胶。分离的蛋白按下述方法转移到Immobilon PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。
凝胶在去离子的、Millipore
Figure C0182025000193
过滤的水中洗涤一次，在含10％甲醇的10mM 3-[环己氨基]-1-丙磺酸(CAPS)、pH 10.5转移缓冲液中平衡15-45分钟。Immobilon膜用甲醇浸湿，并用过滤水漂洗，然后在CAPS转移缓冲液中平衡15-30分钟。初步的转移用BioRad转移装置在70伏进行3小时。转移后移去Immobilon膜，并在过滤的0.1％R250考马斯染料中染色10分钟。膜在50％甲醇/10％乙酸中脱色三次，每次10分钟。脱色后，膜在过滤水中洗涤，并空气干燥。
检测到了约150kD、95kD、50kD和30kD的蛋白条带。推测50kD和30kD条带是抗体污染产生的。然后对150kD和95kD带进行N末端测序，但95kD蛋白是封闭的，阻碍了测序。从膜上切下150kD蛋白带，直接用Applied Biosystems(Foster City，CA)Model 473A蛋白测序仪按照厂商的指示进行测序。所获得的氨基酸序列采用单字母氨基酸命名列于SEQ ID NO：5。
FNLDVEEPMVFQ(SEQ ID NO：5)
所鉴定的序列包含整联蛋白家族α亚基的FNLD序列特征[Tamura，etal.J.Cell.Biol.111：1593-1604(1990)]。
引物设计和设法扩增犬αTM1的序列
根据N末端序列信息，设计了三个用于杂交的寡核苷酸探针：a)“Tommer”，一个完全简并的寡核苷酸；b)“Patmer”，一个部分简并的寡核苷酸；c)“Guesser”一个基于哺乳动物密码子使用的非简并性寡核苷酸。这些探针分别列于下面的SEQ ID NO：6、7和8。这里以及本文的其他核苷酸序列的核酸符号符合37C.F.R§1.882。
5′-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3′(SEQ ID NO：6)
5′-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3′(SEQ ID NO：7)
5′-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3′(SEQ ID NO：8)
基于序列数据，使用这些寡核苷酸在几种低严格条件下对一个克隆到λZAP
Figure C0182025000201
(Stratagene，La Jolla，CA)的犬脾/外周血巨噬细胞cDNA文库进行杂交没有检测到相关的克隆。
根据推导的N末端序列随后设计了四个其他的寡核苷酸引物来设法从上面介绍的Stratagene文库的平板裂解物中纯化的噬菌体文库DNA用PCR扩增犬αTM1序列，这四个引物命名为5′Deg、5′Spec、3′Deg和3′Spec(分别列于SEQ ID NO：9、10、11和12，其中Deg表示简并，Spec表示非简并)。
5′-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3′(SEQ ID NO：9)
5′-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3′(SEQ ID NO：10)
5′-TGRAANACCATNGGYTC-3′(SEQ ID NO：11)
5′-TTGGAAGACCATNGGYTC-3′(SEQ ID NO：12)
αTM1寡核苷酸引物与T3或T7载体引物匹配，T3和T7引物分别列于SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，它们能与λZAP
Figure C0182025000211
中发现的Bluescript
Figure C0182025000212
噬菌粒中的多接头区域的侧翼序列杂交。
5′-ATTAACCCTCACTAAAG-3′(SEQ ID NO：13)
5′-AATACGACTCACTATAG-3′(SEQ ID NO：14)
PCR扩增在含镁并含150ng文库DNA、1μg每种引物、200uMdNTPs、和2.5单位的Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的Taq缓冲液(Boehringer Mannheim，indianapolis，IN)中进行，产物在含有0.25μg/ml溴化乙啶的Tris-乙酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。DNA通过在10×SSPE中吸收过夜转移到Hybond
Figure C0182025000213
膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上，转移之后，固定化的DNA用含有0.6M NaCl的0.5M NaOH变性，用含1.5M NaCl的Tris-HCl、pH 8.0中和，在用Stratalinker(Stratagene)交联装置进行紫外交联前用2×SSPE洗涤。将膜在预杂交缓冲液(5×SSPE、4×Denhardts、0.8％SDS、30％甲醛)中50℃搅拌温育2小时。
寡核苷酸探针5′Deg、5′Spec、3′Deg和3′Spec(分别为SEQ ID NO：9、10、11和12)在用含有100-300uCi γP32-dATP和1-3单位的多核苷酸激酶的Boehringer Mannheim激酶缓冲液中于37℃标记1-3小时。未整合的标记用Sephadex
Figure C0182025000214
G-25fine(Pharmacia，Piscataway，NJ)色谱使用10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA(TE)缓冲液移去，流出液直接加入预杂交溶液。膜用探针在42℃处理16小时并搅拌和反复洗涤，最后用1×SSPE/0.1％SDS在50℃的严格条件下洗涤15分钟。印迹随后在Kodak X-Omat AR胶片上-80℃曝光1-4小时。
寡核苷酸5′Deg、5′Spec、3′Deg和3′Spec仅与来自用它们作为引物的反应的PCR产物杂交，而不能如预期的那样与不用它们作为引物的反应的PCR产物杂交。因此，结论是，没有PCR产物是αTM1特异的，因为没有产物能与所有的适当引物杂交。
实施例3
大规模亲和纯化犬αTM1用于内部测序
为提供用于引物设计的其它氨基酸序列，纯化犬αTM1用于内部测序。用三份冷冻的脾(每份约50克)和来自成年犬的两个部分脾的冷冻细胞来制备内部测序的蛋白。50克脾在200-300ml硼酸缓冲液中用Waring搅拌器匀浆。匀浆物质用1倍体积含有4％NP-40的缓冲液稀释，然后将混合物温和搅拌至少1小时。在2000g离心20分钟清除所产生的裂解物中的大量残渣，然后用Corning(Corning，NY)预滤器或Corning 0.8微滤器过滤，裂解物进一步用Corning 0.4微滤膜系统过滤使之澄清。
脾裂解物和实施例2介绍的抗体偶联的Affigel10树脂按150：1的体积比组合成100ml等分物，在4℃旋转温育过夜。在1000g离心5分钟移去裂解物，与更多的抗体偶联的Affigel
Figure C0182025000222
10树脂混合并按上述温育过夜。然后将吸附的树脂等分物合并并与50倍体积的D-PBS/0.1％ Tween
Figure C0182025000223
20洗涤，然后将树脂转入50ml Biorad柱。吸附的蛋白用3-5倍体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)从树脂中洗脱；收集约900μl的各级份，并用100μl 1M Tris缓冲液、pH 8.0中和，从每个级份中移取15μl，在等体积的含有1/15体积1M二硫苏糖醇的2XLaemmli样品缓冲液中煮沸。将这些样品在8％Novex(San Diego，CA)聚丙烯酰胺凝胶上电泳。使用Daiichi试剂盒(Enprotech，Natick，MA)按厂商推荐的程序用考马斯染料或银染显色。将含有最大量蛋白的级份混合并真空浓缩。剩余的溶液用还原性Laemmli样品缓冲液进行50％稀释，并在Tris-甘氨酸/SDS缓冲液中上1.5mm 7％聚丙烯酰胺凝胶。使用Hoefer转移装置按实施例2中介绍的程序将蛋白从凝胶转移到Immobilon膜上。
从10PVDF膜上切下对应于犬αTM1的蛋白带，并获得了47μg的总蛋白，将带在4ml 50％的甲醇中脱色5分钟，空气干燥，并切成1×2mm的小片。将膜小片浸入2ml 95％丙酮，4℃、30分钟，并不时震荡，然后空气干燥。
在对膜结合的蛋白进行蛋白裂解前，将3mg的溴化氰(CNBr)(Pierce，Rockford，IL)溶解于1.25ml 70％的甲酸中。然后将此溶液加入含有PVDF膜小片的试管中，在暗处室温温育24小时。然后将上清液(S1)移入另一个试管，用0.25ml 70％的甲酸洗涤膜小片。将此上清液(S2)移出，加进前面的上清液(S1)中。在混合的上清液(S1和S2)中加入2毫升Milli Q水，然后将溶液冻干。将PVDF膜小片在氮气中干燥，用1.25ml 60％的乙腈、0.1％四氟乙酸(TFA)在42℃再抽提17小时。将上清液(S3)移出，膜小片用1.0ml 80％的乙腈、0.08％的TFA在42℃再抽提1小时。将此上清液与前面的上清液(S1、S2和S3)混合，真空干燥。
然后将干燥的CNBr片段溶解于63μl 8M尿素、0.4M NH4HCO3。将片段在5μl 45mM二硫苏糖醇(DTT)中还原，并接着在50℃温育15分钟。然后将溶液冷却至室温，并加入5μl 100mM碘乙酰胺(Sigma，St Louis，MO)将片段碱裂解。在室温温育15分钟后，样品用187μl Milli Q水稀释至尿素终浓度为2.0M。然后按酶与蛋白1∶25(w∶w)的比例加入胰蛋白酶(Worthington，Freehold，NJ)，蛋白在37℃消化24小时。加入30μl TFA终止消化。
然后在Waters 625LC系统(Millipore，Milford，MA)上用高效液相色谱(HPLC)将蛋白片段分开，使用在0.05％TFA和HPLC水(缓冲液A)平衡的2.1×250mm 5 micron Vydac C-18柱(Vydac，Hesperia，MA)。肽用0.04％TFA中浓度不断增加的80％乙腈(缓冲液B)进行洗脱，38-75％梯度的缓冲液B洗脱65-95分钟，75-98％的缓冲液B洗脱95-105分钟。肽以0.2ml/分钟的流速分级，并在210nm检测。
分级之后，肽的氨基酸序列用自动Edman降解法进行分析。序列分析在Applied Biosystems Model 437A蛋白测序仪上使用厂商的标准循环进行，并使用Model 610A Data Ana lysis软件程序版本1.2.1。所有的测序试剂由Applied Biosystems提供。8个内部片段中7个的氨基酸序列列于下面，其中“X”表示氨基酸不确定。
VFQEXGAGFGQ          (SEQ ID NO：15)
LYDXVAATGLXQPI       (SEQ ID NO：16)
PLEYXDVIPQAE         (SEQ ID NO：17)
FQEGFSXVLX           (SEQ ID NO：18)
TSPTFIXMSQENVD       (SEQ ID NO：19)
LVVGAPLEVVAVXQTGR    (SEQ ID NO：20)
LDXKPXDTA            (SEQ ID NO：21)
引物设计
将一个获得的内部氨基酸序列(列于SEQ ID NO：22)随后用于设计一个完全简并的寡核苷酸引物，将其命名为p4(R)，列于SEQ IDNO：23。
FGEQFSE                      (SEQ ID NO：22)
5′-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3′(SEQ ID NO：23)
实施例4
一个犬αTM1片段的PCR克隆
犬αTM1基因的5′部分用PCR从双链的犬脾cDNA中扩增。
制备双链的犬脾cDNA
将1克来自幼犬脾的冷冻物质浸入干冰上的液氮中，在20mlRNA-Stat 60缓冲液(Tel-Test B Inc，Friendswood，TX)中匀浆。加入4ml氯仿，溶液在12,000g离心15分钟进行抽提。RNA用10ml乙醇从水相中沉淀。然后在Dynal Oligo dT Dynabeads
Figure C0182025000241
(Dynal，Oslo，Norway)上选择Poly A+RNA。将5等分物的100μg总RNA合并并用等体积的2X结合缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 7.5、1.0M LiCl、1mMEDTA、0.1％SDS)稀释。然后将RNA与Oligo dT Dynabeads
Figure C0182025000242
(所有的样品用1.0ml或5mg珠)一起温育5分钟。按照厂商推荐的程序，在用2mM EDTA、pH 7.5洗脱Poly A+mRNA前，用含有10mM Tris-HCl、pH 7.5、0.15M LiCl、1mM EDTA和0.1％SDS的缓冲液洗涤珠。然后使用洗脱的Poly A+mRNA和Boehringer Mannheim cDNA合成试剂盒，按照厂商推荐的程序，制备双链的cDNA。
部分犬αTM1 cDNA的分离
在一个标准的PCR反应中使用寡核苷酸引物5′Deg(SEQ ID NO：9)和p4(R)(SEQ ID NO：23)，使用150ng双链cDNA、500ng每种引物、200uM dNTPs、和1.5单位的Taq聚合酶(BoehringerMannheim)，在含镁的Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)中进行。将获得的产物(初次反应的1μl)加入用同样引物的第二轮反应中以增加产物数量。将此条带从1％琼脂糖凝胶中洗脱，在65℃于10mMTris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、1.5mM NaCl的缓冲液中转至Schleicher&Schuell(Keene，NH)NA45纸上。并使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照厂商推荐的程序，连接到pCRtmII载体(Invirtogen，San Diego，CA)中。连接混合物电转化至XL-1 Blue细菌(Stratagene)中。一个克隆2.7被确定含有对应于αTM1肽序列的序列，该序列在引物设计中没有使用。
测序用Applied Biosystems 373A DNA测序仪(Foster City，CA)、使用双脱氧终止循环测序试剂盒(ABI)进行，在该试剂盒中，荧光标记的dNTPs按如下方法在一个不对称的PCR反应掺入(McCabe，“用不对称PCR制备单链DNA”，《PCR方法：方法和应用指南》，Innis等(编辑)76-83页，Academic Press：New York(1990))。样品在96℃放置4分钟，然后进行下列步骤的25个循环：96℃，15秒、50℃，1秒、60℃，4分钟。包括图形和文本文件的测序数据自动下载到计算机上的样品文件中。克隆2.7的整个插入子的序列列于SEQ ID NO：24。
设法从Stratagene文库(如实施例2介绍)分离全长的犬αTM1 cDNA没有成功。以克隆2.7作为探针、使用30％甲醛的低严格条件的杂交，对约1×106噬菌斑进行筛选，没有获得阳性克隆。使用来自克隆2.7的特异性寡核苷酸或与基于保守的α亚基基元GFFKR的简并寡核苷酸(Tamura等，上文)匹配的基于其他肽片段的氨基酸序列的简并引物，设法扩增克隆2.7中显示的序列的相关下游序列，也没有成功。
实施例5
推定的犬αTM1的人同源物的克隆
为设法分离与犬αTM1同源的人序列，使用来自克隆2.7的约1kb犬αTM1片段作为探针。探针在实施例2介绍的条件下使用NT2(列于SEQID NO：25)和p4(R)(SEQ ID NO：23)引物，用PCR进行制备。
5′-GTNTTYCARGARGAYGG-3′(SEQ ID NO：25)
PCR产物用Qiagen(ChatSworth，GA)Quick Spin试剂盒按厂商推荐的程序进行纯化。纯化的DNA(200ng)用Boehinger Mannheim随机引物标记试剂盒按厂商推荐的程序，用200uCi α32P dCTP进行标记。未掺入的同位素用Sephadex
Figure C0182025000251
G25(fine)gravity色谱去除。探针在使用前用0.2N NaOH变性，并用0.4M Tris-HCl、pH 8.0中和。
制备pCDNA/Amp(Invitrogen San Diego，CA)中的人脾cDNA文库的Hybond
Figure C0182025000261
滤纸(Amersham)上菌落提呈物。滤纸先按实施例2介绍的方法变性和中和，接着在含有30％甲醛的预杂交液(8ml/滤纸)中在50℃温育2小时，并温和搅拌。将如上介绍的标记探针加入此溶液中，并与滤纸一起在42℃温育14小时。滤纸在2XSSC/0.1％SDS中在37℃洗涤两次，在2XSSC/0.1％SDS中在50℃洗涤两次，。最后的严格洗涤是在65℃、1XSSC/0.1％SDS中洗涤两次(1XSSC是150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH 7.0)，滤纸用增感屏在Kodak X-Omat AR胶片上曝光6小时。将在复制提呈物上有信号的菌落在含镁的LB培养基(LBM)/羧苄青霉素平板上划线，并在37℃温育过夜。所获得的划线菌落用Hybond
Figure C0182025000262
滤纸提呈，并将这些滤纸按上述方法进行处理。滤纸在更严格的条件下与按上述方法标记的、来自克隆2.7的1kb探针在50％的甲酰胺杂交溶液中在50℃杂交3小时。探针处理的滤纸用0.1XSSC/0.1％SDS、65℃的最终严格条件进行洗涤，并用增感屏在-80℃在Kodak X-Omat AR胶片上曝光2.5小时。鉴定阳性克隆，并在LBM/羧苄青霉素培养基中培养过夜。使用Promega Wizard
Figure C0182025000263
miniprep试剂盒按照厂商推荐的程序由培养物制备DNA，并对所获得的DNA进行测序。
初步筛选获得了18个克隆，而在更严格的杂交条件下的第二轮筛选产生了一个阳性克隆，将其命名为19A2。人αd克隆19A2的DNA序列和推导的氨基酸序列分别列于SEQ ID O：1和2。
人αd cDNA和预测的多肽的特征
克隆19A2包含成熟蛋白的全部编码区域，加上48个碱基(16个氨基酸残基)的5′上游信号序列和241个碱基的3′非翻译序列，该序列不以聚腺苷酸化的序列终止。成熟蛋白的核心分子量预计为125kD左右。其胞外结构域预计大约包含SEQ ID NO：2的17至1108氨基酸残基。该胞外结构域紧接着一段与人CD11c跨膜区域同源的约20个氨基酸区域(SEQ ID NO：2的残基1109-1128)。胞内结构域含有约30个氨基酸(大约SEQ ID NO：2的残基1129至1161)。该蛋白还含有一个与CD11a、CD11b和CD11c(Larson和Springer，上文)、αE[Shaw，et al.J.Biol.Chem.269：6016-6025(1994)]和VLA-1和VLA-2(Tamura等，上文)中共同的I(插入子)结构域同源的约202个氨基酸的区域(残基150至352左右)。其他整联蛋白中的I结构域已经证明参与ICAM结合[Landis，et al.J.Cell.Biol.  120：1519-1527(1993)；Diamond，et al.J.Cell.Biol.120：1031-1043(1993)]，这说明αd也可以与表面分子的ICAM家族的成员结合。该区域还没有证明存在于其他整联蛋白亚基。
αd的推导的氨基酸序列显示与CD11a、CD11b和CD11c的序列分别约有36％、60％和66％的同源性。图1显示了CD11b(SEQ ID NO：3)、CD11c(SEQ ID NO：4)和αd(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列比对。
β2整联蛋白α亚基的细胞内结构域通常在同一物种中也各不相同，但个别α亚基在物种间也显示高度的同源性。与这些发现一致，αd的细胞内区域明显地与CD11a、CD11b和CD11c不同，除了已经证明在所有的α整联蛋白中保守的膜亲和GFFKR氨基酸序列之外[Rojiani，et al.Biochemistry 30：98599866(1991)]。因为整联蛋白的细胞内结构域涉及“内外”信号传导和亲和性调节(Lands等，上文)，因此αd可能与和CD11a、CD11b和CD11c相互作用的不同细胞质分子相互作用，因而参与与其他β2整联蛋白不同的信号途径。
αd的细胞外结构域含有保守的与I结构域邻接的保守DGSGS氨基酸序列，在CD11b中DGSGS序列是配体相互作用所必需的金属结合区域[Michishita，et al.Cell 72：857-867(1993)]。CD11b和CD11c的三个额外的推测阳离子结合位点在αd序列中是保守的，在克隆19A2(SEQ ID NO：1)中为氨基酸465-474、518-527和592-600。其αdI结构域与CD11a、CD11b和CD11c的相应区域的同源性分别为36％、62％和57％。这个区域的低序列同源性表明，αd可能与一套与其他已知的β2整联蛋白相互作用的蛋白不同的细胞外蛋白相互作用。另外，αd对其他已知β2整联蛋白配体如ICAM-1、ICAM-2和/或ICAM-R的亲和性，可能与其他β2整联蛋白/ICAM相互作用中证明的亲和性不同(见实施例12)。
分离另外的人αd cDNA克隆用于序列证明
为证明编码人αd的DNA序列，用杂交的方法从一个pcDNA/Amp中的人脾Oligo dt-primed cDNA文库(Invitrogen)(实施例5中介绍)中分离另外的人cDNA。该文库是通过选择琼脂糖凝胶电泳上长度大于3kb的cDNA构建的。杂交所用的探针来自下面介绍的αd的5′区域。杂交条件与上述初步分离人αd克隆的条件相同。只有下面的杂交后处理有所不同，滤纸在2XSSC/0.1％SDS中在室温洗涤两次，在2XSSC/0.1％SDS在42℃洗涤一次。滤纸用Kodak X-Omat AR胶片曝光过夜。
5′αd杂交探针用PCR从19A2克隆中制备，PCR使用引物CD11c 5′For(SEQ ID NO：94)和CD11c 5′Rev(SEQ ID NO：95)在下面的条件下进行。样品在94℃放置4分钟，然后进行下列步骤的30个循环：i)94℃，15秒；ii)50℃，30秒、iii)72℃，1分钟。使用Perkin-Elmer9600热循环仪。
CD11c 5′For：(5′)CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3′)(SEQ ID NO：94)
CD11c 5′Rev：(5′)CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3′)(SEQ ID NO：95)
扩增产物使用BioRad(Hercules，CA)Prep-A-Gene试剂盒按照厂商推荐的程序进行纯化。所获得的5′αd探针为约720碱基长，对应于SEQ ID NO：1的1121-1839核苷酸区域。纯化的DNA(约50ng)用Boehinger Mannheim(Indianapolis，Indiana)随机引物标记试剂盒按厂商推荐的程序，用32PdCTP进行标记。未掺入的同位素用Centrisep
Figure C0182025000281
自旋柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)按照厂商推荐的程序去除。将标记的探针加至含有45％甲酰胺的预杂交溶液中的滤纸中，在50℃温育反应过夜。温育后，滤纸按上面的介绍进行洗涤。
13个克隆在复制提呈物上有信号。将阳性克隆从母板上挑出，在LBM和羧苄青霉素(100μg/ml)稀释，按不同的稀释度铺于Hybond
Figure C0182025000282
(Amersham)滤纸。双份膜用与初次杂交相同的溶液进行杂交，在杂交后，滤纸用2XSSC/0.1％SDS、42℃的最终严格条件进行洗涤，并在胶片上曝光。
初次鉴定的13个阳性克隆有10个在第二轮筛选中被证实。在这10个克隆中，2个克隆(命名为A7.Q和A8.Q)被测序，并确定其编码人αd。克隆A7.Q被发现长约2.5kb，包括5′前导序列、部分编码区域和额外的60个碱基的5′非翻译区。该不完全的编码区被确定是相当于SEQ ID NO：1的2152核苷酸的内含子区域错误剪接的结果。A8.Q被确定长约4kb，跨越整个αd编码区，还含有相当于SEQ ID NO：1的305碱基的内含子区域。与首次分离的αd克隆(SEQ ID NO：1)比较，有一个差异被发现，即A7.Q和A8.Q均被确定在碱基1495处有一个三碱基CAG密码子插入。克隆A7.Q和A8.Q的序列分别列于SEQID NO：96和97，由克隆A7.Q和A8.Q编辑的人序列以及相应的推导氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：98和99。
实施例6
组织中人αd表达的Northern分析
为测定αd相对表达水平和组织特异性，使用来自克隆19A2的片段作为探针进行Northern分析。将来自各人组织或培养细胞系的约10μg总RNA在存在1μg溴化乙啶的情况下上甲醛琼脂糖凝胶。在100V电泳4小时后，将RNA转移到在10XSSC中浸泡过夜的硝酸纤维膜(Schleicher&Schuell)上。将膜在真空中80℃烘烤1.5小时。用含有50％甲酰胺的3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的预杂交溶液在42℃封闭膜3小时。克隆19A2的片段使用Boehringer Mannheim随机引物试剂盒按照厂商的指示，用αP32dCTP和αP 32dTTP两者进行标记。未掺入的标记在TE缓冲液中用Sephadex
Figure C0182025000291
G25柱移去。膜按1.5×106/ml预杂交缓冲液的量用探针进行处理。然后将印迹在室温用2XSSC/0.1％SDS、在42℃用2XSSC/0.1％SDS、在50℃用2XSSC/0.1％SDS、在50℃用1XSSC/0.1％SDS、在50℃用0.5XSSC/0.1％SDS、在50℃用0.1XSSC/0.1％SDS连续洗涤。然后将印迹用胶片曝光19小时。
使用来自克隆19A2的一个BstXI片段(相当于SEQ ID NO：1中2011至3388核苷酸)的杂交揭示出：在肝、胎盘、胸腺和扁桃体总RNA中在约5kb范围内有弱信号；在肾、脑或心脏样品中没有发现信号。如用溴化乙啶染色测定的，肾样品带中存在的RNA量最少。
在使用克隆19A2的第二个片段(包含SEQ ID NO：1的碱基500至2100区域)时，在使用polyA+RNA(Clontech)的人多组织Northern(MTN)印迹中检测到两种不同大小的RNA转录物。在脾和骨骼肌中观察到约6.5kb的条带，在肺和外周血白细胞中观察到4.5kb的条带。观察到的大小上的变化可能是下列原因造成的：组织特异性的腺苷酸化、探针与其他整联蛋白家族成员的交叉反应或与可变剪接的mRNA杂交。
使用来自克隆19A2的第三个片段(跨越SEQ ID NO：1中的2000至3100核苷酸)进行的Northern分析与用其他克隆19A2片段的结果一致。
来自三种骨髓谱系细胞系的RNA也用相当于SEQ ID NO：1的核苷酸500至2100和2000至3100的片段作为探针进行了分析。预先用PMA刺激的THP-1细胞在同样的大小范围给出了扩散的信号(约5.0kb)，强度略大于组织信号。来自未刺激和DMSO刺激的HL-60细胞的RNA与αd探针杂交给出与组织样品相同强度的信号。但是，PMA似乎提高了信号强度。因为PMA和DMSO分别驱使HL-60细胞向单核/巨噬细胞和粒细胞途径分化。该结果提示，在单核/巨噬细胞类型中αd的表达增强。U937细胞表达αd信息，但此信号不因为PMA刺激而增加。在Molt、Daudi、H9、JY或Jurkat细胞中没有检测到条带。
实施例7
人αd构建体的瞬时表达
人克隆19A2缺乏一个起始甲硫氨酸密码子和可能的某些5′信号序列。因此，为制备含有19A2序列的人表达质粒，我们采用了两种策略。第一种策略，构建了两种质粒，在两种质粒中，来自编码CD11b或CD11c的基因的信号肽序列剪接到克隆19A2中，制备了一种嵌合αd序列。第二种方法，构建了第三种质粒，其中在克隆19A2的0位置加入了一个腺苷酸碱基来编码一个起始甲硫氨酸。
这三个质粒含有编码αd序列或嵌合αd序列的5′部分的不同区域。αd区域以一种特异性的3′引物BamRev(列于下面的SEQ ID NO：26)和三种5′引物的一种作为引物，用PCR(见实施例2的条件)进行扩增。三种5′引物在序列中含有：(1)在位置1-6为便于消化的相同的非特异性碱基、位置7-12的EcoRI位点、位置13-18的一个共有的Kozak序列；(2)CD11b(引物ER1B)或CD11c(引物ER1C)的部分信号序列，或一个腺苷酸(引物ER1D)；和(3)特异性地覆盖克隆19A2的5′序列的另外15-17个碱基，用于使引物退火。引物ER1B、ER1C和ER1D分别列于SEQ ID NO：27、28或29。其中起始甲硫氨酸密码子下划线，EcoRI位点下划双线。
5′-CCACTGTCAGGATGCCCGTG-3′(SEQ ID NO：26)
5′-AGTTAC
Figure C0182025000311
GCCACCATGGCTCTACGGGTGCTTCTTCTG-3′
(SEQ ID NO：27)
5′-AGTTAC
Figure C0182025000312
GCCACCATGACTCGGACTGTGCTTCTTCTG-3′
(SEQ ID NO：28)
5′-AGTTAC
Figure C0182025000313
GCCACCATGACCTTCGGCACTGTG-3′
(SEQ ID NO：29)
所获得的PCR产物用EcoRI和BamHI消化。
所有三种质粒均含有一个共同的αd区域(紧接着插入上一节介绍的5′区域的下游)，包括α克隆的3′末端。从核苷酸625延伸至克隆19A2的载体3′多接头区域的XbaI位点的第二αd区域，用BamHI和XbaI消化克隆19A2来分离。
准备连接反应，其中3′αd BamHI/XbaI片段与三种5′αdEcoRI/BamHI片段之一进行连接，使用Boehringer Mannheim连接缓冲液和T4连接酶(每反应1单位)。在14℃温育4小时后，在每个反应中加入适当数量的用EcoRI和XbaI消化的载体pcDNA.3(Invitrogen)及另外1单位的连接酶。继续反应14小时。然后用十分之一的反应混合物转化XL-1 Blue感受态细胞。培养所获得的克隆，并按实施例5分离DNA。用EcoRI消化来鉴定三个该酶切位点阳性即加工信号序列阳性的克隆。将其命名为pATM.B1(CD11b/αd，来自引物ER1B)、pATM.C10(CD11c/αd，来自引物ER1C)和pATM.D2(腺苷酸/αd，来自引物ER1d)。每个克隆中适当信号序列的存在用核酸测序来证实。
上面讨论的αd质粒的表达用每种质粒与一个CD18表达质粒--pRC.CD18共转染COS细胞来进行。作为阳性对照，COS细胞也用质粒pRC.CD18和一个CD11a表达质粒--pDC.CD11A共转染。
在转染16小时前，将细胞加入培养基(DMEM/10％FBS/penstrep)，按50％汇合装入10cm的Corning组织培养物处理的培养皿中。对以下所有的方法，用不含胰蛋白酶的Versene缓冲液(含0.5mM NaEDTA的PBS)从皿中取出细胞。在转染前，板用无血清的DMEM洗涤一次。在每个板中将15微克的每种质粒加入5ml转染缓冲液中(含有20μg/ml DEAE-Dext ran和0.5mM氯喹的DMEM)，在37C温育1.5小时后，细胞用5ml DMEM/10％DMSO休克1分钟。然后用培养基按10ml/每板取代该DMSO溶液。
所获得的转染子按实施例8、9和10介绍的方法用ELISA、FACS和免疫沉淀进行分析。
实施例8
COS转染子的ELISA分析
为确定CD18表达质粒pRC.CD18和αd表达质粒共转染的COS细胞是否在其细胞表面表达与CD18结合的αd，使用针对CD18产生的第一抗体(例如由ATCC HB203纯化的TS1/18)进行PCR。作为阳性对照，也对共转染了CD18表达质粒和一种CD11a表达质粒--pDC.CD11A的细胞进行ELISA。在此对照中，第一抗体包括CD18抗体和抗CD11a抗体(例如，由ATCC HB202纯化的TS1/18)。
为进行ELISA，来自每个板的细胞用Versene缓冲液移出，并转入一个单独的96孔平底的Corning组织培养板。在试验前将细胞在培养基中温育2天。然后将板按150μl/孔用D-PBS/0.5％硬骨鱼皮肤明胶(Sigma)溶液洗涤两次。除显色过程外，此缓冲液用于所有的步骤。所有的洗涤和温育均在室温进行。孔用明胶溶液封闭1小时，第一抗体用明胶溶液稀释至10μg/ml，然后在每孔中加入50μl。每一第一抗体做三个重复的孔。温育1小时后，板按150μl/孔用明胶溶液洗涤3次。1：3500稀释的二抗(羊抗鼠Ig/HRP-Fc特异性(Jackson，West Grove，PA))按50l/孔加入板中，并温育1小时。洗涤三次后，板用100l/孔的邻苯二胺(OPD)(Sigma)溶液(柠檬酸缓冲液中的1mg/ml OPD)显色20分钟，然后加入50μl/孔的15％硫酸。
在ELISA程序中用抗CD18特异性抗体对转染子进行分析的结果显示，在仅用编码CD18的质粒转染的细胞中相对于本底没有明显的表达。用含有CD11a和CD18的质粒共转染的细胞在用CD18特异的抗体或用CD11a特异的试剂分析时，显示比本底高的表达。进一步对编码CD18和一种αd表达构建体(pATM.C10或pATM.D12)共转染的细胞进行分析表明，CD18的表达被αd同时表达所恢复。在转染了pAIM.C10或pATM.D12的COS细胞中，检测到的CD18表达的提高可与在共转染CD11a/CD18阳性对照细胞中观察到的提高相比。
实施例9
COS转染子的FACS分析
为进行FACS分析，培养皿中的细胞在转染的第二天用新鲜的培养基饲养，并在进行试验前温育2天。转染细胞用3ml Versene从板中移取，用5ml FACS缓冲液(DMEM/2％FBS/0.2％叠氮化钠)洗涤一次，并用稀释至500,000细胞/0.1mlFACS缓冲液样品。在每个样品中加入10微升1mg/ml FITC偶联的CD18、CD11a或CD11b特异的抗体(Becton Dickinson)或800μg/ml的CFSE偶联的鼠23F2G(抗-CD18)(ATCC HB11081)。然后将样品在冰上温育45分钟，用FACS缓冲液按每次5ml洗涤3次。并重新悬浮于0.2ml FACS缓冲液中。然后将样品上Becton Dickinson FACscan，并用Lysys II软件(BectonDickinson)分析数据。
CD18序列转染的COS细胞仅不对CD18、CD11a或CD11b染色。用CD11a/CD18共转染时，大约15％的细胞被针对CD11a或CD18的抗体染色。所有转染了CD18和任何一种αd构建体的细胞不会产生对CD11a和CD11b可以检测到的染色。pATM.B1、pATM.C10和pATM.D12组能对CD18分别染出4％、13％和8％的阳性。CD11a/CD18组中的阳性群体的荧光比本底高四倍。与其相比，用αd构建体和CD18构建体共转染产生的群体显示比本底增加4-7倍的荧光强度。
实施例10
共转染的COS细胞的人αd/CD18复合物的生物素标记的免疫沉淀
设法对共转染了CD18和每种实施例7中分别介绍的αd表达质粒的细胞进行免疫沉淀，来确定αd是否能作为整联蛋白特征性的αβ异二聚体复合物的部分来分离。
转染细胞(1-3×108细胞/组)用Versene缓冲液从培养皿中移取，在50ml/组D-PBS中洗涤3次。每个样品用2mg的Sulpho-NHS生物素(Pierce，Rockford，IL)在室温标记15分钟。反应用在50ml/样品的冷D-PBS中洗涤3次进行淬灭。洗涤的细胞重新悬浮于1ml裂解缓冲液(1％NP40、50mM Tris-HCl、pH 8.0、0.2M NaCl、2mM Ca++、2mM Mg++和蛋白酶抑制剂)中，并在冰上温育15分钟。在100,000离心5分钟使不溶性物质沉淀，将上清液移入一个新管。为去除与鼠免疫球蛋白非特异性反应的物质，先进行一个预清除步骤。将25微克的鼠免疫球蛋白(Cappel，West Chester，PA)与上清液在4℃温育。2.5小时后，在每个样品中加入100μl(25μg)的兔抗鼠Ig偶联的Sepharose
Figure C0182025000341
(由蛋白A Sepharose
Figure C0182025000342
4B和兔抗鼠IgG制备，均来自Zymed，San Francisco，CA)，继续在4℃旋转温育16小时。离心从上清液中移出Sepharose珠。预清除后，随后将上清液用20μg抗CD18抗体(TS1.18)在4℃处理2小时。通过与100μl/样品的上面介绍的兔抗鼠/蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000343
制备物一起温育来从上清液中分离抗体/抗原复合物。珠用10mM HEPES、0.2M NaCl和1％Triton-X100
Figure C0182025000344
洗涤4次。将洗涤的珠沉淀，并在20μl含2％巯基乙醇的2XLaemmli样品缓冲液中煮沸10分钟。将样品离心，并上8％预先倒好的Novex聚丙烯酰胺凝胶(Novex)，用100V电泳30分钟。蛋白在TBS-T缓冲液中在200mAmps转移1小时，转移到硝酸纤维膜上(Schleicher&Schuell)。膜用1∶6000稀释的链亲和素辣根过氧化物酶(BOD)(Boehringer Mannheim)处理1小时，接着在TBS-T中洗涤3次。然后用Amersham增强化学发光试剂盒根据厂商的指示显示印迹。然后将膜在Hyperfilm MP(Amersham)上曝光0.5至2分钟。
来自用pRC.CD18与pATM.B1、pATM.C10或pATM.D12转染的细胞的CD18复合物的免疫沉淀显示了一种异二聚体的表面表达，该异二聚体含有约100kD的、与预测的CD18的大小一致的β链和对应于αd的、约150kD的α链。
实施例11
人αd在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定转染
为确定αd是否与CD18结合成异二聚体表达于细胞表面，编码每条链的cDNA都瞬时和稳定地转染到缺乏αd和CD18两者的细胞系中。
为进行这些试验，将αd cDNA用如实施例7介绍的额外的前导序列和一个Kozak共有序列扩增，并亚克隆到表达载体pcDNA3中。最后的构建体命名为pATM.D12，将其与一个修饰的编码人CD18的商业载体--pDC1.CD18共转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)-的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。质粒pDC1.CD18编码一个DHFR+标记，转染子可用适当的核苷酸缺乏的培养基进行选择，产生pDC1.CD18的修饰如下：
质粒pRC/CMV(Invitrogen)是一个带有巨细胞病毒启动子和氨苄青霉素抗性标记基因的哺乳动物表达载体。将来自质粒pSC1190-DHFR的DHFR基因插入到pRC/CMV SV40复制起始位点的5′端。此外，将来自质粒pHF2G-DHF的5′区域的多接头连接到pRC/CMV/DHFR构建体中DHFR基因的3′端。接着将CD18编码序列克隆到产生的质粒的5′侧翼多接头区域和牛生长激素poly A编码区域之间。
CD18的表面表达使用单克隆抗体TS1/18用流式细胞术进行分析。在此细胞系中检测到的αd和CD18之间的异二聚体的形成与实施例10中用COS细胞中的瞬时表达所做的免疫沉淀一致。
实施例12
人αd以CD18依赖的方式与ICAM-R结合
借鉴证明能介导细胞细胞接触的白细胞整联蛋白与细胞间粘附分子(ICAMs)的相互作用的报道[Hynes，Cell 69：11-25(1992)]，CHO细胞表达的αd/CD18与ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1结合的能力用两种方法进行评价。
在同样的试验中，将可溶性的ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1IgG1融合蛋白固定化在塑料上，并测定αd/CD18 CHO转染细胞与固定化的配体结合的能力。转染细胞用calcein内部标记，用结合缓冲液(含1％BSA的RPMI)洗涤，并仅在缓冲液(含有或不含10ng/ml的PMA)或含有10μg/ml的抗CD18单克隆抗体的缓冲液中温育。将转染细胞加入用可溶性的ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白预先包被的96孔Immulon
Figure C0182025000351
4微滴定板中，或以牛血清白蛋白包被作为阴性对照。这些粘附分子的可溶性形式的设计已在共同提交和共同拥有的1993年8月5日提交的系列号为No.08/102,852的美国专利申请中介绍和充分公开。在加入标记的细胞前，孔用含1％BSA的PBS封闭。将板浸入含0.1％BSA的PBS中20分钟进行洗涤后，使用Cytofluor
Figure C0182025000352
2300(Millipore，Milford，MA)测量每孔中剩余的总荧光。
在使用固定化的ICAMs的试验中，αd/CD18共转染的细胞都显示比BSA包被的孔增加3-5倍的与ICAM-R/IgG1孔的结合。这种结合的特异性和CD18依赖性用抗CD18抗体TS1/18的抑制作用进行证明。CD11a/CD18转染的细胞与ICAM-1/IgG1孔的结合与观察到的其与BSA包被的孔的结合相当，CD11a/CD18转染细胞仅在用PMA预先处理后才显示与ICAM-1/IgG1孔的结合有2-3倍的提高，αd/CD18转染的细胞用PMA处理不影响其与ICAM-1/IgG1孔的结合。没有检测到αd/CD18转染细胞与VCAM-1/IgG1孔的结合。
αd/CD18转染细胞与可溶性的ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白的结合用流式细胞术进行测定。在每个测量中，将约1百万αd/CD18转染CHO细胞(生长于摇瓶中进行高表达)悬浮于含有或不含10μg/ml抗CD18抗体的100μl结合缓冲液(RPMI和1％BSA)中。在室温温育20分钟后，细胞在结合缓冲液中洗涤，并加入ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1融合蛋白至终浓度5μg/ml。结合在37℃进行30分钟，然后将细胞洗涤3次，并重新悬浮于100μl含1∶100稀释的FITC偶联的羊抗人IgG1的结合缓冲液。温育30分钟后，将样品洗涤3次，并悬浮于200μl结合缓冲液，用BectonDickinson FACScan进行分析。
约40-50％的αd/CD18转染细胞显示与ICAM-R/IgG1结合，但不与ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1蛋白结合。用PMA预先处理转染细胞不影响其与ICAM-1/IgG1、ICAM-1/IgG1或VCAM-1/IgG1的结合，这与固定化粘附试验一致。与ICAM-R的结合在用抗CD18抗体TS1/18处理αd/CD18转染细胞后降低到本底水平。
由这些双结合测定收集的数据说明，αd/CD18与ICAM-R结合，并且与ICAM-1和VCAM-1的结合相比更优先。αd/CD18与ICAM-R的结合比与ICAM-1的结合更优先，与用CD11a/CD18和CD11b/CD18观察到的结果相反。因此，αd/CD18结合的修饰有希望选择性地影响ICAM-R起主要作用的正常和病理的免疫功能。而且，在检测针对ICAM-R的不同胞外结构域的免疫特异性抗体抑制ICAM-R与αd/CD18转染细胞结合的能力的相似试验中，结果表明，αd/CD18和CD11a/CD18与ICAM-R的不同结构域相互作用。
CD11a/CD18不能与溶液中的ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1结合说明，CD11a/CD18与ICAM1或ICAM-R之间的结合亲和性太低，不能在溶液中结合。而检测到αd/CD18与ICAM-R/IgG1的结合则表明非常高的结合亲和性。
在上述介绍的试验中，VCAM-1/Ig融合蛋白含有7个细胞外免疫球蛋白样结构域。融合蛋白在转染的CHO细胞中制备，蛋白产量用ELISA测定。来自CHO细胞上清液的7结构域VCAM-1融合蛋白不经纯化直接使用，蛋白产量被发现极低。由于VCAM-1制备物中的低蛋白产量，使用一种商业化的VCAM-1制备物(R&Sys tems，Minneapolis，MN)来重新检测αd/CD18与VCAM-1的结合，以确定是否是低浓度的VCAM-1导致了没有检测到αd的结合。
与前面一样，CHO细胞表达的αd和CD18用于采用固定化的重组粘附分子的粘附试验中。使用流式细胞术，结果显示，αd转染的CHO细胞表达αd和CD18两者，并且不表达其他β2整联蛋白。同时还发现，转染的CHO细胞不表达两种已知的VCAM-1结合的配体蛋白--α4β1和α4β7。亲本CHO细胞系显示不表达α4或β2整联蛋白。结合测定基本上按上面的介绍进行。
结果表明，αd转染的CHO细胞与固定化的VCAM-1以约14.2％的比例结合，与之比较，其与固定化的BSA以7.5％的比例结合，与固定化的E-选择素以2.8％的比例结合。此外，在存在针对VCAM-1的第一个结构域的单克隆抗体时，与固定化VCAM-1的结合基本上被阻断(3.0％结合)。亲本CHO细胞不与VCAM-1、E-选择素或BSA结合(结合比例均低与2％)。转染的CHO细胞的结合经过细胞的系列传代后也会降低，这与经过同一时间后观察到的αd表面表达降低相一致。
为确定自然表达αd/CD18的细胞是否以VCAM-1作为结合配偶体，分离外周血的嗜酸性粒细胞，在存在10ng/ml IL-5的条件下培养5-7天以提高αd的表达。流式细胞术检测显示，IL-5使αd的表达提高2-4倍，但对α4的表达没有作用。
结果表明，培养的嗜酸性粒细胞与固定化的VCAM-1以28.8％的比例结合，并且结合被一种抗CD18单克隆抗体(结合率为17.1％)和一种针对α4的单克隆抗体(结合率为18.1％)部分抑制。与前面用低水平和/或不纯的VCAM-1的初步结果相反，这些数据表明αdβ2是VCAM-1的一种配体。
上面介绍的FACS粘附试验被用来检测一种ICAM-R突变体E37A/Ig与表达αd/CD18的CHO细胞的结合。E37A/Ig已经显示排除了与LFA-1/Ig嵌合体结合(Sadhu等《细胞粘附与通信》2卷，429-440页(1994))。来自稳定转染的CHO细胞系的突变蛋白以可溶性形式表达，并按Sadhu等，上文的介绍，用Prosep
Figure C0182025000381
A柱纯化。
在重复的试验中，没有检测到E37A/Ig与αd/CD18转染细胞结合。用FITC偶联的抗人抗体检测到的E37A/Ig嵌合体的平均荧光强度(MFI)与单独的检测抗体的MFI相同，这说明，在试验中使用E37A/Ig没有检测到比本底高的信号。与此类似，在按实施例14的介绍进行的ELISA中，E37A/Ig突变体没有表现出与固定化的αd/CD18偶联。αd与iC3b结合
补体成分C3可以被蛋白酶切割形成复合物iC3b，iC3b启动补体激活的替代途径，最终导致靶的细胞介导的破坏。CD11b和CD11c都参与iC3b结合，并参与随后的iC3b包被的颗粒的巨噬细胞吞噬。CD11bI结构域中的一个肽片段最近已经证实是iC3b相互作用的位点[Ueda，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)91：10680-10684(1994)]。iC3b的结合区域在CD11b、CD11c和αd高度保守，这提示了一种αd/iC3b结合相互作用。
αd与iC3b的结合用转染细胞或天然表达αd的细胞系(例如，PMA刺激的HL60细胞)与iC3b包被的绵羊红细胞(sRBC)在一个玫瑰花环试验中进行。[Dana，et al.J.Clin.Invest.73：153-159(1984)]。αd/CD18 CHO转染细胞、VLA4-CHO转染细胞(阴性对照)和PMA刺激的HL60细胞(阳性对照)在存在和没有抗CD18单克隆抗体(例如TS1/18.1)的情况下形成玫瑰花环的能力进行了比较。
实施例13
使用闪烁亲近测定筛选来鉴定αd结合的调节剂
本发明的αd配体与其结合配偶体(αd配体/抗αd配体对)之间的结合的特异性抑制物，可以用多种方法来确定，例如主要介绍于美国专利No.4,271,139、Hart和Greenwald，Mol.Immunol.12：265267(1979)，and Hart and Greenwald，J.Nuc.Med.20：1062-1065(1979)的闪烁亲近测定技术。上述文献均在此引为参考。
简而言之，将αd配体/抗αd配体对的一个成员直接或间接结合在一个固相支持物上。间接捕获涉及一种直接与支持物结合的单克隆抗体，该抗体能识别可溶性的整联蛋白β链蛋白的C末端的一个特异性表位。该表位可以是血凝素蛋白或分枝杆菌III9表位[Anderson，etal.J.Immunol.141：607-613(1988)]。一种荧光试剂也与支持物结合。另外，荧光试剂可按美国专利No.4,568,649的介绍整合到支持物中，该专利在此引为参考。αd配体/抗αd配体对的非支持物结合成员用放射性化合物标记，该放射性化合物发射能激发荧光试剂的射线。当配体与放射性标记的抗配体结合时，标记物与支持物结合的荧光试剂足够接近，激发荧光试剂，并产生光发射。当没有结合时，标记物一般与固相支持物太远而不能激发荧光试剂，光发射很弱。测量发射的光，该发射光与配体和抗体配体的结合相关。在样品中加入结合抑制物将减少荧光发射，因为抑制物阻止放射性标记被固相支持物捕获到近处。因此，结合抑制物可以通过它们对样品中的荧光发射的影响来进行鉴定。潜在的αd的抗配体也可以用相似的方法进行鉴定。
按如下方法使用可溶性的重组αd/CD18亮氨酸拉链结构(见实施例14)在闪烁亲近测定中筛选CAM结合的调节剂。将重组整联蛋白用预先包被在一个闪烁剂包埋板上的非阻断性抗α亚基或抗β亚基抗体固定化。在板中同时加入化学文库化合物和一种特异性的生物素标记的CAM/Ig嵌合体。CAM/Ig嵌合体的结合用标记的链亲和素进行检测。在此试验中，ICAM-1/Ig和ICAM-R/Ig用NHS-Sulfo-生物素LC(长链，Pierce)按照厂商推荐的程序进行生物素标记。标记蛋白在ELISA反应中，在用链亲和素-HRP并接着用OPD显色进行检测时，仍能与CAM特异性抗体反应，并能显示与固定化的LFA-1反应。
另外，将重组亮氨酸拉链蛋白纯化或部分纯化，直接包被在闪烁包埋板上。同时加入未标记的CAM/Ig嵌合体和化学文库化合物。结合的CAM/Ig用125I标记的抗人Ig进行检测。
另一种选择是，将纯化的CAM/Ig蛋白固定化在闪烁板上。在板中加入化学文库化合物和表达重组亮氨酸拉链整联蛋白的细胞的浓缩上清液。重组整联蛋白的结合用一种标记的、非阻断性抗α亚基或抗β亚基抗体进行检测。
筛选小分子的调节剂
作为闪烁亲近测定的一种替代，相同的αd结合配偶体和抑制剂可以用下面介绍的ELISA样试验来鉴定。
可溶性的αd/CD18亮氨酸拉链(LZ)结构(见实施例14)用抗αd抗体212D(见实施例15)从组织培养上清液中捕获。212D抗体用碳酸氢盐包被缓冲液(pH9.5)在4℃过夜固定于96孔Immulon
Figure C0182025000401
IV板(Costar)。同样的方法也用于固定化抗CD11a抗体TS2/4.1，用来固定化一种LFA-1亮氨酸拉链(LFA-1LZ)融合蛋白，LFA-1在试验VCAM-1结合时用作阴性对照，在试验ICAM-1结合时用作阳性对照。板用300μl/孔的3％牛血清白蛋白封闭1小时，并用D-PBS洗涤。按100μl/孔加入表达αd/CD18LZ或LFA-1LZ的稳定CHO转染细胞的组织培养上清液，并在4℃温育6-8小时。板用含Tween
Figure C0182025000402
20的Tris缓冲盐溶液(TBS-T)洗涤两次，接着用含有2mM的每种氯化钙、氯化镁和氯化锰的TBS(不含Tween
Figure C0182025000403
)洗涤一次。后者在剩下的试验中用作试验和洗涤缓冲液。
在捕获整联蛋白后，板用250μl/孔的TBS洗涤三次。将纯化的CAM/Ig(见实施例12)从起始浓度10至20μg/ml经过系列的2∶3稀释后加入每孔中。与CAM/Igs在室温结合2小时后，板按前述方法进行洗涤。结合的融合蛋白用辣根过氧化物酶偶联的羊抗人Ig抗体(Jackson Labs)进行检测，并接着用邻苯二胺(OPD)进行显色。
结果显示，ICAM-1/Ig与LFA-1LZ偶联时，信号增加5至7倍，但不与αd/CD18LZ偶联。相反，VCAM-1/Ig在含有αd/CD18LZ的孔中显示比本底高5倍的信号。一种ICAM-R突变体E37A/Ig(见实施例12)不与两种整联蛋白偶联。
检测了αd特异性单克隆抗体212D、217L、217I、217H、217G、217K和217M抑制VCAM-1与固定化的αd/CD18偶联的能力。此外，使用抗VCAM-1单克隆抗体130K、130P和IG11B1(Caltag)来确定反应的特异性。抗αd单克隆抗体的使用浓度为5μg/ml，抗VCAM-1抗体的使用浓度是25μg/ml，考虑到本试验系统中的VCAM-1处于溶液中，因此使用较高的抗VCAM-1抗体浓度。
在用217I或130K与130P一起处理的孔中产生了部分阻断(50％)。130K/130P的组合还完全抑制了VLA-4与VCAM-1的相互反应，这说明αd和VLA-4与VCAM-1的不同位点结合，并有可能发展选择性地干预αd/VCAM-1结合的拮抗剂。
本试验可按如下所述来进行高通量的筛选测定，筛选αd结合的抑制物。将VCAM-1/Ig生物素化并按上述方法在存在预先溶于DMSO中的混合化合物时进行使用，然后用一种链亲和素-铕(Eu)复合物检测结合的VCAM-1/Ig。链亲和素-Eu复合物螯合后被激活，产生可以测量的光发射。光发射的改变，或更具体的说降低，就表明VCAM-1/αd结合的抑制，这很可能是小分子混合物中的一种或多种化合物作用的结果，然后就可以对它们进行单独分析或分成小的组别进行分析。
实施例14
可溶性人αd表达构建体
全长、可溶的人αd/CD18异二聚体蛋白的表达能方便地为免疫和结合测定提供纯化的材料。制备可溶性蛋白的优势在于其能够从上清液中而不是从细胞裂解物中纯化(如用全长的膜结合αd/CD18)，此时，收率提高且杂质减少。
可溶性αd表达质粒按如下进行构建。克隆在质粒pATM.D12中的、相当于SEQ ID NO：1中的0-3161碱基区域的核苷酸片段，用HindIII和AatII消化的方法进行分离。使用分别列于SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：31的引物sHAD.5和sHAD.3从质粒pATM.D12扩增了一个相当于SEQID NO：1的碱基3130-3390的、与HindIII/AatII片段重叠并在3′末端含有一个额外的MluI限制位点的PCR片段。
5′-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3′(SEQ ID NO：30)
5′-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3′
(SEQ ID NO：31)
PCR产物用AatII和MluI消化，并与HindIII/AatII片段连接。所获得的产物连接到HindIII/MluI消化的质粒pDC1.s中。
将该构建体与CD18在稳定转染的CHO细胞中共表达，表达用来自35S-甲硫氨酸标记的细胞中免疫沉淀的CD18复合物的放射性自显影来检测。同时还将该构建体与CD18在293细胞中共表达[Berman，et al.J.Cell.Biochem.52：183-195(1993)]。
可溶性全长αd构建体
本发明还包括其他的αd表达构建体，为便于表达和纯化一种完整的αd/CD18异二聚体，可溶性αd和CD18表达质粒被构建为包括一种“亮氨酸拉链”融合序列，该序列使异二聚体在纯化过程中稳定[Chang，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，91：11408-11412(1994)]。简而言之，编码拉链的酸性和碱性氨基酸链的DNA用Chang等介绍的寡核苷酸进行引物退火来制备。该DNA序列被进一步修饰来分别在5′和3′末端包括额外的MluI和XbaI限制位点，使该DNA序列便于亚克隆到前面所述的αd或CD18表达构建体中。此外，在XbaI位点后面加入代表血凝素蛋白或一个聚组氨酸序列的序列以及一个终止密码子。整合血凝素或聚组氨酸是为了便于表达蛋白的纯化。编码拉链的碱性链的序列整合到表达CD18的质粒载体上，酸性链插入到αd链结构上。修饰的αd和CD18蛋白在宿主细胞中表达时，推测拉链结构的酸性链和碱性链之间的相互作用将使异二聚体稳定，并使完整的αd/CD18分子能够用上面介绍的亲和纯化进行分离。
构建带有酸性和碱性“亮氨酸拉链”序列的表达可溶性的αd和CD18的质粒，按照实施例7介绍的DEAE/Dextran方法转染COS细胞。所获得的蛋白被称为“αd/CD18LZ”。血凝素和聚组氨酸标记没有整合到αd/CD18LZ中。转染细胞在还原血清(2％)条件下生长14天。用实施例8介绍的ELISA方法每隔5天从转染细胞中收集上清液检测蛋白的产生。简而言之，将αd/CD18LZ固定化在用抗αd单克隆抗体169B(见实施例15)包被的板上。加入生物素化抗CD18单克隆抗体TS1/18.1(见实施例8)，接着加入链亲和素/辣根过氧化物酶(HRP)偶联物和邻苯二胺(OPD)，检测αd/CD18LZ复合物。上清液中的蛋白可清楚地检出。
使用可溶性全长αd表达产物的结合测定
使用上面介绍的可溶性全长αd/CD18LZ异二聚体的功能性结合测定通过将异二聚体固定化在单克隆抗体169B或一种非阻断性抗CD18单克隆抗体(见实施例15)包被的板上来进行。孔在加入起始浓度为10μg/ml的CAM/Ig嵌合体前(见实施例12)用鱼皮明胶封闭以防止非特异性结合。嵌合体与αd/CD18的结合用羊抗人Ig HRP偶联物(Jackson Labs)进行检测，并接着用OPD显色。
VCAM-1/Ig被观察到与捕获的αd/CD18LZ的结合比与捕获的CD11a/CD18高3-5倍。ICAM-1/Ig和ICAM-2/Ig与可溶性的CD11a/CD18异二聚体的结合比本底分别高大约15和10倍，但不与αd/CD18结合。VCAM-1的结合在存在VCAM-1特异性抗体130K和130P联用时减低大约50％。
使用固定化在96孔板上的ICAM/Ig蛋白并随后加入细胞上清液中的重组可溶性整联蛋白也进行了结合测定。可溶性整联蛋白的结合用非标记的非阻断性α和β亚基特异的鼠抗体，接着与HRP偶联的羊抗鼠抗体温育，并用OPD显色，进行检测。
结果显示，非阻断性抗体检测到的αd/CD18LZ与ICAM-R/Ig的结合，比在不含抗体的对照孔中检测到的结合，高10倍。没有检测到可溶性αd/CD18与固定化的ICAM-1/Ig的结合，但在αd/CD18与固定化的CD11b/CD18和CD11a/CD18之间观察到的结合，分别比本底结合高15和5倍。
因为以前的研究已经证明，CD11b和CD11c与脂多糖(LPS)结合[Wright，Curr.Opin.Immunol.3：83-90(1991)；IngaLLs andGolenbock，J.Exp.Med.181：1473-1479(1995)]，LPS与αd/CD18的结合也用流式细胞术和板基测定进行了评价。结果表明，从明尼苏达沙门氏菌和伤寒沙门氏菌分离的FITC标记的LPS(均获自Sigma)在20μg/ml时能够微弱地与αd/CD18转染的CHO细胞结合。在未转染的对照CHO细胞中没有发现结合。在ELISA型试验中，生物素化的LPS[Luk，et al.Alan.Biochem.232：217-224(1995)]在0.5-3.0μg时结合所获得的αd/CD18LZ信号比单独的捕获抗体和阻断试剂高4倍。LPS与CD11a/CD18的表观结合在排除了每个试验本底与抗CD11a抗体TS2/4结合后降低。
为鉴定αd/CD18的其他配体，在一个两层次研究中使用了重组αd/CD18LZ蛋白。不同细胞类型与固定化蛋白的结合用来确定何种细胞在细胞表面表达αd配体。然后用抗体抑制来确定所观察到的细胞结合是否是已知的表面粘附分子引起的。如果没有抑制结果，使用αd/CD18LZ与来自能与αd结合的细胞的裂解物蛋白的免疫共沉淀来设法鉴定配体。
可溶性人αd I结构域表达构建体
已经有报道CD11a中的I结构域能作为一个独立的结构单位进行表达，并能保持其配体结合能力和抗体识别特性[Randi and Hogg，J.Biol.Chem.269：12395-12398(1994)；Zhout，et al.J.Biol.Chem.269：17075-17079(1994)；Michishita，et al.Cell 72：857867(1993)]。为制备一种包含αd I结构域和人IgG4的可溶性融合蛋白，用PCR扩增αd I结构域，使用设计在侧翼添加BamHI和XhoI限制位点以便于亚克隆的引物。引物列于SEQ ID NO：32和33，并在酶切位点下划线。
5′-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3′
(SEQ ID NO：32)
5′-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3′
(SEQ ID NO：33)
SEQ ID NO：32中紧接着BamHI位点3′端的C核苷酸相当于SEQ ID NO：1的435核苷酸，SEQ IN NO：33中紧接着XhoI位点3′端的G核苷酸互补于SEQ ID NO：1中的1067核苷酸。扩增的I结构域用适当的酶消化，将纯化的片段连接到哺乳动物表达载体pDCs和原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)，并对I结构域序列进行测序。然后用合适的表达构建体转染或转化的COS、CHO或大肠杆菌细胞表达融合蛋白。
已知αd对ICAM-R具有亲和性，αd I结构域的表达可能具有足够的亲和性来用作αd参与的细胞粘附的抑制剂。
人αd I结构域/IgG4融合蛋白的分析
蛋白质用在还原和非还原条件下SDS-PAGE进行分析，并用银染或考马斯染色进行显示。然后将蛋白转移到Immobilon PVDF膜上，并用抗人IgG单克隆抗体或抗牛Ig单克隆抗体进行Western印迹分析。
检测到的蛋白被测定在非还原条件下以约120kD迁移，在还原条件下以45kD迁移。在非还原条件下还检测到次要带，它能够与抗人抗体反应但不与抗牛抗体反应。一个200kD的次要带被Western印迹确定为牛Ig。
使用I结构域表达产物的结合测定
在一个ELISA试验中检测了I结构域特异性识别ICAM-R/IgG嵌合蛋白的能力。在TBS中系列稀释的αdI结构域IgG4融合蛋白(Iαd/IgG4)与固定化于ImmulonIV RIA/EIA板的ICAM-1/IgG、ICAM-R/IgG、VCAM-1/IgG或一种无关的IgG1骨髓瘤蛋白一起温育。CD11a I结构域/IgG嵌合蛋白和人IgG4/K骨髓瘤蛋白用作阴性对照。结合的IgG4用生物素化的抗IgG4单克隆抗体HP6023，并接着加入链亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，用底物邻苯二胺显色，进行检测。
在重复的试验中，用任何一种固定化蛋白没有检测到CD11a/IgG4蛋白或IgG4骨髓瘤蛋白的结合。Iαd/CIgG4蛋白不与鱼皮明胶或牛血清白蛋白封闭试剂、人IgG1或ICAM-1/IgG结合。使用1-5μg/ml浓度的Iαd/IgG4蛋白在ICAM-R/IgG蛋白包被的孔中检测到了比本底高2-3倍的结合信号。VCAM-1/IgG蛋白包被的孔中的信号比本底高7-10倍。在前面的试验中，αd/CD18转染的CHO细胞不能结合VCAM-1/IgG蛋白，这表明VCAM-1结合可能是分离的I结构域氨基酸序列的特征。
另外的αdI结构域构建体
另外的αdI结构域构建体用与前面的构建体相同的方式制备，但围绕αdI结构域整合更多的氨基酸。具体构建体包括：i)来自外显子5(SEQ ID NO：2的127-353氨基酸)，在当前构建体的前面；ii)在I结构域之后的EF手性重复(SEQ ID NO：2的17-603氨基酸)；iii)在转膜区域截短的α链(SEQ ID NO：2的17-1029氨基酸)，带有一个用于纯化和检测的IgG4尾巴。将这些构建体连接到哺乳动物表达载体pDCS1或原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)中，并对I结构域测序。然后在用适当表达构建体转化或转染的COS、CHO或大肠杆菌细胞中表达融合蛋白。蛋白用ProSepA(Bioprocessing Limited，Durham，England)柱进行纯化，并用抗IgG4单克隆抗体HP6023检测反应性，在聚丙烯酰胺凝胶上用考马斯染色进行显示。
为构建用于表达完整的αd多肽的表达质粒，按下面的方法对上文介绍的pATM.D12进行修饰来表达一种αd-IgG4融合蛋白。编码IgG4的DNA用PCR的方法从载体pDCS1中分离，使用分别整合了5′AatII限制位点(SEQ ID NO：89)和3′XbaI限制位点(SEQ ID NO：90)的引物。
5′-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3′(SEQ ID NO：89)
5′-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3′(SEQ ID NO：90)
质粒pATM.D12用AatII和XbaI消化，并将适当消化和纯化的IgG4PCR产物连接到一个线性的载体中。
实施例15
制备人αd特异的单克隆抗体
1.将来自实施例7的瞬时转染细胞在Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(D-PBS)中洗涤三次，按5×106细胞/鼠与50μg/鼠的胞壁酰二肽(Sigma)一起注射到Balb/c小鼠中。小鼠用同一方式间隔2周再注射两次。小鼠的放血前和免疫血清用实施例9介绍的方法进行筛选，将与表达αd/CD18的转染细胞有最高反应的小鼠的脾脏融合。然后分别筛选缺乏与CD11a/CD18转染的COS细胞反应的细胞和筛选与αd表达质粒和CD18共转染的细胞反应的杂交瘤上清液。
用此方法没有获得单克隆抗体。
2.另一种制备单克隆抗体的方法是，从稳定转染的CHO细胞的上清液中亲和纯化可溶性的αd I结构域/IgG4融合蛋白，并按上述方法免疫Balb/c小鼠。建立杂交瘤，并用ELISA筛选能与αd I结构域融合蛋白反应的来自这些杂交瘤的上清液。然后分析阳性培养物与CHO转染细胞上表达的全长αd/CD18复合物的反应性。
小鼠1908接受三次αd/CD18转染的CHO细胞的初次免疫和两次可溶性αd/CD18异二聚体的加强免疫。最后两次免疫包括50μg/鼠的αd I结构域/IgG4融合蛋白。融合产生了270个产生IgG的孔。45个孔的上清液在ELISA中显示与Iαd/IgG4融合蛋白的结合比与人IgG4的结合至少高7倍。FACS分析确定，没有上清液能与αd/CD18转染的CHO细胞反应。
为确定上清液是否能在另一种环境下识别整联蛋白α亚基，新鲜的冷冻脾切片用45孔中的24孔上清液进行染色，三个上清液被确定为阳性。一个染上了红髓中的大量细胞，而另外两个染上了红髓及小梁中的分散细胞。
进一步分析了这些上清液免疫沉淀来自αd/CD18转染的CHO细胞或PMA刺激的HL60细胞的生物素化CD18的能力。选择其上清液能识别去污剂裂解物中的蛋白(这种蛋白结构上不局限于以异二聚体形式表达的蛋白)的融合孔进行进一步的亚克隆。能识别去污剂中蛋白的单克隆抗体可能在免疫沉淀来自转染细胞、组织和细胞系的异二聚体复合物时更有用。
3.另一种制备单克隆抗体的替代方法是，CD18复合物用抗CD18单克隆抗体23F2G在预先清除了CD11a/CD18(使用单克隆抗体TS2/4)和CD11b/CD18(用单克隆抗体Mo-1)后从人脾裂解物中免疫沉淀。5只10-12周龄的Balb/c小鼠用皮下注射的方法用约30μg在弗氏完全佐剂中的所获蛋白在第0天进行免疫，接着在第28和第43天按30μg/鼠并用弗氏不完全佐剂进行两次加强免疫。在最后一次加强免疫后10天抽取试验血清。在Western印迹中用1∶500稀释的每种血清检测1μg/条免疫原的方法对反应性进行评价。来自三只小鼠的血清能检测到约95和150kD的带，在用1∶50稀释的免疫前血清处理的条中没有发现信号。推测150kD代表一种体内糖基化状态的αd。此外，所有经过免疫的血清都能免疫沉淀来自生物素化αd/CD18CHO细胞的裂解物的蛋白，这种蛋白在SDS-PAGE上以适当的分子量迁移，并代表异二聚体。由这些结果，选择小鼠#2212，在64天用PBS中的30μg免疫原，使用腹膜内注射的方法，进一步免疫。在4天后处死小鼠，无菌取出脾脏。
将脾脏在浸没在补加有2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清RPMI 1640中的两个显微镜载玻片的磨沙端研磨，形成单个细胞的悬液(RPMI)(Gibco，Canada)。细胞悬液滤过一个无菌的70筛Nitex细胞滤过器(Becton，Dickinson，Parsippany，New Jersey)。滤过物在200×g离心5分钟洗涤2次。所获得的沉淀重新悬浮于20ml无血清RPMI。从三只Balb/c幼鼠取出的胸腺细胞也用同样的方法进行制备。
在融合前，将在融合前三天用含10％Fetalclone血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，Utah)的RPMI维持在对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞，在200×g离心5分钟进行沉淀。用上一段介绍的方法洗涤两次，并计数。将大约2×108脾细胞与4×107NS-1细胞混合，将所获得的混合物用200×g离心沉淀。上清液弃去。敲击试管取出细胞沉淀，并在1分钟内加入2ml 75mM Hepes(pH8.0、37℃)(Boehringer Mannheim)中的50％PEG1500，并搅动。在接着的7分钟内加入另外14ml无血清RPMI，接着立即加入16ml的RPMI。所获得的混合物在200×g离心10分钟，弃去上清液。沉淀重新悬浮于200ml含有15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的RPMI，并按200μl/孔分于96孔平底组织培养板(Corning，联合王国)上。在融合后的第2、4和6天饲喂细胞，方法是用一只18G针(Becton Dickinson)从每孔中吸出约100μl，并按100μl/孔加入上面介绍的铺板培养基，但含有10单位/ml的IL-6和不含胸腺细胞外。
在融合后的第7-10天，用抗体捕获ELISA对每孔中的上清液进行筛选，检测鼠IgG的存在。ImmulonIV板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)用50μl/孔的1∶5000稀释于50mM碳酸钠缓冲液、pH9.6的羊抗鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)在4℃进行包被。板用含有0.5％Tween
Figure C0182025000482
20的PBS(PBST)洗涤三次，并加入来自每个孔的培养上清液50μl。在37℃温育30分钟后，孔用PBST按上述方法洗涤。然后在每孔中加入50μl的按1∶3500稀释于PBST的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoRsesearch，WestGrove，Pennsylvania)。板按上述方法进行温育，用PBST洗涤四次，然后加入在100mM柠檬酸、pH4.5中含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2的底物。在5分钟后加入50μl 15％的硫酸终止颜色反应。用读板机(Dynatech)确定每孔的490nm吸收。
杂交瘤进一步用下面的方法进行鉴定。来自产生IgG培养物的上清液用流式细胞术分析其与αd/CD18转化的CHO细胞而不是与JY细胞(在前面的原位染色试验中发现的，一种LFA-1阳性，但其他β2整联蛋白阴性的B细胞系)的反应性。简而言之，将5×105αd/CD18转化的CHO细胞或αd/CD18-JY细胞悬浮于50μl含有2％FBS和10mM NaN3(FACS缓冲液)的RPMI中，分别将各细胞悬液加入96孔圆底板(Corning)中的50l IgG阳性杂交瘤培养物上清液中，在冰上温育30分钟后，细胞用医用离心机沉淀洗涤两次。将每孔的上清液弃去，并将沉淀重新悬浮于200-300μl FACS缓冲液。最后一次洗涤用50μl/孔的1∶100稀释的在FACS缓冲液中制备的羊抗鼠IgG(H+L)-FITC偶联物的F(ab′)2代替。按上述方法温育后，细胞用补加了10mM NaN3的Dulbecco′s PBS(D-PBS)洗涤两次。并最后悬浮于含有1％低聚甲醛的D-PBS。然后将样品转移到聚丙烯试管中，用BectonDickinson FACsan分析仪进行流式细胞术分析(FACs)。
融合产生了四个按两种标准判断似乎是阳性的培养物。在大约4天后用扩大的上清液进行第二次重复筛选时，四个培养物中有三个保持阳性。这三个孔命名为169A、169B、169D，将这三个孔通过在15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、16mM胸腺嘧啶和10单位/ml IL-6的RPMI中两倍稀释连续克隆2至3次。克隆板上的孔在四天后目测计数，记录最少密度孔中的克隆数。每一克隆的选择孔在7-10天后用FACS进行分析。在两个培养物169A和169B中发现活性。在最后一次克隆中，含有单个克隆的阳性孔在含有11％FBS的RPMI中扩大。169A和169B克隆上清液中的抗体用IsoStrip试剂盒(Boehringer Mannheim)按照厂商指示进行分型，发现它们属于IgG1同种型。
与来自CHO转染细胞和PMA刺激的HL-60细胞的αd/CD18复合物的免疫沉淀被用作特异性的第四轮筛选。杂交瘤169A和169B能沉淀来自CHO细胞系的适当带以及来自HL-60细胞的一条单一α链类型，这个结果被SDS-PAGE所确定。杂交瘤169A和169B在1995年5月31日在美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852进行了保藏，其保藏号分别为HB11907和HB11906。
为分析169A和169B更完全的结合特性，检测了每种抗体抑制另一种抗体或抗CD18抗体TS1/18.1与可溶性αd/CD18结合的能力。可溶性全长的αd/CD18被96孔板中的每种未标记的抗体分别固定化，用生物素化抗体来检测相同或不同非标记抗体与蛋白的结合。使用一种羊抗鼠Ig/HRP偶联物并接着加入OPD底物来检测结合。结果显示，抗体169A能够阻断生物素化169A和TS1/18.1的结合，而抗体169B仅阻断其自身的结合。
4.选择另一只小鼠(#2214)，用与小鼠#2212相同的方法进行初始免疫，并在70天进行融合前的加强免疫，免疫使用PBS中的来自脾裂解物的30μg纯化αd。4天后处死小鼠，无菌取出脾脏。
阳性细胞的融合和克隆如上所述进行。融合产生了5个抗αd单克隆杂交瘤，命名为170D、170F、170E、170X和170H，使用IsoStrip试剂盒(Boehringer Mannheim)按照厂商指示进行分型，发现它们属于IgG1同种型。
5.选择另一只小鼠(#2211)，用与小鼠#2212和小鼠#2214相同的方法进行初始免疫，在88天用30μg免疫原进行加强免疫，在203天用30μg免疫原进行融合前的加强免疫。小鼠在4天后处死，按照前述的方法取出脾脏并融合。杂交瘤按照上面段落的详细介绍，通过抗体捕获ELISA和流式细胞术筛选杂交瘤上清液。
鉴定了15个阳性的杂交瘤，命名为188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R和188T，并用ELISA进行分型。简而言之，Immulon
Figure C0182025000501
4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)按50μl/孔用在50mM碳酸钠缓冲液、pH9.6按1∶5000稀释的羊抗鼠IgA、G、M(Organ Teknika)在4℃包被。板用含1％BSA的PBS在37℃封闭30分钟，用PBS/0.5％Tween20(PBST)洗涤三次，加入50μl的培养物上清液(用PBST1∶10稀释)。如前所述进行温育和洗涤后，加入50μl用含1％正常羊血清的PBST按1∶1000稀释的辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG1、G2a或G3(Zymed，SanFrancisco，California)。板按前述进行温育，用PBST洗涤四次，然后加入100μl底物，底物为含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2的100mM柠檬酸、pH4.5。在5分钟后加入50μl 15％的硫酸终止颜色反应。用读板机(Dynatech)读A490nm。所有15个抗体被确定为IgG1。
将来自小鼠#2211的剩余脾细胞在一个冷冻小管中冷冻，并贮存于液氮。将冷冻小管置于37℃水浴箱内迅速解冻，并使其以圆周方式移动，直至内容物融解。将细胞转至一个15ml离心管，同时缓慢加入1ml含有11％FBS的预热RPMI，加入过程为3至5分钟。等待5分钟后，再加入5ml预热的RPMI，试管在200×g离心5分钟，吸出上清液。将细胞重新悬浮于RPMI，按前述方法进行融合。按前述方法用抗体捕获法和流式细胞术对杂交瘤上清液进行筛选。
融合产生了5个克隆，命名为195A、195C、195D、195E和195H。用ELISA程序按前述方法对这些克隆进行分型，单克隆抗体195A、195C、195D和195E被确定为IgG1，195H被确定为IgG2a。
6.在制备抗αd单克隆抗体的另一个努力中，小鼠#2213用与小鼠2214、2211和2212同样的方法进行免疫，但在第414天和441天用与Sepharose
Figure C0182025000511
珠偶联的30μg人αd/CD18亮氨酸拉链(LZ)进行进一步的免疫。用于小鼠#2213的免疫原通过将人αd/CD18LZ(实施例14)与抗CD18单克隆抗体和蛋白A Sepharose
Figure C0182025000512
免疫沉淀来制备。沉淀的复合物按1∶1的比例重悬于PBS成为浆。在加强免疫后4天处死小鼠。取出脾脏，按前述方法进行融合。
阳性的杂交瘤用ELISA方法进行鉴定，使用用非阻断性抗CD18抗体的F(ab)′2片段固定化的人αd/CD18LZ。简而言之，F(ab)′2片段在4℃按100ng/孔包被于Immulon
Figure C0182025000513
4ELISA板。吸出缓冲液后，孔用0.5％鱼皮明胶(Sigma)在37℃封闭30分钟。在PBST中洗涤三次后，加入50μl/孔来自先前用编码可溶性αd/CD18LZ的质粒转化的CHO细胞的上清液。板在37℃温育30分钟。重复洗涤步骤，并加入50μl/孔的杂交瘤上清液。单克隆抗体的检测按前述方法进行。阳性细胞按前述方法用流式细胞术进行分析，使用用αd/CD18LZ编码DNA转化的CHO细胞，两个被命名为212A和212D的阳性杂交瘤得到鉴定。杂交瘤分泌的抗体使用前面介绍的分型ELISA分型为IgG1。
7.在另一个制备抗人αd单克隆抗体的方法中。小鼠用按前述方法制备的αd/CD18LZ Sepharose
Figure C0182025000514
珠进行免疫，每只小鼠在第0天、36天和66天接受30μg的免疫原。在用前面介绍的重组蛋白ELISA程序对小鼠血清进行筛选后，选择小鼠#2477进行融合。融合、选择和克隆程序使用上面212融合中介绍的方法进行。鉴定了7个阳性杂交瘤---217F、217G、217H、217I、217K、217L和217M，但在最后一轮克隆中杂交瘤丧失了反应性，这一点被流式细胞术确定。来自剩余6个杂交瘤系的抗体按前述方法进行分型，均被发现为IgG1。
8.在另一个制备αd单克隆抗体的方法中，小鼠#2480用小鼠#2477同样的方法进行免疫，但在第217天和218天用30μg的αd/CD18LZ经腹膜内注射进行进一步的免疫。小鼠在第221天处死，取出脾脏，并按前述方法进行融合。杂交瘤上清液按介绍的ELISA方法进行筛选，并用流式细胞术确定其与先前用编码αd/CD18的DNA转染的JY细胞的反应性。筛选过程按上面的介绍进行。融合产生了3个阳性的杂交瘤，240F、240G和240H，三种杂交瘤分泌的抗体用ELISA法均分型为IgG1。
9.为鉴定能抑制功能性αd偶联的抗体，使用可溶性αd/CD18LZ(见实施例14)进行免疫。蛋白在一种亲和层析树脂上从瞬时转染的COS细胞的上清液中分离，将树脂结合的αd用作免疫原。一只被选小鼠按上面介绍的方法进行免疫，并在初次免疫后两周给予最后的加强。用这种技术免疫可以防止经常与细胞的去污剂裂解相关的蛋白构象的可能改变。另外的小鼠用也与树脂结合的重组蛋白进行免疫，但不用从细胞裂解物中纯化的蛋白进行初次免疫。
按前述方法制备的、由免疫产生的杂交瘤细胞用ELISA在用一种非阻断性抗体的Fab片段从细胞上清液中固定化的重组蛋白上进行筛选。此外，使用流式细胞术分析其与先前用αd cDNA转染的JY细胞的反应性。
10.另一种选用方法，单克隆抗体按如下进行制备。使用来自稳定转染的CHO细胞的去污剂裂解物的亲和纯化的αd/CD18和50μg/ml胞壁酰二肽按前述方法免疫Balb/c小鼠。通过用CHO转染细胞中的生物素化复合物免疫沉淀确定其对αd/CD18的血清反应性之前，小鼠接受三次免疫。阳性动物的杂交瘤按标准程序建立。然后使用αd/CD18转染细胞用流式细胞术对杂交瘤培养物进行选择。CD11a/CD18转染细胞用作仅与CD18反应的对照。
11.另一种单克隆抗体制备的选用方法是，Balb/c小鼠接受一种免疫/免疫抑制程序，这种免疫/免疫抑制程序被设计来减少与免疫中使用的转染细胞上的CHO细胞决定子的反应。该程序包括用未转染的CHO细胞进行免疫，并接着用环磷酰胺处理来杀死与CHO细胞反应的B细胞前体。在经过三轮的免疫和环磷酰胺处理后，小鼠按前述方法用αd/CD18CHO转染细胞进行免疫。
12.另一种选用方法是，按前述的预清除方法富集来自PMA刺激的HL60细胞的去污剂裂解物的CD18复合物。其他的β2整联蛋白在同一柱上被清除。用所获得的复合物进行免疫、杂交瘤制备和筛选过程均按上文所述方法进行。
多克隆血清的制备
使用纯化的αd I结构域/IgG4嵌合体(实施例14)来在兔中制备多克隆抗血清。用弗氏完全佐剂中的αd I结构域/IgG4抗原按100μg/兔进行初次免疫，接着用弗氏不完全佐剂中的相同数量的蛋白进行三次加强免疫。在第三和第四次注射后测试待测血液。兔免疫球蛋白(Ig)在一个蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000531
柱上从血清中纯化，并在一个人IgG/Affigel10柱上预清除抗人IgG反应性。用在ELISA中与I结构域嵌合体反应但不与人IgG反应来证明完全的清除。
预清除的多克隆血清被用来从先前用αd和CD18表达载体转染的表面生物素化的CHO细胞的去污剂裂解物中免疫沉淀蛋白。免疫沉淀按前面实施例10中介绍的方法进行。预清除的血清识别一种蛋白复合物，该蛋白复合物与用抗CD18单克隆抗体TS1.18沉淀的蛋白分子量相同。此外，血清在与来自αd/CD18转染的CHO细胞的CD18复合物进行Western印迹时，识别一个适当大小的单一条带。由人脾脏亲和纯化的整联蛋白CD11a/CD18、CD11b/CD18和VLA4不被兔多克隆血清识别。流式细胞术测定发现，该血清不能与溶液中的αd转染的CHO细胞反应。因此结论是，兔多克隆血清仅能识别变性的αdI结构域/IgG4蛋白。
在一个制备抗αd/CD18多克隆抗血清的努力中，一只小鼠用αd转染的CHO细胞(D6.CHO，αd/CD18)和辅助肽免疫3次，用纯化的αd/CD18异二聚体免疫一次。最后一次加强免疫仅包括αd/CD18异二聚体。大约100μl免疫血清通过加入大约108LFA-1转染的CHO细胞在4℃预清除2小时。检测所获得的血清在1/5000、1/10000、1/20000和1/40000稀释时与正常人脾上的αd的反应性。多克隆抗体在1/20000的稀释度时具有反应性，而在1/40000时染色非常弱。
实施例16
使用抗αd单克隆抗体的流式细胞术分析
在用抗αd单克隆抗体212D、217K和217L进行的研究中使用几种原代和永生化细胞系。细胞染色按实施例7中介绍的方法进行和分析。MAGE-3(黑色素瘤相关蛋白)肽特异的原代CD8+/CD56-和CD4-/CD8-/CD56+原代细胞系对CD11b和CD11c显示强阳性，但不被任何一种αd抗体染色。MAGE-3肽特异细胞使用荷肽抗原递呈细胞(APCs，树突细胞或单核细胞)从外周血单个核细胞群中扩大。经过在限制稀释条件下重复刺激结合表型选择，产生了能够特异性地杀伤携带肽来源的天然蛋白的靶细胞的克隆化裂解细胞系。
来自外周血的树突细胞，在存在细胞因子IL-4和GM-CSF时培养7天后，能被针对CD11a、CD11b和CD11c的抗体以及217L抗αd抗体强染色。在重复的试验中，抗体217D、217K、217I、217H和217M不与这些细胞和来自不同供体的树突细胞反应。培养的第14天后，217L抗原的表面表达减弱，染色在第21天完全消失。在培养过程中，CD11b和CD11c的表达保持在高水平(比本底染色高2-3个数量级)。
实施例17
人单核细胞αd的表达
从外周血中纯化人单核细胞
从一个志愿供者抽取约300ml血加入3.8％柠檬酸钠缓冲液中(Sigma)。血液用无内毒素的PBS(Sigma)稀释至480ml，将30ml稀释的血小心分层在50ml离心管中的17ml Histopaque上。在BeckmanTabletop离心机中用1500rpm离心30分钟进行分层。代表单个核细胞的细胞层从每层中收集，并转到一个新的50ml管。用无内毒素的PBS、0.1％BSA(无内毒素)将体积增加至50ml，在Beckman Tabletop离心机中用1500rpm离心15分钟。弃去上清液，将细胞重悬于一个小体积的PBS/BSA中，随后混合。
从按上述方法获得的细胞混合群中纯化单核细胞需要第二次分层(使用Percoll[Denholm and Wolber，J.Immunol.Meth.144：247-251(1991)])。简而言之，将10ml 10X的Hanks缓冲液(Gibco)与600μ1的1N HCL混合。在此混合物中，加入60ml的Percoll(Pharmacia，Piscataway NJ)，将混合物缓慢搅拌使所有的Percoll进入溶液。将Percoll溶液的pH调为7.0，然后将8.0ml的分级混合物加入6个15ml的圆底聚丙烯试管。在每个分级中精确加入4ml细胞悬液，并将试管颠倒几次使其充分混合。分级物用一个固定角转头在室温下在1690rpm离心25分钟。单核细胞级份在分层物中显示为一层薄的白带，将其收集并转至一个新的50ml离心管中。用PBS/0.1％BSA将体积调为50ml，离心沉淀细胞。将细胞沉淀重新悬浮于小体积中，并混合，用血细胞计数器测定细胞数量。将细胞重悬于FACS缓冲液(RPI1640，0.2％FBS、0.2％叠氮化钠)中并调整为1.0×106/条件，即在每种FACS染色条件下使用1.0×106细胞，来分析不同的细胞标记。
FACS染色和分析
单抗体细胞染色使用对αd或细胞标记具有免疫特异性并与一种可用荧光检测的标记物直接偶联的抗体来进行。将鼠抗人αd抗体212D或217L按10μg/ml加入细胞，然后在冰上温育30分钟，并洗涤3次。在另外的细胞样品中加入10微升直接偶联的细胞标记CD3-FITC(Becton-Dickinson)(T细胞特异)或CD33-FITC(Becton-Dickinson)(单核细胞特异)，同时将10μl二抗--抗鼠FITC(Sigma)加入到212D和217L染色的细胞中。所有的样品在冰上在暗处温育30分钟，洗涤3次，重悬于300μl 2％的低聚甲醛中。将样品上BectonDickinson FACScan，并用Lysys II软件(Becton Dickinson)分析数据。
在第一个实验中，在用双分级法纯化的全体细胞中，单核细胞占68％，T细胞占18％。有相当数量的两种细胞类型在212D和217L进行αd染色时被染上，分别为细胞的55％和65％。基于后一个实验，在对新鲜分离的人单核细胞进行αd染色时，似乎在相对数量上存在供体与供体之间的差异，虽然分离的单核细胞总是染色阳性。当在细胞中加入人IgG(在加入第一抗体前以1mg/ml在冰上10分钟进行使用)来阻断任何可能的Fc受体结合问题时，αd染色没有改变。当这些细胞在使用Hydron包被的培养皿(Interferon Sciences)在10％FBS/RPM-1640中悬浮培养并分析αd表达时，在24小时内表面表达就有丧失，并且该减少过程持续一个7天的时间过程。相对于其他整联蛋白包括CD11a、CD11b和CD11c在新鲜分离的人单核细胞上的表达，αd染色较低。
人单核细胞的αd 2色FACS染色
为进行2色FACS染色，212D和217L抗体均用NHS-LC-生物素(Pierce)按照厂商的指示进行生物素化。在一个单独的实验中，细胞按上述方法分离，并用生物素标记的212D和217L抗体和一种生物素标记的对照IgG1抗体10μg/ml在冰上染色30分钟。细胞在FACS缓冲液(修饰为含有D-PBS、2％FBS和0.2％叠氮化钠)中洗涤三次，并重新悬浮于1.0ml的FACS缓冲液中。将10μl FITC-偶联的CD 33(单核细胞特异)和5μl链亲和素PE(PharMingen)一起加入细胞悬液中。样品于暗处在冰上温育30分钟，在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于300μl 1％低聚甲醛中。样品按上述方法进行FACS。
在两种抗体中，217L显示相比于对照明显地与CD33+细胞结合。抗体也能与这种细胞类型结合，但染色的CD33+细胞的数量明显低于在抗体217L中观察到的数量。这个结果在两个单独的实验中一致。在使用生物素化的抗体212D和217L的相关实验中，217L-生物素总是比212D-生物素染更多的细胞。
代表淋巴细胞混合物的单个核细胞和用Percoll梯度分离前获得的单核细胞也用上面介绍的2色分析进行了检测，检测采用212D和217L-生物素以及FITC偶联的对CD3(T细胞)、CD4(辅助T细胞)、CD5(胸腺细胞、成熟T细胞、B细胞亚群)、CD8(细胞毒/抑制T细胞)、CD14(单核细胞、中性粒细胞、小节树突网状细胞)、CD20(B细胞)和CD56(NK细胞、T细胞亚群)(Becton Dickinson)免疫特异性的抗体进行双染色。没有发现与这些细胞标记共表达的αd阳性细胞群。
实施例18
αd分布的分析
αd/CD18的组织分布用按实施例15介绍的方法制备的多克隆抗血清进行测定。
纯化的兔多克隆抗体在对冷冻的人脾切片进行免疫细胞化学分析时使用的浓度范围为120ng/ml到60μg/ml。将6微米厚的切片放置在Superfrost Plus玻片(VWR)上并贮存于-70℃。使用前，将载玻片从-70℃中取出，在55℃放置5分钟。然后将切片在冰冷的丙酮中固定2分钟，空气中干燥。将切片在室温在含有1％BSA、30％正常人血清和5％正常兔血清的溶液中封闭30分钟。将第一抗体加入每个切片在室温处理1小时。未结合的抗体通过在TBS缓冲液中洗涤载玻片三次去除，每次洗涤5分钟。接着，将在同一TBS缓冲液中的兔抗鼠IgG连接抗体加入到每个切片中。一种鼠碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)抗体，在室温温育30分钟，用来检测二抗。然后将载玻片在TBS缓冲液中洗涤3次。加入Fast Blue底物(Vector Labs)，显色反应通过浸入水中予以终止。载玻片在Nuclear Fast Red(Sigma)中负染，并在水中漂洗，然后用Aqua Mount(Baxter)计数。用这种试剂在脾红髓中检测到染色，但用无关的兔多克隆Ig制备物或来自同一动物的未纯化的免疫前血清没有检测到染色。
一旦鼠血清被确定具有特异性的αd活性，就用它来对不同的淋巴样或非淋巴样组织进行染色。识别CD18、CD11a、CD11b和CD11c的单克隆抗体也在同一实验中用作对照。用αd多克隆抗血清以及针对CD11c、CD11a、CD11b和CD18的单克隆抗体对正常的脾切片的染色得到了下列结果。用αd多克隆抗血清观察到的图谱不显示以CD11a、CD11b、CD11c或CD18作为标记的相同图谱。发现了某些位于白髓的边缘区的细胞的清楚标记图谱和边缘区外周的细胞的清楚标记。该图谱用其他抗体没有观察到。分散于红髓的单个细胞也被标记，它们可能是或不是与用CD11a和CD18所见的相同细胞群或亚群。
用CD11c标记的确显示了边缘区中的一些染色细胞，但与αd多克隆抗血清相比，抗体并没有显示围绕白髓的清晰环状图谱，在红髓中的标记也没有给出与αd多克隆血清相同的染色图谱。
因此，用αd多克隆血清所见的标记图谱与用针对其他β2(CD11a、CD11b、CD11c和CD18)的抗体所见的图谱相比是独特的。这说明，αd在人体内的分布不同于其他β2整联蛋白。
用单克隆抗体分析人αd表达的特性
使用杂交瘤169A和169B分泌的抗体，用免疫沉淀法分析冷冻组织切片中的人αd表达，用流式细胞术分析细胞系和外周血白细胞中人αd的表达。在两组实验中使用的杂交瘤上清液都不稀释。
组织染色
所有的染色均按上面的介绍进行，除了肝切片按下面的方法进行。在丙酮固定后，切片在含1％的H2O2和1％叠氮化钠的TBS中在室温冷却15分钟。用第一抗体染色后，加入一种直接与过氧化物酶偶联的兔抗鼠抗体，在室温处理30分钟。载玻片在TBS缓冲液中洗涤3次。用一种与过氧化物酶直接偶联的猪抗兔抗体在室温温育30分钟来检测二抗。然后将载玻片在TBS缓冲液中洗涤三次，加入AEC底物(Vector Labs)，进行显色。载玻片用Hematoxylin Gil1′s No.2(Sigma)进行负染，接着在水中漂洗，然后脱水和计数。
在脾切片中，大多数表达位于脾红髓中形态鉴定为粒细胞和巨噬细胞的细胞上。大量的粒细胞被染色，而巨噬细胞只有一个亚群产生信号。白髓中的一小部分小节树突细胞也被αd抗体微弱地染色。在整个红髓和白髓都检测到CD11a和CD18染色。CD11c染色主要见于脾白髓和围绕白髓的边缘区中的推测为巨噬细胞的大细胞，同时还发现在红髓中的分散的染色。CD11b与αd染色在红髓中的分布似乎重叠但不相同，并且没有白髓参与。
对正常和(类风湿)关节炎滑膜组织中的整联蛋白表达也进行了比较。在正常组织中用所有抗整联蛋白抗体(包括能与CD11a、CD11b、CD11c、CD18以及αd特异性免疫反应的抗体)发现了最少的染色，其中静止细胞(推测是巨噬细胞)广泛分布。在炎症的滑膜中，所有的整联蛋白的表达多位于淋巴小管周围的成簇的细胞。αd和CD11b的表达图谱是相似的，CD11c似乎表达不强，并且限于白细胞的一个亚群。
在狗中，CD11b而不是αd的表达见于肝巨噬细胞或枯否氏细胞。正常人肝切片的染色(与前面的狗肝切片染色的介绍一样，上文)证明了在人中这一染色图谱是保守的。此外，检测到了低水平的CD11c。在来自一个肝炎病人的切片中，所有白细胞整联蛋白的染色都高于在正常肝中所观察到的染色，而在这些样品中αd的表达在巨噬细胞和粒细胞上被检测到。
用抗αd抗体在人结肠切片中观察到了最少的染色，并观察到微弱的平滑肌染色和白细胞染色。在来自克隆氏病患者的切片中检测到了高水平的所有白细胞整联蛋白。
正常的肺显示了有限数量的弱αd阳性细胞，通过形态它们被确定为巨噬细胞和中性粒细胞。在一个肺气肿病人的肺组织中，在中性粒细胞和含有血铁黄蛋白(一种含铁色素)的巨噬细胞上检测到了αd染色，这说明红细胞被这些细胞吞噬。
检测了正常脑切片和来自多发性硬化(MS)病人的斑损的整联蛋白表达。在正常脑中，αd染色比CD11a、CD11b和CD11c的强度低，并局限于用形态学和CD68染色分型为小胶质细胞的细胞。CD11b阳性细胞位于小管周围，并分布于整个组织。CD11c+细胞似乎位于小管内，而αd +细胞围绕小管。在MS组织切片中，αd表达在小胶质细胞和非巨噬细胞的白细胞亚群上均被发现。αd +细胞位于斑损内以及整个皮层。αd信号的强度与CD11c相同，但低于CD11b的强度。
用抗白细胞整联蛋白和抗CAM抗体对来自PDAY(青年人的动脉粥样硬化病理生理决定子，LSU医学中心)组织样品的胸主动脉和腹主动脉切片均进行了分析。检查的病灶与主动脉脂肪性条纹一致，主动脉脂肪性条纹由大的泡沫细胞(主要是带有摄入的脂的巨噬细胞)的内膜下集聚和较小的白细胞浸润组成。使用αd和其他β2整联蛋白α链(CD11a、CD11b和CD11c)加上一个巨噬细胞标记(CD68)特异的单克隆抗体进行的单标记研究显示，多数装满脂的巨噬细胞分别表达中等水平的αd和CD18，而表达低水平或比中等水平低的CD11a和CD11c。仅微弱表达CD11b，且仅由巨噬细胞的一个亚群表达。
进行双标记研究来确定αd和ICAM-R抗原在主动脉切片中的相对定位。因为这些切片中的泡沫细胞能被对巨噬细胞标记特异的抗体Ham56染色，而不能被对平滑肌肌动蛋白特异的抗体染色，因此能够确定泡沫细胞不是由内膜平滑肌细胞衍生的。表达αd的CD68阳性的巨噬细胞被小的ICAM-R阳性白细胞包围和分开。CD68阴性但能被αd和ICAM-R抗体染色的小白细胞的数量似乎有限。
αd在正常组织中的分布似乎在静止的白细胞，其分布图谱与CD11b和CD11c的图谱重叠但不相同。CD11b和CD11c是前面已经鉴定为具有有限的白细胞分布的另外两种白细胞整联蛋白α链。细胞形态表明，αd染色大量限于巨噬细胞和粒细胞，而淋巴细胞染色有限。一般来说，组织炎症表现为增加特定组织中观察到的白细胞数量和种类，并伴随有白细胞整联蛋白包括αd染色的增加。因为在病理组织中白细胞整联蛋白的细胞和空间分布是不同的，因此可以推知，在不同的情况下，对每个家族成员包括αd存在不同的功能和配体。
有趣的是，αd在早期粥样硬化病灶中的表达显示比CD11a、CD11b和CD11c要更强，这表明αd在这些病灶的建立中可能起着核心作用。αd和ICAM-R阳性细胞的并列分布，这一点被表明αd和ICAM-R之间相互作用的证据所支持，说明αd可能在这些病灶中参与早期的白细胞的募集或激活。
细胞系和外周血白细胞染色
抗体169A和169B在FACS中能够对前髓单核细胞细胞系HL60染色。αd在这些细胞中的表面表达受到PMA刺激的负面影响，有报道说PMA刺激诱导巨噬细胞分化途径，但不被DMSO影响，DMSO诱导粒细胞分化(Collins等，《血液》70卷，1233-1244(1987))。169A和169B与PMA刺激的FACS图谱与用抗CD11b和抗CD11c单克隆抗体中所观察到的图谱相对立。一种单核细胞系THP-1也显示能被169A和169B弱染色。此外，在FACS中，外周血白细胞中淋巴细胞和单核细胞门(gates)的一个细胞亚群显示弱阳性，而B淋巴细胞被发现没有αd的表面表达。T淋巴细胞的CD8+亚群是αd +。此外，抗体169A和169B不能在下面的细胞系中检测到抗原：B细胞系JY、Ramos；嗜碱性粒细胞系KU813和T细胞系Jurkat、SKW和Molt 16。
根据HL60细胞的结果，粒细胞用ficoll/hypaque梯度离心并接着裂解红细胞的方法从外周血中分离。通过在乙酸中观察核形态，发现所有的制备物＞90％为PMNs。单独的制备物用50ng/ml的PMA或10- 8M甲酰化肽(fMLP)刺激30分钟，使可能的细胞内整联蛋白贮存释放。相对于一种IgG1对照，未刺激的群体显示低但却明显的169A和169B抗原的表达，在刺激后观察到可以察觉的提高。在PMNs中，αd和CD11c的表面表达比在HL60细胞中更相似。随后抗体169B被用来沉淀来自生物素化的PMNs的一种去污剂裂解物的异二聚体分子，该分子含有分别约150和95kD相当于αd和CD18大小的亚基。
αd在PMNs上的存在不能由已知的有关犬αd表达的信息进行预测。犬中性粒细胞不象其人对应物，它表达T辅助细胞标记CD4，还表达整联蛋白VLA-4，因此在狗中可能有与在人中不同的配体和功能。
PBL亚族的染色
本研究用来确定这种β2整联蛋白在人外周血白细胞中的分布。此外，还对αd的细胞表面密度相对于其他β2整联蛋白进行了比较。最后，还对纯化的人嗜酸性粒细胞中αd表达的急性调节进行了评价。
人外周血白细胞用密度梯度分离成单个核细胞级份(含单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞)和粒细胞(中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)[Warner，et al.J.Immunol.Meth.105：107-110(1987)]。对于某些实验，嗜酸性粒细胞用CD16免疫磁选择纯化至纯度大于95％[Hansel，et al.RImmunol.Meth.122：97-103(1989)]。皮肤肥大细胞用酶解的方法从人皮肤中分离，并按前述方法进行富集[Lawrence，et al.J.Immunol.139：3062-3069(1987)]。
细胞用适当稀释的CD11a(MHM24)、CD11b(H5A4)、CD11c(BU-15)或αd(169A)特异的单克隆抗体进行标记。还使用一种鼠对照抗体。洗涤细胞，然后与藻红蛋白偶联羊抗鼠IgG一起温育。在一些实验中，细胞与过量的鼠IgG和FITC-标记的鼠单克隆抗体或羊多克隆抗体一起温育，上述抗体特异于特定细胞(例如，CD3、CD4或CD8对T细胞特异；CD16+淋巴细胞对NK细胞特异；抗-IgE对嗜碱性粒细胞特异[Bochner，et al.J.Immunol.Meth.125：265-271(1989)]。然后用流式细胞术(Coulter EPICS图形)检测样品，使用不同的选通(gating)来鉴定细胞亚群。
为进行使用嗜酸性粒细胞的研究(在该研究中检测了αd表达的急性上调)，在用不同的单克隆抗体按前述方法进行标记前，细胞用佛波酯(10ng/ml)、RANTES(100ng/ml)[Schall，Cytokine 3：165-183(1991)]或IL-5(10ng/ml)刺激15分钟。
结果显示，αd在所有的外周血嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和NK细胞上出现。一小类(约30％)CD8+淋巴细胞也被发现表达αd。皮肤肥大细胞和CD4+淋巴细胞不表达αd。一般来说，CD11a和CD11b以比αd高的密度出现在淋巴细胞上，后者以相对低的类似于CD11c的水平表达。在白细胞中，单核细胞和CD8+细胞具有最高密度的αd，而嗜酸性粒细胞具有最低水平的αd表达。在中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和NK细胞中的表达处于中间。
用CC趋化因子RANTES刺激外周嗜酸性粒细胞没有导致任何一种β2整联蛋白表达的改变。然而用佛波酯处理在CD11b和αd的表达中产生了2至3倍的增加，但不影响CD11a或CD11c的表达。IL-5处理导致CD11b表达的选择性上调，而不影响其他整联蛋白亚基的水平。
综合起来，这些结果表明，在外周血白细胞中，αd一般以与CD11c相当的水平表达。最高的表达水平被发现于单核细胞和CD8+淋巴细胞的一个亚群。人皮肤肥大细胞不表达αd。纯化的嗜酸性粒细胞似乎具有CD11b和αd的前体的细胞质内贮存库。但IL-5相对PMA显示的不同上调说明，这些贮存库各不相同。
还使用组合的选通和表面标记用流式细胞术按前面的介绍对外周血白细胞(PBL)亚群的染色图谱进行了测定，来更精确地确定169A/B阴性的淋巴细胞群。PBL按前述方法在Ficoll上分离，并分别用169A、169B和针对CD14(单核细胞/巨噬细胞标记)、CD20(B细胞)、CD56(NK细胞)、T细胞受体α/β(T细胞)、CD16(中性粒细胞、NK细胞)和α4(中性粒细胞的一个阴性标记)的抗体染色。门用大小和标记分布来确定。
结果显示，在CD14+单核细胞门中的细胞显示低水平的169A和169B染色。在淋巴细胞门中的早期实验中观察到的双峰表达图谱用增加向前散射进行了解决。混合的TCR+/CD20+群显示具有较低但一致水平的169A/B表达，而一个对CD56有50％染色阳性、定位在略高侧向散射(细胞复杂性)的细胞群，显示具有不同的169A/B阴性群体。该阴性群体也不为TCR、CD20、CD14或CD16抗体识别。
αd的滑膜分布
为确定αd、其他β2整联蛋白及其反受体在炎症和非炎症滑膜中的细胞分布，针对不同β2整联蛋白和免疫球蛋白超基因家族的单克隆抗体被用于免疫组织学研究。在正常、骨关节炎和类风湿关节炎滑膜组织样品中的蛋白表达得到了测定。
结果显示，滑膜衬细胞层表达高水平的VCAM-1、CD11b/CD18和αd/CD18。在这些细胞中，CD11c/CD18表达受到限制，CD11a/CD18一般检测不到。在类风湿关节炎滑膜炎中，滑膜细胞层中β2整联蛋白的表达的增加与增生的程度成比例。表达CD11c的细胞比例显著增加，接近CD11b和αd的比例，但CD11a的表达没有增加。
在组织的衬下区域，CD3/CD11a/ICAM-R+淋巴细胞的集聚和扩散浸润，散布于CD68/CD11b/αd +巨噬细胞中。集聚的显著数量证明特别是在T细胞富含区域的强烈αd表达。
滑膜内皮细胞不同地表达ICAM-1和ICAM-2，极少有ICAM-R表达的证据。
综合起来，这些结果显示，滑膜巨噬细胞和巨噬细胞样的滑膜细胞组成地表达高水平的β2整联蛋白CD11b和αd。在滑膜炎中，在衬区域和衬下区域都有该亚群细胞的扩增，并伴随着CD11c表达的明显增加。类风湿滑膜T淋巴细胞的特殊群体除了表达CD11a和ICAM-R，还表达高水平的αd，后一分子已在前面显示在外周血淋巴细胞中以低水平表达。
αd在患病的肺和肝组织中的表达
将来自一个结节病个体的肺组织和来自两个硬化个体的肝组织制成6um厚的切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)载玻片上在室温中空气干燥15分钟。在使用前，载玻片在50℃温育大约5分钟。切片在室温下在冷冻的(4℃)丙酮(EM Science)中固定2分钟，并在室温下空气干燥。将切片置于100ml 1XTBS、1.1ml 30％H2O2(Sigma)、1.0NaN3(Sigma)的溶液中，在室温放置15分钟，以除去内源性的过氧化物酶活性。每个切片用150μl含有20％正常人血清(Boston Biomedica)、5％正常大鼠血清(Harlan)和2％BSA(Sigma)的1XTBS溶液在室温下封闭30分钟。温育后，轻轻地从切片上吸干溶液。第一抗体按10μg/ml的蛋白浓度在封闭溶液中制备，并在每个组织切片上加入75μl，在室温处理1小时。温育后，切片在1XTBS中洗涤三次，每次5分钟，以除去未结合的抗体。在最后一次洗涤后，吸去组织周围多余的TBS。生物素化的大鼠抗小鼠抗体(JacksonLaboratories)在封闭溶液中稀释至1∶400，并在每个切片中加入75μl，在室温处理30分钟。载玻片用1XTBS洗涤2次，每次5分钟。过氧化物酶偶联的羊抗生物素抗体(Vector Laboratories)在封闭溶液中稀释至1∶200，并在每个切片中加入75μl，室温处理30分钟。载玻片用1XTBS洗涤2次，每次洗涤5分钟。加入底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(Vector Laboratories)或二氨基联苯胺(DAB)底物(Vector Laboratories)，浸入水中使显色过程终止，载玻片在Gill′s苏木精#2(Sigma)中负染，在水中漂洗，然后用Aquamount(Baxter)或Cytoseal(VWR)进行计数。
在结节病肺中，只有217L单克隆抗体染上细胞，多数217L表位表达位于肉芽肿。肉芽肿中的巨大细胞显示为217L抗原阴性。217L表位的表达位于形态学显示为上皮组织细胞的细胞上，这种细胞是巨噬细胞系的高度分化的吞噬细胞型细胞。在结节病肺中其他整联蛋白的分布被观察到与217L表位的分布重叠，但表达图谱不同。例如，对所有其他整联蛋白免疫特异的抗体能够标记217L染色阴性的肉芽肿中的细胞以及巨大细胞。。
来自第二个被诊断为结节病的病人的切片为217L表位表达阴性。但从病理报道中看不出该病人是否接受过类固醇免疫抑制剂，这是最常见形式的治疗。
在来自硬化的肝组织的切片中，抗αd抗体标记肝小节之间的结缔组织中的泡沫细胞以及淋巴细胞的一个亚群。CD11c的分布与αd表达重叠但不一样，抗CD11c抗体也标记一个泡沫细胞亚群，但比抗αd抗体标记更多的巨噬细胞和淋巴细胞。CD11a和CD11b表达的分布与αd表达没有明显的重叠。
抗体217L也能染上簇状的并从212D和217L鉴定的群体中分离出来的吞噬细胞型细胞。针对CD11b和CD11c的抗体以不同的方式染上217L+簇。
在相关的实验中，用抗体212D和217L对人脾组织切片以及来自非人的灵长动物M.nemestrina的系列切片进行染色。还用流式细胞术评价来自新鲜的人和猴脾组织的脾细胞中αd的表达。抗体212D和217L都能识别人和猴脾细胞。用ICC和FACS，αd +群体均占总细胞的约20％，不像在啮齿动物中显示更大百分比的αd +细胞。阳性细胞显示与巨噬细胞形态相同。
人骨髓染色
人骨髓样品按照标准方法获自正常骨髓供体的髂骨。原始样品在Iscove′s培养基中按1∶3稀释，在2000RPM离心20分钟。小心收集血块黄层，洗涤一次，在溶血缓冲液(0.83％氯化铵、0.1％碳酸钠、无EDTA)中溶血。细胞重悬于含15％FBS的PBS中，分成100μl中的100,000细胞/管，置于冰上。按前述方法进行免疫染色。简而言之，在每孔中分别加入单克隆的鼠抗αd抗体212D或217L或鼠抗人CD18或鼠抗人CD50(ICAM-R特异)抗体至终浓度10μg/ml，混合物在冰上温育20分钟。将细胞洗涤两次，并与羊抗鼠FITC再另外温育20分钟。细胞洗涤两次，并重悬于1％低聚甲醛中。用荧光激活细胞分选仪FACSCAN(Becton Dickinson)测量荧光。
四个实验的结果显示，αd表达用212D抗体测定时见于13至43％的细胞上(中间值27％)、用217L时见于6-55％的细胞上(中间值21％)，CD18表达见于60-96％的细胞上(中间值71％)，CD50见于86-99％细胞上(中间值94％)。
αd在乳腺癌病人外周血单个核细胞上的表达
使用Ficoll分离法从经过了骨髓移植的高危乳腺癌病人的血液样品中分离外周血单个核细胞。高危乳腺癌病人即预后不良的乳腺癌病人。按上述方法用免疫染色来筛选表达αd的细胞。
结果显示，αd表达用212D抗体测定时发现在20％的细胞上，用217L时在13％的细胞上。抗体212D还染上了显示很可能是淋巴细胞的小细胞的一个亚群。表达αd的细胞的百分比与在正常血液供体中一般观察到的百分比相当。
此外，抗体212D显示不仅染上为CD14+的大细胞，还能染上实验鉴定为CD3+的小得多的细胞。在血液和骨髓中都观察到这个结果。
表达αd细胞的数量的变化可以用从不同供体抽取的骨髓细胞组成的变化来解释(例如骨髓数量与循环血数量相比)。
实施例19
αd表达的上调
因为白细胞整联蛋白在血液透析中和慢性肾衰竭中观察到的免疫改变中一般上调[Rabb，et al.J.Am.Soc.Nephrol.6：1445-1450(1995)and Rabb，et al.Am.J.Kidnet Dis.23：155-166(1994)]，我们检测了在血液透析和慢性肾衰竭中αd/CD18的表面表达。此外，还研究了在PKC刺激后αd/CD18在体外的表达。
全血样品获自5个随机选择的没有肾病的住院病人。在表面染色和流式细胞术分析前，血液样品与50ng/ml的PMA在37℃温育30分钟。同时也从患有慢性肾衰竭的病人中收集血液样品。病人情况稳定，没有糖尿病，每周三次进行血液透析。基线样品在开始透析前获取，接着在用一个cuprophane膜透析中15分钟和180分钟抽取样品。使用来自不患有已知疾病的正常个体的血液样品作为对照。
为进行细胞染色，将5μg的抗体169A和169B(和一个阴性对照1B7)与100μl全血在暗处温育15分钟。在每个混合物中加入Becton Dickinson裂解试剂(2ml)，在暗处继续温育10分钟。然后沉淀细胞，重悬于PBS。离心再次沉淀细胞，并与FITC偶联的二抗混合，在暗处温育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤、离心、弃去上清液、重悬于1.0％福尔马林。
使用Rabb，et al.[J.Am.Soc.Nephrol.6：1445-450(1995)]的方法进行流式细胞术。样品用Simulset软件(Becton Dickinson)在FACscan流式细胞术(Becton Dickinson)上进行分析。每个样品最少分析22,000个细胞。粒细胞、单核细胞和淋巴细胞亚群用前向光散射和侧向光散射进行分门。细胞亚群的纯度用CD45染色和CD14染色进行评价。
结果显示，αd/CD18的表达可在从正常人供体抽取的血液中检测到，表达在单核细胞上最高，在淋巴细胞上最低。在中性粒细胞上的表达介于单核细胞和淋巴细胞之间。用抗体169B染色弱于用抗体169A染色。PMA处理上调αd/CD18表达，特别是在中性粒细胞和单核细胞上。
在来自肾衰竭病人的样品中，在开始透析前，αd/CD18的表达在中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上检测到。在使用白细胞激活膜透析15分钟后，检测到αd/CD18表达的少量增加。在处理的后期，单核细胞和淋巴细胞上的表达实际上减少。这个结果表明，αd/CD18表达与观察到的透析后CD11a/CD18、CD11b/CD18和L-选择素的表达不同。
实施例20
大鼠cDNA的分离
因为犬和人αd亚基都存在，我们设法在其他物种包括大鼠(本实施例)、小鼠(实施例20，上文)中分离同源性基因。
从一个大鼠脾λgt10文库(Clontech)中获得了显示与人αd基因同源的大鼠cDNA的部分序列。将该文库按2×104pfu/板铺于150mm LBM/琼脂平板。按标准方法[Sambrook，et aL，Mol ecular Cloning：alaboratory manual，p.2.110]的介绍，将文库提呈到Hybond
Figure C0182025000671
膜上(Amersham)，变性3分钟，中和3分钟，用缓冲液洗涤5分钟。立即将膜置于一个Stratalinker(Stratagene)上，用自动交联装置使DNA交联。将膜分别在低度和高度严格条件下，在30％或50％甲醛中进行预杂交和杂交。先用一种32P标记的探针对膜进行筛选，该探针从人αd cDNA中制备，并相当于克隆19A2(SEQ ID NO：1)的碱基500至2100。探针使用Boehringer Mannheim′s随机引物试剂盒按照厂商推荐的程序进行标记。滤膜用2XSSC在55℃进行洗涤。
鉴定了两个克隆，它们被命名为684.3和705.1，它们显示与人αd、人CD11b、和人CD11c序列同源。两个克隆都在基因的3′区域与人αd基因匹配，对684.3来说，起始于碱基1871而延伸至碱基3012，对克隆705.1，为碱基1551至3367。
为分离包含5′区域的更完整的大鼠序列，使用初次筛选中同样的程序，但使用由克隆A1160制备的一种鼠探针(见实施例20，上文)，对相同的文库进行再次筛选。从第二次筛选选择单个、分离的噬菌斑，在LBM/琼脂平板上维持为单个克隆。在一个标准的PCR程序中使用测序引物434FL和434FR(分别为SEQ ID NO：34和35)来制备用于测序的DNA。
5′-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3′(SEQ ID NO：34)
5′-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3′(SEQ ID NO：35)
PCR产生的DNA用Quick自旋柱(Qiagen)按照厂商推荐的程序进行纯化。
鉴定了两个克隆，它们被命名为741.4和741.11，它们与克隆684.3和705.1重叠，在重叠区域，克隆741.4和741.1与克隆684.3和705.1100％同源。一个合并的与人αd基因具有同源性的大鼠cDNA列于SEQ ID NO：36，预测的氨基酸序列列于SEQ ID NO：37。大鼠αd 5′端的克隆
使用一个Clontech大鼠脾RACE克隆试剂盒，按照厂商推荐的程序，获得了一个大鼠αd基因5′cDNA片段。使用的基因特异的寡核苷酸被命名为741.11#2R和741.11#1R(分别为SEQ IDNO：59和58)。
5′-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3′(SEQ ID NO：59)
5′-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3′(SEQ IN NO：58)
寡核苷酸741.11#2R包含SEQ ID NO：36中的131-152碱基对，但方向相反；741.11#1R包含SEQ IN NO：36中的696-715碱基对，方向也相反。使用3′-多数寡核苷酸741.11#1R进行初次PCR。接着用寡核苷酸741.11#2R和初次反应产生的DNA进行第二次PCR。在1％琼脂糖凝胶上检测到了大约300碱基对的一条带。
将第二次PCR的产物按照厂商推荐的程序连接到质粒pCRTAII(Invitrogen)中。挑取白色(阳性)克隆，并加入到100μl含有1μl的50mg/ml羧苄青霉素贮存液和1μl的M13K07噬菌体培养物的LBM中，并分别加入到一个圆底96孔组织培养板的单个孔中。混合物在37℃温育30分钟至1小时。初次温育期之后，加入X100μl的LBM(含有1μl的50mg/ml羧苄青霉素贮存液和10mg/ml卡那霉素贮存液的1∶250稀释物)，继续在37℃温育过夜。
使用无菌的96孔金属转移吸头，将96孔板的上清液转移到4张Amersham Hybond尼龙滤膜上。按照标准程序将滤膜变性、中和和交联。滤膜在20ml预杂交缓冲液(5XSSPE，5XDenhardts、1％SDS、50μg/ml变性鲑鱼精子DNA)在50℃预杂交数小时并摇动。
寡核苷酸探针741.11#1和741.11#1R(分别为SEQ ID NO：56和57)包含碱基对86-105(SEQ ID NO：36)，分别为正向和反向，它们按下面方法进行标记。
5′-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3′(SEQ ID NO：56)
5′-AGGTTAGACCCATGACAGG-3′(SEQ ID N0：57)
将12μl dH20中的大约65WP寡核苷酸DNA加热至65℃两分钟。在试管中加入3μl的10mCi/ml γ-32P-ATP，并加入4μl 5X激酶缓冲液(Gibco)和1μl T4DNA激酶(Gibco)。混合物在37℃温育30分钟。温育之后，将16μl的每种标记的寡核苷酸探针加入预杂交缓冲液中和滤膜上，并在42℃继续杂交过夜。滤纸在5XSSPE、0.1％SDS中在室温下洗涤三次，每次5分钟，并放射性自显影6小时。将阳性克隆扩增，并使用Magic Mini Prep试剂盒(Promega)按照厂商推荐的程序纯化DNA。克隆2F7被选择来进行测序，并在重叠区域显示与克隆741.11有100％的同源性。完整的大鼠αd核酸序列列于SEQ IDNO：54，其氨基酸序列列于SEQ ID NO：55。
大鼠cDNA和氨基酸序列的特征
大鼠β2整联蛋白α亚基的核酸和氨基酸序列在以前都没有报道。但与已报道的人β2整联蛋白α亚基的序列比较表明，分离到的大鼠克隆和其预测的氨基酸序列与αd核苷酸和氨基酸序列最密切相关。
在核酸水平，分离的大鼠cDNA克隆与人αd cDNA比较时显示80％的同一性，与人CD11b比较时显示68％的同一性，与人CD11c比较时显示70％的同一性，与鼠CD11b比较时显示65％的同一性。在与人CD11a和鼠CD11a比较时，没有明显的同一性。
在氨基酸水平，由分离cDNA编码的预测大鼠多肽在与人αd多肽比较时显示70％的同一性，在与人CD11a比较时显示28％的同一性，在与人CD11b比较时显示58％的同一性，在与人CD11c比较时显示61％的同一性，在与鼠CD11a比较时显示28％的同一性，在与鼠CD11b比较时显示55％的同一性。
实施例21
大鼠组织αd表达的Northern分析
从一组Lewis大鼠组织中提取RNA来用一种大鼠αd探针进行Northern分析。样品包括来自正常的脾、肾、肝、肺和骨髓的总RNA，加上来自正常脾、脑、脊髓、胸腺、皮肤、小肠、大鼠抗原激活的T细胞、患EAE病(实验性过敏性脑脊髓炎)的脾和淋巴结的poly(A+)RNA。实验使用实施例6介绍的技术进行。
αd探针选自大鼠cDNA的一个区域，包括SEQ ID NO：54中的1184-3008核苷酸，该区域代表与大鼠CD11c和CD11b具有最低程度的同源性的区域。该1124bp探针通过用EcoRI内切酶消化10μg大鼠αdcDNA克隆684.3来制备。该片段用凝胶纯化，并按实施例6中的介绍用于一个随机引物标记反应。Northern印迹按实施例6中介绍的预杂交、杂交和洗涤来进行，除了探针按5.5×105cpm/ml加入到杂交缓冲液中。
放射性自显影5天后，在含有脾总RNA以及来自正常鼠及来自患有活跃的EAE大鼠的脾的poly(A+)RNA泳道中检测到条带，在患有活跃的EAE的大鼠中，RNA的量明显大于来自正常鼠的RNA量。检测到的转录物的大小与全长大鼠cDNA克隆的大小一致。
实施例22
啮齿动物αd特异性抗体-针对大鼠αd I结构域/Hu IgG4融合蛋白的抗体的制备和特征分析
由于已经证明人β2整联蛋白的I结构域参与配体结合，可以推测对大鼠αd蛋白也是同样。因此对大鼠αdI结构域免疫特异的单克隆抗体有αd结合参与的人疾病的大鼠模型中是有用的。
寡核苷酸“大鼠α-DI5”(SEQ ID NO：87)和“大鼠α-DI3”(SEQINNO：88)从大鼠αd序列中制备，它们分别相当于SEQ ID NO：54中的碱基对469-493和碱基对1101-1125(相反方向)。将寡核苷酸用于一个标准的PCR反应，来制备一个含有跨越相当于SEQ ID NO：54中碱基对459-1125的I结构域的大鼠αd DNA片段。将PCR产物按照厂商推荐的程序连接到载体pCRTAII(Invitrogen)中，选择一个阳性克隆并扩增，用一个Qiagen(Chatswoth，GA)Midi Prep试剂盒按照厂商推荐的程序纯化DNA。DNA用XhoI和BglII在一个标准的反应中酶消化，用凝胶纯化一个600碱基对的带，并随后将其连接到pDCS1/HuIgG4表达载体中。选择一个阳性克隆扩增，用一个Qiagen MaxiPrep试剂盒纯化DNA。
将COS按半汇合铺于100mm培养皿，在37℃在7％CO2中生长过夜。细胞用5ml的DMEM漂洗一次。在5ml DMEM中，加入50μl DEAE-葡聚糖、2μl氯喹和15μg前面介绍的大鼠αdI结构域/HuIgG4DNA。将混合物加入COS细胞，在37℃温育3小时。然后移出培养基，在精确的1分钟内加入5ml CMF-PBS中的10％DMSO。细胞用DMEM温和地洗涤一次。在细胞中加入10ml含有10％FBS的DMEM，继续在37℃在7％CO2中温育过夜。第二天，用新鲜的培养基代替培养基，并继续再培养另外3天。收集培养基，并在板中加入新鲜的培养基。三天后，再收集培养基，弃去板。重复上述过程，直到收集到2升培养上清液。将按前述方法收集的上清液上一个ProsepA
Figure C0182025000711
柱(Bioprocessing)并按下面的介绍纯化蛋白。
先用15倍体积的含35mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5的洗涤缓冲液洗涤柱，将上清液以低于60柱体积/小时的低速率上柱。上柱后，用15倍体积的洗涤缓冲液、15倍体积的0.55M二乙醇胺、pH 8.5和15倍体积的50mM柠檬酸、pH 5.0洗柱。蛋白用50mM柠檬酸、pH 3.0洗脱。蛋白用1.0M Tri s、pH 8.0中和，并在无菌PBS中透析。
大鼠αd I结构域蛋白用实施例14介绍的方法进行分析。检测到的蛋白以与人I结构域蛋白观察到的相同方式迁移。
制备针对大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白的单克隆抗体
小鼠分别用预先在等体积的弗氏完全佐剂(FCA)(Sigma)中乳化的50μg纯化的大鼠αd I结构域/HuIgG4融合蛋白进行免疫。将大约200μl抗原/佐剂制备物注射到每只小鼠背部和侧部的4个位点。两周后，小鼠通过注射100μl预先在等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)中乳化的大鼠αd I结构域/HuIgG4抗原(50μg/鼠)进行加强免疫。另外两周后，小鼠用200μl PBS中的50μg抗原经静脉进行加强免疫。
为评价免疫小鼠中的血清滴度，在第三次免疫后10天对动物进行眼窝后取血，使眼窝后血凝集，并离心分离血清。将血清用于生物素(BIP)标记的大鼠脾细胞的免疫沉淀。来自每只小鼠的血清都能免疫沉淀大鼠αd和大鼠CD18的预期分子量的蛋白条带。选择一只小鼠进行融合，并按第三次加强免疫中介绍的方法进行第四次加强。
杂交瘤上清液按下面的介绍用抗体捕获法进行筛选。Immulon4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)在4℃按50μl/孔用在50mM碳酸钠缓冲液、pH 9.6中1∶5000稀释的羊抗鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)进行包被。板用含有0.05％Tween
Figure C0182025000722
20的PBS(PBST)洗涤三次，并加入50μl培养上清液。在37℃温育30分钟后，按前述方法洗涤。加入在PBST中1∶3500稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG9(Fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。板按前述方法进行温育，并用PBST洗涤四次。紧接着，加入含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2的100mM柠檬酸、pH 4.5的底物。5分钟后加入50μl的15％硫酸终止颜色反应。在Dynatech读板仪上读出490nm处的吸收。
来自含有抗体的孔中的上清液也用固定化的大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白进行ELISA分析。一个用HuIgG4抗体包被的板进行的ELISA用作针对IgG融合配偶体反应的对照。选择阳性孔用下面介绍的技术在大鼠脾细胞裂解物上用BIP进一步筛选。
大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白多克隆抗血清的制备
在用弗氏完全佐剂(FCA)中的100μg纯化的大鼠αd I结构域/HuIgG4融合蛋白进行免疫前，对两只兔预先采血。每三周用弗氏不完全佐剂(IFA)中的相同剂量重复注射。三次注射后，对兔进行实验采血，并将收集的血清用于大鼠脾细胞裂解物上的一个标准免疫沉淀。结果确定，来自两只兔的血清均能与大鼠αd免疫反应。再用IFA中的100μg抗原对兔进行加强免疫，并用免疫沉淀分析收集的血清与大鼠αd免疫反应的提高。10天后给予动物最后一次加强免疫，放血，收集血清。
大鼠αd的组织学
按实施例18中介绍的技术将针对大鼠αd“I”结构域制备的兔多克隆血清用于兔组织切片的染色。在冷冻和石蜡包埋的大鼠脾切片上的染色图谱与用针对人αd抗体所观察到的图谱相同，染色的单个细胞分布于整个红髓。该染色图谱与用针对大鼠CD11a、CD11b和CD18的单克隆抗体观察到的图谱不同。此外，在胸腺中观察到了单个细胞分布于整个皮层的阳性染色图谱。这些组织在用免疫前的兔血清染色时，不能产生任何信号。
抗体特异性分析
大鼠用CO2窒息处死，用标准的外科技术取出脾脏。将脾脏在20mlRPMI中用一个3cc注射器塞轻推过一个金属筛来收集脾细胞。将细胞收集到一个50锥型试管中，并在适当的缓冲液中洗涤。
细胞在冷D-PBS中洗涤三次，并以108至109的细胞密度重悬于40ml PBS。在细胞悬液中加入4mg的NHS-Biotin(Pierce)，反应在室温下继续精确进行15分钟。沉淀细胞，在冷D-PBS中洗涤三次。
细胞按108细胞/ml重悬于冷的裂解缓冲液中(1％NP40、50mMTris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl、1∶100的抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑酶肽溶液，在加入细胞前加入；0.0001克PMSF晶体，在加入细胞前加入)。将裂解物振荡旋转30秒，在室温温育5分钟，并在冰上温育15分钟。将裂解物在10,000g离心10分钟使不溶物沉淀。将上清液收集到一个新管，贮存在4℃至-20℃之间。
将1ml裂解物与200μl蛋白A Sepharose
Figure C0182025000731
浆(Zymed)在4℃温育过夜进行预清除。将预清除的裂解物按50μl/管分装到Eppendorf管中用于每种检测抗体。将25μl多克隆血清或100至500μl单克隆抗体上清液加入预处理的裂解物中，并将获得的混合物在4℃旋转温育2小时。然后加入与PBS中的蛋白A Sepharose珠结合的100μl兔抗鼠IgG(Jackson)，继续在室温旋转温育30分钟。轻微离心使珠沉淀，并用冷洗涤缓冲液(10mM HEPES、0.2M NaCl、1％Trition X-100
Figure C0182025000733
)洗涤三次。吸出上清液。加入20μl含有10％β-巯基乙醇的2XSDS样品缓冲液。样品在水浴槽内煮沸2分钟。将样品上5％SDS PAGE凝胶，分离后，将蛋白用恒定电流过夜转移至硝酸纤维膜上。硝酸纤维滤膜用含3％BSA的TBS-T在室温封闭1小时，弃去封闭缓冲液。加入在0.1％BSA TBS-T中1∶6000稀释的链亲和素-HRP偶联物(Jackson)，在室温继续温育30分钟。滤膜用TBS-T洗涤三次，每次15分钟，并用Amersham′s ECL试剂盒按照厂商推荐的程序进行放射性自显影。
针对全长大鼠αd蛋白的单克隆抗体的制备
从大鼠脾细胞中纯化大鼠αd来制备用于产生抗大鼠αd单克隆抗体的免疫原。收集来自约5012-20周龄的正常雌性Lewis大鼠的脾脏，并通过使其通过一个精密的金属筛从组织制备一个单细胞悬液。在含有150mM NH4CL、10mM KHCO3、0.1mM EDTA、pH7.4缓冲液裂解除去红细胞，余下的白细胞用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤两次。离心沉淀脾细胞，并在含有50mM Tris、150mM NaCL、2mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM PMSF、亮抑酶肽、抑胃酶肽和1％Triton X-100
Figure C0182025000741
的缓冲液中裂解。脾细胞裂解按每ml裂解缓冲液5×108脾细胞在冰上进行30分钟。离心除去不溶物质。
CD11a、CD11b和CD11c按下面方法用免疫沉淀从脾裂解物中除去。将体积为750μl的蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000742
浆与2mg兔抗鼠免疫球蛋白在4℃温育30分钟。兔抗鼠-蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000743
用裂解缓冲液洗涤三次，并悬浮于终体积为1.5ml的裂解缓冲液中。将大约200μg的每种大鼠β2整联蛋白特异的单克隆抗体515F(大鼠CD11a特异)、0X-42(大鼠CD11b特异)和100g(大鼠CD11c特异)加入每个50ml的大鼠脾裂解物中。在4℃温育30分钟后，将500μl的兔抗鼠-蛋白A-Sepharose加入到脾裂解物中，颠倒旋转在4℃混合30分钟。将裂解物在2500×g离心10分钟沉淀与兔抗鼠-蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000745
结合的CD11a、CD11b和CD11c，将上清液转至一个干净的50ml离心管。用抗体515F、OX-42和100g另外重复沉淀两次以保证完全清除CD11a、CD11b和CD11c。
裂解物中剩余的β2整联蛋白用亲和纯化方法进行分离。将约250μ1与CHBr-Sepharose
Figure C0182025000746
偶联的抗大鼠CD18单克隆抗体20C5B浆加入到裂解物中，在4℃颠倒旋转混合30分钟。在2500×g离心10分钟使抗体/抗原复合物沉淀，沉淀用裂解缓冲液洗涤三次，然后贮存于4℃。亚美尼亚仓鼠的免疫
1.6-8周龄的亚美尼亚仓鼠先用50μg在弗氏完全佐剂中乳化的含大鼠αd I结构域与IgG4重链融合的重组蛋白进行免疫。初次免疫之后接着在14、33和95天用在弗氏不完全佐剂中乳化的大鼠αd I结构域/HuIgG4进行免疫。并接着进行两次单独的融合，它们被命名为197和199。
在融合197前4天(306天)，对一只仓鼠给予纯化自脾细胞的大鼠αd蛋白和大鼠αd转染的CHO细胞的合并物。在融合前三天(307天)用纯化的大鼠αd蛋白和αd转染的CHO细胞进行加强免疫。大鼠αd转染的CHO细胞按下面的方法制备。
将一个编码全长的大鼠αd蛋白的基因插入到pDC1载体中，并与一个人CD18-pRC构建体一起电转化到CHO细胞中。转染细胞在存在次黄嘌呤的条件下生长以选择成功地转染了pRC构建体的细胞，并在存在G418的条件下生长以选择转染了pDC1构建体的细胞。三周后，细胞用大鼠αd特异的兔多克隆血清染色，并用FACS分类。收集表达高水平的表面αd的一小百分比的细胞(大约占总数的3％)，并进一步扩增。重复FACS选择数次来提供αd高水平表面表达的细胞群。
αd转染的细胞也用流式细胞术使用一种大鼠αd特异的多克隆血清和一种人CD18特异的单克隆抗体TS1.18.1进行分析。结果证明，转染的CHO细胞表达高水平的大鼠αd和人CD18。
最后，细胞中αd和CD18的表达用免疫沉淀进行评价。一种大鼠αd特异的兔多克隆血清被发现免疫沉淀两种不同分子量的蛋白：高分子量蛋白为约170kD，低分子量蛋白为约95kD。这些发现与转染CHO细胞表面大鼠αd/人CD18异二聚体复合物的表达一致。
在融合那天，取出脾脏，将组织在浸入在补加有2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无血清RPMI1640中的两个显微镜载玻片的磨沙端研磨，形成单个细胞的悬液(RPMI)(Gibco，Canada)。细胞悬液滤过一个无菌的70筛Nitex细胞滤过器(Becton，Dickinson，Pars ippany，New Jersey)。在200×g离心5分钟洗涤2次。所获得的沉淀重新悬浮于20ml无血清RPMI。从三只Balb/c幼鼠取出的胸腺细胞也用同样的方法进行制备。在融合前，将在融合前三天用含10％Fetalclone血清(FCS)(HycloneLaboratorieS，Logan，Utah)的RPMI维持在对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞，在200×g离心5分钟，沉淀用前面介绍的方法洗涤两次。
将大约1.15×108脾细胞与5.8×107NS-1细胞混合，离心并吸出上清液。敲击试管取出细胞沉淀，并在1分钟内加入7ml 37℃的PEG1500(75mM Hepes、pH 8.0中50％)(Boehringer Mannheim)，并搅动。在接着的7分钟内加入另外14ml无血清RPMI。再加入8ml的RPMI。细胞在200×g离心10分钟。弃去上清液。沉淀重新悬浮于200ml含有15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞的RPMI。悬液按200μl/孔分于10个96孔平底组织培养板(Corning，联合王国)上。在融合后的第4、5、6和7天饲喂细胞，方法是用一只18G针(Becton Dickinson)从每孔中吸出约100μl，按前面介绍的方法除了不含胸腺细胞外加入100μl/孔的铺板培养基。
在融合后的第10天，来自融合孔的上清液用流式细胞术检测其与大鼠αd/人CD18转染的CHO细胞的反应性。将约5×105大鼠αd转染的CHO细胞重悬于50μl含有2.0％FBS和0.05％叠氮化钠的RPMI中，加入96孔圆底板中的约100μl杂交瘤上清液中。染色的阳性对照包括兔抗αd多克隆血清和TS1/18(抗人CD18)。细胞在冰上温育30分钟，在FACS缓冲液(RPMI，2.0％FBS、0.05％叠氮化钠)中洗涤三次，并与一种在FACS缓冲液中最终稀释为1∶200的FITC偶联的羊抗仓鼠抗体(Jackson ImmunolResearch Labs)在冰上温育30分钟。细胞在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于200ml的FACS缓冲液。样品用Becton Dickinson FACscan分析仪进行分析。为保证阳性克隆为大鼠αd特异，用非转染的CHO细胞重复筛选过程。将符合与大鼠αdCHO转染细胞反应而不与非转染的CHO细胞反应标准的孔克隆。
初次筛选后，来自阳性孔的细胞用两倍稀释法并接着在含15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、16mM胸腺嘧啶和10单位/mlIL-6的RPMI中有限稀释进行克隆。在有限稀释步骤中，确定显示生长的孔的百分比，克隆性用泊松分布分析进行预测。10-12天后用FACS分析显示生长的孔。最后一次克隆之后，阳性孔在RPMI和11％FBS中扩增。克隆产生了一个用这些标准判断为阳性的孔，从该孔中扩增了四个单独的亚克隆，分别命名为197A-1、197A-2、197A-3和197A-4。
在进行199融合前，第二只仓鼠在307天用2.3×106大鼠αd(RAD)转染的CHO细胞进行加强免疫。在融合前4天(334天)和融合前3天(335天)进行最后两次免疫。334天的加强免疫包括2×106大鼠αd转染的CHO细胞和200μl与Sepharose
Figure C0182025000761
(前面介绍)结合的纯化大鼠αd经腹膜内给药。335天的加强免疫包括5×106大鼠αd转染的CHO细胞，也经腹膜内注射给药。199融合的融合和筛选过程与197融合相同。鉴定和克隆了三个上清液与大鼠αd反应的杂交瘤，命名为199A、199H和199M。
2.使用197和199融合相同的过程进行第二次免疫。334天加强免疫后，在394和395天之前不进行进一步的免疫。在融合前，对仓鼠经腹膜内给予2×106RAD转染的CHO细胞及300μl纯化大鼠αd-Sepharose
Figure C0182025000771
接着进行的融合205的融合和筛选过程与融合199和197相同，除了在克隆中，亚美尼亚仓鼠ELISA试剂如羊抗亚美尼亚仓鼠抗体(Jackson ImmunolResearch Labs)被用作初次筛选。用此方法鉴定的阳性孔接着按介绍用FACS进行筛选。融合205产生三个单独的阳性克隆，命名为205A、205C、205E。
3.在另一种制备抗大鼠αd单克隆抗体的方法中，6至12周龄的BALB/c小鼠在第1天用纯化的大鼠αd-Sepharose在弗氏完全佐剂中经皮下给药进行免疫。在第25天用弗氏不完全佐剂中的相同免疫原经相同的途径进行第二次加强免疫。与第二次相同的第三次加强免疫在第42天进行。在融合前加强免疫前不再进行进一步的加强，融合前加强免疫包括400μl(融合226)和250μl(融合236)纯化的大鼠αd-Sepharose
Figure C0182025000773
的腹膜内注射。每体积包含约10至15μg抗原，这由考马斯染色确定。对于融合226，融合前加强在62天和63天进行，融合在66天进行；对于融合236，融合前加强在132天和133天进行，融合在136天进行。两种融合过程与前面介绍的亚美尼亚仓鼠融合所用的过程的不同之处在于，使用5∶1比例的脾细胞对NS-1细胞，与之相比，在亚美尼亚仓鼠融合中，使用2∶1的比例。融合过程的其他方面与亚美尼亚仓鼠过程相同。
融合226和236的筛选和克隆过程与融合197、199和205的过程相同，除了用ELISA进行初级筛选外。在ELISA中，使用一种羊抗鼠全分子来从杂交瘤上清液中捕获鼠抗体。并使用一种羊抗鼠辣根过氧化物酶偶联物来检测鼠抗体。阳性克隆接着用FACS按照融合197至205的介绍进行筛选。
融合226产生9个阳性克隆，命名为226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H和226I。融合236产生10个阳性克隆，命名为236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、236L和236M。从这些克隆产生的单克隆抗体用ELISA按照实施例15的介绍进行分型，发现所有的抗体均为IgG1同种型。
针对大鼠αd单克隆抗体的特征分析
为分析抗大鼠αd单克隆抗体的特征，生物素标记的脾裂解物按前面实施例12部分D中的介绍进行制备。裂解物在用于免疫沉淀前进行预清除。首先，将50μg/ml的正常鼠免疫球蛋白加入到裂解物中，所获得的溶液在4℃颠倒旋转混合30分钟。加入包被有兔抗鼠免疫球蛋白的蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000781
浆75μl，继续颠倒旋转混合30分钟。在一台台式微量离心机中在4℃以15,000rpm离心5分钟，使兔抗鼠包被的蛋白A珠沉淀，收集上清液。弃去沉淀物质。
对每个克隆的杂交瘤，将大约300μl的上清液加入一个Eppendorf微量离心管，在其中加入30μl 30％的Triton X-100
Figure C0182025000782
30μl的抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑酶肽100X贮存液、100μg PMSF晶体和50μl预清除的生物素化大鼠脾裂解物。将样品温和地振荡旋转，在4℃置于一个颠倒旋转转头30分钟。一个对照样品用在50μl大鼠脾裂解物中加入10mg/ml兔抗大鼠αd特异性多克隆抗体来制备。
经过30分钟温育后，在每个样品中加入75μl蛋白A-Sepharose
Figure C0182025000783
珠的PBS浆，在4℃颠倒旋转温育30分钟。蛋白A-偶联的珠在一台台式微量离心机中以15,000在4℃离心5分钟进行沉淀，收集上清液。沉淀的珠用如下一系列1ml的去污剂顺序洗涤：含有10mM Tris、400mM NaCl、1.0％Triton X-100
Figure C0182025000784
pH 8.0的缓冲液#1；含有10mM Tris、400mM NaCl、1.0％Triton X-1000.5％Triton X-100
Figure C0182025000786
pH 8.0的缓冲液#2；含有10mM Tris、400mM NaCl、0.1％脱氧胆酸、pH 8.0的缓冲液#3；含有10mM Tris、400mM NaCl、0.5％M LiCl2、pH 8.0的缓冲液#4。最后一次洗涤用缓冲液#1进行。在每次洗涤中将珠温和地旋转振荡，并用台式微量离心机沉淀。上清液用转移吸液器移去。最后一次洗涤后，用Hamilton注射器将剩余的缓冲液从珠中移出。在各个沉淀中加入50μl含有溴酚蓝和派洛宁Y染料和终浓度为10％的β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液。将混合物剧烈振荡旋转1-2分钟，并在室温温育5-10分钟。样品在4℃在台式微量离心机中以15,000rpm离心5分钟，收集释放的蛋白，转移到一个新管中。来自每个样品的等分物在水浴槽中煮沸4分钟，然后上7.5％SDS-PAGE凝胶。PAGE分离后，将蛋白在200mAmps转移1小时转移到硝酸纤维膜上。并将滤膜在3.0％BSA/TBS-T溶液中在4℃封闭过夜。向每张滤纸加入含有1∶6000稀释的链亲和素-OPD的0.1％BSA-TBS-T溶液，在室温继续温育1小时。滤膜在TBS-T中洗涤5次，每次10分钟，用Amersham′s ECL试剂盒按照厂商推荐的程序进行显色。
克隆199M被发现能免疫沉淀一种异二聚体蛋白。较大的蛋白亚基具有约170-175kD的分子量，与用兔抗大鼠αd多克隆对照免疫沉淀的蛋白大小一致。还沉淀了分子量约为95kD的第二种蛋白，与CD18的分子量一致。
实施例23
单克隆抗体199M的特异性
使用偶联有199M单克隆抗体的CNBr-Sepharose
Figure C0182025000791
亲和柱来从脾细胞裂解物中亲和纯化大鼠αd。简而言之，将大约1.3×1010大鼠脾细胞在含有150mM NaCl、10mM PMSF、10mM Tris、1％Triton X-100
Figure C0182025000792
pH 8.0的缓冲液中裂解。缓冲液中的细胞在冰上温育30分钟并在4℃用约10,000×g离心30分钟。
将抗体199M按下述方法与CNBr-活化的Sepharose
Figure C0182025000793
4B(Pharmacia)偶联。将1克活化的树脂悬浮于1mM HCl中15分钟，用15ml 1mM HCl洗涤三次，用15ml含有0.1mM HCO3、0.5M NaCl、pH 8.0的偶联缓冲液洗涤一次。将偶联缓冲液中的抗体199M按终浓度约10-20mg/ml加入到树脂悬液中，混合物在4℃温育过夜。第二天，离心使偶联的树脂沉淀，弃去上清液。树脂上未处理的基团通过在室温在0.1M Tris、pH 8.0中温育1小时进行封闭。偶联的树脂用0.1M柠檬酸、pH 3.0洗涤，并以1∶2浆的形式贮存于含有0.1％叠氮化钠的裂解缓冲液中。
为进行亲和纯化，将脾细胞与0.4ml的199M偶联的琼脂糖树脂颠倒混合过夜进行温育。然后离心沉淀树脂，用15ml裂解缓冲液洗涤树脂4次。将每份约100μl的凝胶在含有0.1M Tris-HCl、pH 6.8、2.0％SDS、20％甘油、0.0002％溴酚蓝、10％β-巯基乙醇(终浓度为5％)的还原型样品缓冲液中迅速煮沸，并上样，蛋白用6.0％聚丙烯酰胺SDS凝胶(SDS-PAGE)分辨。
SDS-PAGE分离时，亲和纯化的物质被发现含有两个主要和一个次要蛋白种类。一个具有90kD分子量的主要蛋白带与CD18的已知大小一致，未对这个条带进行测序。对160kD的第二个主要带进行了检测，该带与αd的预测分子量一致。此外，还检测了表观分子量为200kD的次要带。160kD和200kD都用蛋白氨基端测序进行了分析，并将结果与用大鼠αd cDNA预测的氨基酸序列以及已知的CD11c和CD11b的氨基酸序列进行了比较。160kD和200kD带的序列被发现均与用克隆的大鼠αd预测的氨基酸序列一致，这表明可能有两种形式的αd，它们可能是剪接变体或由糖基化差异造成的。
实施例24
使用大鼠表达αd的巨噬细胞的T细胞增殖试验
分离自大鼠脾脏的表达αd的巨噬细胞被用作抗原递呈细胞(APC)来刺激一种名为LR-21的髓磷脂碱性蛋白特异性T细胞系。简而言之，大鼠用100μl体积的铁颗粒(BioMag，Cambridge，MA)经静脉注射。第二天，用脾脏制备单细胞悬液，用磁收集具有吞噬的铁颗粒的αd +巨噬细胞。流式细胞术和免疫沉淀显示，吞噬铁的细胞50至80％是αd +。
结果显示，表达αd的脾巨噬细胞相比于其他APC例如胸腺巨噬细胞是非常弱的APC。还在增殖试验中用αd阳性的巨噬细胞和LR-21细胞系检测了命名为205C的单克隆抗体。然后按如下方法进行增殖试验。
αd表达阳性的脾巨噬细胞按6×106细胞/ml的密度悬浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，在每孔中加入100μl的巨噬细胞悬液。来自LR-21细胞系的细胞按1×106细胞/ml的密度悬浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，并在每孔中加入50μl悬液。在每孔中加入50μ1体积的单克隆抗体205C至终浓度为50、10和2μg/ml。板在37℃温育72小时，并加入1 uCi3H-胸腺嘧啶来进行最后24小时温育。将细胞收集到玻璃纤维垫上，用直接β计数器(Packard Matrix96)测定3H整合。
实验结果显示，高浓度的抗体205C(10和50μg/ml)能以剂量依赖方式降低T细胞增殖。
实施例25
来自大鼠骨髓的αd的免疫沉淀
用PBS冲洗股骨的方法从一只Lewis大鼠中收集骨髓细胞。细胞基本上按实施例18介绍的方法洗涤、生物素化和免疫沉淀，使用20μg纯化的单克隆抗体来从100μl预清除的细胞裂解物中免疫沉淀蛋白。免疫沉淀蛋白的检测按前面介绍的方法进行。
大鼠αd单克隆抗体205C免疫沉淀以160kD和95kD迁移的两条带，这样大小的带与在用相同抗体从脾细胞裂解物中进行蛋白质的免疫沉淀观察到的αd/CD18的α和β链的大小一致。抗大鼠CD11a、CD11b或CD11c的抗体免疫沉淀与αd不同的α链，所有的抗体都共沉淀一种分子量与CD18的已知分子量一致的蛋白。
实施例26
αd在动物模型中的表达
初步的结果显示，大鼠αd选择性地表达于巨噬细胞的亚群，包括胸腺中的皮层巨噬细胞、肝脏中的枯否细胞、中枢神经系统中的维管细胞、腹膜巨噬细胞的亚群和静止的骨髓巨噬细胞。此外，硫葡萄糖盐巨噬细胞的一个亚群在用地塞米松刺激后显示αd的表达上调。所观察到的大鼠αd的巨噬细胞限制性表达表明需要对多种动物模型中的表达作进一步的分析。
大鼠αd在苯肼模型中的表达
对动物给予苯肼会导致大量红细胞(rbc)损伤而产生暂时性贫血。受损的红细胞被红髓巨噬细胞从循环中清除，从而导致明显的脾大。据推测表达αd的巨噬细胞可能参与受损红细胞和其他外源物质从循环中清除。
为验证此假说，多组大鼠单独用盐水或溶解于盐水中的苯肼处理，并经腹膜内按100mg/kg体重进行给药。在一些实验中，大鼠用针对大鼠αd的“结构域I”产生的多克隆抗血清进行处理。
在苯肼给药后的不同时间点处死动物，脾重和血细胞比容用作红细胞清除的参数。此外，收集肾、脾和肝进行组织病理学分析，包括对CD11a、CD11b、CD11c和αd进行免疫染色。
总的发现表明，用苯肼(盐水对照和αd处理)处理4天后，大鼠产生了急剧的脾大，而血细胞比容降低。用αd多克隆血清处理对苯肼诱导的脾细胞重量或血比容下降没有影响。
将来自盐水和4天苯肼处理的大鼠的组织制成4um厚的切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)载玻片上在室温空气干燥15分钟。使用前，将载玻片在50℃温育约5分钟。切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中在室温固定2分钟，并在室温干燥。将切片置于100ml的1XTBS、1.1ml 30％的H2O2(Sigma)、1ml 10％NaN3(Sigma)在室温放置15分钟以去除内源性的过氧化物酶活性。每个切片用150μl含有1XTBS中的30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的溶液在室温封闭30分钟，然后温和地从切片上去除溶液。每个切片用75μl在封闭液中稀释至13.3μg/ml的生物素化的仓鼠抗大鼠αd抗体205C，在室温处理1小时。温育后，切片在1XTBS中洗涤三次，每次5分钟，以去除任何未结合的抗体。在最后一次洗涤后在组织周围将多余的TBS吸出。过氧化物酶偶联的羊抗生物素抗体(Vector Laboratories)在封闭液中稀释至1∶200，将75μl用于每个切片，室温下30分钟。温育后，载玻片在1XTBS中洗涤2次，每次5分钟。加入AEC(Vector Laboratories)底物，通过浸入水中使显色终止。将载玻片在Gill′s苏木精#2(Sigma)中负染，并在水中漂洗，然后在70％、95％、100％乙醇及二甲苯中依次脱水。然后切片用cytoseal(VWR)封固。
在用盐水处理的大鼠脾切片中，大多数的αd表达位于脾红髓中形态学鉴定为巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞的一个亚群的细胞上。而在苯肼处理的大鼠脾中，脾红髓经历了形态学改变，使得唯一鉴定的细胞型是吞噬了受损红细胞的大巨噬细胞群。这些巨大的巨噬细胞的大多数被观察到表达αd。在苯肼处理的大鼠中，还显示脾白髓中表达αd的巨噬细胞的数量增加。
在苯肼处理的大鼠脾脏上，还进行了双标记实验来确定αd和CD11c的表达。如前所述，αd表达在脾红髓中显示吞噬了受损的红细胞的大巨噬细胞中检测到。CD11c表达也在脾红髓中的大巨噬细胞中检测到，而且在红髓中CD11c阳性细胞显示比αd阳性细胞多。大多数表达αd的巨噬细胞也表达CD11c，尽管观察到一小部分αd阳性巨噬细胞不表达CD11c。也有一个群体的CD11c阳性巨噬细胞不表达αd。
因此免疫学分析表明，在苯肼处理的动物的脾脏中CD11c的表达在第4天与盐水对照相比显示上调。而其他整联蛋白CD11a、CD11b和αd的表达显示不受苯肼处理的影响。用多克隆“I”结构域αd抗体处理也显示不影响红髓巨噬细胞对红细胞的摄取，但吞噬红细胞的的巨噬细胞多数是αd阳性。吞噬受损的红细胞的αd阳性巨噬细胞不存在于苯肼给药7天后收集的脾脏中。
随后使用凋亡试验和用生物素偶联的抗体205C对4天苯肼处理的大鼠脾脏进行双标记实验。将来自正常大鼠和4天苯肼处理的大鼠的组织制成4微米厚的切片，在Superfrost Plus(VWR Scientific)上在室温空气干燥15分钟，并贮存于-20℃。使用前，将载玻片加热至50℃。将加温的载玻片置于含有100ml的1XTBS、1.1ml 30％的H2O2(Sigma)、1ml 10％NaN3(Sigma)的缓冲液在室温放置15分钟以去除内源性的过氧化物酶活性。每个切片用150μl含有1XTBS中的20％正常大鼠血清(Harian Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的溶液在37℃封闭10分钟，然后温和地从切片上去除溶液。每个切片用75μl在封闭液中稀释至26.6μg/ml的生物素化的仓鼠抗大鼠αd抗体205C在37℃温育30分钟。然后切片在1XTBS中洗涤三次，每次5分钟，以去除未结合的抗体。在最后一次洗涤后在组织周围将多余的TBS吸出。将按照厂商的指示制备的碱性磷酸酶偶联的亲和素/生物素复合物(Vector Laboratories)用于每个切片，37℃下20分钟。温育后，载玻片在1XTBS中洗涤2次，每次5分钟。切片在4℃用低聚甲醛(Sigma)固定5分钟。然后切片在1XPBS中洗涤，并置于CSK缓冲液(100mM NaCl、300mM蔗糖、10mM PIPES pH 6.8、3mMMgCl2、0.5％Triton-X-100
Figure C0182025000831
)中4℃两分钟。将切片在1XPBS中在室温漂洗2分钟，然后切片用1XPBS洗涤三次，每次5分钟。将TUNEL反应混合物(Boehringer Mannheim)应用于每个切片，37℃下60分钟。温育后，切片在1XPBS中洗涤三次，每次5分钟。凋亡试剂盒的原理与原位杂交相似，TUNEL试剂(FITC偶联的)与“切口”DNA杂交。将转变子-POD(一种识别TUNEL试剂上的FITC标志的过氧化物酶偶联的抗体)用于每个切片，37℃下30分钟。切片用1XPBS洗涤三次，每次5分钟。加入AEC(Vector Laboratories)底物，浸入水中终止显色。切片用Aquamount(VWR)封固。
在模型中，脾脏的红和白髓区域中的大量细胞都产生凋亡，但红髓中已经吞噬了红细胞的大巨噬细胞(表达αd并在模型的第7天消失)没有发现产生凋亡。
正常大鼠脾上大鼠αd表达的细胞类型分析
为确定哪种大鼠细胞类型表达αd，在正常大鼠脾脏上进行双标记染色。按前述方法制备正常大鼠脾脏的切片直至大鼠血清封闭步骤。加入第一细胞标记抗体后，碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠抗体(JacksonLaboratories)在用于第一抗体的相同稀释剂中稀释到1∶500，并将75μl加入到每个切片上，室温30分钟。载玻片在1XTBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。将碱性磷酸酶标记的驴抗羊抗体(JacksonLaboratories)在抗体稀释剂中稀释到1∶300，并将75μl加至每个切片，室温30分钟。按上述方法洗涤和封闭后，每个切片接受75μl蛋白浓度为20μg/ml的生物素化的仓鼠抗大鼠αd抗体(205C)，各1小时45分钟，然后洗涤去除未结合的抗体。最后一次洗涤后从组织周围吸去多余的TBS。将过氧化物酶偶联的羊抗生物素(VectorLaboratories)在抗体稀释剂中稀释至1∶200。并将75μl加入每个切片，室温下45分钟。载玻片用1XTBS洗涤2次，每次洗涤5分钟。加入AEC底物(Vector Laboratories)，浸入水中终止显色。然后加入Fast Blue底物(Vector Laboratories)，浸入水中终止显色。然后载玻片用Aquamount(Baxter)封固。
双抗体免疫细胞化学用针对CD5、CD2、CD4、CD8、NK标记、或HIS45(一种T细胞标记)结合一种抗αd抗体来进行，以设法确定表达αd的细胞的表型。用CD2/αd或HIS45/αd没有检测到双标记细胞。在正常大鼠的脾红髓中，αd能够标记被发现也能表达CD5的小细胞簇。还没有确定这种CD5阳性细胞是否是T细胞或B细胞。在红髓中一小群αd表达细胞被测定也表达CD4。此外，NK细胞和CD8阳性细胞的一个亚群也被鉴定为表达αd。因此，脾脏中的αd表达发现于T细胞、可能的B细胞的一个亚群、NK细胞的一个亚群和巨噬细胞的一个亚群。
αd在来自F344大鼠模型的巨大粒细胞性白细胞(LGL)肿瘤细胞上的表达
在F344大鼠中使用获自国立癌症研究所的肿瘤细胞建立了一个LGL白血病大鼠模型，该肿瘤细胞被静脉注射到3只雄性F344大鼠中(每只一百万细胞)。疾病显示需要三个月，在此时，将几只动物处死，用FACS和组织化学分析检查组织。
为进行FACS分析，取出部分脾脏，按下面的实施例的介绍制备单细胞悬液。简而言之，脾组织用钳切成小片，并在存在D-PBS的条件下通过一个金属筛。离心沉淀细胞，并重悬于30ml D-PBS。在一个15ml离心管中将5.0ml细胞悬液铺于5.0ml Histopaque制备Histopaque梯度(Sigma)。将该梯度用Beckman台式离心机在1500rpm离心30分钟，并收集细胞层，在D-PBS中洗涤一次，用血细胞计数器计数。将细胞重悬于FACS缓冲液(RPMI-1640/2％FBS、0.2％叠氮化钠)，使其密度为1×106细胞/样品。
细胞通过与生物素偶联的仓鼠抗大鼠αd抗体205C(10μg/ml)和一系列FITC标记的抗大鼠细胞标记的抗体温育来进行双色染色。这些第二种抗体包括抗巨噬细胞-FITC、抗CD3-FITC和抗IgM(B细胞)-FITC抗体(均获自PharMingen)，加上一种FITC偶联的具有NK细胞特异性的抗体(Harlan)。FITC偶联的抗体均按10μl/样品使用。
样品先在冰上与205C-生物素抗体温育30分钟，在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于1.0ml的FACS缓冲液。将FITC偶联物与5μl链亲和素-PE(Pharmigen)一起加入，并将样品置于冰上30分钟。温育后，样品在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于200μl FACS缓冲液。用Becton Dickinson FACscan检测样品，并用Lysis II软件(BectonDickinson)分析数据。
结果压倒性地证明了αd在NK或LGL细胞表面的表达。B细胞和T细胞标记染色阳性的细胞没有显示αd表达，用巨噬细胞标记染色的细胞显示仅有轻微程度的αd表达。据信在疾病的这一点上，脾脏主要由NK肿瘤细胞组成，这与观察到的大群脾细胞被NK标记和αd表达染色的结果一致。
这些观察也与使用从同一动物收集的外周血细胞并按上面方法进行FACS的平行实验的结果一致。使用外周血细胞的结果表明，循环的NK细胞也表达αd，而血液中表达其他细胞标记的细胞不显示αd表达。但使用外周血细胞的结果并不像推测是由于脾脏和外周血中存在不同的细胞类型的百分比差异产生的脾细胞结果那样变化剧烈。
在用来自这些模型动物的大鼠脾细胞接着进行FACS时，获得了相同的结果。在使用上面的细胞制备物进行进一步的分析时，LGL肿瘤细胞也显示CD18以及CD11a、CD11b和CD11c表达的染色。
使用上面介绍的ICC程序，对正常和NK F344疾病组织进行了组织化学分析。初步的数据表明，αd在NK F344肿瘤肺和肝组织中表达，但在相应的正常组织中没有检测到或以极低水平表达。疾病肺组织显示αd在小和大的细胞簇以及分散于整个肺的单个细胞上表达。NK F344肝显示小管周围以及散布整个组织的其他细胞上的弱标记。针对其他β2整联蛋白的抗体显示，这些分子在正常组织和疾病组织中以相似水平表达，虽然标记图谱不同。
在平行的分析中，正常大鼠胸腺在皮质的分散细胞中显示轻微的αd表达，而F344NK胸腺显示αd表达水平增加。正常脾显示红髓中的表达，NK脾脏具有分布整个组织的簇状标记。
然后自疾病发作开始每周检测NK脾脏，结果显示αd的表达水平提高，直到第三周，然后在第四周下降。
实施例27
使用抗αd单克隆抗体抑制NK肿瘤细胞诱导的靶细胞裂解的分析
Figure C0182025000861
NK细胞的一个特殊功能是靶向和杀伤病毒感染细胞和外源细胞。为分析NK细胞裂解特定靶细胞的能力。靶细胞用51铬标记，当裂解发生时，在培养基中可检测到升高的放射性。先前已经证明在NK细胞上表达的αd，据推测其可能参与NK细胞靶向的细胞杀伤。为评价这一假说，肿瘤细胞与αd抗体预温育，来分析αd在一个功能分析中的作用。
αd阳性NK-肿瘤效应细胞的制备
用从国立癌症研究所获得的NK肿瘤细胞注射F344大鼠，并在取出脾脏前在动物中传代3至4周。取出脾脏，切成小片，在D-PBS存在下通过一个金属筛。将所获得的细胞悬液在Beckman台式离心机上在室温以1500rpm离心10分钟。吸出上清液，将细胞重悬于30mlD-PBS。
然后按下述方法进行来自血液的单个核细胞的Histopaque分离。在6个15ml离心管中加入5ml Histopaque(Sigma)，在其上铺一层上面介绍的细胞悬液5ml。细胞在Beckman台式离心机上在室温以1500rpm离心30分钟。收集细胞层，合并，并用血细胞计数器计数。在D-PBS中制备几种分离的肿瘤细胞的稀释物，并随后在存在或不存在浓度为50μg/ml的抗大鼠αd抗体的条件下温育。对照抗体包括一种抗大鼠CD18抗体和一种抗大鼠ICAM-1抗体，这两种抗体也以50μg/ml的浓度与细胞温育。在试验前，肿瘤细胞与抗体在37℃预温育约30分钟。
Yak-1靶细胞的铬标记
Yak-1细胞(ATCC)是一种小鼠淋巴瘤细胞系，将该种细胞培养于10％FBS/RPMI 1640。离心收集细胞，在1.5至4.0ml RPMI“测试培养基”中按约1×107的细胞密度重悬。测试培养基用500ml RPMI1640、5ml Pen-Strep抗生素溶液和10ml FBS制备。在Yak-1细胞悬液中加入约200至300uCi的51铬，然后在37℃轻微混合温育45至60分钟。温育后，用测试培养基将体积增加至50ml，并离心沉淀细胞。弃去上清液，将细胞悬浮于1至3ml测试培养基，并将密度调为5×104。还制备浓度为1×107细胞/ml的非标记Yak-1细胞用作自身对照。
通过用γ计数器测试三个重复中100μl的标记细胞悬液来测定标记细胞的活性。
短期铬释放试验
将NK效应细胞的各个稀释物按三个重复铺于96孔微量板中的100μl体积测试培养基中，在每孔中加入100μl标记的Yak-1细胞。自身即自发或本底的释放用100μl标记细胞和非标记Yak细胞在每个效应细胞稀释度温育来获得。总51铬释放用在一系列孔的靶细胞中加入1.0％Triton来获得。自发释放用仅有靶细胞的孔中发现的51铬量进行测量。效应细胞/靶细胞的温育在37℃进行4小时，然后将板离心，从每孔收集100μl上清液，测量放射活性。
细胞裂解活性用下面的公式进行计算：
Figure C0182025000881
结果显示，仓鼠抗大鼠αd抗体(包括199M和205C)和小鼠抗大鼠αd抗体(226A、226B、226C、226D、226F、226G、226H和226I)都不能影响NK肿瘤细胞杀伤或裂解标记的靶细胞的能力。
实施例28
小鼠cDNA克隆的分离
设法分离小鼠αd同源物
使用两种PCR制备的探针进行种间交叉杂交：相当于人克隆19A2(SEQ ID NO：1)的碱基522至2047的一个1.5kb片段；和一个相当于人克隆19A2(SEQ ID NO：1)的碱基1900至2900碱基的1.0kb大鼠片段。人探针使用分别列于SEQ ID NO：38和39称为ATM-2和9-10.1的引物对用PCR进行制备；大鼠探针使用分别列于SEQ ID NO：34和35的引物对434L和434R来制备。样品在94℃温育4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序：94℃；50℃2分钟；72℃4分钟。
5′-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3′(SEQ ID NO：38)
5′-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3′(SEQ ID NO：39)
PCR产物用Qiagen Quick Spin试剂盒按照厂商推荐的程序纯化，约180DNA使用Boehringer Mannheim随机引物标记试剂盒按照厂商推荐的程序用200uCi[32P]-dCTP进行标记。未掺入的同位素使用Centri-sep自旋柱(Princeton Separation，Adelphia，NJ)按照厂商推荐的程序除去。使用前，探针用0.2N NaOH变性，用0.4MTris-HCl、pH 8.0中和。
将一个λZAP
Figure C0182025000882
II中的小鼠胸腺寡聚dT-引物cDNA文库(Stratagene)按约30,000噬菌斑每15cm平板进行铺板。硝酸纤维膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上的噬菌斑提呈物在含有30％甲酰胺的预杂交溶液(8ml/提呈物)中在50℃搅动温育1小时。将标记的人和大鼠探针加入预杂交溶液中，继续在50℃温育过夜。将滤膜在室温在2XSSC/0.1％SDS中洗涤两次，在37℃在2XSSC/0.1％SDS中洗涤一次，在42℃在2XSSC/0.1％SDS中洗涤一次。滤膜在KodakX-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏曝光27小时。
将在复制的提呈物中显示阳性信号的4个噬菌斑重新划线于含镁(LBM)/羧苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基平板上，并在37℃温育过夜。将噬菌斑用Hybond
Figure C0182025000891
滤膜(AmershaM)提呈，按初次筛选的方法探针检测，并在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏曝光24小时。
将12个给出阳性信号的噬菌斑转至含有10mM Tris-HCl和1mMMgCl2的低Mg++噬菌体稀释剂中。使用T3和T7引物(分别为SEQ IN NO：13和14)和下面的反应条件用PCR测定插入子的大小。样品在94℃温育4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序：94℃15秒；50℃30秒；72℃1分钟。
6个样品产生大小范围为300碱基至1kb的不同带。通过与辅助噬菌体共感染来释放噬菌粒，并重新环化制备Bluescript
Figure C0182025000892
SK-(Stratagene)。所获得的克隆在LBM/羧苄青霉素(100mg/ml)中培养过夜。DNA用Promega Wizard
Figure C0182025000893
miniprep试剂盒(Madison，WI)按照厂商推荐的程序进行分离。纯化DNA的EcoRI限制酶分析证明了用PCR检测的分子量。插入DNA用分别列于SEQ ID NO：40和41的引物M13和M13反向.1进行测序。
5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′(SEQ ID NO：40)
5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′(SEQ ID NO：41)
测序按实施例4中的介绍进行。
在6个克隆中，只有被称为10.3-1和10.5-2的两个克隆提供了序列信息，并且是相同的600bp片段。该600bp序列与人αd的相应区域有68％的同一性，与人CD11a有40％的同一性，与人CD11c有58％的同一性，与小鼠CD11b有54％的同一性。然后将该600bp片段用来分离编码可能的小鼠αd同源物的更完整的cDNA。
将一个λZAP
Figure C0182025000901
II(Stratagene)中的小鼠脾cDNA文库(寡聚dT和随机引物)按约2.5×104噬菌斑/15cmLBM平板进行铺板。将噬菌斑提呈到Hybond尼龙转移膜上(Amersham)，用0.5M NaOH/1.5M NaCl变性，用0.5M Tris碱/1.5M NaCl/11.6HCl中和，并用2XSSC洗涤。用紫外线照射的方法将DNA交联到滤膜上。
使用按上文所述方法预先标记的探针10.3-1和10.5-2对约500,000个噬菌斑进行了筛选。将探针加入预杂交溶液中并在50℃温育过夜。滤膜在室温在2XSSC/0.1％SDS中洗涤两次，在37℃在2XSSC/0.1％SD5中洗涤一次，在42℃在2XSSC/0.1％SDS中洗涤一次。滤膜在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏曝光24小时。将14个在复制提呈物上给出阳性信号的噬菌斑用于第二轮筛选，第二轮筛选与第一轮筛选基本相同，除了增加最后的高严格条件的洗涤，高严格条件的洗涤为，在50℃在2XSSC/0.1％SDS中，在50℃在0.5XSSC/0.1％SDS中，在55℃在0.2XSSC/0.1％SDS中。滤膜在Kodak X-OmatAR胶片上在-80℃用增感屏曝光13小时。
将18个阳性噬菌斑转移到低Mg++噬菌体稀释剂中，并按上面的介绍用PCR扩增来测定插入子的大小。7个样品给出范围为600bp至4kb的阳性带。纯化DNA的EcoRI限制酶分析证明了用PCR观察到的大小，DNA用引物M13和M13反向.1(分别为SEQ ID NO：40和41)进行测序。
一个被命名为B3800的克隆含有一个相当于人αd19A2克隆的5′端下游200bp的区域的4kb插入子，并包括3′非翻译区的553个碱基。克隆B3800显示与人αd的相应区域有77％的同一性，与人CD11a的相应区域有44％的同一性，与人CD11c的相应区域有59％的同一性，与小鼠CD11b的相应区域有51％的同一性。第二个克隆A1160是一个1.2kb的插入子，该插入子与人αd编码区的5′端起始甲硫氨酸下游约12核酸处并列。克隆A1160显示与人αd的相应区域有75％的同一性，与人CD11a的相应区域有46％的同一性，与人CD11c的相应区域有62％的同一性，与小鼠CD11b的相应区域有66％的同一性。
片段更接近人克隆19A2的5′端的克隆A1160，长度为1160碱基，与克隆B3800共有一段起始于碱基205并延续到碱基1134的重叠区域。克隆A1160具有一个在B3800的重叠区域中不存在的110碱基的插入(克隆A1160的碱基704-814)。该插入可能位于外显子-内含子连接区域[Fleming，et al.J.ImmunoL 150：480-490(1993)]，在克隆A1160和B3800的随后连接前移去。
推定的小鼠αd克隆的5′cDNA端的快速扩增
使用RACE PCR[Frohman，″RACE：Rapid Amplification of cDNAEnds，″in PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis，et al.(eds.)pp.28-38，Academic Press：New York(1990)]来获得丢失的推定小鼠αd克隆的5′端序列，包括5′非翻译序列和起始甲硫氨酸。按照厂商推荐的程序使用一个小鼠脾RACE-Ready试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)。设计两个反义的、基因特异的引物---A1160 RACE1-初级和A1160RACE2-嵌套式(SEQ ID NO：42和43)来进行初级和嵌套式PCR。
5′-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3′(SEQ ID NO：42)
5′-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3′(SEQ ID NO：43)
引物SEQ ID NO：42和43分别对应于从5′端302和247碱基起始的区域。使用5′锚引物(SEQ ID NO：44)和试剂盒提供的小鼠脾cDNA按上文所述方法进行PCR。
5′-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3′
(SEQ ID NO：44)
PCR产物电泳显示了一条大小约280碱基的带，将其用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照厂商推荐的程序亚克隆。培养10个所获得的克隆，分离DNA并测序。用这种方法鉴定了5′序列的一个另外60碱基，它对应于SEQ ID NO：45的碱基1至60。
小鼠cDNA和预测的氨基酸序列的特征
编码人αd的推定同源物的小鼠cDNA的一个合并序列示于SEQ IDNO：45。虽然人和小鼠克隆的外部结构域之间的同源性很高，但胞质结构域的同源性仅为30％。所观察到的差异可能表明人和小鼠蛋白之间的C末端功能差异。另外胞质结构域的差异也可能由剪接差异引起，或表明另外的β2整联蛋白基因的存在。
在氨基酸水平，由小鼠cDNA可预测一种蛋白(SEQ ID NO：46)，该蛋白与小鼠CD11a有28％的同一性，与小鼠CD11b有53％的同一性，与人CD11a有28％的同一性，与人CD11b有55％的同一性，与人CD11c有59％的相，与人αd有70％的同一性。将人αd的胞质结构域的氨基酸序列与同样长度的其推定的小鼠同源物进行比较，结果显示这些区域具有相同的长度但却有不同的一级结构。这些区域的序列长度相似表明是种间变化而不是剪接变体形式。当与上文实施例20中的预测大鼠多肽进行比较时发现，小鼠和大鼠胞质结构域显示大于60％的同一性。
实施例29
分离另外的小鼠αd cDNA克隆用于序列验证
为验证实施例28中介绍的小鼠αd的核酸和氨基酸序列，分离另外的小鼠序列用于证明。
使用一个小鼠脾随机引物文库和一个λZAP
Figure C0182025000921
II中的小鼠胸腺寡聚dT-引物cDNA文库(Stratagene)，用两种同源性αd探针杂交的方法来进行小鼠cDNA的分离。文库按约5×105噬菌斑每15cmLBM平板进行铺板。将噬菌斑提呈到Hybond
Figure C0182025000922
尼龙膜上(Amersham)，将膜变性(0.5M NaOH/1.5M NaC l)、中和(0.5M Tris碱/1.5M NaCl/11.6HCl)、洗涤(2XSSC盐溶液)。用紫外线照射的方法将DNA交联到滤膜上。
探针使用下面介绍的引物在如下条件下的PCR反应中制备。样品在94℃温育4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序(94℃15秒、50℃30秒、72℃1分钟，使用Perkin-Elmer 9600热循环仪。
3′探针长约900碱基并跨越从核苷酸2752至3651的区域(SEQ IDNO：1中)(5′→3′)，并用分别示于SEQ ID NO：69和74的引物11.b-1/2FOR11和11.b-1/1REV1来制备。该探针用于第一套提呈。
5′探针长约800碱基并跨越从核苷酸149至946的区域(SEQ IDNO：1中)(5′→3′)，并用分别示于SEQ ID NO：50和85的引物11.b-1/2FOR1和11.a-1/2REV2来制备。该探针用于第二套提呈。
在第三套提呈中，上面介绍的两种探针一起用于相同的平板。
使用上面介绍的两种探针对约500,000个噬菌斑进行筛选，探针按实施例20种介绍的相同方法进行标记。将标记探针加入含有45％甲酰胺的预杂交溶液中并在50℃温育过夜。滤膜在室温(22℃)在2XSSC/0.1％SDS中洗涤两次，最后一次洗涤在50℃在2XSSC/0.1％SDS中进行，在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏放射性自显影19小时。
对至少在复制的提呈物上给出阳性信号的13个噬菌斑进行第二轮筛选，第二轮筛选按初次筛选的介绍进行，除了以下变化，3′和5′标记引物都用于杂交，并加上另外一次使用2XSSC/0.1％SDS在65℃的最后洗涤。按上面的介绍进行2.5小时的放射性自显影。
将给出阳性信号的13个噬菌斑(命名为MS2P1至MS2P13)转入低Mg++噬菌体稀释剂中。在上面所述相同条件下，使用能与ZAP
Figure C0182025000931
II中Bluescript噬菌粒退火的T3和T7引物(序列已在前面介绍)，用PCR扩增(Perkin-Elmer 9600 thermocycler)来测定插入子的大小。条带大小在500碱基至4kb的范围内。噬菌粒用M13和M13反向.1(分别为SEQ ID NO：40和41)分离、制备和测序。对13个克隆中的5个：MS2P-3、MS2P-6、MS2P9、MS2P-12、MS2P-13进行了测序，而且它们一起，表示了从5′端的约碱基200到3′末端的第一个终止密码子后约300碱基的区域。
自动测序按实施例4中的介绍进行。首先使用M13和M13反向.1引物(分别为SEQ ID NO：40和41)来测定每个克隆的末端序列，并确定其相对于构建体#17(SEQ ID NO：45)的位置。然后每个克隆用对特定区域适当的引物(列于下面)进行完全测序。
11.b-1/2FOR 15′-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3′
(SEQ ID NO：50)
11.a-1/1FOR25′-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3′
(SEQ ID NO：60)
11.a-1/1FOR35′-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3′
(SEQ ID NO：61)
11.b-1/2FOR45′-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3′
(SEQ ID NO：62)
11.b-1/2FOR55′-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3′
(SEQ ID NO：63)
11.b-1/2FOR65′-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3′
(SEQ ID NO：64)
11.b-1/2FOR75′-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3′
(SEQ ID NO：65)
11.b-1/2FOR85′-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3′
(SEQ ID NO：66)
11.b-1/2FOR95′-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3′
(SEQ ID NO：67)
11.b-1/2FOR105′-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3′
(SEQ ID NO：68)
11.b-1/2FOR115′-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3′
(SEQ ID NO：69)
11.b-1/2FOR125′-GTCACAGAGGGAACCTCC-3′
(SEQ  ID NO：70)
11.b-1/2FOR135′-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3′
(SEQ  ID NO：71)
11.b-1/2FOR145′-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3′
(SEQ  ID NO：72)
11.b-1/2FOR155′-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3′
(SEQ ID NO：73)
11.b-1/2REV25′-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3′
(SEQ ID NO：74)
11.b-1/2REV35′-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3′
(SEQ ID NO：75)
11.b-1/2REV45′-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3′
(SEQ ID NO：76)
11.b-1/2REV55′-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3′
(SEQ ID NO：77)
11.b-1/2REV65′-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3′
(SEQ  ID NO：78)
11.b-1/2REV75′-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3′
(SEQ ID NO：79)
11.b-1/2REV85′-GATCCAACGCCAGATCATACC-3′
(SEQ ID NO：80)
11.b-1/2REV95′-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3′
(SEQ ID NO：81)
11.b-1/2REV105′-CACGTCCCCTAGCAGTGTCAG-3′
(SEQ ID NO：82)
11.b-1/2REV115′-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3′
(SEQ ID NO：51)
11.b-1/2REV 125′-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3′
(SEQ ID NO：83)
11.b-1/2REV 135′-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3′
(SEQ ID NO：84)
11.a-1/1REV15′-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3′
(SEQ ID NO：85)
11.a-1/1REV25′-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3′
(SEQ ID NO：86)
将序列编辑、并列，并与以前分离的小鼠αd序列(构建体#17，SEQ IDNO：45)进行比较。
新序列比对揭示，在构建体#17中有一个始于核苷酸2308的18碱基删除，该删除没有造成阅读框移动。按上面的介绍测序的克隆MS2P-9也显示相同的18碱基删除。该删除被发现在50％的含有该区域的小鼠克隆中发生，但在大鼠或人的αd克隆中却没有检测到。18碱基删除的特征是一个12碱基的回文序列AAGCAGGAGCTCCTGTGT(SEQ IDNO：91)。这个核酸序列中的反向重复序列是自身互补的，并可能形成一个向外的环，在逆转录过程中导致切除。含有该额外的18碱基的小鼠αd序列列于SEQ ID NO：52，其推导的氨基酸序列列于SEQ ID NO：53。
实施例30
小鼠中原位杂交
接着确定小鼠αd的组织分布，来提供与实施例6中介绍的人αd分布的比较。
采用体外RNA转录并整合32S-UTP(Amersham)的方法，从一个DNA模板中制备了一个单链的200bp的mRNA探针，该探针对应于小鼠cDNA胞质尾区域的核苷酸3460至3707。
使用放射性标记的单链mRNA探针对小鼠全胚胎(受精后11-18天收集)和不同的小鼠组织包括脾脏、肾脏、肝脏、小肠和胸腺进行原位杂交。
将组织切成6um厚，并粘附在Vectabond(Vector Laboratories，Inc，Burlingame，CA)包被的载玻片上，贮存于-70℃。在使用前，将载玻片从-70℃中取出，在50℃放置约5分钟。将切片在4％低聚甲醛中4℃固定20分钟，用不断提高的乙醇梯度(75-95-100％)在4℃进行脱水，每个浓度1分钟，在室温下空气干燥30分钟。将切片在70％甲酰胺/2XSSC中在70℃变性2分钟，在2XSSC中漂洗2次，用上面介绍的乙醇梯度脱水并空气干燥30分钟。杂交在55℃在含有6×105cpm/切片的35S标记核酸探针和在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中终浓度为50％的甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris-HCl、pH 7.5、10％硫酸葡聚糖、1XDenhardts溶液、100mM二硫苏糖醇(DTT)和5mMEDTA的溶液中过夜(12-16小时)进行。杂交后，切片在室温在4XSSC/10mM DTT中洗涤1小时，在60℃在50％甲酰胺/2XSSC/10mM DTT中洗涤40分钟，在室温在2XSSC中洗涤30分钟，在室温在0.1XSSC中洗涤30分钟。将切片脱水，空气干燥2小时，用Kodak NTB2照相乳胶包被，空气干燥2小时，显色(在完全黑暗中在4℃保存后)，并用苏木精/伊红负染。
脾组织显示主要在红髓的强信号。这一图谱与脾脏中组织巨噬细胞的分布一致，但不排除其他的细胞类型。
实施例31
小鼠表达构建体的制备
为构建包含与人αd显示同源性的小鼠cDNA序列的表达质粒，将来自克隆A1160和B3800的插入子连接。但在该连接前，将一段含有一个起始甲硫氨酸的5′前导序列加入到克隆A1160。设计命名为“5′PCR前导”(SEQ ID NO：47)的引物，该引物含有：(1)在位置1-6为相同的便于消化的非特异性碱基；(2)便于亚克隆到表达载体中的位置7-12的BamI位点(SEQ ID NO：47中下划线)；(3)位置13-18的一个共有的Kozak序列；(4)含有一个起始甲硫氨酸密码子(SEQ ID NO：47中粗体)的信号序列；和(5)特异性地与克隆A1160的5′序列重叠以便于引物退火的另外31个碱基。使用第二个称为“3′末端frag″(SEQ ID NO：48)的引物和引物“5′PCR前导”来从克隆A1160中扩增插入子。
5′-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3′
(SEQ ID NO：47)
5′-GCTGGACGATGGCATCCAC-3′(SEQ ID NO：48)
所获得的PCR产物不能被BamHI消化，说明限制酶切位点前的碱基数目不足，抑制了酶的识别。增加5′引物(SEQ ID NO：47)中BamHI位点前“尾”序列的长度，在第一次PCR扩增产物上重复PCR。设计了一个称为mAD.5′.2(SEQ ID NO：49)的5′引物，它在位置1-4带有额外的非特异性碱基，并含有特异性地与前面所用的“5′PCR前导”引物序列重叠的另外20个碱基。
5′-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3′(SEQ ID NO：49)
将引物“mAD.5′.2”和“3′端fraG″同时用于以第一次扩增的产物为模板的PCR反应中。将获得的第二次PCR产物按照厂商推荐的程序亚克隆到质粒pCRtmII(Invitrogen)中，并转化到One shot感受态细胞中(Invitrogen)。用BamHI和EcoRI限制酶切分析了一个含有PCR产物的克隆，并进行测序。证实了序列之后，用BamHI和EcoRI消化和凝胶纯化分离插入子。
用EcoRI和NotI消化、凝胶纯化从克隆B3800中分离插入子，并加入一个含有扩大的A1160BamHI/EcoRI片段的连接反应中。连接在14℃进行14小时。在连接反应中加入用BamHI和NotI消化的载体pcDNA.3(Invitrogen)及额外的连接酶，继续反应12小时。将一等分物反应混合物转化到大肠杆菌感受态细胞中，培养所获得的克隆，使用引物11.b-1/2FOR1和11.b-1/2REV11(分别为SEQ ID NO：50和51)用PCR分析来对一个阳性克隆进行鉴定。这些引物跨越了A1160和B3800片段，因此检测到扩增产物就表明两个片段已经连上。阳性克隆的序列用列于SEQ ID NO：50和51的引物进行验证，这对引物能够扩增起始甲硫氨酸后从碱基100至1405。
实施例32
一种敲除小鼠的构建
为更精确地评价推定的小鼠αd cDNA编码的蛋白的免疫学作用，设计了一种“敲除”小鼠，在这种小鼠中，编码推定αd同源物的基因组DNA序列用同源重组破坏。这样由被破坏的基因编码的蛋白的意义就可以用编码蛋白的缺乏来评价。“敲除”小鼠的制备在Deng，et a1.Mol.Cell.Biol.13：2134-2140(1993)中介绍。
设计这样的小鼠从构建含有准备用同源重组事件“敲除”的基因的质粒开始。使用小鼠cDNA的一个750碱基对片段(相当于SEQ ID NO：45中核苷酸1985至2733)从一个λFIXII基因组文库中鉴定一个编码推定的小鼠αd同源物的小鼠基因组序列。初次的筛选产生了14个阳性克隆，其中7个用第二次筛选来证实。从两个给出最强信号的噬菌斑获得液体裂解物，并用传统的方法分离λDNA。限制酶切图谱和Southern分析证明了其中一个命名为14-1的克隆的正确性。用NotI消化分离插入DNA。将该片段克隆到Bluescript
Figure C0182025000981
SKII+。
为鉴定一个约为9-14kb的限制酶切片段(据称此长度为使同源重组事件的可能性最大)，用750bp cDNA探针进行Southern杂交。在杂交前，对克隆14-1建立限制酶切图谱。一个12kb的片段被鉴定为可能的候选物，并将该片段亚克隆到pBluescript
Figure C0182025000982
SKII+中一个位置，使小鼠DNA的侧翼为胸苷激酶编码盒。用一种I结构域探针(相当于SEQ ID NO：45中核苷酸454-1064)对该克隆进一步分析表明，该克隆不含I结构域编码序列。
使用相同的I结构域探针，对λFIXII基因组文库进行再次筛选。开始，检测到了6个阳性克隆，其中一个在第二次筛选时保持阳性。由此克隆分离的DNA在Southern分析中与一种I结构域探针反应强烈。但用原来的750bp探针没有检测到任何反应，这说明此克隆包括SEQ ID NO：45的核苷酸1985-2773的5′区域。
另外，不能与750bp探针杂交可能表明，此克隆是整联蛋白蛋白家族的另一种成员。为确定这种解释是否正确，将13kb的插入子亚克隆到pBluescript
Figure C0182025000983
SKII+。纯化的DNA用相当于SEQ ID NO：52中的αdI结构域核酸序列441-461、591-612、717-739和反向的898-918的引物进行测序。仅在使用第一个4441-4461引物时获得了序列信息，并且仅有I结构域的5′-most外显子被有效扩增。I结构域的剩余部分没有被扩增。因此，所获得的克隆含有小鼠αd基因的外显子6和该外显子的5′和3′端的内含子序列。外显子7不在克隆中。测序后，制备了一个含有新霉素抗性和胸苷激酶基因的构建体。
将新霉素抗性(neor)基因以打断基因组小鼠DNA的蛋白编码序列的方式插入到所获得的质粒中。因此所获得的质粒在小鼠基因组DNA序列中含有一个neor基因，所有这些都位于一个胸腺激酶编码区域。需要用这种方式构建的质粒来使同源重组优于随机重组[Chisaka，etal.Nature 355：516-520(1992)]。
另一种策略被用来制备适用于产生αd敲除小鼠的构建体。将两套寡核苷酸引物交给Genome Systems，Inc.(St.Louis，MO)来对由胚胎干细胞基因组DNA制备的大插入文库进行高严格PCR分析。引物对应于αd中I结构域的第一个和最后一个外显子。鉴定了三个克隆，其中两个(命名为1117和1118)能与两种引物反应，另一个(命名为1119)只能用来自最后一个外显子的引物扩增。
一个小鼠基因组αd DNA的鉴定
从克隆1117和1118的细菌裂解物中按照厂商的指示(GenomeSystems，Inc.)制备质粒DNA。αd插入子使用寡核苷酸madk.f1(SEQID NO：104)和madk.r1(SEQ ID NO：105)和madk.r2(SEQ ID NO：106)用PCR进行验证。
madk.fl  SEQ ID NO：104
TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GC
madk.r1  SEQ ID NO：105
GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGG
madk.r2  SEQ ID NO：106
TAT AGC ATA GCA AAT GAT CC
两种质粒分成等分物用限制内切酶BamHI、PstI、SacI、SalI、SmaI、XbaI和XhoI(Boehringer Mannheim)消化。将每个消化样品在0.8％琼脂糖凝胶上分开，并将多核苷酸转移到Hybond
Figure C0182025000991
-N+核酸转移膜上(Amersham)进行分析。印迹用32P随机标记引物DNA为探针进行检测，32P随机标记引物用1.6kb模板制备，该模板以寡核苷酸madfor 1(SEQ ID NO：107)和madrev 1(SEQ ID NO：108)为引物用PCR产生。
madforl  SEQ ID NO：107
ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATC
madrevl  SEQ ID NO：108
TCG AGA TCC ACC AAA CTG CAD
杂交在含有50％甲酰胺的SSPE中在42℃过夜进行。标记的印迹在2XSSPE中在室温洗涤5次。放射性标记的带用将印迹在KodakX-Omat放射性自显影胶片上在-70℃曝光2小时来显示。
从克隆1118鉴定了两个感兴趣的片段：一个4.1kb的SacI片段和一个8.3kb的XbaI片段。将克隆1118的SacI和XbaI消化的全部样品内容物不经进一步纯化连接到载体pBluescript KS+中，连接后，将全部反应内容物转化到大肠杆菌TG1/λ SmR菌株的钙-感受态细胞中。分离产生的克隆，在含有辅助病毒M13KO7的200μl选择培养基中培养过夜来复制单链DNA。然后将取自每个孔的上清液10μl点样到Hybond
Figure C0182025001001
-N+转移膜上，用上面介绍的相同探针和程序进行杂交。由9个阳性克隆扩大培养，并用Wizard
Figure C0182025001002
Plus Miniprep DNA纯化系统(Progema)从每个培养物中分离质粒DNA。用限制酶消化和PCR证实分离的质粒中插入子的存在和大小。
使用载体引物T3和T7以及对应于小鼠αd序列的寡核苷酸引物对三个克隆进行序列测定。这三个克隆与小鼠cDNA用Geneworks软件进行的序列比较表明，所有这三个克隆都同时含有小鼠αd的外显子1和外显子2。被称为A的最长克隆是一个8280kb长的XbaI克隆。另两个较短的克隆被称为E和H，它们是相同的4112kb长的SacI克隆。选择8280kb克隆进行进一步的发展。
实施例33
兔αd的克隆
兔cDNA文库的构建和筛选
大鼠和小鼠中人αd同源物的鉴定促进了对兔同源物的研究，兔同源物在上文介绍的人类疾病的兔模型中将十分有用。
使用Invitrogen FastTrack试剂盒(San Diego，CA)以及试剂盒提供的试剂按照厂商推荐的程序从一个全兔脾脏中制备Poly A+RNA。从1.65克组织中，分离了73μg的Poly A+ RNA。使用一个来自Stratagene(La Jolla，CA)的试剂盒来用兔脾RNA构建一个ZAP
Figure C0182025001011
表达cDNA文库。将获得的cDNA直接克隆到pBK-CMV噬菌粒载体的λ臂的EcoRI和XhoI位点。用Gigapack
Figure C0182025001012
II Gold(Stratagene)将λ臂包装到噬菌体颗粒中。所获得的文库的滴度估计为8×105颗粒，平均插入大小为1.2kb。
通过铺板噬菌斑连片生长将文库扩增一次，收集细胞裂解物。将扩增后的文库按约30,000噬菌斑形成单位(pfu)每150mm大肠杆菌平板进行铺板，将产生的混合物在37℃温育12-16小时使噬菌斑形成。将噬菌体DNA转移到Hybond
Figure C0182025001013
N+尼龙膜上(Amersham，ArlingtonHeights，Illinois)。膜用两种随机引物放射性标记的小鼠αdPCR DNA探针的混合物进行杂交。第一个探针用一个跨越SEQ ID NO：52的核苷酸149-946的PCR产物制备。第二个探针来自跨越SEQ ID NO：52的核苷酸2752-3651的PCR产物。探针用随机引物标记法(BoehringerMannheim随机引物DNA标记试剂盒)进行标记，反应混合物通过一个Sephadex
Figure C0182025001014
G-50柱来去除未掺入的核苷酸。杂交溶液由5XSSPE、5XDenhardts、1％SDS、40％甲酰胺和1×106dpm/ml标记探针组成。杂交在42℃进行16-18小时。滤膜在2XSSPE/0.1％SDS中在室温下充分洗涤，并在X-射线胶片上曝光来显示任何杂交的噬菌斑。
鉴定了两个明显与人αd序列同源的克隆。克隆#2长约800bp，并与人αd的5′末端匹配。克隆#2包括一个起始甲硫氨酸和完整的前导序列。克隆#7长约1.5kb并包括一个起始甲硫氨酸。克隆#7的5′末端与克隆#2的5′末端重叠，而3′末端序列在I结构域序列之后的一个位点终止。用引物步行法对克隆#7进行完整的测序。克隆#7的核苷酸和推导的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO：100和101。
由克隆#2和克隆#7确定的兔αd的预测N末端氨基酸序列表明，该蛋白与人αd有73％的同一性，与小鼠αd有65％的同一性，与小鼠CD11b、人CD11b和人CD11c有58％的同一性。克隆#2的核酸序列列于SEQ ID NO：92，其预测的氨基酸序列列于SEQ ID NO：93。
使用标记的兔克隆#7并对获取该片段的cDNA文库再次进行筛选，来设法分离全长的兔αd cDNA。鉴定了25个另外的克隆，其中一个称为克隆49的被确定为最大。用嵌套式删除技术对克隆49进行完整的测序。克隆49的核苷酸和氨基酸序列分别列于SEQ ID No：102和103。因为克隆#7和#49不重叠，设计寡核苷酸作为使用第一链兔脾cDNA的PCR中的引物，来分离丢失的序列。
这两个部分克隆的推导氨基酸序列与其他白细胞整联蛋白的氨基酸序列的关系介绍于表1。
表1
β2整联蛋白家族成员在氨基酸水平的同一性百分比
Figure C0182025001021
*如果＜25％同一性，仅为随机比对，没有意义。
分离了兔αd克隆，就可以表达该蛋白，既可以表达于转染细胞的表面，也可以以可溶性的全长或截短形式表达。然后将该蛋白用作免疫原来制备单克隆抗体，来用于人疾病状态的兔模型。
实施例34
猴αd的分离
制备亲和柱
为制备一种能从猴脾脏中分离αd的亲和柱，将抗人αd抗体212D和217L各10mg对含有0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH 8.3的偶联缓冲液透析过夜。按照厂商推荐的程序制备约1.0g的CNBr Sepharose
Figure C0182025001022
4B(Pharmacia，Piscataway NJ)，将1.0mL树脂与每种透析的抗体混合。所产生的浆在4℃旋转过夜进行混合。在Beckman台式离心机中在1000rpm离心5分钟，获取偶联的树脂。收集未吸附的上清液部分，用分光光度计分析未偶联蛋白的存在。结果显示，所有可用的抗体都已与凝胶基质结合。树脂上的未偶联的活性基团用1M乙醇胺在室温封闭2小时，树脂在偶联缓冲液中经一系列高和低pH改变进行洗涤，然后用含有0.1M NaC2H3·3H2O和0.5M NaCl、pH 4.0的乙酸缓冲液进行最后洗涤。所有的树脂都在偶联缓冲液中贮存于4℃。
猴脾脏的制备
雌性猕猴脾脏获自华盛顿大学的Regional Primate Center。用100U/ml的胶原酶D(Sigma)注射脾组织，并将其切成小片。然后将组织片悬浮于小体积的含有50mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、pH 8.0和1.0％Triton X-100
Figure C0182025001031
的裂解缓冲液，并贮存于-70℃。加入蛋白酶抑制剂PLA(抑胃酶肽A、亮抑酶肽和抑酶肽的混合物，均来自Sigma)和4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸(AEBSF)(NovaBiochem)以防止贮存过程中的蛋白酶解。贮存组织直到获得6个猕猴脾脏。
将6个猴的脾脏混合，在一个Waring搅拌器中在含有25mM Tris、0.15M NaCl、002％NaN3、1.0％Triton1X PLA和0.1mM AEBSF的TSA裂解缓冲液中匀浆，共进行三个循环，每次10秒钟。收集裂解物，并在一个旋转平台上4℃放置1小时。然后在Beckman台式离心机中以3000rpm离心15分钟。收集上清液，并弃去沉淀的细胞残渣。共收集了总体积为550ml的裂解物，将裂解物在4℃与预先在1M乙醇胺中处理以封闭反应位点的CNBr Sepharose
Figure C0182025001033
温育2小时。温育后，离心移去树脂，收集上清液。
亲和纯化和测序
将按上述方法制备的脾裂解物分成两半，分别与212D和217L制备的CNBr Sepharose
Figure C0182025001034
凝胶混合。将产生的浆在4℃旋转混合3天，然后在Beckman台式离心机上以1500rpm离心10分钟收集未吸附的部分，并保存。将凝胶转移到一个15ml离心管中，在几个体积的D-PBS中顺序洗涤。将每种凝胶的100μl的等分物在含有0.1M Tris-HCl、pH 6.8、2％SDS、20％甘油和0.002％溴酚蓝、10％β-巯基乙醇(终浓度5％)的还原型样品缓冲液中迅速煮沸，并上6.0％聚丙烯酰胺SDS凝胶(SDS-PAGE)，分析蛋白。凝胶用考马斯染色，检测到伴随大量本底蛋白的、与αd和CD18分子量一致的蛋白。
为提高具有与αd相似分子量的蛋白的纯化，将每种结合了蛋白的凝胶的两个100μl等分物用不同的方法进行洗涤。在一种方法中，凝胶在含有150mM NaCl、10mM Tris、1.0％Triton-X100
Figure C0182025001041
pH 8.0的缓冲液中洗涤数次。在第二种方法中，凝胶用相同方法进行洗涤，但结合的蛋白在最后一次洗涤中用0.05M甘氨酸、pH 2.4进行洗脱。与前面一样，洗脱蛋白在还原型样品缓冲液中迅速煮沸，并在6.0％SDS-PAGE上分析。从在低pH甘氨酸缓冲液中洗涤的树脂中，考马斯染色仅检测到与αd和CD18一致的蛋白，因此选择这种方法。为分离用于测序的蛋白，剩余的CNBr Sepharose
Figure C0182025001042
树脂按前面的介绍洗涤四次，将约四分之三的树脂悬浮于2ml的0.05M甘氨酸、pH 2.4中，剧烈摇匀。离心3分钟使树脂沉淀，并收集未吸附的部分。然后将凝胶在甘氨酸缓冲液中再洗涤一次，将此次的洗涤物与前面的未结合部分混合。将此混合部分在4℃对D-PBS透析过夜，中间换液两次。透析后，将样品干燥使体积减少为1ml。
为进行测序，将洗脱物在7.0％的分离胶上分开，按实施例2介绍的方法将蛋白转移到Immobilon(PVDF)膜(Millipore Bedford，MA)上。简而言之，将凝胶在去离子水中洗涤一次，并在含有10％甲醇的10mM环己胺-丙磺酸缓冲液pH 10.5(CAPS)中平衡15至45分钟。将PDVF膜在甲醇和去离子水中洗涤，然后在CAPS转移缓冲液中平衡15至30分钟。将蛋白在70伏转移3小时转移到PDVF膜上，然后将其在经过过滤的0.1％R250考马斯染料中染色10分钟。膜在50％甲醇/10％乙酸中洗涤脱色三次，每次洗涤10分钟，在过滤水中再洗涤一次，并干燥。
从212D和217L偶联的树脂中都检测到约150kD和95kD的主要蛋白带，这两条蛋白带与前面在分析级凝胶上检测到的蛋白一致。在来自217L偶联树脂的膜上观察到了位于紧靠150kD蛋白下方的一条清晰度稍差的带，但在膜干燥后检测不到该带。从每张膜上切下150kd带，用Applied Biosystems(Foster City，CA)473型蛋白测序仪按照厂商推荐的程序直接测序。
结果显示，用212D偶联树脂分离的猴蛋白的氨基端序列具有列于SEQ ID NO：109的氨基酸序列。而用217L偶联树脂分离的蛋白的氨基端具有列于SEQ ID NO：110的序列。SEQ ID NO：110中的“X”表示一个未确定的残基。
212D-偶联蛋白SHQ ID NO：109
NLDVEEPTIFQEDA
217L偶联蛋白SEQ ID NO：110
NLDVEEPTIFXEDA
猴序列与人αd及β2整联蛋白家族中的的其他α链的氨基端序列的比较示于表2
表2
猴αd氨基端序列与人β2整联蛋白α亚基的比较
蛋白        SEQ ID NO：    氨基端序列
猴αd       111            F N L D V E E P T I F Q E D A
人αd       112            F N L D V E E P T I F Q E D A G G
人CD11c     113            F N L D T E E L T A F V D S A G
人CD11b     114            F N L D T E N A M T F Q E N A R G
基于序列同一性，结论为，212D和217L都能识别猴和人的αd。
实施例35
217L抗原的特征分析
基于前面实施例中从猴脾脏中沉淀的蛋白的N末端序列，可以得出结论，212D和217L能识别猴和人的αd。但免疫细胞化学(ICC)分析和免疫沉淀实验表明，217L具有212D没有的额外反应特性。使用针对所有α链的抗体的FACS和ICC实验检测到217L与CD11c(最密切相关的白细胞整联蛋白α链)和CD11b的交叉反应性。因此，可能217L还识别αd的构象、糖基化或剪接变体或与αd有序列同源性的新α链。
结节病肺组织(见实施例18)中抗体217L识别的抗原具有独特的分布，与CD11c的染色图谱不重叠，这表明该抗原可能具有生物学意义。因此，为进一步理解217L抗原的意义，需要对该蛋白和编码该蛋白的DNA进行分析，并采用不同的途径来进行。
使用抗体217L来从人树突细胞或外周血中免疫沉淀一种蛋白复合物，接着对沉淀的蛋白进行N末端测序。序列分析将揭示，在外周血细胞上识别的蛋白是否与αd具有氨基端同一性。然后将从树突细胞或外周血细胞沉淀的蛋白用去糖基化酶处理，并与从其他来源沉淀的CD11c和αd进行比较，来提供一级氨基酸序列的分子量比较。
此外，用整个αd cDNA在低严格条件下对由树突细胞RNA制备的cDNA文库进行探针杂交。反应克隆用对整个克隆长度核酸测序进行分析，来确定克隆中是否存在非αd序列。
实施例36
测定αd治疗用途的动物模型
犬中的免疫组织学数据和大鼠与小鼠中的原位杂交已经确定，在脾脏中，αd主要由红髓和淋巴结中的巨噬细胞表达，αd在髓索和窦中被发现。其表达图谱非常类似于已经报道的、用两种单克隆抗体F4/80和SK39确定的两种鼠抗原的表达图谱。而这些小鼠抗原的生化特征已经证明，它们不同于αd，αd很可能确定了与小鼠抗原F4/80和SK39所确定的相同巨噬细胞亚群。
在小鼠中，SK-39阳性巨噬细胞已在脾红髓和淋巴结索中被鉴别，在脾红髓中，它们可能参与从循环中清除外源物质。[Jutila，et al.JLeukocyte Biol.54：30-39(1993)]。SK-39阳性巨噬细胞也被报道位于急性和慢性炎症的部位。而且，聚集在巯基乙酸诱发炎症的腹膜腔中的单核细胞也表达SK39抗原。总结来说，这些发现表明，如果SK39+细胞也是αd +，那么这些细胞在脾中将负责清除外源物质，并参与巨噬细胞起重要作用的炎症。
虽然αd的功能还不清楚，特征研究得更清楚的其他β2整联蛋白已被显示参与非常广泛的粘附事件，包括能促进细胞迁移、加强吞噬、促进细胞-细胞相互作用的事件，以及导致炎症过程上调的所有事件。因此，很有可能，干预正常的αd功能也能干预巨噬细胞在其中起重要作用的炎症。这样的抗炎症作用由下列因素产生：i)阻止巨噬细胞在炎症位点聚集，ii)阻止巨噬细胞在炎症位点激活或iii)干扰巨噬细胞的效应功能，这些效应功能通过特异性的自身免疫应答或作为细胞损伤的旁观者而损伤正常细胞。
有证据表明巨噬细胞在疾病过程中起重要作用的疾病状态包括多发性硬化、关节炎、移植动脉粥样硬化、某些类型的糖尿病和肠道炎症疾病。下面将要讨论的动物模型已经显示能复制这些人类疾病的许多方面。αd抑制剂的功能在这些模型系统中进行了测试，以确定治疗相应人类疾病的可能性是否存在。
移植动脉粥样硬化
心脏移植目前是治疗性干预某些类型的晚期心脏疾病的一种可接受形式。由于使用环孢菌素A已经使一年存活率提高到80％，产生渐进性的移植动脉粥样硬化已成为心脏移植存活一年后死亡的主要原因。最近的研究发现，心脏移植3年后明显的动脉粥样硬化的发生范围为36-44％[Adams，et al.Transplantation 53：1115-1119(1992)；Adams，et a1.Transplantation 56：794-799(1993)]。
移植动脉粥样硬化一般包括能影响整个冠状血管壁的弥漫性、闭塞性、内膜损害，并通常伴随着脂沉积。虽然移植动脉粥样硬化的病理仍不清楚，但它很可能与供体和受体的组织相容性差异相关，并且在本质上是免疫性的。从组织学上讲，变厚的内膜区域主要是巨噬细胞组成，虽然偶尔也能见到T细胞。因此很可能表达αd的巨噬细胞在移植动脉粥样硬化的诱导和/或发展中起重要的作用。在这种情况下，αd功能的单克隆抗体或小分子抑制剂(例如，可溶性的ICAM-R)可以为接受了心脏移植并有产生移植动脉粥样硬化风险的个体提供预防。
虽然心脏移植中的动脉粥样硬化对生命造成了最大威胁，移植动脉粥样硬化也见于其他的实体器官移植，包括肾脏和肝脏。αd阻断试剂的治疗性应用能防止其他器官移植中的动脉粥样硬化，减少移植失败产生的并发症。
大鼠移植动脉粥样硬化的一个模型涉及越过最小组织相容性障碍的异体心脏同种移植。在Lewis心脏同种移植物移植到MHC I和II型匹配的F344受体时，80％的同种移植物至少存活3周，而25％的移植物无限存活。在此低级移植排斥过程中，在供体心脏内形成动脉粥样硬化。120天的同种移植物中的动脉损害一般有弥漫性的纤维状内膜增厚，与在排斥的人心脏同种移植物中发现的移植物动脉粥样硬化损害的表现没有区别。
大鼠用最小组织相容性抗原不匹配的心脏进行移植，例如Lewis至F-344。向移植受体定期给予大鼠αd特异的单克隆抗体或αd的小分子抑制剂。处理被希望来减少在非排斥供体心脏中移植物动脉粥样硬化的的发生。用αd单克隆抗体或小分子抑制剂处理大鼠可以不限于预防性处理。阻断αd功能也可希望来减少巨噬细胞介导的炎症和使移植物中动脉损害回复。
胆固醇饲养兔中的动脉粥样硬化
用一种含有胆固醇补加物的致动脉粥样硬化食物饲养约12-16周的兔会产生覆盖大部分上行主动脉的腔表面的内膜损害[Rosenfeld，et al.Arteriosclerosis 7：9-23(1987)；Rosenfeld，et al.Arteriosclerosis 7：24-34(1987)]。在这些兔中见到的动脉粥样硬化损害与在人中见到的相似。损害中含有大量的T细胞，这些T细胞多数表达CD45RO，这是一种与记忆T细胞有关的标记。约一半的浸润T细胞也表达MHC II类抗原，而且有一些表达IL-2受体，这说明这些细胞大多处于活性状态。
动脉粥样硬化损害的一个方面在胆固醇饲养的兔中发现，但在啮齿动物模型中明显没有，这就是富含泡沫细胞的损害集聚。泡沫细胞型巨噬细胞据信是通过特异性受体摄取了氧化的低密度脂蛋白(LDL)而造成的。氧化的LDL颗粒被发现对某些细胞类型包括内皮细胞和平滑肌细胞是有毒的。巨噬细胞摄取的可能有毒的、氧化的LDL颗粒作为一种激发物，驱使巨噬细胞活化，从而对动脉粥样硬化损害有关的炎症起作用。
已经对兔αd制备了一种单克隆抗体，并用它处理了胆固醇饲养的兔。处理包括预防性给予αd单克隆抗体或小分子抑制剂，来证明αd +的巨噬细胞参与疾病的进程。另外的研究将证明针对αd的单克隆抗体或小分子抑制剂能够使用一种致动脉粥样硬化食物饲养的兔中检测到的血管损害回复。
胰岛素依赖型糖尿病
BB大鼠在鼠龄70-150天时会自发产生胰岛素依赖型糖尿病。使用免疫组化技术，在疾病的早期可以检测到MHC II+类ED1+巨噬细胞对胰岛的浸润。多数巨噬细胞表现为参与细胞残渣或正常细胞的吞噬。在疾病发展时，更多的巨噬细胞被发现浸润到胰岛中，虽然有相当数量的T细胞以及后来的B细胞也被发现聚集在该位点[Hanenberg，et al.Diabetologia 32：126-134(1989)]。
BB大鼠中糖尿病的发展似乎依赖于早期的巨噬细胞浸润和随后的T细胞聚集。用对巨噬细胞有毒的二氧化硅颗粒处理BB大鼠能够有效地阻断早期巨噬细胞对胰岛的浸润。在没有了早期巨噬细胞浸润时，接着的由淋巴细胞群自身攻击造成的组织损害就不会发生。用能阻断T细胞相关的疾病期的单克隆抗体OX-19(大鼠CD5特异)或单克隆抗体OX-8(CD8特异)进行给药也能有效地抑制糖尿病的发展。
巨噬细胞在该模型的病理中所起的核心作用，使得用它来测试αd功能的抑制剂很有吸引力。遗传上预定能产生胰岛素依赖型糖尿病的大鼠用针对αd的单克隆抗体或小分子抑制剂处理，并评价疾病的发展。防止或延迟临床症状开始就证明αd在巨噬细胞对胰岛细胞的损害中起关键作用。
炎性肠病(克隆氏病、溃疡性结肠炎)
用来研究炎性肠病(IBD)的动物模型一般用有毒的刺激物(例如乙酸或三硝基苯磺酸/乙醇)经直肠给药来诱导。这些试剂诱导的结肠炎症是化学或代谢损伤的结果，缺乏与人LBD相关的慢性或自发性复发炎症。但一种最近介绍的使用浆膜下层注射由A型或D型链球菌纯化的肽聚糖-多糖(PG-PS)聚合物的动物模型，似乎是更与人LBD生理相关的模型[Yamada，et al.Gastroenterology 104：759-771(1993)]。
在这个模型中，PG-PS注射到远结肠的浆膜下层。所产生的炎症应答分两个时期，最初是注射三天后的急性发作，接着3至4周后的自发性的慢性期。后期应答在本质上是肉芽肿性的，导致结肠增厚、粘附、结肠节和粘膜损伤。除了粘膜损伤，PG-PS结肠炎经常导致关节炎、贫血和肉芽肿肝炎。该疾病的肠外症状使该模型能用来研究克隆氏病，因为很多患有活动性克隆氏病的病人受到关节疾病和肝胆管炎症的折磨。
肉芽肿损害是慢性炎症的结果，慢性炎症导致单核细胞/巨噬细胞系细胞的聚集和随后激活。在克隆氏病和上述动物模型中存在肉芽肿损害，使其成为αd的单克隆抗体或αd功能的其他抑制剂的有吸引力的临床靶。αd功能的抑制剂被希望来阻止与IBD相关的损害的形成或甚至逆转疾病中所见的组织损害。
关节炎
关节炎似乎是一种多因素的疾病过程，涉及多种炎症细胞类型包括中性粒细胞、T淋巴细胞和吞噬性巨噬细胞。虽然已存在多种关节炎模型，链球菌细胞壁肽聚糖制备物能产生与人类疾病最相似的疾病。
在大鼠中，链球菌细胞壁诱导外周关节炎症，其特征是反复发作的疾病进程和随后缓解，并在几个月后最终导致关节破坏[Cromartie，et al.J.Exp.Med.146：1585-1602(1977)；Schwab et al.Infection and Immunity 59：4436-4442(1991)]。在疾病的慢性期内，单核的吞噬细胞或巨噬细胞据信在滑膜的破坏中起主要作用。而且，能抑制巨噬细胞聚集在滑膜中的试剂能有效地减少炎症和关节炎的病理特征。
巨噬细胞在能导致关节炎的滑膜破坏中起核心作用预示着，针对αd的单克隆抗体或αd功能的抑制剂在治疗这种疾病中有治疗潜力。如同在前面介绍的其他模型一样，预防性地给予αd单克隆抗体或小分子抑制剂，是被希望来阻止或减轻关节炎症和防止滑膜破坏。干预αd功能的试剂也可通过阻止额外的巨噬细胞聚集到关节或阻断巨噬细胞激活来减轻正在进行的炎症。最终结果是逆转正在进行的关节破坏并促进组织修复。
多发性硬化
虽然多发性硬化(MS)的病理原因还不清楚，但一般都认为，该疾病由能够识别中枢神经系统中的自身抗原并激发炎症级联反应的CD4+T细胞介导。所产生的免疫应答导致额外的炎症细胞包括对该病有作用的活化巨噬细胞的聚集。实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)是一种能够复制MS的某些方面的动物模型。最近，能与炎症性巨噬细胞上存在的CD11b/CD18反应的单克隆抗体[Huitinga，et al.Eur.J.Immuslol.23：709-715(1993)]已显示能够阻断临床和组织学的疾病。这些结果表明，αd的单克隆抗体或小分子抑制剂可能在阻断EAE的炎症应答中有效。这样的试剂也在MS的处理中有重要的治疗性应用。
免疫复合物肺泡炎
位于肺部的肺泡管、气管、结缔组织和胸膜间隙的肺泡巨噬细胞代表着肺抵抗吸入的环境物质的第一道防线。应答于物质包括细菌来源的LPS、IFN-γ和免疫复合物的刺激，肺泡巨噬细胞释放多种强炎症介质，包括高反应性的氧自由基和氮中间物。虽然超氧阴离子、过氧化氢和一氧化氮(NO-)在清除病原物中有重要的功能，但这些物质对正常的组织也能产生伤害。
在一个免疫复合物肺泡炎的大鼠模型中，从肺泡巨噬细胞释放的NO-已显示能介导多种肺损伤[Mulligan，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：638-6342(1991)]。NO-也已在其他免疫复合物介导的损伤包括皮肤脉管炎(Mulligan等，上文)中被确认为介质，并在疾病例如肾小球肾炎中可能起作用。
NO-介导的组织损伤不限于有免疫复合物参与的炎症。例如，被试剂如PMA、LPS或IFN-γ刺激的小神经蚀质细胞产生能杀死少突神经蚀质细胞水平的NO-[Merrill，et aL，ImmunoL 151：2132(1993)]。胰岛细胞也被发现对NO-敏感，而巨噬细胞释放这种介质已被认为参与导致糖尿病的组织损伤[Kroncke，et aL，BBRC 175：752-758(1991)]。更近一些时候，已经最终证明了NO-释放在内毒素休克中起作用[MacMicking，et al.Cell 81：641-650(1995)]。当被给予脂多糖(LPS)时，正常野生型小鼠产生严重的、进行性的主动脉压降低，导致死亡。但缺乏诱导的一氧化氮的小鼠在应答于LPS时产生不太严重的动脉压力降低，并在处理中全部存活。
体外试验表明，阻断αd能有效地阻断巨噬细胞(或通常表达αd的白细胞)活化的某些方面，如NO-释放。用IFN-γ刺激的肺泡巨噬细胞在存在抗αd多克隆抗血清(在兔中针对一种αd I结构域多肽制备)时被发现比用对照抗血清处理的巨噬细胞产生明显少的NO-分解产物--亚硝酸盐/硝酸盐。这个发现说明，针对αd特别是针对αd I结构域的单克隆抗体可能是一种潜在的抗炎症试剂，并在MS、糖尿病、肺炎和内毒素休克中有潜在应用。而且，与影响多种白细胞类型功能的CD18相对，αd的有限分布使其成为比CD18更有吸引力的靶，来阻止巨噬细胞(或通常表达αd的白细胞)活化。
大鼠IgG免疫复合物诱导的肺泡炎是广泛使用的、理解急性肺损伤重要的实验模型。这种损伤通过经气管插管向肺部注入抗牛血清白蛋白(BSA)抗体并接着静脉注射BSA来诱导。肺部微气管形成的免疫复合物导致补体激活和中性粒细胞聚集到肺部。很可能，肺部免疫复合物的形成之后接着是白细胞从血中外渗并接着穿过肺上皮。随后释放介质包括自由基、TNF-α和一氧化氮(NO-)从参与疾病进程的活化的内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中释放。疾病的病理特征包括导致水肿和肺泡间隙存在大量红细胞和PMNs的血管通透性增加。
在一个免疫复合物诱导的肺泡炎大鼠模型中对针对αd I结构域特异的多克隆抗血清进行了检测。抗αd多克隆抗血清与抗BSA在同一时间经气管插管导入肺中。接着肺部损伤通过静脉给予BSA和少量的125I标记的BSA(约800,000cpm)来诱导，后一种物质用来定量测量肺损伤产生的水肿。使肺部损伤进行4小时，损伤用肺通透性值来评价，肺通透性值被定义为肺部125I标记的BSA与1.0ml血中存在的标记量比较的比率。一般来说，阳性对照比率的通透性值的范围在0.6到0.8之间，而阴性对照(未接受BSA的大鼠)具有的通透性值范围是0.1-0.2。
初步研究表明，用抗αd多克隆抗血清处理能减少大于50％的肺通透性值，这表明肺损伤的大大缓解。以前，用抗CD18处理能减少60％的通透性值。这些发现表明αd可能是急性肺损伤过程中最重要的β2整联蛋白，但不能精确确定抗血清阻止白细胞从血中渗出或穿过肺上皮的效果。
作为αd缓解肺损伤的另外证据，对支气管肺泡吸出液中的TNF-α水平进行了评价。用抗αd抗血清处理被发现能使TNF-α水平降低约4倍。TNF-α早已被视为急性肺炎中的重要介质，并造成炎症细胞聚集到炎症部位、细胞激活和组织损伤。很可能，抗αd抗血清在免疫复合物肺泡炎的形成过程中阻止静止的肺泡巨噬细胞活化，从而缓解TNF-α和NO-的释放，并减少随后由这些试剂导致的组织损伤和中性粒细胞聚集。
LGL白血病的F344大鼠模型
F344大鼠的LGL白血病最早在本世纪80年代早期至中期作为具有稳定的NK细胞活性的移植性白血病被介绍。这种白血病被认为可以作为人Tγ淋巴瘤和T细胞慢性淋巴细胞白血病的模型[Ward andReynolds，Ain.J.Pathol.111：1-10(1982)；Stromberg，Am.J.Pathol.119：517-519(1985)；Reynolds，et al.J.Immunol.132：534-540(1984)]。这种模型能为研究LGL和NK细胞功能提供充足的细胞。最令人感兴趣的是，如同实施例26中介绍的用仓鼠抗大鼠抗体205C通过FACS分析检测到的那样，这些细胞表面存在αd。因为该发现，对αd在体外(例如，用前面介绍的细胞裂解试验)和体内的作用进行了检测。
LGL白血病的病理特征包括严重的脾大、白色斑点的肝脏、外周淋巴结增大和肺、脑和淋巴结中的点状出血。因为αd存在于正常大鼠脾脏的红髓(脾巨噬细胞上)，而LGL白血病的标志是严重的脾大，因此可以假设，αd阳性的NK肿瘤细胞也可能“返巢”或限制于一种尚待确定的配体，并在此增生。为检验这个假设，将肿瘤细胞放射性标记，并与或不与αd抗体处理一起注射到受体大鼠中。三小时后取出这些动物的脾脏，检测NK肿瘤细胞的存在。下面更完整地介绍所用的方法和实验的结果。
在进行每次实验前2至4周，将获自LGL白血病大鼠的脾脏并按下面的介绍制备的肿瘤细胞过继性转移到受体大鼠中。从前面的组织学研究和FACS分析已经知道，肿瘤的快速增生和产生的脾大发生在过继性转移后约3到4周。在第一个实验中，从一个接受了肿瘤细胞4周的动物中取出脾脏。用钳将脾脏剪切成小片，并将小片在存在D-PBS的条件下通过一个目筛，制备成一种单细胞悬液。将细胞悬液收集到一个50ml离心管中，并在Beckman台式离心机中在室温下以1500rpm离心10分钟。弃去上清液，细胞在30ml D-PBS中重新悬浮。将约5.0ml这种细胞悬液铺于5.0ml的Histopaque上，并将梯度在1500rpm离心30分钟。从这些梯度中收集细胞层，合并，并用血球计数器计数。将细胞数量调节为每个受体大鼠接受1.0×107细胞，并稍微多出一些以抵消洗涤和准备注射过程中的细胞损失。将细胞悬浮于NK“测试培养基”(补加了抗生素的RPMI-1640，补加2％FBS)中，并用10mCi的51铬在37℃标记1小时。温育后，用测试培养基将细胞悬液的体积增加为50ml，并在1200rpm离心10分钟沉淀细胞。弃去上清液，细胞按介绍再洗涤两次。将标记的细胞按1×107细胞/ml悬浮，并在注射到受体大鼠之前，在存在或不存在抗大鼠αd抗体以及一种对照IgG1抗体的情况下进行预温育。将每只动物所用的最终抗体浓度调整为5.5mg/kg或约1mg/动物。每种条件下至少做4只动物。
将受体大鼠称重，并经皮下注射150至200μl的ACE溶液(含0.25ml氯胺酮、0.2ml ACE、0.8ml Rompin)进行麻醉。对每种抗体处理，向动物经静脉注射1.0×107细胞。使用伽马计数器检测约300μl的每种细胞悬液来确定总的注射cpm/大鼠。允许标记的NK细胞在大鼠中循环3小时，然后处死动物，用主动脉穿刺法抽取1.0ml的外周血。从每只动物取出脾脏，称重，并用伽马计数器计数。为测定回到脾脏的细胞百分比，用每分钟计数(cpm)/脾脏除以注射到大鼠中的已知总cpm。为测定外周血中的cpm，假设血液占大鼠总重量的约6.0％，用1.0ml血中的cpm乘以6.0％的动物总重量来确定血液中的总cpm。然后将这个数据除以注射到每只动物中的总cpm，来获得血液中保留的cpm的百分比。
在第一个实验中，使用了抗体226B、226G、226H、226I、20C5B(一种非阻断性CD18抗体)和一种对照抗体。抗体226B和226G与对照抗体和其他两种226抗体相比，能明显减少回到脾脏中的细胞数量。与对照抗体温育后约7％至8％的标记细胞回到脾脏，而与226B和226G温育后约6％的细胞回到脾脏。血液中的总cpm的百分比在0.9％和1.4％之间，除了226B外，不同处理组之间的血液总cpm百分比没有显示明显的差异，226B组比其他组的值低。
在第二个实验中，对上面确定的程序作了几个调整。首先，对每种条件4只动物进行了增加，第二，在过继性转移2.5周后而不是上面介绍的4周后，从荷瘤大鼠中取出脾脏。按准确相同的方法制备NK细胞，并按上面确定的剂量与抗体226B或226G或一种对照抗体温育后注射到受体动物中。同样，允许标记的细胞循环3小时，然后如上处死动物，收集血液和脾脏。此外，从两个动物/环境中取出组织，测定肿瘤细胞的其他位置。这些组织包括肝脏、脑、胸腺、肺、长骨(为骨髓)和肾脏。
结果表明，在对照IgG1中，约32％的肿瘤细胞位于脾脏，而226B和226G中脾脏的标记细胞都显示减少的数量，分别为28％和29％。血液中细胞的百分比对每种抗体都相似，在血液中发现了3到4％的总cpm，226G抗体处理略少于其他两组。
各处理组的组织分布相似，肝脏显示27％的总cpm、脑0.05％、胸腺0.10％、肺15％、肾0.80％、长骨1.3％。
在第三个实验中，增加每种条件下的动物数量(n＝6或7)来设法检测上面三个处理组的统计学差异。同样，使用取自实验前两周用肿瘤细胞注射的动物的脾脏，并用上面介绍的相同方法进行制备。细胞用相同的方式进行标记，注射到动物中并允许循环3小时。在本实验中，由于使用的动物数量大，而只从动物收集血液样品和脾脏。
结果与第二次实验一致，在对照组中约30％的标记细胞被观察到回到脾脏，而在226B抗体处理的细胞只有25％、在226G抗体处理的细胞中只有27％发现于脾脏中。血液值同样在各组间没有显示主要的差异，在对照组中约17％的总cmp发现于血中，而226B和226G处理组分别发现15.8％和14.75％。
为确定3小时是否是检测处理组间差异的最佳时间点，在第四次实验中作了很小的调整。同样，用同样的方法分离和制备细胞，用于注射到受体动物中，除了将另外一种抗CD18抗体20C5B加入到待测抗体的序列中。此外，每个条件只用4只动物。在本实验中，细胞在注射后仅允许循环30分钟，在该时间点上从动物抽取血液和取出脾脏。
在30分钟时间点上，脾脏中的总cpm从在第二次实验和第三次实验中观察到的值减少到12％至13％。在脾样品中所有的处理组没有明显的差异，虽然抗体226B处理组的四只动物中的两只具有略低的值。所有组间的血液值同样相似，在血液中发现约6至7％的总cmp。各血液组之间的唯一明显差异是来自226B和226G抗体处理动物的数值较大的扩散。这些发现表明，αd在白血病细胞返巢至脾脏中起作用。实验表明，返巢需要数小时，而用αd特异性单克隆抗体的最大抑制发生在3小时。
多发性硬化和动脉粥样硬化的猕猴模型
免疫细胞化学染色和免疫沉淀显示，单克隆抗体212D和217L能与猕猴脾细胞交叉反应。该识别的特异性被来自猕猴脾的一种αd种同源物的免疫沉淀和氨基端测序所证实(实施例34)。由于以前的这些观察，这两种抗体被用来对获自实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)或动脉粥样硬化研究的猕猴的组织进行染色。这两种疾病的标志都是吞噬性巨噬细胞浸润到病灶中，在EAE是摄取髓磷脂碱性蛋白(MBP)，在动脉粥样硬化是低密度脂蛋白。MBP或脂堆积巨噬细胞可以用形态学或用Oil Red(ORO)或抗体Ham 56(Dako，Carpinteria，CA)染色来鉴别。这些研究中所用的方法相同于实施例18中介绍来分析αd在人组织中表达特征所用的方法。
来自患EAE的猕猴脑的切片的特征是淋巴细胞和巨噬细胞的浸润。αd在表达位于病灶中巨噬细胞的一个亚群，这些巨噬细胞能用ORO染色，表明以前摄取了MBP。ORO染色阴性的病灶也为αd表达阴性。这个结果表明了ORO染色和αd的直接联系。用抗体217K、217I和217H也观察到相似的结果。
动脉硬化病灶获自用高脂肪食物饲养的猕猴的胸主动脉或腹主动脉。在人中病灶发生在两个位置，但产生病理的病灶更通常位于腹主动脉。本研究中试验的病灶被分为5个不同的阶段(I至V)和正常。阶段(IV/V)病灶来自腹主动脉，其余来自胸主动脉。
早期病灶(I/II)显示很少的巨噬细胞浸润和低水平或没有αd表达。在后期病灶中，泡沫细胞浸润增大，并且检测到αd表达。
在两个组织中，其他白细胞整联蛋白α链亚基的染色图谱与αd表达重叠但不相同。最显著的是，非αd白细胞整联蛋白的α亚基的表达在用抗αd抗体不能染色的淋巴细胞上检测到。
这些结果表明，在两种动物模型中，αd表达可能是吞噬性巨噬细胞的特征。但还不清楚，αd是否直接参与吞噬或某些下游过程例如抗原递呈。
实施例37
αd在临床前模型中的表达
为评价αd在不同疾病状态中的不同表达，来自动物疾病模型的组织切片用按上面介绍的方法(实施例22)制备的抗αd多克隆血清染色。来自正常和疾病大鼠的组织被切成6um厚，并在Superfrost Plus(VWRScientific)载玻片上在室温空气干燥过夜。干燥后，切片贮存于-70℃备用。使用前，载玻片从-70℃取出，在50℃放置约5分钟。将切片在冷(4℃)丙酮(Stephens Scientific)中在室温下固定10分钟，并在室温干燥。每个切片用150μl含有30％正常大鼠血清(HarlanBioproducts)、5％正常羊血清(Vector Laboratories)和1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Company)的1XTBS中在室温下封闭30分钟。然后温和地从切片上吸出溶液。将兔多克隆血清和取自同一兔的免疫前血清在封闭溶液中分别稀释为蛋白浓度34μg/ml和38.5μg/ml，并分别取100μl加入到每个切片上，37℃放置30分钟。从切片上吸出血清，并通过在1XTBS中洗涤三次以去除未结合的抗体，每次5分钟。最后一个洗涤后吸去多余的TBS。来自一个Elite兔IgG Vectastain
Figure C0182025001171
ABC试剂盒(Vector)的生物素化的羊抗兔抗体按照厂商推荐的程序进行制备，并将所获得的溶液100μl用于每个切片，37℃放置15分钟。载玻片在1XTBS中洗涤两次，每次洗涤5分钟，然后将在5％正常大鼠血清和1％BSA中1∶100稀释的链亲和素-金偶联物(Goldmark Biologicals)用于每个切片，室温放置1小时。载玻片用TBS洗涤三次，每次洗涤5分钟，并加入100μl含1％戊二醛(Sigma)的TBS缓冲液，室温5分钟。载玻片再在TBS中洗涤三次，每次洗涤5分钟，并在无菌去离子水中洗涤5次，每次洗涤3分钟。将多余的液体从每个载玻片上吸去，在每张切片上加两滴银加强和起始溶液(Goldmark Biologicals)。反应在室温下进行20-30分钟，然后将切片在无菌去离子水中充分漂洗，在室温下空气干燥过夜，并用Cytoseal 60(VWR)封固。作为对照，切片用识别CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体在同一实验中用相同的方法进行标记。
用αd多克隆血清和针对CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体标记，显示了αd与其他α亚基中观察到的不同的染色图谱。
在正常肺组织中，αd表达在支气管的呼吸上皮(但不是肺泡间隙的上皮)上和似乎是气隙中肺泡巨噬细胞的单个细胞上被检测到。用多克隆血清观察到的信号明显高于用免疫前血清对照观察到的本底信号水平。在肺肉芽肿组织中，在给予多糖24和96小时后，用αd染色肺泡区域的呼吸上皮检测到不同的信号，并且在似乎是气管巨噬细胞的部分上检测到更强的信号。在来自从疾病中恢复的动物(多糖给药后16天处死)的肺组织中，用αd抗体没有观察到信号。在这些组织中，用免疫前血清观察到极少的本底信号。
使用来自抗原诱导的哮喘模型的大鼠肺组织，用αd抗体在支气管和肺泡隙的呼吸上皮中检测到了非常强的信号。该信号明显高于免疫前血清中的本底信号水平。
临床前模型---单核细胞增生利斯特氏菌
证据表明，脾红髓中αd阳性巨噬细胞参与从循环中清除受损的红细胞和其他颗粒。很可能细菌物质也由脾红髓中的αd阳性巨噬细胞从循环中清除。不需要一种抗原特异性T细胞应答诱导的非感染性物质将由红髓巨噬细胞直接清除。相反，机会感染性物质由红髓巨噬细胞清除的确需要为消灭细菌而产生的T细胞免疫应答。因此有可能红髓巨噬细胞上表达的αd通过调节巨噬细胞从红髓移动到边缘区或通过作为参与导致T细胞激活的巨噬细胞/T细胞相互作用的辅助分子而起作用来帮助调节巨噬细胞/T细胞相互作用。
为研究αd在对感染性物质免疫应答中的作用，使用一个单核细胞增生利斯特氏菌小鼠模型对αd在脾脏中的表达进行了评价。对已经吞噬了细菌的红髓巨噬细胞上的αd表达进行了检测。针对αd的抗体也在此模型中进行了检测，来确定αd在诱导针对单核细胞增生利斯特氏菌的T细胞应答中所起的作用。
实施例38
αd在脊髓损伤中的作用
在中枢神经系统(CNS)创伤后，免疫应答涉及侵入性中性粒细胞、天然杀伤细胞和吞噬性单核细胞/巨噬细胞的混合[Means，et al.J.Neurophathol.&Exp.Neurol.42：707-719(1983)]。该应答包括释放炎症介质、诱导反应性小胶质细胞、血小板浸润、内皮破坏和血管通透性增强以及发生水肿。最近的观察提示，脊髓中的创伤后炎症导致慢性缺陷，部分通过脱髓鞘或通过更直接的神经元和轴突破坏[Blight，A.R.Central Nervous System Trauma，2：299-315(1985)]。此外，最近的研究报道，巨噬细胞/小胶质细胞的数目与撞击损伤后脊髓每个水平的组织破坏量显著相关[Carlson，et al.Exp.Neurol.151：71-81(1998)]。中性粒细胞和巨噬细胞吞噬碎片又诱导氧化爆发，导致产生反应性氧。这些抗细菌因子尽管有效，但导致周围健康组织的破坏。因此，淋巴细胞浸润和伴随的反应性氧的产生参与起始撞击位点以外的继发损伤的播散。该假设由一些研究所支持，在该研究中中性粒细胞或巨噬细胞浸润导致卒中或脊髓损伤后的损伤程度减少。
完整的横断模型
为了评估αd在脊髓损伤中的作用，使用了大鼠横断模型和αd的单克隆抗体，其中的一些阻断αd与其配体VCAM-1的结合。在该模型中，诱导了在第四胸椎(T)节段的完全横断，这产生了自主神经反射障碍[Krassioukov，et al.Am.J.Physiol.268：H2077-H2083(1995)]。该模型的优点在于小的外科病变产生边界清除的原发组织破坏的窄区段，其有利于分析脊髓损伤对该区域的影响。
所有实验都是根据加拿大动物保护协会制定的“实验动物护理和使用指南”中确立的原则进行的。首先通过腹膜内注射给予体重为270-320克的雄性Wistar大鼠(Charles River)阿托品(0.5mg/kg)和安定(2.5mg/kg)。10分钟后，通过腹膜内注射苯巴比妥钠(35mg/kg)麻醉大鼠。手术时根据需要补充注射麻醉剂(2mg/kg)。手术时将大鼠置于加热的垫上，将其体温保持于接近37℃。在显微镜下去除第三胸椎(T3)的背部突起，进行椎板切除术以暴露脊髓。用手术刀在T4脊髓节段完全横断脊髓。关闭椎板切除术部位之上的肌肉和皮肤，使动物在热灯下恢复。截瘫大鼠的术后护理按照以前的描述进行[Krassioukov et al.Neurosci.70：211-226(1996)]。从手术中恢复后，随意提供食物和水。动物在术后存活两天。
将大鼠分为以下治疗组(4-5只/组)：(1)1mg/kg αd单克隆抗体226H，236L，226B，或无关的同种型匹配的IgGl κ抗体1B7和(2)5mg/kgαd单克隆抗体226H，236L，或对照1B7。在治疗方案中，每只小鼠仅接受一种抗体。
使用与免疫球蛋白区融合的重组人VCAM-1和表达大鼠αd和人CD18的CHO细胞系根据体外结合测定选择抗体。检测了一组抗体中各个抗体阻断αd与VCAM-1结合的能力。结合测定的结果表明，一些抗体不阻断结合(“非阻断剂”)，一些在50％的范围内阻断(“中等阻断剂”)，而其它在75％-85％的范围内阻断(“强阻断剂”)。从非阻断、中等阻断和强阻断组中选择代表性抗体用于下文中描述的用途。
在手术前24小时、手术后2小时和24小时通过尾静脉注射而给予所有单克隆抗体。在pH 7.2的磷酸缓冲盐水中稀释抗体，其中不含氯化钙或氯化镁，以保证足够体积便于注射。在另一对照组中，在脊髓完全横断后30分钟通过尾静脉注射而给予浓度为30mg/kg的甲基强的松龙(MP)，脊髓完全横断后2小时和24小时给药浓度为15mg/kg。
术后两天，在经心脏灌注之前通过腹膜内注射3g/kg乌拉坦(Aldrich Chemical Company，Inc.Milwaukee，WI，USA)将动物深度麻醉。在打开胸腔后，将肝素注射至左心室。用250ml pH 7.4的氧合组织培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium；Gibco BRL)灌注大鼠，然后用500ml溶于0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)中的4％甲醛固定液灌注。如前所述去除横断处尾端的胸椎(T4-8)用于检查[Krenz andWeaver，Neurosci 85：443-458(1998)]。在相同的固定液中固定过夜后，用4℃的溶于PBS的10％，20％，和30％的蔗糖溶液冷冻保存脊髓部分。然后在恒冷切片机上将脊髓部分切成水平切片(50μm)。用pH 4的1％甲酚紫对切片染色，用标准程序显现多形核白细胞，在二甲苯中漂洗，用DPX浸片剂(BDH Laboratory Supplies，Poole，U.K.)覆盖。对病变位点的脊髓区域中甲酚紫染色后表现出圆形的吞噬外形的巨噬细胞/小胶质细胞和表现出特征性多叶核的中性粒细胞进行计数。用亮视野显微镜和具有格栅(总面积0.08mm2)的40X物镜进行免疫细胞定量。检查三个样品区的免疫细胞，从横断的脊髓边缘开始，向尾侧移动，并且从一边到另一边。该程序导致2.72mm2的脊髓平均总定量面积。然后在另一脊髓切片中重复该过程。从脊髓的水平切片选择具有最大灰质的样品面积(边界在V和VII之间)，因为炎症反应在灰质最显著。在每个样品面积中计数的巨噬细胞和中性粒细胞的总数除以总样品面积(mm2)得到每个治疗组中每mm2的巨噬细胞和中性粒细胞数目。比较抗体治疗组(1mg/kg和5mg/kg)和各自的同剂量无关IgG匹配对照组和非药物治疗横断对照组。在进一步的比较中，将最显著降低免疫细胞的平均数目的组与MP治疗动物和手术对照动物进行比较。在不知道治疗组的情况下通过盲法进行所有细胞的计数。
结果表明，横断两天后，激活的小胶质细胞和/或血巨噬细胞鉴定为单核细胞，具有透明的大细胞质的圆形细胞在病变位点很明显。发现没有接受αd抗体或皮质类固醇治疗的对照动物在脊髓损伤位点每mm2的平均巨噬细胞/小胶质细胞数为396±26。低剂量(1mg/kg)无关IgG1抗体1B7的治疗使巨噬细胞/小胶质细胞数减少至362±43/，但该值与未接受抗体治疗的对照动物无显著差异。在检验的αd抗体中，1mg/kg的226H和236L与1B7抗体和横断对照相比均导致每mm2的巨噬细胞平均数目显著减少。具体地，与1B7抗体和未接受治疗的对照动物相比，226H给药使每mm2的巨噬细胞/小胶质细胞数减少至147±17，236L给药使每mm2的巨噬细胞/小胶质细胞数减少至131±4。相反，注射1mg/kg的αd抗体226B使每mm2的巨噬细胞/小胶质细胞数减少至327±65，这与对照组的值相比没有显著差异。MP治疗使每mm2的巨噬细胞/小胶质细胞数为250±24，这与对照动物相比显著减少，但比用226H和236Lαd抗体治疗的动物中检测到的值高。该结果是没有预料到的，因为甲基强的松龙是急性脊髓损伤的临床治疗中最广泛使用的药物。
当αd抗体的剂量增加至5mg/kg时，226H和236L治疗组的每mm2的巨噬细胞/小胶质细胞数显著低于对照组，但该数目与用无关IgG1同种型匹配的对照抗体治疗的动物中的数目无显著差异。
关于中性粒细胞(NLs)的结果表明，大多数以单个或聚集形式在整个灰质中检测到。只有一小部分可见NLs在灰质每侧的白质中检测到。而且，在脊髓组织切片中发现一些中性粒细胞粘附于小静脉和小动脉的腔面。在未接受治疗的动物中，每mm2的平均NLs数为295±56，在用1mg/kg 1B7治疗的动物中，每mm2的NLs数显著增加至416±63。与未接受治疗的对照动物相比，αd治疗显著减少了NLs数。具体地，1mg/kg的226H和226B分别使每mm2的NLs数显著增加至361±80和332±43。与1B7治疗的动物相比，1mg/kg的236L和MP治疗分别使每mm2的NLs数显著减少至270±39和193±39。然而，这些结果与未接受治疗的对照组相比没有显著差异。
在5mg/kg，1B7治疗使每mm2的平均NLs数增加至343±37，但该结果与未接受治疗的动物相比没有显著差异。与1B7治疗的动物相比，抗体226H使平均NLs数减少至236±38，但该计数与未接受治疗的动物相比没有显著差异。相反，236L使每mm2的NLs数减少至190±17/mm2，与接受1B7治疗的动物相比没有显著差异。
这些结果表明，低剂量的αd单克隆抗体减少损伤的脊髓中的白细胞数，可能是通过破坏与VCAM-1的相互作用，这与以前报道的结果一致。其它使用抗VCAM-1，VLA-4的已知反受体的抗体的报道表明，VLA-4阳性细胞向脑中的浸润减少，并且防止实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)的临床和病理体征。已经证明相似的抗TNFα治疗可以抑制EAE的发病率和严重性，一个作用机制是抑制脊髓血管上的VCAM-1表达，导致白细胞进入CNS显著减少。这些以前的结果提示，阻断白细胞表面上的αd和内皮细胞或胶质细胞表面上的VCAM-1的相互作用可以导致观察到的炎症反应减弱。
由于阻断巨噬细胞浸润的抗体之一226H不阻断αd和VCAM-1之间的相互作用，这些结果提示，抗体的抑制模式可以包括阻断αd和除VCAM-1外的其它结合配偶体之间的相互作用。一种可能性是存在ICAM-R的大鼠对应物。以前的观察表明，除VCAM-1外，αd也与ICAM-R结合，但亲和性远低于VCAM-。有趣的是，ICAM-R似乎在内皮细胞上缺乏，主要在静止单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞上表达，这排除了其在正常环境下参与白细胞-内皮粘附。已经表明，ICAM-R在白细胞的细胞-细胞接触的起始阶段起作用，ICAM-R参与LFA-1/ICAM-1白细胞的细胞间相互作用的调节。已经证明ICAM-R在早期白细胞相互作用中的作用诱导细胞聚集。破坏导致聚集的起始接触降低了免疫应答的效率。也已经证明，ICAM-R的另一种配体LFA-1的相互作用诱导了LFA-1在细胞间接触位点转换至其激活状态。αd和ICAM-R在静止白细胞上的共表达可以以相同的方式工作，两种蛋白之间的相互作用可能促进接触依赖性白细胞激活事件。相反，例如，通过使用αd抗体破坏相互作用，可以解释白细胞进入脊髓的减少。
一些解释可以说明巨噬细胞浸润的增加。最简单地，结果可能是系统现象。或者，更高剂量的抗体可能导致成熟巨噬细胞上FcγR的交联，导致趋化因子产生的起始爆发，这吸引额外的白细胞到损伤位点。以相同的方式，趋化因子的产生可以解释大多数情况下出现的1B7治疗后损伤位点处的中性粒细胞和巨噬细胞的数量更多。观察到的结果的另一可能的解释是动物间的变异，因为在Wistar大鼠的远交株中检验了αd抗体。例如，不同组的大鼠可能具有轻度不同的免疫活性状态。为了检验该可能性，用低剂量和高剂量的单克隆抗体在相同或相关窝动物中在同一时间重复了实验。
钳压缩损伤(CCI)模型
用于脊髓损伤的另一动物模型是临床上更相关的钳压缩损伤(CCI)模型[Rivlin，et al.Surg.Neurol.10：38-43(1978)；Maiorov，et al.J Neurotrauma 15：365-74(1998)]。简言之，按前面关于完全脊髓横断的描述准备大鼠，通过在T3和T4胸段进行背侧椎板切除术而保留脊髓。用改良的动脉瘤钳压缩脊髓，在T3和T4的背根之间的脊髓下张开钳。然后将钳闭合1分钟的时间，其后打开钳并取下。然后通过缝合关闭大鼠。这些动脉瘤钳进行了专门的改良，使得它们具有校准的力。以此方式，可以对钳进行改良，以诱导严重、中度或轻度的脊髓损伤。脊髓损伤的严重、中度或轻度钳压缩模型准确和一致地复制了人脊髓损伤的所有病理生理方面，包括缺血。
用上述关于动物护理和治疗给药的程序进行所有实验。用以下方案之一在损伤后2、24和48小时后治疗严重CCI(50g)的大鼠：(i)抗αd单克隆抗体217L(1mg/ml)，(ii)抗αd单克隆抗体226H(1mg/ml)，(iii)抗αd单克隆抗体236L(1mg/ml)，(iv)同种型对照抗体1B7或(v)PBS(无治疗的对照)。第6组大鼠在CCI后24小时接受30mg/ml甲基强的松龙(MP)，在CCI后24小时和48小时接受15mg/ml MP。每个治疗组检验4-5只大鼠。在72小时，处死动物，用固定液灌注，其后去除脊髓进行进一步处理。分析了抗αd单克隆抗体(217L，226H和236L)减少ED1+(即单核细胞/巨噬细胞)和MPO+(即吞噬细胞)细胞向损伤位点浸润的有效性。通过使用两种不同荧光团的免疫细胞化学双染色法鉴定ED1+和MPO+细胞。由于有时难以区别具有中性粒细胞样外形和具有巨噬细胞样外形的细胞，两者均被计数为MPO+细胞。总体上，大多数MPO+细胞为中性粒细胞。在损伤的一侧(通常在尾侧)计数细胞。对于每只动物，对跨损伤的完整脊髓节段所切的每10个连续的水平切片中的一个16μm的切片进行计数。该程序使每只动物总共有6-10个切片进行了计数。
该分析的结果表示，与用PBS或对照1B7抗体或236L抗体治疗的动物相比，用抗体217L和226H治疗后损伤位点的浸润性ED1+细胞减少40-55％。发现接受PBS或1B7抗体的对照动物中分别有681.3±47.4和641.8±77.8个ED1+细胞浸润到严重CCI的位点。用217L，226H或236L抗体治疗的大鼠在损伤位点分别表现出388.6±52.8、291.9±67.7和692.7±98.4个浸润性ED1+细胞。用甲基强的松龙治疗的大鼠在损伤位点表现出409.0±42.6个浸润性ED1+细胞。用双向Anova进行的这些结果的统计分析表明，用217L或226H治疗的动物与对照组不同的显著改进(p＜0.05)。浸润性+细胞的相似分析表明，与未治疗动物或用对照抗体1B7治疗的动物相比，217L最持续地减少了这些细胞向损伤位点的迁移。发现用217L，226H或236L抗体治疗的大鼠在损伤位点分别具有156.5±63.3、191.3±39.0和299.1±44.0个浸润性MPO+细胞。用PBS或1B7抗体治疗的对照动物在损伤位点分别表现出615.3±45.7和260.9±48.92个浸润性MPO+细胞。然而，由于中性粒细胞浸润的峰时间一般为CCI后大约18小时，在损伤后72小时后获得的数据可能不反映抗αd单克隆抗体减少中性粒细胞浸润的有效性。
也进行了采用接受中度CCI(35g)的大鼠的相似实验。该实验的结果表明，接受217L抗体的动物中损伤位点的浸润性ED1+细胞和MPO+细胞数目显著减少。接受PBS或1B7抗体的对照动物表现出832.3±69和1075±87.94个浸润性ED1+细胞。用217L，226H或236L抗体治疗的大鼠在损伤位点分别表现出507.0±51.4，797.4±65.1，和761.2±88.2个浸润性ED1+细胞。在损伤位点进行的浸润性MPO+细胞检查表明，用217L，226H或236L抗体治疗的大鼠在损伤位点分别具有190.5±28.4，253.7±45.2和301.4±36.6个MPO+细胞。用PBS或1B7抗体治疗的对照动物在损伤位点分别表现出611.7±140.5和247.6±18.1个MPO+细胞。
抗αd mAb治疗的大鼠运动评分
按前面的描述对4只大鼠进行严重CCI并且用抗体治疗。在损伤后第1，7，10，14，17和19天，通过Basso，Beattie，Bresnahan(BBB)21点评分系统[Basso，et al.J.Neurotrauma 12：1-21(1995)]对大鼠进行恢复的运动能力的评估。简言之，BBB评分系统是基于脊髓损伤后恢复的三个主要阶段。在早期阶段观察到没有或很少有后肢移动，中间阶段的特征在于不协调的迈步，晚期阶段动物表现出脚趾和尾的缓慢而费力的运动，躯干不稳和脚掌旋转。将三个阶段的每一个进一步分为特征在于特定行为的类别。在19天的时间段中评估大鼠41C450和42C50，在17天的时间段中评估大鼠44C50和45C50。14天评估的水平条表示具有相同严重损伤的未治疗大鼠达到的平均BBB评分。每个大鼠两侧的评分表示压缩损伤均匀施加于脊髓。
所检验的4只大鼠中的3只与未治疗大鼠相比表现出运动恢复的明确增加。应该注意，到17天时，所有4只大鼠也恢复了一定程度的膀胱控制。
评估CCI大鼠的自主神经反射障碍
通过扩张结肠评估了上述4只大鼠的自主神经反射障碍[Maiorov，D.N.et al.J.Neurotrauma 15：365-374(1998)]。大鼠44C50和45C50在第17天开始进行该评估，大鼠41C50和45C50在第19天开始。从动脉插管日开始在连续的两天中获取两次心率(HR)、动脉压(AR)和平均动脉压(MAP)的同时记录。给予严重损伤的大鼠217L抗体使结肠扩张对动脉压的影响减少大约50％。未治疗的损伤大鼠表现出MAP比大约100mm Hg的基础血压平均增加了42±3mmHg。相反，用217抗体治疗的相同损伤的大鼠表现出MAP平均增加22±3mmHg。未治疗的静息CCI大鼠的平均心率(HR)为515±16跳/分。在诱导自主神经反射障碍后，结肠扩张时HR值减少了124±13跳/分。用217L抗体治疗的4只静息大鼠的平均心率为544±9跳/分。在诱导自主神经反射障碍后，结肠扩张导致该值减少117.7±18。因此在诱导自主神经反射障碍之前和之后治疗和未治疗大鼠的HR没有显著统计学差异，这可能是由于反应于结肠扩张的心率改变是通过不依赖于脊髓损伤而起作用的副交感迷走神经。
在损伤后12、24或48小时后检查用抗αd单克隆抗体治疗的大鼠
如果抗αd单克隆抗体的初次给药可以延迟至脊髓损伤后12、24或48小时并且仍然有效，将是有用的，因为给予有效治疗的时间范围将扩大。为了研究这种可能性，按照上文的描述用(i)PBS，(ii)1B7抗体或(iii)抗αd单克隆抗体治疗接受了严重或中度CCI的大鼠，只是在CCI后12小时(然后在CCI后24和48小时注射抗体)或24小时(然后在CCI后48小时再注射抗体)给予抗体。也进行了相似的实验，其中只是在CCI后48小时给予一次抗体。用上文所述方法评估ED1+和MPO+细胞数。如果抗αd抗体给药延迟到CCI后12、24或48小时，并且动物表现出浸润性ED1+和MPO+细胞数目的显著减少，那么使用该抗体可以在损伤后更晚的时间点开始。
比较单次注射抗αd单克隆抗体和三次注射方案ED1+和MPO+细胞向减少损伤位点的浸润的有效性
使用单剂量的抗体将比用三剂量方法有利。单剂量治疗将减少成本、简化治疗程序并且也可以减少可能的副作用的发生。基于上述进行的实验的结果，确定了抗体给药的最佳时间。在CCI后2小时或在通过分析前述结果确定的最佳时间给接受严重或中度CCI的大鼠单次注射抗αd单克隆抗体、对照1B7抗体或PBS。在损伤后72小时处死大鼠，测定损伤位点的ED1+和MPO+细胞数。比较接受单剂量的动物的结果和用单剂量方案治疗的动物的结果，以确定低剂量治疗的有效性。
检查抗αd单克隆抗体治疗减少向损伤位点的中性粒细胞峰浸润的有效性
中性粒细胞浸润的正常峰发生于损伤后18小时，然后迅速降低至低得多的维持水平。为确定抗αd抗体治疗是否可以减少中性粒细胞向损伤位点的浸润，在CCI(严重或中度)后2或12小时后用抗αd抗体、对照1B7抗体或PBS治疗大鼠。然后测定向损伤位点浸润的中性粒细胞数目，以分析中性粒细胞峰浸润中抗αd抗体给药的作用。
在接受CCI并用抗αd抗体治疗的大鼠中检查运动能力和自主神经反射障碍
根据前面所述的实验，确定最佳治疗方案。使大鼠接受严重或中度CCI，采用最佳治疗方案，用PBS、对照1B7或抗αd抗体治疗。损伤后每3天使用前面所述的标准BBB评分系统评估大鼠的运动能力。CCI后3周，检验一个亚组动物的自主神经反射障碍，而对其余的大鼠进行另外3周的运动能力评估。自主神经反射障碍的测定方法如前所述。
实施例39
αd在克隆氏病中的表达
以前的工作(实施例18)表明，在克隆氏病患者的组织切片中检测到了更高水平的白细胞整联蛋白。为了评估克隆氏病中αd表达受调节程度，如下文所述检查了从患病和正常结肠得到的组织切片。
将从5名克隆氏病患者的结肠组织和正常结肠得到的组织切片为6μm的厚度，室温下在Superfrost Plus(VWR Scientific)载玻片上干燥5分钟。将载玻片储存于-20℃，直到进行测定。在使用之间，在50℃温育载玻片大约2分钟。将切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中固定2分钟，在室温下风干。室温下将切片置于含100ml 1XTBS，1.1ml 30％H2O2(Sigma)，和1.0ml 10％NaN3(Sigma)的缓冲液中15分钟，以去除内源性过氧化物酶活性。室温下将每个切片在含有1XTBS中的20％正常人血清(Boston Biomedica)，5％正常大鼠血清(Harlan)和2％BSA(Sigma)的150μl封闭缓冲液中温育30分钟。在封闭溶液中以10μg/ml的蛋白浓度制备第一抗体，在室温下将75μl施用于每个切片1小时。温育后，在1XTBS中洗涤每个切片3次5分钟，以去除未结合的抗体。在最后一次洗涤后通过吸取组织周围而去除过量的TBS。在封闭缓冲液中以1∶400稀释生物素化的大鼠抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)，在室温下将75μl施用于每个切片30分钟。在1XTBS中洗涤每个载玻片2次，每次5分钟。通过加入由制造商提供的9μl凝胶试剂A和9μl凝胶试剂B至782μl 1XTBS而制备过氧化物酶偶联的亲和素/生物素复合物(Vector Laboratories)，在室温下将75μl得到的混合物施用于每个切片30分钟。在1XTBS中洗涤每个载玻片2次，每次5分钟。施用底物3，3′-二氨基联苯胺(DAB)(Vector Laboratories)，通过浸入水中而停止显色。将1滴1％的锇酸(VWR)施用于每一切片大约15秒，以增强信号强度，通过浸入水中而停止显色。在Gill′s苏木精#2(Sigma)中对切片进行负染，在水中清洗，然后脱水并且用Cytoseal(VWR)固定。
在正常结肠中，用抗体217L，217K或212D检测不到标记。抗体240I标记聚集在淋巴结中的许多细胞，和分散在固有层中的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。抗体240I也标记似乎是巨噬细胞或激活的淋巴细胞的细胞类型。用抗体169A进行的染色与抗体240I相似。抗体240I标记了分散在固有层和粘膜下层中的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，以及围绕动脉和位于外肌层的一个亚型的平滑肌细胞。
对于克隆氏病的样品，采用各个抗体观察到的标记模式重叠，但表达模式不同。用抗体217K或212D检测不到标记。抗体240I标记淋巴结中的在多核巨细胞上有差别表达的肉芽肿，并且标记淋巴结中的淋巴细胞。抗体240I标记分散在固有层中的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。抗体217L也标记淋巴结中的在多核巨细胞上有差别表达的肉芽肿。抗体217L标记了240I所标记的固有层和粘膜下层中的一个淋巴瘤小亚型。抗体169A的染色模式与240I相似，只是169A标记较少的淋巴细胞。抗体169B的染色与169A的染色模式相似，只是169B还标记围绕血管和位于外肌层中的一个平滑肌细胞亚型。
实施例40
从大鼠脾αd +细胞释放TNFα
为了鉴定一个独特的脾αd +细胞亚群在刺激时产生细胞因子的能力，进行了以下实验。
在后侧腹给Lewis大鼠皮下注射100μl完全弗氏佐剂(CFA)在PBS中的1∶1乳状液，7天后处死动物。收获脾，用标准程序制备单细胞悬浮液。用预先安装到抗小鼠IgG磁珠偶联物上的抗CD4(抗体W3/25，E.A.A.C.C.No：84112002)，CD11b(抗体OX42，E.A.A.C.C.No：87081803)和CD45Ra/b(抗体OX33，Pharmingen)的单克隆抗体选择性去除B细胞、CD4+T辅助细胞和巨噬细胞。CD4抗体鉴定T细胞，CD11b抗体鉴定巨噬细胞、单核细胞、粒细胞和天然杀伤细胞，CD45Ra/b抗体识别B细胞、T细胞亚型、单核细胞、粒细胞和巨噬细胞。然后用磁铁去除抗体包被的细胞。收集非粘附T细胞，用生物素化的大鼠抗αd单克隆抗体205C和226G进行阳性选择，然后用链亲和素磁珠温育。用磁铁收集抗体包被的细胞，并且以5×105细胞/ml悬浮于生长培养基(包含2％正常Lewis大鼠血清、青霉素/链霉素丙酮酸钠、L-谷氨酰胺的RPMI 1640)。
向3μg/ml抗大鼠CD3单克隆抗体(G418，Pharmingen)、无关对照抗体或无抗体包被的24孔板的各个孔中加入2ml细胞悬浮液。在37℃下7％CO2中温育板，20小时、48小时和72小时后从每个孔收集上清液。收集后立即等分上清液并且储存于-70℃。在测定前，以1∶2稀释上清液，并且置于抗大鼠TNFα检测测定设备(Biosource)。
结果表明，用抗CD3单克隆抗体刺激后，20小时后αd +细胞释放大约280pg/ml TNFα，抗体对照和培养基处理组释放大约40pg/ml。
实施例41
调节从αd抗体激活的脾细胞释放TNFα
为了评估αd +吞噬性脾细胞在炎症反应中的作用，进行了以下实验。
因为以前已经表明αd +脾巨噬细胞吞噬了注射至大鼠中的磁性颗粒，采用以下方式收集这种类型的细胞。给4只小鼠静脉内注射200μl磁珠悬浮液(胺偶联的，Perspective Biosystems)。24小时后，取出脾，通过使组织通过金属丝网筛制备单细胞悬浮液。用磁铁分离细胞，在含镁和钙的PBS中洗涤一次，置于RPMI/10％FBS培养基中的培养物，在以下六个条件下生长：(i)无处理；(ii)用与小鼠αd交叉反应的仓鼠抗大鼠αd单克隆抗体205C(10μg/ml)处理；(iii)用与小鼠αd交叉反应的仓鼠抗大鼠αd单克隆抗体205E(10μg/ml)处理；(iv)用脂多糖(LPS)处理；(v)用LPS和单克隆抗体205C(10μg/ml)处理；和(vi)用LPS和与小鼠αd交叉反应的单克隆抗体205E(10μg/ml)处理。
首先用抗体处理细胞30分钟，其后收集200μl条件培养基的样品，此时代表起始时间点(t＝0)。然后如上文所述向孔中加入LPS(10ng/ml)，在0.5小时、1小时、2小时和4小时收集培养基的等分物，采用鼠TNFα试剂盒(ENDOGEN，#005452)通过ELISA测定释放的TNFα。收集后，立即冷冻样品，直到测定。在测定前，以1∶1稀释条件培养基并且根据制造商建议的方案进行测定。
结果表示，不论是否已经用抗体处理，未用LPS激活的脾细胞没有表现出向培养基中的显著TNFα释放。用LPS处理的脾细胞向培养基中释放可检测水平的TNFα，而用205C或205E抗体处理的LPS激活的细胞表现出显著更低的TNFα释放。这些结果在所有检验的时间点是一致的，并且在随后重复的测定中得到证实。此外，在后来用没有使用磁珠分离的脾细胞进行的实验中观察到了相同的结果。最后，初步结果表明，脾细胞的IL-1β释放被抗αd单克隆抗体相似地抑制。
实施例42
鉴定嗜酸性粒细胞上的αd表达
以前的观察表明αd在所有外周血嗜酸性粒细胞上表达(实施例18)。为了进一步检验在人嗜酸性粒细胞上的表达和功能，进行了以下分析。
αd整联蛋白在人粒细胞上的表达
在按下文所制备的细胞上检验αd在人粒细胞上的表达。通过以前所描述的密度梯度离心、低渗红细胞裂解和免疫磁性阴性选择方法从过敏的志愿者外周血分离正常密度的嗜酸性粒细胞(即具有大于1.09的正常比重)[Hansel，et al.J.Immunol.Meth.145：105(1991)]。通过密度梯度离心和单独的低渗红细胞裂解从正常志愿者的外周血纯化中性粒细胞[Bochner，et al.J.Immunol，.145：1832(1990)]。细胞类型的代表性纯度通常超过95％。采用双percoll密度梯度分离法从外周血中富集嗜碱性粒细胞，这使得嗜碱性粒细胞的数目增加至总白细胞计数的3-10％[Bochner，et al，J.Immunol.Meth.125：265(1989)]。按照以前的描述采用单色间接免疫荧光和流式细胞术评估从血液中新分离、在培养物中刺激后的细胞上的整联蛋白表达[Bochner，et al.J.Immunol.Meth.125：265(1989)；Matsumoto，et aL，Blood 86：1437(1995)]。也进行了嗜碱性粒细胞的双色检测(采用抗IgE)。所有样品在0.1％低聚甲醛(Sigma)中固定并且采用EPICS图形II流式细胞仪(Coulter)进行分析。收集大约10,000个事件，并且在4-log规模上显示，产生平均荧光强度(MFI)的值。
结果表明，嗜酸性粒细胞表达所有四种β2整联蛋白。αd整联蛋白的表面表达水平高于CD11c，但低于αd整联蛋白(CD49d)，CD11a或CD11b的表达。结果也表示，嗜碱性粒细胞比中性性粒细胞上的αd整联蛋白表达水平略高。
调节人嗜酸性粒细胞上的αd整联蛋白表达
进行了初步的研究以确定嗜酸性粒细胞是否可以象中性粒细胞所报道的那样迅速动员细胞内的αdβ2储存[Van der Vieren，et aL，Immunity 3：683(1995)]。用PMA或钙离子载体A23187温育纯化的外周血嗜酸性粒细胞(按以前的描述制备)15分钟，通过间接免疫荧光测量β2整联蛋白家族的一些α链的表面表达(如前所述)。
结果表明，50ng/ml的PMA或1μM的钙离子载体显著增加αd和CD11b的表达。在加入PMA内几分钟，表达增加，在10分钟内达到显著增加的水平。该观察结果表面，嗜酸性粒细胞的细胞质αdβ2储存可以迅速动员至细胞表面，与CD11b储存相似。
根据这些结果，检验了其它激活嗜酸性粒细胞的刺激对αdβ2表达的确切作用。用MDC(100nM)，IL-5(10ng/ml)，RANTES(100ng/ml)，和eotaxin(100μM)温育嗜酸性粒细胞15分钟不能改变αd整联蛋白表达。
以前的观察结果表明，通过长时间暴露于某些细胞因子，如IL-5，在称作“激发”的现象中可以增强许多嗜酸性粒细胞反应[Walsh，etal.Immunol.71：258(1990)]。因此设计了实验，用于检验用IL-5激发嗜酸性粒细胞培养物是否能导致αd的表面表达改变。用10ng/mlIL-5温育按上述方法制备的纯化嗜酸性粒细胞4天，按前面的描述测定各种整联蛋白的表达。
结果表面，尽管αd整联蛋白在细胞表面的表达增加4-5倍，α4整联蛋白的表达水平保持不变。αd整联蛋白表达增加的动力学表明，在培养4-7天后的表达具有统计学显著的增加。相反，α4整联蛋白的水平没有显著改变。PMA暴露后αd表达增强的动力学与CD11b相似，表明这两种白细胞整联蛋白可能存在于相似或相同的细胞内腔室。任一种整联蛋白在嗜酸性粒细胞中的腔室的位置还未知；然而，在中性粒细胞中，CD11b的预成型的储存物定位于特定颗粒[Todd，et al.J.Clin.Invest.74：1280(1984)；Bainton，et al.J.Exp.Med.166：1641(1641)]。
由于晚期支气管肺泡灌洗(BAL)嗜酸性粒细胞表达细胞因子激发的嗜酸性粒细胞的许多特征[Kroegel，et al.Ann.Rev.Respir.Dis.143：A45(1991)；Sedgewick，et al.J.Immunol.149：3710(1992)]，也检验了αd在该细胞类型上的表达。从使用豚草或D.petrynissinus提取物进行了18小时支气管内节段过敏原刺激的过敏患者中获得BAL细胞[Kroegel，et al.J：Clin.Allergy Immunol.93725(1994)]。晚期BAL液体中的嗜酸性粒细胞纯度为19±4％。
结果表明，晚期BAL嗜酸性粒细胞也表现出αd整联蛋白表达的统计学显著增加，其水平与用IL-5刺激培养物3天后的水平相似。在检验晚期BAL嗜酸性粒细胞，即已经进行了细胞粘附和迁移以便到达气道腔中的细胞上的αd整联蛋白水平时，观察到了介于新分离的和IL-5培养的嗜酸性粒细胞上的水平之间的表达水平。这些数据表明，IL-5培养后αd的水平升高的至少一部分是由于αd整联蛋白转录和翻译的增加。
表达αd的嗜酸性粒细胞与VCAM-1结合
尽管已经证明αd整联蛋白与VCAM-1结合并且可能介导白细胞-白细胞粘附[Van der Vieren，et al.Immunit 3：683(1995)]，设计实验以检验在嗜酸性粒细胞上表达的αd的其它可能的配体。部分由于以前的研究提示嗜酸性粒细胞与VCAM-1的β2整联蛋白依赖性、CD11b非依赖性粘附[Matsumoto，et al.Blood 86：1437(1995)]，用固定化的重组VCAM-1进行了初步研究。
对于新纯化的和培养的嗜酸性粒细胞，按照以前的描述在37℃下进行30分钟的51Cr标记细胞与VCAM-1(250ng/ml)或BSA(1％)包被的孔的粘附[Matsumoto，et al.Blood 86：1437(1995)]。在一些实验中，在检验粘附之间，用饱和浓度的以下封闭性单克隆抗体在4℃下预温育细胞30分钟：抗CD18(7E4)，抗CD11a(MHM24)，抗CD11b(克隆44)，抗CD11c(BU-15)，抗αd(240I)，和抗α4(HP2/1)。
对于转染的和亲代CHO细胞，用与嗜酸性粒细胞粘附所使用的相同的包被的板进行粘附。对转化CHO细胞的检查表明，αd表达相对低，因此，CHO转染子和VCAM-1之间的相互作用没有所检测到的嗜酸性粒细胞和VCAM-1之间的相互作用强。因此使用了以前描述的轻柔洗涤技术的改进[Shanley，et al.J.Immunol.160：1014(1998)]。该技术允许从20℃下以1×g离心30分钟的反转的板释放非粘附细胞。然后用0.1M EDTA(Sigma)取出剩下的粘附细胞，并且通过流式细胞术计数，除VCAM-1外，在一些粘附实验中也使用E-选择蛋白(100ng/ml)包被孔。除了封闭用于嗜酸性粒细胞研究中使用的单克隆抗体外，在加入CHO细胞之前用F(ab′)2抗VCAM-1单克隆抗体的适当稀释液处理固定化的VCAM-1。
结果表明，新分离的嗜酸性粒细胞粘附于VCAM-1，αd整联蛋白的单克隆抗体阻断有效抑制粘附。用抗CD11b抗体没有作用。可以通过抗αd单克隆抗体240I显著和持续抑制粘附，尽管比使用抗α4抗体所观察到的程度要低(大约抑制30％)。
甚至更引起注意的是VCAM-1粘附实验的结果，其中使用了，IL-5培养的嗜酸性粒细胞，其表达升高水平的αd整联蛋白。在这些条件下，CD18的单克隆抗体、αd或α4整联蛋白相等有效地将粘附减少到本底水平，而CD11a，CD11b，和CD11c的封闭抗体的组合没有作用。也已经观察到，与新分离的嗜酸性粒细胞观察到的结果相比，IL-5培养的嗜酸性粒细胞表现出本底粘附的增加和VCAM-1粘附的减少。根据用新分离的嗜酸性粒细胞进行的单克隆抗体阻断研究，与VCAM-1的粘附主要通过α4整联蛋白介导。然而，在IL-5培养的嗜酸性粒细胞中，α4和αd整联蛋白相等地介导与VCAM-1的粘附。综合起来，这些数据首先证明了αdβ2整联蛋白在人嗜酸性粒细胞上的表达和功能的激活依赖性调节，并且记录了αdβ2作为VCAM-1的另一种配体的新功能。
基于嗜酸性粒细胞上的αd整联蛋白与VCAM-1结合并且可以用IL-5上调的结果，该白细胞整联蛋白可以在细胞因子激发的嗜酸性粒细胞向炎症位点的募集中起作用。
实施例43
表达αd的CHO细胞结合VCAM-1
为了进一步证明αdβ2作为VCAM-1的配体，按如下方法制备了表达人αd和β2整联蛋白链的CHO转染子。
按实施例11的描述转染仓鼠卵巢细胞。在含有1mM丙酮酸和2mM L-谷氨酰胺(Biofluids)，补加10％的FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和600μg/ml G418(均来自于Life Technologies)的DMEM/F12培养基中培养αdβ2转染的CHO细胞。用于培养亲代CHO细胞系的培养基是相似的，只是使用未透析的FBS(Life Technologies)，并且0.1mM次黄嘌呤和16nM胸苷(Sigma)代替了G418。被转染的细胞表达中度水平的αd和β2整联蛋白链，并且不表达CD11a，CD11b，CD11c或α4整联蛋白。亲代CHO细胞系不能表达这些整联蛋白中的任意一种，按实施例42所示的方法进行粘附测定。
结果表明，αdβ2转染的CHO细胞粘附于VCAM-1包被的孔。通过抗VCAM-1第一结构域的F(ab′)2单克隆抗体和抗CD18或αd的单克隆抗体有效阻断了粘附。相反，未转染的亲代CHO细胞不能粘附于VCAM-1，两种细胞类型都没有表现出与E-选择蛋白的显著粘附。
关于VCAM-1第一结构域中的α4整联蛋白结合位点的单克隆抗体完全阻断αdβ2整联蛋白依赖性VCAM-1粘附的发现强烈提示，αdβ2结合位点邻近于或相同于α4整联蛋白。由于在αd和α4整联蛋白之间只有很少的氨基酸同源性，该结果是预料不到的。αdβ2整联蛋白是否可以与纤连蛋白或粘膜地址素细胞粘附分子1等其它α4整联蛋白配体结合还未知。
αd结合所需要的VCAM-1区域
已经发现VCAM-1的前两个结构域支持与α4整联蛋白的结合，已经鉴定了这些结构域中的相关氨基酸。为了确定αd具有相似的VCAM-1分子中的识别位点，构建了含融合于人免疫球蛋白Fc的VCAM-1结构域1和2的序列的质粒。此外，通过PCR产生了两个结构域表达构建体的修饰形式，以引入取代突变，其中残基40的丙氨酸被天冬氨酸残基取代。用以前描述的DEAE-右旋糖苷方案将两个表达构建体瞬时转染至COS细胞中。用蛋白A Sepharose
Figure C0182025001341
按以前的描述从培养物上清液纯化蛋白。
按如下方法检验了表达α4β1或αdβ2的CHO细胞与5个结构域的VCAM-1/Ig融合蛋白或ICAM-1/Ig融合蛋白结合的能力。以0.5μg/孔在碳酸氢盐缓冲液(pH 9.5)中将CAMs固定于96孔微量滴定板。用1％鱼明胶封闭板，用缓冲液、无关抗体或封闭性VCAM-1抗体处理。用缓冲液、α链的特异性单克隆抗体的无关抗体(对于αd为130K或217I，对于α4为α4.1)或封闭性α链抗体处理αd或α4转化的CHO细胞。洗涤细胞，然后以100,000细胞/孔的密度加入CAM包被的孔。在固定化的抗体存在下温育细胞20分钟，然后加入5％的戊二醛。固定后，用蒸馏水洗涤板，然后用1％结晶紫染色细胞，用66％乙醇脱染色几小时后，在Dynatech平板读数器上570nm下测定吸光度。
结果表明，αdβ2和α4β1以相同程度识别VCAM-1的5结构域和2结构域形式，说明结合可能不需要其它结构域。尽管在αd/VCAM-1结合和α4/VCAM-12结合之间检测到了差异，很可能该差异来自于被转化CHO细胞中的差异表达。VCAM-1抗体(50-100％)、α4抗体(100％)和αd抗体(50％)阻断两种细胞系的结合。α4转染的细胞系不识别突变的VCAM1，αd细胞系与突变体的结合是用野生型VCAM-1所检测到的结果的50％。两种CHO细胞系都不结合ICAM-1/Ig。综合起来，这些结果表明，αd和α4识别VCAM-1的结构域1和2，并且识别重叠但不等同的表位。
实施例44
将αd靶定为肿瘤抗原
αd的空间和时间限制表达提示，该分子可能作为去除表面表达αd的致病细胞群的靶。以前的一些观察结果导致了该可能性。
例如，与其它白细胞整联蛋白相比，αd表达范围较小。αd的表达似乎限于特定的和/或高度分化的淋巴细胞亚型。与其它白细胞整联蛋白不同，αd似乎受调节，这是由培养中的原代或转化细胞的迅速下调所证明的。αd的单克隆抗体表现出可变的反应性，尽管抗体是特异于αd的。例如，与用另一种抗αd单克隆抗体217L观察到的反应性相比，抗αd抗体212D表现出与正常组织和高度分化的髓细胞的有限反应性。有趣的是，敲除αd的小鼠存活至出生或存活更长，但此观察结果几乎未提供关于αd的生物功能的信息。最后，在估计70％的犬白血病细胞上检测到了αd表达，在从F344大鼠新分离的NK白血病细胞上检测到了高水平的αd表达(实施例26)。尽管肿瘤细胞可以是用αd为靶进行清除的优选细胞群，任何表达αd的所需细胞类型也可以以下文所述方式清除。
优先选择一种或多种与正常组织具有低水平反应性的抗体。根据前面的讨论，一个可能性是抗体212D。也选择了适当的对照抗体，包括作为阴性对照的无关抗体。从白血病和淋巴瘤患者获得血液和肿瘤样品，并且通过免疫细胞化学筛选，通过FAScan、免疫沉淀和蛋白质印迹分析使用所选择的抗体分析细胞表面表达。然后，阳性染色的检测可以导致开发清除方法的其它程序。
在一个方法中，克隆了前面所选阳性染色抗体的超变区，并且在补体固定的人同种型的范围中表达。在亚克隆和同种型转换后，按上文所述再次评估特异性和反应性，例如通过FACS分析、正常组织的组织学和免疫沉淀。为了在人IgG1的范围中表达选定的超变区，开发了基因盒载体。此外，设计并合成了一系列引物，以促进从杂交瘤细胞系扩增感兴趣抗体的超变区[Gavilondo-Cowley，et aL，inHYBRIDOMA，Vol 9No；5，1990，Mary Anne Leibert Inc.Publishers，Media，PA，pp.407-417]。然后体外检验得到的抗体，以确定其在补体存在下的结合是否导致细胞死亡。优选地，使用肿瘤细胞进行了体外测定。对照测定将确定单克隆抗体在不表达αd的细胞培养物中是否表现出相同的活性。
也检验了单克隆抗体，以确定结合是否导致内化，这说明了该抗体可以与细胞毒性药物偶联。
开发了临床前模型，其中检验了体内细胞毒活性。在一个实施例中，在F344大鼠模型中检验了等同性(实施例26)。另一模型是SCID/Hu系统，其中移植了人细胞。例如，将骨髓U937细胞、Jurkat T细胞或人结肠癌HTC166细胞移植到小鼠中，收获肿瘤，用抗αd抗体(如212D和217L)对肿瘤进行了表面抗原染色。αd表达的检测导致体内使用抗体去除肿瘤。
实施例44
人抗αd单克隆抗体
按以前的描述通过筛选展示在丝状噬菌体上的抗体所有组成成分而鉴定人单克隆抗体[Waterhouse，et aL，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)；Parsons，et al.Protein Engineering 9：1043-1049(1996)]。简言之，用来自于未免疫的人供体的功能性V基因片段构建展示在噬菌体表面的单链Fv(scFv)片段的所有组成成分。将片段克隆至噬菌粒中，该载体允许在没有亚克隆的条件下产生噬菌体展示的和可溶的scFv。掺入组氨酸标记以允许通过镍螯合层析迅速纯化scFv。该文库形式的使用一般允许在少于两周的时间内分离人单克隆抗体。按以前的描述进行分离[Marks，et al.J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，Vaughan，et aL，Nature Biotechnol.14：309-314(1996)]。优选鉴定特异性识别I结构域的抗体。
实施例45
Motheaten小鼠中的抗αd抗体治疗
在motheaten突变小鼠中[Koo，et al.J.Immunol.147：1194-1200(1992)；Koo.et al.J.Immunol.151：6733-6741(1993)]，常染色体隐性meV基因作为C57BL/6小鼠中的造血细胞蛋白酪氨酸磷酸酶的点突变自发存在。纯合体产生慢性骨髓单核细胞炎症，该炎症包括骨髓单核细胞在肺和皮肤中的聚集，导致间质性肺炎、胸腺萎缩以及T细胞和NK细胞功能障碍。这些小鼠的骨髓细胞可以转移炎症状况，表明meV突变是由于骨髓单核细胞途径中的干细胞缺陷。由于αd存在于骨髓细胞中，进行了一种程序以评估抗αd单克隆抗体治疗在从motheaten突变小鼠移植骨髓的正常小鼠中对免疫病理改变的抑制作用。
从Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME获得C57BL/6J(B6)-meV/meV和它们的正常+/-同胞(B6)-+/-小鼠。将小鼠维持在无病原体的环境中，随意提供食物和水。所有小鼠都是6-10周龄。
第1天，所有小鼠通过腹膜内注射接受溶于0.5ml PBS的2μg/mlα-NK1.1抗体PK136(Pharmingen)。第0天，所有B6+/-小鼠用750Rad辐射。按以前的描述从(B6)meV/meV小鼠收获骨髓。从胫骨和股骨取出细胞，转移到补充的RPMI培养基，并且在静脉内注射到接受辐射的小鼠之前温育2小时。立即通过腹膜内注射用溶于200μl PBS的5mg/kg抗αd抗体205C或无关抗体治疗小鼠。以前已经描述过与小鼠αd单克隆抗体交叉反应的纯化仓鼠抗大鼠205C抗体。最为阴性对照，一组小鼠接受等量的盐水注射。在4-25天，用抗体或盐水注射每隔一天治疗小鼠，总共治疗10次，检测动物体重和疾病体征的改变。总之，每组的观察持续总共两个月。
垂死状态是测定的终点。处死病重的动物。评估组中的存活率，并且用组织的组织学分析作为αd抗体治疗效率的额外指标。进行了观察αd抗体的治疗特性的相似实验，以补充前面所描述的预防研究。
第35天，用αd抗体治疗的小鼠都没有死亡，而盐水治疗组的9只小鼠中的2只死亡，剩下7只中的2发生了综合征的典型状况。用无关抗体治疗的组中，8只中的3只死亡。
实施例46
αd在人白血病细胞上的表达
根据细胞系，白血病可以分为两类，髓细胞和淋巴细胞白血病，这两种类型都可进一步区分为急性和慢性。由于αd表达明显限于髓细胞系细胞，假定髓细胞而不是淋巴细胞白血病表达αd。如果第一个假设是正确的，将确定研究的第二种细胞系是否根据致病性而导致αd表达的不同，从而提示αd在这些细胞上的疾病相关功能。
按实施例18的描述用抗体212D和217L检测了αd在外周血细胞上的表达。在检查白血病细胞时，首先通过流式细胞术分析正常骨髓细胞的αd表达，以建立该细胞类型的基线。根据标准程序用抗体212D和217L染色患者样品，两种抗体均表现出与骨髓中的单核细胞的弱反应性。抗体212D仅仅是临界阳性。
来自患者外周血或骨髓的白血病细胞的流式细胞术分析表明，在三种急性髓细胞白血病(AML)患者的成髓细胞和成单核细胞上存在212D和217L表位。在来自于慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的细胞上也观察到了表达。在更晚的时间也评估了来自于另一AML患者的细胞，发现是αd阳性的。αd在细胞上的表达比对照单克隆抗体高50-100％，但显著低于CD11a，CD11b和CD11c的表达水平。
根据这些结果，也评估了等同于M-4期(以M1-M5的区分标准)AML细胞的U937细胞系，即一种髓细胞系白血病。CD11a，CD11b和CD11c的表达模式与AML患者的细胞相似。有趣的是，细胞表面αd蛋白的存在依赖于培养条件。具有高血清水平的丰富培养基(Iscove′s改良Dulbecco′s培养基，20％FBS)支持αd表达，而基本培养基(RPMI，10％FBS)则不支持。
关于在CLL患者的成淋巴细胞上检测到αd表达的发现表明，αd可以在淋巴细胞系的细胞中表达，与其它数据一致(即大鼠CD5+细胞和犬CD8+细胞上的αd表达)。其它白细胞整联蛋白在这些细胞上的相对高水平表达将排除以可重复反式用这些细胞检验αd功能，并且表明，该家族的功能冗余可以补偿这些细胞类型中一个成员的抑制。实际上，这些细胞的αd表达可以与错误转录同时发生。
尽管这些实验没有完全支持最初的假设，αd蛋白在髓细胞和淋巴细胞系白血病上的存在表明，很多患者可以通过使用目的在于肿瘤去除而不是功能抑制的抗αd治疗。
本领域的技术人员可对上面列出的说明性实施例作各种修改和变化。因此本发明仅由所附权利要求限定。
序列表
<110>W.M.加拉丁
     M.范德维伦
<120>新型人β2整联蛋白α亚基
<130>27866/36646
<140>
<141>
<150>08/173,497
<151>1993-12-23
<150>08/286,889
<151>1994-08-05
<150>08/362,652
<151>1994-12-21
<150>08/943,363
<151>1997-10-03
<150>09/193,043
<151>1998-11-06
<150>09/350,259
<151>1999-07-08
<160>114
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>3726
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(3)..(3485)
<400>1
tg acc ttc ggc act gtg ctt ctt ctg agt gtc ctg gct tct tat cat    47
    Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His
      1               5                  10                  15
gga ttc aac ctg gat gtg gag gag cct acg atc ttc cag gag gat gca  95
Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala
                 20                  25                  30
ggc ggc ttt ggg cag agc gtg gtg cag ttc ggt gga tct cga ctc gtg  143
Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
             35                  40                  45
gtg gga gca ccc ctg gag gtg gtg gcg gcc aac cag acg gga cgg ctg  191
Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu
         50                  55                  60
tat gac tgc gca gct gcc acc ggc atg tgc cag ccc atc ccg ctg cac  239
Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His
     65                  70                  75
atc cgc cct gag gcc gtg aac atg tcc ttg ggc ctg acc ctg gca gcc  287
Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala
 80                  85                  90                  95
tcc acc aac ggc tcc cgg ctc ctg gcc tgt ggc ccg acc ctg cac aga  335
Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg
                100                 105                 110
gtc tgt ggg gag aac tca tac tca aag ggt tcc tgc ctc ctg ctg ggc  383
Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
            115                 120                 125
tcg cgc tgg gag atc atc cag aca gtc ccc gac gcc acg cca gag tgt  431
Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys
        130                 135                 140
cca cat caa gag atg gac atc gtc ttc ctg att gac ggc tct gga agc  479
Pro His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
    145                 150                 155
att gac caa aat gac ttt aac cag atg aag ggc ttt gtc caa gct gtc  527
Ile Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val
160                 165                 170                 175
atg ggc cag ttt gag ggc act gac acc ctg ttt gca ctg atg cag tac  575
Met Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr
                180                 185                 190
tca aac ctc ctg aag atc cac ttc acc ttc acc caa ttc cgg acc agc  623
Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser
            195                 200                 205
ccg agc cag cag agc ctg gtg gat ccc atc gtc caa ctg aaa ggc ctg  671
Pro Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu
        210                 215                 220
acg ttc acg gcc acg ggc atc ctg aca gtg gtg aca cag cta ttt cat  719
Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His
    225                 230                 235
cat aag aat ggg gcc cga aaa agt gcc aag aag atc ctc att gtc atc  767
His Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
240                 245                 250                 255
aca gat ggg cag aag tac aaa gac ccc ctg gaa tac agt gat gtc atc  815
Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile
                260                 265                 270
ccc cag gca gag aag gct ggc atc atc cgc tac gct atc ggg gtg gga  863
Pro Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly
            275                 280                 285
cac gct ttc cag gga ccc act gcc agg cag gag ctg aat acc atc agc  911
His Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser
        290                 295                 300
tca gcg cct ccg cag gac cac gtg ttc aag gtg gac aac ttt gca gcc  959
Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala
    305                 310                 315
ctt ggc agc atc cag aag cag ctg cag gag aag atc tat gca gtt gag  1007
Leu Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu
320                 325                 330                 335
gga acc cag tcc agg gca agc agc tcc ttc cag cac gag atg tcc caa  1055
Gly Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln
                340                 345                 350
gaa ggc ttc agc aca gcc ctc aca atg gat ggc ctc ttc ctg ggg gct  1103
Glu Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala
            355                 360                 365
gtg ggg agc ttt agc tgg tct gga ggt gcc ttc ctg tat ccc cca aat  1151
Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn
        370                 375                 380
atg agc ccc acc ttc atc aac atg tct cag gag aat gtg gac atg agg  1199
Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg
    385                 390                 395
gac tct tac ctg ggt tac tcc acc gag cta gcc ctg tgg aag ggg gta  1247
Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val
400                 405                 410                 415
cag aac ctg gtc ctg ggg gcc ccc cgc tac cag cat acc ggg aag gct  1295
Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala
                420                 425                 430
gtc atc ttc acc cag gtg tcc agg caa tgg agg aag aag gcc gaa gtc  1343
Val Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val
            435                 440                 445
aca ggg acg cag atc ggc tcc tac ttc ggg gcc tcc ctc tgc tcc gtg  1391
Thr Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val
        450                 455                 460
gat gtg gac agc gat ggc agc acc gac ctg atc ctc att ggg gcc ccc  1439
Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro
    465                 470                 475
cat tac tat gag cag acc cga ggg ggc cag gtg tcc gtg tgt ccc ttg  1487
His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu
480                 485                 490                 495
cct agg ggg cag agg gtg cag tgg cag tgt gac gct gtt ctc cgt ggt  1535
Pro Arg Gly Gln Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly
                500                 505                 510
gag cag ggc cac ccc tgg ggc cgc ttt ggg gca gcc ctg aca gtg ttg  1583
Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu
            515                 520                 525
ggg gat gtg aat gag gac aag ctg ata gac gtg gcc att ggg gcc ccg  1631
Gly Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro
        530                 535                 540
gga gag cag gag aac cgg ggt gct gtc tac ctg ttt cac gga gcc tca  1679
Gly Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser
    545                 550                 555
gaa tcc ggc atc agc ccc tcc cac agc cag cgg att gcc agc tcc cag  1727
Glu Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln
560                 565                 570                 575
ctc tcc ccc agg ctg cag tat ttt ggg cag gcg ctg agt ggg ggt cag  1775
Leu Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln
                580                 585                 590
gac ctc acc cag gat gga ctg atg gac ctg gcc gtg ggg gcc cgg ggc  1823
Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly
            595                 600                 605
cag gtg ctc ctg ctc agg agt ctg ccg gtg ctg aaa gtg ggg gtg gcc  1871
Gln Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala
        610                 615                 620
atg aga ttc agc cct gtg gag gtg gcc aag gct gtg tac cgg tgc tgg  1919
Met Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp
    625                 630                 635
gaa gag aag ccc agt gcc ctg gaa gct ggg gac gcc acc gtc tgt ctc  1967
Glu Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu
640                 645                 650                 655
acc atc cag aaa agc tca ctg gac cag cta ggt gac atc caa agc tct  2015
Thr Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser
                660                 665                 670
gtc agg ttt gat ctg gca ctg gac cca ggt cgt ctg act tct cgt gcc  2063
Val Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala
            675                 680                 685
att ttc aat gaa acc aag aac ccc act ttg act cga aga aaa acc ctg  2111
Ile Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu
        690                 695                 700
gga ctg ggg att cac tgt gaa acc ctg aag ctg ctt ttg cca gat tgt  2159
Gly Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys
    705                 710                 715
gtg gag gat gtg gtg agc ccc atc att ctg cac ctc aac ttc tca ctg  2207
Val Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu
720                 725                 730                 735
gtg aga gag ccc atc ccc tcc ccc cag aac ctg cgt cct gtg ctg gcc  2255
Val Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala
                740                 745                 750
gtg ggc tca caa gac ctc ttc act gct tct ctc ccc ttc gag aag aac  2303
Val Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn
            755                 760                 765
tgt ggg caa gat ggc ctc tgt gaa ggg gac ctg ggt gtc acc ctc agc  2351
Cys Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser
        770                 775                 780
ttc tca ggc ctg cag acc ctg acc gtg ggg agc tcc ctg gag ctc aac  2399
Phe Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn
    785                 790                 795
gtg att gtg act gtg tgg aac gca ggt gag gat tcc tac gga acc gtg  2447
Val Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val
800                 805                 810                 815
gtc agc ctc tac tat cca gca ggg ctg tcg cac cga cgg gtg tca gga  2495
Val Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly
                820                 825                 830
gcc cag aag cag ccc cat cag agt gcc ctg cgc ctg gca tgt gag aca  2543
Ala Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr
            835                 840                 845
gtg ccc act gag gat gag ggc cta aga agc agc cgc tgc agt gtc aac  2591
Val Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn
        850                 855                 860
cac ccc atc ttc cat gag ggc tct aac ggc acc ttc ata gtc aca ttc  2639
His Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe
    865                 870                 875
gat gtc tcc tac aag gcc acc ctg gga gac agg atg ctt atg agg gcc  2687
Asp Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala
880                 885                 890                 895
agt gca agc agt gag aac aat aag gct tca agc agc aag gcc acc ttc  2735
Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe
                900                 905                 910
cag ctg gag ctc ccg gtg aag tat gca gtc tac acc atg atc agc agg  2783
Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg
            915                 920                 925
cag gaa gaa tcc acc aag tac ttc aac ttt gca acc tcc gat gag aag  2831
Gln Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys
        930                 935                 940
aaa atg aaa gag gct gag cat cga tac cgt gtg aat aac ctc agc cag  2879
Lys Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln
    945                 950                 955
cga gat ctg gcc atc agc att aac ttc tgg gtt cct gtc ctg ctg aac  2927
Arg Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn
960                 965                 970                 975
ggg gtg gct gtg tgg gat gtg gtc atg gag gcc cca tct cag agt ctc  2975
Gly Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu
                980                 985                 990
ccc tgt gtt tca gag aga aaa cct ccc cag cat tct gac ttc ctg acc  3023
Pro Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr
            995                1000                1005
cag att tca aga agt ccc atg ctg gac tgc tcc att gct gac tgc ctg  3071
Gln Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu
       1010                1015                1020
cag ttc cgc tgt gac gtc ccc tcc ttc agc gtc cag gag gag ctg gat  3119
Gln Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp
   1025                1030                1035
ttc acc ctg aag ggc aat ctc agt ttc ggc tgg gtc cgc gag aca ttg  3167
Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu
1040               1045                1050                1055
cag aag aag gtg ttg gtc gtg agt gtg gct gaa att acg ttc gac aca  3215
Gln Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr
               1060                1065                1070
tcc gtg tac tcc cag ctt cca gga cag gag gca ttt atg aga gct cag  3263
Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln
           1075                1080                1085
atg gag atg gtg cta gaa gaa gac gag gtc tac aat gcc att ccc atc  3311
Met Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile
       1090                1095                1100
atc atg ggc agc tct gtg ggg gct ctg cta ctg ctg gcg ctc atc aca  3359
Ile Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr
   1105                1110                1115
gcc aca ctg tac aag ctt ggc ttc ttc aaa cgc cac tac aag gaa atg  3407
Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met
1120               1125                1130                1135
ctg gag gac aag cct gaa gac act gcc aca ttc agt ggg gac gat ttc  3455
Leu Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe
               1140                1145                1150
agc tgt gtg gcc cca aat gtg cct ttg tcc taataatcca ctttcctgtt    3505
Ser Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser
           1155                1160
tatctctacc actgtgggct ggacttgctt gcaaccataa atcaacttac atggaaacaa 3565
cttctgcata gatctgcact ggcctaagca acctaccagg tgctaagcac cttctcggag 3625
agatagagat tgtaatgttt ttacatatct gtccatcttt ttcagcaatg acccactttt 3685
tacagaagca ggcatggtgc cagcataaat tttcatatgc t                     3726
<210>2
<211>1161
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His Gly
  1               5                  10                  15
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala Gly
             20                  25                  30
Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val
         35                  40                  45
Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr
     50                  55                  60
Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His Ile
65                  70                  75                  80
Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser
                85                  90                  95
Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg Val
                100                 105                 110
Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser
            115                 120                 125
Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys Pro
        130                 135                 140
His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val Met
                165                 170                 175
Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr Ser
            180                 185                 190
Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser Pro
        195                 200                 205
Ser Gln Gln Ser LeuVal Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu Thr
    210                 215                 220
Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu ThrVal Val Thr Gln Leu Phe His His
225                 230                 235                 240
Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr
                245                 250                 255
Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro
            260                 265                 270
Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly His
        275                 280                 285
Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser Ser
    290                 295                 300
Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala Leu
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu Gly
                325                 330                 335
Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala Val
        355                 360                 365
Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Met
    370                 375                 380
Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp
385                 390                 395                 400
Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val Gln
                405                 410                 415
Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala Val
            420                 425                 430
Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val Thr
        435                 440                 445
Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp
    450                 455                 460
Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro His
465                 470                 475                 480
Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu Pro
                485                 490                 495
Arg Gly Gln Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu
            500                 505                 510
Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly
        515                 520                 525
Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly
    530                 535                 540
Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser Glu
545                 550                 555                 560
Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln Leu
                565                 570                 575
Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln Asp
            580                 585                 590
Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly Gln
        595                 600                 605
Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala Met
    610                 615                 620
Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp Glu
625                 630                 635                 640
Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr
                645                 650                 655
Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val
            660                 665                 670
Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile
        675                 680                 685
Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
    690                 695                 700
Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val
705                 710                 715                 720
Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val
                725                 730                 735
Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val
            740                 745                 750
Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys
        755                 760                 765
Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe
    770                 775                 780
Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val
785                 790                 795                 800
Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val
                805                 810                 815
Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Ala
            820                 825                 830
Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Val
        835                 840                 845
Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His
    850                 855                 860
Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp
865                 870                 875                 880
Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala Ser
                885                 890                 895
Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gln
            900                 905                 910
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gln
        915                 920                 925
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys Lys
    930                 935                 940
Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln Arg
945                 950                 955                 960
Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
                965                 970                 975
Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu Pro
            980                 985                 990
Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr Gln
        995                1000                1005
Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu Gln
   1010                1015                1020
Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp Phe
025                1030                1035                 104
Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gln
              1045                1050                1055
Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
           1060                1065                1070
Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln Met
       1075                1080                1085
Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile Ile
   1090                1095                1100
Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Ala
105                1110                1115                 112
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu
               1125                1130                1135
Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser
           1140                1145                1150
Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser
       1155                1160
<210>3
<211>1153
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Met Ala Leu Arg Val Leu Leu Leu Thr Ala Leu Thr Leu Cys His Gly
  1               5                  10                  15
Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg
             20                  25                  30
Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Leu Gln Gly Ser Arg Val Val Val
         35                  40                  45
Gly Ala Pro Gln Glu Ile Val Ala Ala Asn Gln Arg Gly Ser Leu Tyr
     50                  55                  60
Gln Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys Glu Pro Ile Arg Leu Gln Val
 65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Thr
                 85                  90                  95
Thr Ser Pro Pro Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Gln Thr
            100                 105                 110
Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly Leu Cys Phe Leu Phe Gly Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Arg Gln Gln Pro Gln Lys Phe Pro Glu Ala Leu Arg Gly Cys
    130                 135                 140
Pro Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
Ile Ile Pro His Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val
                165                 170                 175
Met Glu Gln Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr
            180                 185                 190
Ser Glu Glu Phe Arg Ile His Phe Thr Phe Lys Glu Phe Gln Asn Asn
        195                 200                 205
Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro Ile Thr Gln Leu Leu Gly Arg
    210                 215                 220
Thr His Thr Ala Thr Gly Ile Arg Lys Val Val Arg Glu Leu Phe Asn
225                 230                 235                 240
Ile Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn Ala Phe Lys Ile Leu Val Val Ile
                245                 250                 255
Thr Asp Gly Glu Lys Phe Gly Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile
            260                 265                 270
Pro Glu Ala Asp Arg Glu Gly Val Ile Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly
        275                 280                 285
Asp Ala Phe Arg Ser Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ala
    290                 295                 300
Ser Lys Pro Pro Arg Asp His Val Phe Gln Val Asn Asn Phe Glu Ala
305                 310                 315                 320
Leu Lys Thr Ile Gln Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu
                325                 330                 335
Gly Thr Gln Thr Gly Ser Ser Ser Ser Phe Glu His Glu Met Ser Gln
            340                 345                 350
Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Pro Leu Leu Ser Thr
        355                 360                 365
Val Gly Ser Tyr Asp Trp Ala Gly Gly Val Phe Leu Tyr Thr Ser Lys
    370                 375                 380
Glu Lys Ser Thr Phe Ile Asn Met Thr Arg Val Asp Ser Asp Met Asn
385                 390                 395                 400
Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ala Ala Ala Ile Ile Leu Arg Asn Arg Val
                405                 410                 415
Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Leu Val
            420                 425                 430
Ala Met Phe Arg Gln Asn Thr Gly Met Trp Glu Ser Asn Ala Asn Val
        435                 440                 445
Lys Gly Thr Gln Ile Gly Ala Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val
    450                 455                 460
Asp Val Asp Ser Asn Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro
465                 470                 475                 480
His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu
                485                 490                 495
Pro Arg Gly Gln Arg Ala Arg Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Tyr Gly
            500                 505                 510
Glu Gln Gly Gln Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu
        515                 520                 525
Gly Asp Val Asn Gly Asp Lys Leu Thr Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro
    530                 535                 540
Gly Glu Glu Asp Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Thr Ser
545                 550                 555                 560
Gly Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Gly Ser Lys
                565                 570                 575
Leu Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln
           580                 585                 590
Asp Leu Thr Met Asp Gly Leu Val Asp Leu Thr Val Gly Ala Gln Gly
        595                 600                 605
His Val Leu Leu Leu Arg Ser Gln Pro Val Leu Arg Val Lys Ala Ile
    610                 615                 620
Met Glu Phe Asn Pro Arg Glu Val Ala Arg Asn Val Phe Glu Cys Asn
625                 630                 635                 640
Asp Gln Val Val Lys Gly Lys Glu Ala Gly Glu Val Arg Val Cys Leu
                645                 650                 655
His Val Gln Lys Ser Thr Arg Asp Arg Leu Arg Glu Gly Gln Ile Gln
            660                 665                 670
Ser Val Val Thr Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Ser Gly Arg Pro His Ser
        675                 680                 685
Arg Ala Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Ser Thr Arg Arg Gln Thr Gln
    690                 695                 700
Val Leu Gly Leu Thr Gln Thr Cys Glu Thr Leu Lys Leu Gln Leu Pro
705                 710                 715                 720
Asn Cys Ile Glu Asp Pro Val Ser Pro Ile Val Leu Arg Leu Asn Phe
                725                 730                 735
Ser Leu Val Gly Thr Pro Leu Ser Ala Phe Gly Asn Leu Arg Pro Val
            740                 745                 750
Leu Ala Glu Asp Ala Gln Arg Leu Phe Thr Ala Leu Phe Pro Phe Glu
        755                 760                 765
Lys Asn Cys Gly Asn Asp Asn Ile Cys Gln Asp Asp Leu Ser Ile Thr
    770                 775                 780
Phe Ser Phe Met Ser Leu Asp Cys Leu Val Val Gly Gly Pro Arg Glu
785                 790                 795                 800
Phe Asn Val Thr Val Thr Val Arg Asn Asp Gly Glu Asp Ser Tyr Arg
                805                 810                 815
Thr Gln Val Thr Phe Phe Phe Pro Leu Asp Leu Ser Tyr Arg Lys Val
            820                 825                 830
Ser Thr Leu Gln Asn Gln Arg Ser Gln Arg Ser Trp Arg Leu Ala Cys
        835                 840                 845
Glu Ser Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Gly Ala Leu Lys Ser Thr Ser
    850                 855                 860
Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Pro Glu Asn Ser Glu Val Thr Phe
865                 870                 875                 880
Asn Ile Thr Phe Asp Val Asp Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asn Lys Leu
                885                 890                 895
Leu Leu Lys Ala Asn Val Thr Ser Glu Asn Asn Met Pro Arg Thr Asn
            900                 905                 910
Lys Thr Glu Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met
        915                 920                 925
Val Val Thr Ser His Gly Val Ser Thr Lys Tyr Leu Asn Phe Thr Ala
    930                 935                 940
Ser Glu Asn Thr Ser Arg Val Met Gln His Gln Tyr Gln Val Ser Asn
945                 950                 955                 960
Leu Gly Gln Arg Ser Leu Pro Ile Ser Leu Val Phe Leu Val Pro Val
                965                 970                 975
Arg Leu Asn Gln Thr Val Ile Trp Asp Arg Pro Gln Val Thr Phe Ser
            980                 985                 990
Glu Asn Leu Ser Ser Thr Cys His Thr Lys Glu Arg Leu Pro Ser His
        995                1000                1005
Ser Asp Phe Leu Ala Glu Leu Arg Lys Ala Pro Val Val Asn Cys Ser
   1010                1015                1020
Ile Ala Val Cys Gln Arg Ile Gln Cys Asp Ile Pro Phe Phe Gly Ile
1025               1030                1035                1040
Gln Glu Glu Phe Asn Ala Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Asp Trp
               1045                1050                1055
Tyr Ile Lys Thr Ser His Asn His Leu Leu Ile Val Ser Thr Ala Glu
           1060                1065                1070
Ile Leu Phe Asn Asp Ser Val Phe Thr Leu Leu Pro Gly Gln Gly Ala
       1075                1080                1085
Phe Val Arg Ser Gln Thr Glu Thr Lys Val Glu Pro Phe Glu Val Pro
   1090                1095                1100
Asn Pro Leu Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu
1105               1110                1115                1120
Leu Ala Leu Ile Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg
               1125                1130                1135
Gln Tyr Lys Asp Met Met Ser Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala Glu Pro
           1140                1145                1150
Gln
<210>4
<211>1163
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Thr Arg Thr Arg Ala Ala Leu Leu Leu Phe Thr Ala Leu Ala Thr
  1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Phe Asn Leu Asp Thr Glu Glu Leu Thr Ala Phe Arg Val
             20                  25                  30
Asp Ser Ala Gly Phe Gly Asp Ser Val Val Gln Tyr Ala Asn Ser Trp
         35                  40                  45
Val Val Val Gly Ala Pro Gln Lys Ile Ile Ala Ala Asn Gln Ile Gly
     50                  55                  60
Gly Leu Tyr Gln Cys Gly Tyr Ser Thr Gly Ala Cys Glu Pro Ile Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Val Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
                 85                  90                  95
Ala Ser Thr Thr Ser Pro Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val
            100                 105                 110
His His Glu Cys Gly Arg Asn Met Tyr Leu Thr Gly Leu Cys Phe Leu
        115                 120                 125
Leu Gly Pro Thr Gln Leu Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Gln Glu
    130                 135                 140
Cys Pro Arg Gln Glu Gln Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ser Ile Ser Ser Arg Asn Phe Ala Thr Met Met Asn Phe Val Arg Ala
                165                 170                 175
Val Ile Ser Gln Phe Gln Arg Pro Ser Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln
            180                 185                 190
Phe Ser Asn Lys Phe Gln Thr His Phe Thr Phe Glu Glu Phe Arg Arg
        195                 200                 205
Thr Ser Asn Pro Leu Ser Leu Leu Ala Ser Val His Gln Leu Gln Gly
    210                 215                 220
Phe Thr Tyr Thr Ala Thr Ala Ile Gln Asn Val Val His Arg Leu Phe
225                 230                 235                 240
His Ala Ser Tyr Gly Ala Arg Arg Asp Ala Ile Lys Ile Leu Ile Val
                245                 250                 255
Ile Thr Asp Gly Lys Lys Glu Gly Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Asp Val
            260                 265                 270
Ile Pro Met Ala Asp Ala Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val
         275                280                 285
Gly Leu Ala Phe Gln Asn Arg Asn Ser Trp Lys Glu Leu Asn Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Ser Lys Pro Ser Gln Glu His Ile Phe Lys Val Glu Asp Phe Asp
305                 310                 315                 320
Ala Leu Lys Asp Ile Gln Asn Gln Leu Lys Glu Lys Ile Phe Ala Ile
                325                 330                 335
Glu Gly Thr Glu Thr Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Leu Glu Met Ala
            340                 345                 350
Gln Glu Gly Phe Ser Ala Val Phe Thr Pro Asp Gly Pro Val Leu Gly
        355                 360                 365
Ala Val Gly Ser Phe Thr Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro
    370                 375                 380
Asn Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met
385                 390                 395                 400
Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly
                405                 410                 415
Val Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Lys
            420                 425                 430
Ala Val Ile Phe Ile Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Met Lys Ala Glu
        435                 440                 445
Val Ile Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser
    450                 455                 460
Val Asp Val Asp Thr Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala
465                 470                 475                 480
Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro
                485                 490                 495
Leu Pro Arg Gly Trp Arg Arg Trp Trp Cys Asp Ala Val Leu Tyr Gly
            500                 505                 510
Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu
        515                 520                 525
Gly Asp Val Asn Gly Asp Lys Leu Thr Asp Val Val Ile Gly Ala Pro
    530                 535                 540
Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Val Leu
545                 550                 555                 560
Gly Pro Ser Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Gly Ser Gln
                565                 570                 575
Leu Ser Ser Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln
            580                 585                 590
Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly
        595                 600                 605
Gln Val Leu Leu Leu Arg Thr Arg Pro Val Leu Trp Val Gly Val Ser
    610                 615                 620
Met Gln Phe Ile Pro Ala Glu Ile Pro Arg Ser Ala Phe Glu Cys Arg
625                 630                 635                 640
Glu Gln Val Val Ser Glu Gln Thr Leu Val Gln Ser Asn Ile Cys Leu
                645                 650                 655
Tyr Ile Asp Lys Arg Ser Lys Asn Leu Leu Gly Ser Arg Asp Leu Gln
            660                 665                 670
Ser Ser Val Thr Leu Asp Leu Ala Leu Ala Pro Gly Arg Leu Ser Pro
        675                 680                 685
Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Lys Asn Arg Ser Leu Ser Arg Val Arg
    690                 695                 700
Val Leu Gly Leu Lys Ala His Cys Glu Asn Phe Asn Leu Leu Leu Pro
705                 710                 715                 720
Ser Cys Val Glu Asp Ser Val Ile Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe
                725                 730                 735
Thr Leu Val Gly Lys Pro Leu Leu Ala Phe Arg Asn Leu Arg Pro Met
            740                 745                 750
Leu Ala Ala Leu Ala Gln Arg Tyr Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu
        755                 760                 765
Lys Asn Cys Gly Ala Asp His Ile Cys Gln Asp Asn Leu Gly Ile Ser
    770                 775                 780
Phe Ser Phe Pro Gly Leu Lys Ser Leu Leu Val Gly Ser Asn Leu Glu
785                 790                 795                 800
Leu Asn Ala Glu Val Met Val Trp Asn Asp Gly Glu Asp Ser Tyr Gly
                805                 810                 815
Thr Thr Ile Thr Phe Ser His Pro Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Tyr Val
            820                 825                 830
Ala Glu Gly Gln Lys Gln Gly Gln Leu Arg Ser Leu His Leu Thr Cys
        835                 840                 845
Cys Ser Ala Pro Val Gly Ser Gln Gly Thr Trp Ser Thr Ser Cys Arg
    850                 855                 860
Ile Asn His Leu Ile Phe Arg Gly Gly Ala Gln Ile Thr Phe Leu Ala
865                 870                 875                 880
Thr Phe Asp Val Ser Pro Lys Ala Val Gly Leu Asp Arg Leu Leu Leu
                885                 890                 895
Ile Ala Asn Val Ser Ser Glu Asn Asn Ile Pro Arg Thr Ser Lys Thr
            900                 905                 910
Ile Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Ile Val Val
        915                 920                 925
Ser Ser His Glu Gln Phe Thr Lys Tyr Leu Asn Phe Ser Glu Ser Glu
    930                 935                 940
Glu Lys Glu Ser His Val Ala Met His Arg Tyr Gln Val Asn Asn Leu
945                 950                 955                 960
Gly Gln Arg Asp Leu Pro Val Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Glu
                965                 970                 975
Leu Asn Gln Glu Ala Val Trp Met Asp Val Glu Val Ser His Pro Gln
            980                 985                 990
Asn Pro Ser Leu Arg Cys Ser Ser Glu Lys Ile Ala Pro Pro Ala Ser
        995                 1000                1005
Asp Phe Leu Ala His Ile Gln Lys Asn Pro Val Leu Asp Cys Ser Ile
    1010                1015                1020
Ala Gly Cys Leu Arg Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln
1025               1030                1035                1040
Glu Glu Leu Asp Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val
                1045                1050                1055
Arg Gln Ile Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile
            1060                1065                1070
Ile Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe
        1075                1080                1085
Met Arg Ala Gln Thr Ile Thr Val Leu Glu Lys Tyr Lys Val His Asn
    1090                1095                1100
Pro Ile Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Ile Gly Gly Leu Leu Leu Leu
1105               1110                1115                1120
Ala Leu Ile Thr Ala Val Leu Tyr Lys Val Gly Phe Phe Lys Arg Gln
                1125                1130                1135
Tyr Lys Glu Met Met Glu Glu Ala Asn Gly Gln Ile Ala Pro Glu Asn
            1140                1145                1150
Gly Thr Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Glu Lys
        1155                1160
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>狗
<400>5
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gln
  1               5                  10
<210>6
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>6
ttyaayytgg aygtngarga rccnatggtn ttyca    35
<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>7
ttcaacctgg acgtggagga gcccatggtg ttccaa   36
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>8
ttcaacctgg acgtngaasa ncccatggtc ttccaa   36
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>9
ttyaayytng aygtngarga rcc                 23
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>10
ttyaayytgg acgtngaaga    20
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>11
tgraanacca tnggytc       17
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>12
ttggaagacc atnggytc      18
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>13
attaaccctc actaaag       17
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>14
aatacgactc actatag       17
<210>15
<211>11
<212>PRT
<213>狗
<400>15
Val Phe Gln Glu Xaa Gly Ala Gly Phe Gly Gln
  1               5                  10
<210>16
<211>14
<212>PRT
<213>狗
<400>16
Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gln Pro Ile
  1               5                  10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>狗
<400>17
Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gln Ala Glu
  1               5                  10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>狗
<400>18
Phe Gln Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa
  1               5                  10
<210>19
<211>14
<212>PRT
<213>狗
<400>19
Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gln Glu Asn Val Asp
  1               5                  10
<210>20
<211>17
<212>PRT
<213>狗
<400>20
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gln Thr Gly
  1               5                  10                  15
Arg
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>狗
<400>21
Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala
  1               5
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>狗
<400>22
Phe Gly Glu Gln Phe Ser Glu
  1               5
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>23
raanccytcy tgraaactyt c    21
<210>24
<211>1006
<212>DNA
<213>狗
<400>24
ttcaacctgg acgtggagga gcccatggtg ttcaagagga tggagctggc tttggacaga    60
gcgtggccca gcttggcgga tctagactcg tggtgggagc ccccctggag gtggtggcgg    120
tcaaccaaac aggaaggttg tatgactgtg tggctgccac tggccttgtc aacccatacc    180
cctgcacaca cccccagatg ctgtgaacat gtccctgggt ctgtccctgt cagccgccgc    240
cagtcgcccc tggctgctgg cctgtggccc aaccatgcac agagcctgtg gggagaatat    300
gtatgcagaa ggcttttgcc tcctgttgga ctcccatctg cagaccattt ggacagtacc    360
tgctgcccta ccagagtgtc caagtcaaga gatggacatt gtcttcctga ttgatggttc    420
tggcagtatg agcaaagtga ctttaaacaa atgaaggatt tgtgagagct gtgatgggac    480
agtttgaggg cacccaaacc ctgttctcac tgatacagta tcccacctcc ctgaagatcc    540
acttcacctt cacgcaattc cagagcagct ggaaccctct gagcctggtg gatcccattg    600
tccaactgga cggcctgaca tatacagcca cgggcatccg gaaagtggtg gaggaactgt    660
ttcatagtaa gaatggggcc cgtaaaagtg ccaagaagat cctcattgtc atcacagatg    720
gcaaaaatac aaagaccccc tggagtacga ggacgtatcc ccaggcagag agagcggatc    780
atccgctatg ccattggggt gggagatgct ttctggaaac ccagtgccaa gcaggagctg    840
gacaacattg gctcagagcc ggctcaggac catgtgttca gggtggacaa ctttgcagca    900
ctcagcagca tccaggagca gctgcaggag aagatctttg cactcgaagg aacccagtcg    960
acgacaagta gctctttcca acatgagatg ttccaagaag ggttca                   1006
<210>25
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>25
gtnttycarg argaygg       17
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>26
ccactgtcag gatgcccgtg    20
<210>27
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>27
agttacgaat tcgccaccat ggctctacgg gtgcttcttc tg    42
<210>28
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>28
agttacgaat tcgccaccat gactcggact gtgcttcttc tg    42
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>29
agttacgaat tcgccaccat gaccttcggc actgtg           36
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>30
ttgctgactg cctgcagttc                             20
<210>31
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>31
gttctgacgc gtaatggcat tgtagacctc gtcttc      36
<210>32
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>32
acgtatgcag gatcccatca agagatggac atcgct      36
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>33
actgcatgtc tcgaggctga agccttcttg ggacatc     37
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>34
tatagactgc tgggtagtcc ccac                   24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>35
tgaagattgg gggtaaataa caga                                         24
<210>36
<211>3528
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3453)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>36
ggc tgg gcc ctg gct tcc tgt cat ggg tct aac ctg gat gtg gag gaa    48
Gly Trp Ala Leu Ala Ser Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Glu
  1               5                  10                  15
ccc atc gtg ttc aga gag gat gca gcc agc ttt gga cag act gtg gtg    96
Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val
             20                  25                  30
cag ttt ggt gga tct cga ctc gtg gtg gga gcc cct ctg gag gcg gtg    144
Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val
         35                  40                  45
gca gtc aac caa aca gga cgg ttg tat gac tgt gca cct gcc act ggc    192
Ala Val Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly
     50                  55                  60
atg tgc cag ccc atc gta ctg cgc agt ccc cta gag gca gtg aac atg    240
Met Cys Gln Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu Glu Ala Val Asn Met
 65                  70                  75                  80
tcc ctg ggc ctg tct ctg gtg act gcc acc aat aac gcc cag ttg ctg  288
Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Ala Thr Asn Asn Ala Gln Leu Leu
                 85                  90                  95
gct tgt ggt cca act gca cag aga gct tgt gtg aag aac atg tat gcg  336
Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg Ala Cys Val Lys Asn Met Tyr Ala
            100                 105                 110
aaa ggt tcc tgc ctc ctt ctc ggc tcc agc ttg cag ttc atc cag gca  384
Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala
        115                 120                 125
gtc cct gcc tcc atg cca gag tgt cca aga caa gag atg gac att gct  432
Val Pro Ala Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gln Glu Met Asp Ile Ala
    130                 135                 140
ttc ctg att gat ggt tct ggc agc att aac caa agg gac ttt gcc cag  480
Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gln Arg Asp Phe Ala Gln
145                 150                 155                 160
atg aag gac ttt gtc aaa gct ttg atg gga gag ttt gcg agc acc agc  528
Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Thr Ser
                165                 170                 175
acc ttg ttc tcc ctg atg caa tac tcg aac atc ctg aag acc cat ttt  576
Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe
            180                 185                 190
acc ttc act gaa ttc aag aac atc ctg gac cct cag agc ctg gtg gat  624
Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro Gln Ser Leu Val Asp
        195                 200                 205
ccc att gtc cag ctg caa ggc ctg acc tac aca gcc aca ggc atc cgg  672
Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Ile Arg
    210                 215                 220
aca gtg atg gaa gag cta ttt cat agc aag aat ggg tcc cgt aaa agt  720
Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser
225                 230                 235                 240
gcc aag aag atc ctc ctt gtc atc aca gat ggg cag aaa tac aga gac  768
Ala Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Arg Asp
                245                 250                 255
ccc ctg gag tat agt gat gtc att ccc gcc gca gac aaa gct ggc atc  816
Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Ala Gly Ile
            260                 265                 270
att cgt tat gct att ggg gtg gga gat gcc ttc cag gag ccc act gcc  864
Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe Gln Glu Pro Thr Ala
        275                 280                 285
ctg aag gag ctg aac acc att ggc tca gct ccc cca cag gac cac gtg  912
Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val
    290                 295                 300
ttc aag gta ggc aac ttt gca gca ctt cgc agc atc cag agg caa ctt  960
Phe Lys Val Gly Asn Phe Ala Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
cag gag aaa atc ttc gcc att gag gga act caa tca agg tca agt agt  1008
Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu Gly Thr Gln Ser Arg Ser Ser Ser
                325                 330                 335
tcc ttt cag cac gag atg tca caa gaa ggt ttc agt tca gct ctc aca  1056
Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr
            340                 345                 350
tcg gat gga ccc gtt ctg ggg gcc gyg gga agc ttc agc tgg tcc gga  1104
Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala Xaa Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly
        355                 360                 365
ggt gcc ttc tta tat ccc cca aat acg aga ccc acc ttt atc aac atg  1152
Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met
    370                 375                 380
tct cag gag aat gtg gac atg aga gac tcc tac ctg ggt tac tcc acc  1200
Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr
385                 390                 395                 400
gca gtg gcc ttt tgg aag ggg gtt cac agc ctg atc ctg ggg gcc ccg  1248
Ala Val Ala Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro
                405                 410                 415
cgt cac cag cac acg ggg aag gtt gtc atc ttt acc cag gaa gcc agg  1296
Arg His Gln His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ala Arg
            420                 425                 430
cat tgg agg ccc aag tct gaa gtc aga ggg aca cag atc ggc tcc tac  1344
His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr
        435                 440                 445
ttc ggg gcc tct ctc tgt tct gtg gac gtg gat aga gat ggc agc acy  1392
Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa
    450                 455                 460
gac ctg gtc ctg atc gga gcc ccc cat tac tat gag cag acc cga ggg  1440
Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly
465                 470                 475                 480
ggg cag gtc tca gtg tkc ccc gtg ccc ggt gtg agg ggc agg tgg cag  1488
Gly Gln Val Ser Val Xaa Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln
                485                 490                 495
tgt gag gcc acc ctc cac ggg gag cag grc cat cct tgg ggc cgc ttt  1536
Cys Glu Ala Thr Leu His Gly Glu Gln Xaa His Pro Trp Gly Arg Phe
            500                 505                 510
ggg gtg gct ctg aca gtg ctg ggg gac gta aac ggg gac aat ctg gca  1584
Gly Val Ala Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Ala
        515                 520                 525
gac gtg gct att ggt gcc cct gga gag gag gag agc aga ggt gct gtc  1632
Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ala Val
    530                 535                 540
tac ata ttt cat gga gcc tcg aga ctg gag atc atg ccc tca ccc agc  1680
Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser
545                 550                 555                 560
cag cgg gtc act ggc tcc cag ctc tcc ctg aga ctg cag tat ttt ggg  1728
Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu Ser Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly
                565                 570                 575
cag tca ttg agt ggg ggt cag gac ctt aca cag gat ggc ctg gtg gac  1776
Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp
            580                 585                 590
ctg gcc gtg gga gcc cag ggg cac gta ctg ctg ctc agg agt ctg cct  1824
Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro
        595                 600                 605
ctg ctg aaa gtg gag ctc tcc ata aga ttc gcc ccc atg gag gtg gca  1872
Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Ala Pro Met Glu Val Ala
    610                 615                 620
aag gct gtg tac cag tgc tgg gaa agg act ccc act gtc ctc gaa gct  1920
Lys Ala Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala
625                 630                 635                 640
gga gag gcc act gtc tgt ctc act gtc cac aaa ggc tca cct gac ctg  1968
Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys Gly Ser Pro Asp Leu
                645                 650                 655
tta ggt aat gtc caa ggc tct gtc agg tat gat ctg gcg tta gat ccg  2016
Leu Gly Asn Val Gln Gly Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro
            660                 665                 670
ggc cgc ctg att tct cgt gcc att ttt gat gag act aag aac tgc act  2064
Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr
        675                 680                 685
ttg acg gga agg aag act ctg ggg ctt ggt gat cac tgc gaa aca gtg  2112
Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val
    690                 695                 700
aag ctg ctt ttg ccg gac tgt gtg gaa gat gca gtg agc cct atc atc  2160
Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile
705                 710                 715                 720
ctg cgc ctc aac ttt tcc ctg gtg aga gac tct gct tca ccc agg aac  2208
Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser Ala Ser Pro Arg Asn
                725                 730                 735
ctg cat cct gtg ctg gct gtg ggc tca caa gac cac ata act gct tct    2256
Leu His Pro Val Leu Ala Val Gly Ser Gln Asp His Ile Thr Ala Ser
            740                 745                 750
ctg ccg ttt gag aag aac tgt aag caa gaa ctc ctg tgt gag ggg gac  2304
Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp
        755                 760                 765
ctg ggc atc agc ttt aac ttc tca ggc ctg cag gtc ttg gtg gtg gga  2352
Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly
    770                 775                 780
ggc tcc cca gag ctc act gtg aca gtc act gtg tgg aat gag ggt gag    2400
Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu
785                 790                 795                 800
gac agc tat gga act tta gtc aag ttc tac tac cca gca ggg cta tct  2448
Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser
                805                 810                 815
tac cga cgg gta aca ggg act cag caa cct cat cag tac cca cta cgc  2496
Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gln Gln Pro His Gln Tyr Pro Leu Arg
            820                 825                 830
ttg gcc tgt gag gct gag ccc gct gcc cag gag gac ctg agg agc agc  2544
Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Ala Ala Gln Glu Asp Leu Arg Ser Ser
        835                 840                 845
agc tgt agc att aat cac ccc atc ttc cga gaa ggt gca aag acc acc  2592
Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Thr Thr
    850                 855                 860
ttc atg atc aca ttc gat gtc tcc tac aag gcc ttc cta gga gac agg  2640
Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg
865                 870                 875                 880
ttg ctt ctg agg gcc aaa gcc agc agt gag aat aat aag cct gat acc  2688
Leu Leu Leu Arg Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr
                885                 890                 895
aac aag act gcc ttc cag ctg gag ctc cca gtg aag tac acc gtc tat  2736
Asn Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr
            900                 905                 910
acc ctg atc agt agg caa gaa gat tcc acc aac cat gtc aac ttt tca  2784
Thr Leu Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser
        915                 920                 925
tct tcc cac ggg ggg aga agg caa gaa gcc gca cat cgc tat cgt gtg  2832
Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gln Glu Ala Ala His Arg Tyr Arg Val
    930                 935                 940
aat aac ctg agt cca ctg aag ctg gcc gtc aga gtt aac ttc tgg gtc  2880
Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Ala Val Arg Val Asn Phe Trp Val
945                 950                 955                 960
cct gtc ctt ctg aac ggt gtg gct gtg tgg gac gtg act ctg agc agc  2928
Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser
                965                 970                 975
cca gca cag ggt gtc tcc tgc gtg tcc cag atg aaa cct cct cag aat  2976
Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Met Lys Pro Pro Gln Asn
            980                 985                 990
ccc gac ttt ctg acc cag att cag aga cgt tct gtg ctg gac tgc tcc  3024
Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser
        995                 1000                1005
att gct gac tgc ctg cac tcc cgc tgt gac atc ccc tcc ttg gac atc  3072
Ile Ala Asp Cys Leu His Ser Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile
    1010               1015                1020
cag gat gaa ctt gac ttc att ctg agg ggc aac ctc agc ttc ggc tgg  3120
Gln Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp
1025               1030                1035                1040
gtc agt cag aca ttg cag gaa aag gtg ttg ctt gtg agt gag gct gaa  3168
Val Ser Gln Thr Leu Gln Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Ala Glu
               1045                1050                1055
atc act ttc gac aca tct gtg tac tcc cag ctg cca gga cag gag gca  3216
Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala
           1060                1065                1070
ttt ctg aga gcc cag gtg gag aca acg tta gaa gaa tac gtg gtc tat  3264
Phe Leu Arg Ala Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr
       1075                1080                1085
gag ccc atc ttc ctc gtg gcg ggc agc tcg gtg gga ggt ctg ctg tta  3312
Glu Pro Ile Phe Leu Val Ala Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu
   1090                1095                1100
ctg gct ctc atc aca gtg gta ctg tac aag ctt ggc tyc tyc aaa cgt  3360
Leu Ala Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg
1105               1110                1115                1120
cag tac aaa gaa atg ctg gac ggc aag gct gca gat cct gtc aca gcc  3408
Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala Asp Pro Val Thr Ala
               1125                1130                1135
ggc cag gca gat ttc ggc tgt gag act cct cca tat ctc gtg agc      3453
Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser
           1140                1145                1150
taggaatcca ctctcctgcc tatctctgna atgaagattg gtcctgccta tgagtctact 3513
ggcatgggaa cgagt                                                  3528
<210>37
<211>1151
<212>PRT
<213>大鼠
<400>37
Gly Trp Ala Leu Ala Ser Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Glu
  1               5                  10                  15
Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val
             20                  25                  30
Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val
         35                  40                  45
Ala Val Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly
     50                  55                  60
Met Cys Gln Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu Glu Ala Val Asn Met
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Ala Thr Asn Asn Ala Gln Leu Leu
                 85                  90                  95
Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg Ala Cys Val Lys Asn Met Tyr Ala
            100                 105                 110
Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala
        115                 120                 125
Val Pro Ala Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gln Glu Met Asp Ile Ala
    130                 135                 140
Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gln Arg Asp Phe Ala Gln
145                 150                 155                 160
Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Thr Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe
            180                 185                 190
Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro Gln Ser Leu Val Asp
        195                 200                 205
Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Ile Arg
    210                 215                 220
Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Arg Asp
                245                 250                 255
Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Ala Gly Ile
            260                 265                 270
Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe Gln Glu Pro Thr Ala
        275                 280                 285
Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val
    290                 295                 300
Phe Lys Val Gly Asn Phe Ala Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu Gly Thr Gln Ser Arg Ser Ser Ser
                325                 330                 335
Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr
            340                 345                 350
Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala Xaa Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly
        355                 360                 365
Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met
    370                 375                 380
Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr
385                 390                 395                 400
Ala Val Ala Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro
                405                 410                 415
Arg His Gln His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ala Arg
            420                 425                 430
His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr
        435                 440                 445
Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa
    450                 455                 460
Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly
465                 470                 475                 480
Gly Gln Val Ser Val Xaa Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln
                485                 490                 495
Cys Glu Ala Thr Leu His Gly Glu Gln Xaa His Pro Trp Gly Arg Phe
            500                 505                 510
Gly Val Ala Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Ala
        515                 520                 525
Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ala Val
    530                 535                 540
Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser
545                 550                 555                 560
Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu Ser Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly
                565                 570                 575
Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp
            580                 585                 590
Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro
        595                 600                 605
Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Ala Pro Met Glu Val Ala
    610                 615                 620
Lys Ala Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala
625                 630                 635                 640
Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys Gly Ser Pro Asp Leu
                645                 650                 655
Leu Gly Asn Val Gln Gly Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro
            660                 665                 670
Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr
        675                 680                 685
Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val
    690                 695                 700
Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile
705                 710                 715                 720
Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser Ala Ser Pro Arg Asn
                725                 730                 735
Leu His Pro Val Leu Ala Val Gly Ser Gln Asp His Ile Thr Ala Ser
            740                 745                 750
Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp
        755                 760                 765
Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly
    770                 775                 780
Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu
785                 790                 795                 800
Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser
                805                 810                 815
Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gln Gln Pro His Gln Tyr Pro Leu Arg
            820                 825                 830
Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Ala Ala Gln Glu Asp Leu Arg Ser Ser
        835                 840                 845
Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Thr Thr
    850                 855                 860
Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg
865                 870                 875                 880
Leu Leu Leu Arg Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr
                885                 890                 895
Asn Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr
            900                 905                 910
Thr Leu Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser
        915                 920                 925
Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gln Glu Ala Ala His Arg Tyr Arg Val
    930                 935                 940
Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Ala Val Arg Val Asn Phe Trp Val
945                 950                 955                 960
Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser
                965                 970                 975
Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Met Lys Pro Pro Gln Asn
        980                 985                 990
Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser
        995                1000                1005
Ile Ala Asp Cys Leu His Ser Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile
   1010                1015                1020
Gln Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp
1025               1030                1035                1040
Val Ser Gln Thr Leu Gln Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Ala Glu
               1045                1050                1055
Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala
           1060                1065                1070
Phe Leu Arg Ala Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr
       1075                1080                1085
Glu Pro Ile Phe Leu Val Ala Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu
   1090                1095                1100
Leu Ala Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg
1105               1110                1115                1120
Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala Asp Pro Val Thr Ala
               1125                1130                1135
Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser
           1140                1145                1150
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>38
gtccaagctg tcatgggcca g      21
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>39
gtccagcaga ctgaagagca cgg    23
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>40
tgtaaaacga cggccagt          18
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>41
ggaaacagct atgaccatg                         19
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>42
ggacatgttc actgcctcta gg                     22
<210>43
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>43
ggcggacagt cagacgactg tcctg                  25
<210>44
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>44
ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag    38
<210>45
<211>3519
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(52)..(3516)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>45
gctttctgaa ggttccagaa tcgatagtga attcgtgggc actgctcaga t atg gtc 57
                                                         Met Val
                                                           1
cgt gga gtt gtg atc ctc ctg tgt ggc tgg gcc ctg gct tcc tgt cat  105
Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser Cys His
          5                  10                  15
ggg tct aac ctg gat gtg gag aag ccc gtc gtg ttc aaa gag gat gca  153
Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu Asp Ala
     20                  25                  30
gcc agc ttc gga cag act gtg gtg cag ttt ggt gga tct cga ctc gtg  201
Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
 35                  40                  45                  50
gtg gga gcc cct ctg gag gcg gtg gca gtc aac caa aca gga cag tcg  249
Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly Gln Ser
                 55                  60                  65
tct gac tgt ccg cct gcc act ggc gtg tgc cag ccc atc tta ctg cac  297
Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu Leu His
             70                  75                  80
att ccc cta gag gca gtg aac atg tcc ctg ggc ctg tct ctg gtg gct  345
Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Ala
         85                  90                  95
gac acc aat aac tcc cag ttg ctg gct tgt ggt cca act gca cag aga  393
Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg
    100                 105                 110
gct tgt gca aag aac atg tat gca aaa ggt tcc tgc ctc ctt ctg ggc  44l
Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
115                 120                 125                 130
tcc agc ttg cag ttc atc cag gca atc cct gct acc atg cca gag tgt    489
Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro Glu Cys
                135                 140                 145
cca gga caa gag atg gac att gct ttc ctg att gat ggc tcc ggc agc    537
Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
            150                 155                 160
att gat caa agt gac ttt acc cag atg aag gac ttc gtc aaa gct ttg    585
Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu
        165                 170                 175
atg ggc cag ttg gcg agc acc agc acc tcg ttc tcc ctg atg caa tac    633
Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met Gln Tyr
    180                 185                 190
tca aac atc ctg aag act cat ttt acc ttc acg gaa ttc aag agc agc    681
Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys Ser Ser
195                 200                 205                 210
ctg agc cct cag agc ctg gtg gat gcc atc gtc cag ctc caa ggc ctg    729
Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu
                215                 220                 225
acg tac aca gcc tcg ggc atc cag aaa gtg gtg aaa gag cta ttt cat    777
Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu Phe His
            230                 235                 240
agc aag aat ggg gcc cga aaa agt gcc aag aag ata cta att gtc atc    825
Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
        245                 250                 255
aca gat ggg cag aaa ttc aga gac ccc ctg gag tat aga cat gtc atc    873
Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His Val Ile
    260                 265                 270
cct gaa gca gag aaa gct ggg atc att cgc tat gct ata ggg gtg gga    921
Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly
275                 280                 285                 290
gat gcc ttc cgg gaa ccc act gcc cta cag gag ctg aac acc att ggc    969
Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr Ile Gly
                295                 300                 305
tca gct ccc tcg cag gac cac gtg ttc aag gtg ggc aat ttt gta gca  1017
Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe Val Ala
            310                 315                 320
ctt cgc agc atc cag cgg caa att cag gag aaa atc ttt gcc att gaa  1065
Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu
        325                 330                 335
gga acc gaa tca agg tca agt agt tcc ttt cag cac gag atg tca caa  1113
Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln
    340                 345                 350
gaa ggt ttc agc tca gct ctc tca atg gat gga cca gtt ctg ggg gct  1161
Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala
355                 360                 365                 370
gtg gga ggc ttc agc tgg tct gga ggt gcc ttc ttg tac ccc tca aat  1209
Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Ser Asn
                375                 380                 385
atg aga tcc acc ttc atc aac atg tct cag gag aac gag gat atg agg  1257
Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp Met Arg
            390                 395                 400
gac gct tac ctg ggt tac tcc acc gca ctg gcc ttt tgg aag ggg gtc  1305
Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys Gly Val
        405                 410                 415
cac agc ctg atc ctg ggg gcc cct cgc cac cag cac acg ggg aag gtt  1353
His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly Lys Val
    420                 425                 430
gtc atc ttt acc cag gaa tcc agg cac tgg agg ccc aag tct gaa gtc  1401
Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val
435                 440                 445                 450
aga ggg aca cag atc ggc tcc tac ttt ggg gca tct ctc tgt tct gtg  1449
Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val
                455                 460                 465
gac atg gat aga gat ggc agc act gac ctg gtc ctg att gga gtc ccc  1497
Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Val Pro
            470                 475                 480
cat tac tat gag cac acc cga ggg ggg cag gtg tcg gtg tgc ccc atg  1545
His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Met
        485                 490                 495
cct ggt gtg agg agc agg tgg cat tgt ggg acc acc ctc cat ggg gag  1593
Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His Gly Glu
    500                 505                 510
cag ggc cat cct tgg ggc cgc ttt ggg gcg gct ctg aca gtg cta ggg  1641
Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly
515                 520                 525                 530
gac gtg aat ggg gac agt ctg gcg gat gtg gct att ggt gca ccc gga  1689
Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly
                535                 540                 545
gag gag gag aac aga ggt gct gtc tac ata ttt cat gga gcc tcg aga  1737
Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg
            550                 555                 560
cag gac atc gct ccc tcg cct agc cag cgg gtc act ggc tcc cag ctc  1785
Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu
        565                 570                 575
ttc ctg agg ctc caa tat ttt ggg cag tca tta agt ggg ggt cag gac  1833
Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp
    580                 585                 590
ctt aca cag gat ggc ctg gtg gac ctg gcc gtg gga gcc cag ggg cac  1881
Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His
595                 600                 605                 610
gtg ctg ctg ctt agg agt ctg cct ttg ctg aaa gtg ggg atc tcc att  1929
Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile Ser Ile
                615                 620                 625
aga ttt gcc ccc tca gag gtg gca aag act gtg tac cag tgc tgg gga  1977
Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys Trp Gly
            630                 635                 640
agg act ccc act gtc ctc gaa gct gga gag gcc acc gtc tgt ctc act  2025
Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr
        645                 650                 655
gtc cgc aaa ggt tca cct gac ctg tta ggt gat gtc caa agc tct gtc  2073
Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser Ser Val
    660                 665                 570
agg tat gat ctg gcg ttg gat ccg ggc cgt ctg att tct cgt gcc att  212l
Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile
675                 680                 685                 690
ttt gat gag acg aag aac tgc act ttg acc cga agg aag act ctg ggg  2169
Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
                695                 700                 705
ctt ggt gat cac tgc gaa aca atg aag ctg ctt ttg cca gac tgt gtg  2217
Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val
            710                 715                 720
gag gat gca gtg acc cct atc atc ctg cgc ctt aac tta tcc ctg gca  2265
Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser Leu Ala
        725                 730                 735
ggg gac tct gct cca tcc agg aac ctt cgt cct gtg ctg gct gtg ggc  2313
Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val Gly
    740                 745                 750
tca caa gac cat gta aca gct tct ttc ccg ttt gag aag aac tgt gag  2361
Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn Cys Glu
755                 760                 765                 770
ggg aac ctg ggc gtc agc ttc aac ttc tca ggc ctg cag gtc ttg gag  2409
Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu
                775                 780                 785
gta gga agc tcc cca gag ctc act gtg aca gta aca gtt tgg aat gag  2457
Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu
            790                 795                 800
ggt gag gac agc tat gga acc tta arc aag ttc tac tac cca gca gag  2505
Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu
        805                 810                 815
cta tct tac cga cgg gtg aca aga gcc cag caa cct cat ccg tac cca  2553
Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg Ala Gln Gln Pro His Pro Tyr Pro
    820                 825                 830
cta cgc ctg gca tgt gag gct gag ccc acg ggc cag gag agc ctg agg  2601
Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Thr Gly Gln Glu Ser Leu Arg
835                 840                 845                 850
agc agc agc tgt agc atc aat cac ccc atc ttc cga gaa ggt gcc aag  2649
Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys
                855                 860                 865
gcc acc ttc atg atc aca ttt gat gtc tcc tac aag gcc ttc ctg gga  2697
Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly
            870                 875                 880
gac agg ttg ctt ctg agg gcc agc gca agc agt gag aat aat aag cct  2745
Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro
        885                 890                 895
gaa acc agc aag act gcc ttc cag ctg gag ctt ccg gtg aag tac acg  2793
Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr
    900                 905                 910
gtc tat acc gtg atc agt agg cag gaa gat tct acc aag cat ttc aac  2841
Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn
915                 920                 925                 930
ttc tca tct tcc cac ggg gag aga cag aaa gag gcc gaa cat cga tat  2889
Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg Gln Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr
                935                 940                 945
cgt gtg aat aac ctg agt cca ttg acg ctg gcc atc agc gtt aac ttc  2937
Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Thr Leu Ala Ile Ser Val Asn Phe
            950                 955                 960
tgg gtc ccc atc ctt ctg aat ggt gtg gcc gtg tgg gat gtg act ctg  2985
Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu
        965                 970                 975
agg agc cca gca cag ggt gtc tcc tgt gtg tca cag agg gaa cct cct  3033
Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Arg Glu Pro Pro
    980                 985                 990
caa cat tcc gac ctt ctg acc cag atc caa gga cgc tct gtg ctg gac  3081
Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln Ile Gln Gly Arg Ser Val Leu Asp
995                1000                1005                1010
tgc gcc atc gcc gac tgc ctg cac ctc cgc tgt gac atc ccc tcc ttg  3129
Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu
               1015                1020                1025
ggc acc ctg gat gag ctt gac ttc att ctg aag ggc aac ctc agc ttc  3177
Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe
           1030                1035                1040
ggc tgg atc agt cag aca ttg cag aaa aag gtg ttg ctc ctg agt gag  3225
Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu
       1045                1050                1055
gct gaa atc aca ttc aac aca tct gtg tat tcc cag ctg ccg gga cag  3273
Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln
   1060                1065                1070
gag gca ttt ctg aga gcc cag gtg tca acg atg cta gaa gaa tac gtg  3321
Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val
1075               1080                1085                1090
gtc tat gag ccc gtc ttc ctc atg gtg ttc agc tca gtg gga ggt ctg  3369
Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu
               1095                1100                1105
ctg tta ctg gct ctc atc act gtg gcg ctg tac aag ctt ggc ttc ttc  3417
Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe
           1110                1115                1120
aaa cgt cag tat aaa gag atg ctg gat cta cca tct gca gat cct gac  3465
Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Leu Pro Ser Ala Asp Pro Asp
       1125                1130                1135
cca gcc ggc cag gca gat tcc aac cat gag act cct cca cat ctc acg  3513
Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr
   1140                1145                1150
tcc tag                                                          3519
Ser
1155
<210>46
<211>1155
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser
1                 5                  10                  15
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg
         35                  40                  45
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly
     50                  55                  60
Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu
 65                  70                  75                  80
Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
                 85                  90                  95
Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala
            100                 105                 110
Gln Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu
        115                 120                 125
Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro
    130                 135                 140
Glu Cys Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met
            180                 185                 190
Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu
225                 230                 235                 240
Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile
                245                 250                 255
Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His
            260                 265                 270
Val Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly
        275                 280                 285
Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr
    290                 295                 300
Ile Gly Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305                 310                 315                 320
Val Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala
                325                 330                 335
Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu
        355                 360                 365
Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro
    370                 375                 380
Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp
385                 390                 395                 400
Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys
                405                 410                 415
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly
            420                 425                 430
Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys
    450                 455                 460
Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly
465                 470                 475                 480
Val Pro His Tyr Tyr Glu HisT hr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys
                485                 490                 495
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His
            500                 505                 510
Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val
        515                 520                 525
Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala
    530                 535                 540
Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala
545                 550                 555                 560
Ser Arg Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser
                565                 570                 575
Gln Leu Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly
            580                 585                 590
Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln
        595                 600                 605
Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile
    610                 615                 620
Ser Ile Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys
625                 630                 635                 640
Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys
                645                 650                 655
Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser
            660                 665                 670
Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg
        675                 680                 685
Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr
    690                 695                 700
Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp
705                 710                 715                 720
Cys Val Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser
                725                 730                 735
Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala
            740                 745                 750
Val Gly Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn
        755                 760                 765
Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val
    770                 775                 780
Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp
785                 790                 795                 800
Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro
                805                 810                 815
Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg Ala Gln Gln Pro His Pro
            820                 825                 830
Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Thr Gly Gln Glu Ser
        835                 840                 845
Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly
    850                 855                 860
Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe
865                 870                 875                 880
Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn
                885                 890                 895
Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys
            900                 905                 910
Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Lys His
        915                 920                 925
Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg Gln Lys Glu Ala Glu His
    930                 935                 940
Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Thr Leu Ala Ile Ser Val
945                 950                 955                 960
Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val
                965                 970                 975
Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Arg Glu
            980                 985                 990
Pro Pro Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln Ile Gln Gly Arg Ser Val
        995                1000                1005
Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His Leu Arg Cys Asp Ile Pro
   1010               1015                1020
Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Lys Gly Asn Leu
025                1030                1035                1040
Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln Lys Lys Val Leu Leu Leu
               1045                1050                1055
Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro
           1060                1065                1070
Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val Ser Thr Met Leu Glu Glu
       1075                1080                1085
Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met Val Phe Ser Ser Val Gly
   1090                1095                1100
Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Tyr Lys Leu Gly
105                1110                1115                1120
Phe Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Leu Pro Ser Ala Asp
               1125                1130                1135
Pro Asp Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His
           1140                1145                1150
Leu Thr Ser
        115
<210>47
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>47
agttacggat ccggcaccat gaccttcggc actgtgatcc tcctgtgtg    49
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>48
gctggacgat ggcatccac                                     19
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>49
gtagagttac ggatccggca ccat                               24
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>50
gcagccagct tcggacagac                                    20
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>51
ccatgtccac agaacagaga g                                          21
<210>52
<211>3803
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3483)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>52
atg gtc cgt gga gtt gtg atc ctc ctg tgt ggc tgg gcc ctg gct tcc  48
Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser
  1               5                  10                  15
tgt cat ggg tct aac ctg gat gtg gag aag ccc gtc gtg ttc aaa gag  96
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
             20                  25                  30
gat gca gcc agc ttc gga cag act gtg gtg cag ttt ggt gga tct cga  144
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg
         35                  40                  45
ctc gtg gtg gga gcc cct ctg gag gcg gtg gca gtc aac caa aca gga  192
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly
     50                  55                  60
cag tcg tct gac tgt ccg cct gcc act ggc gtg tgc cag ccc atc tta  240
Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu
 65                  70                  75                  80
ctg cac att ccc cta gag gca gtg aac atg tcc ctg ggc ctg tct ctg  288
Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
                 85                  90                  95
gtg gct gac acc aat aac tcc cag ttg ctg gct tgt ggt cca act gca  336
Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala
            100                 105                 110
cag aga gct tgt gca aag aac atg tat gca aaa ggt tcc tgc ctc ctt  384
Gln Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu
        115                 120                 125
ctg ggc tcc agc ttg cag ttc atc cag gca atc cct gct acc atg cca  432
Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro
    130                 135                 140
gag tgt cca gga caa gag atg gac att gct ttc ctg att gat ggc tcc  480
Glu Cys Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser
145                 150                 155                 160
ggc agc att gat caa agt gac ttt acc cag atg aag gac ttc gtc aaa  528
Gly Ser Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys
                165                 170                 175
gct ttg atg ggc cag ttg gcg agc acc agc acc tcg ttc tcc ctg atg  576
Ala Leu Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met
            180                 185                 190
caa tac tca aac atc ctg aag act cat ttt acc ttc acg gaa ttc aag  624
Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys
        195                 200                 205
agc agc ctg agc cct cag agc ctg gtg gat gcc atc gtc cag ctc caa  672
Ser Ser Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln
    210                 215                 220
ggc ctg acg tac aca gcc tcg ggc atc cag aaa gtg gtg aaa gag cta  720
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu
225                 230                 235                 240
ttt cat agc aag aat ggg gcc cga aaa agt gcc aag aag ata cta att  768
Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile
                245                 250                 255
gtc atc aca gat ggg cag aaa ttc aga gac ccc ctg gag tat aga cat  816
Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His
            260                 265                 270
gtc atc cct gaa gca gag aaa gct ggg atc att cgc tat gct ata ggg  864
Val Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly
        275                 280                 285
gtg gga gat gcc ttc cgg gaa ccc act gcc cta cag gag ctg aac acc  912
Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr
    290                 295                 300
att ggc tca gct ccc tcg cag gac cac gtg ttc aag gtg ggc aat ttt  960
Ile Gly Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305                 310                 315                 320
gta gca ctt cgc agc atc cag cgg caa att cag gag aaa atc ttt gcc  1008
Val Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala
                325                 330                 335
att gaa gga acc gaa tca agg tca agt agt tcc ttt cag cac gag atg  1056
Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met
            340                 345                 350
tca caa gaa ggt ttc agc tca gct ctc tca atg gat gga cca gtt ctg  1104
Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu
        355                 360                 365
ggg gct gtg gga ggc ttc agc tgg tct gga ggt gcc ttc ttg tac ccc  1152
Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro
    370                 375                 380
tca aat atg aga tcc acc ttc atc aac atg tct cag gag aac gag gat  1200
Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp
385                 390                 395                 400
atg agg gac gct tac ctg ggt tac tcc acc gca ctg gcc ttt tgg aag  1248
Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys
                405                 410                 415
ggg gtc cac agc ctg atc ctg ggg gcc cct cgc cac cag cac acg ggg  1296
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly
            420                 425                 430
aag gtt gtc atc ttt acc cag gaa tcc agg cac tgg agg ccc aag tct  1344
Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser
        435                 440                 445
gaa gtc aga ggg aca cag atc ggc tcc tac ttt ggg gca tct ctc tgt  1392
Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys
    450                 455                 460
tct gtg gac atg gat aga gat ggc agc act gac ctg gtc ctg att gga  1440
Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly
465                 470                 475                 480
gtc ccc cat tac tat gag cac acc cga ggg ggg cag gtg tcg gtg tgc  1488
Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys
                485                 490                 495
ccc atg cct ggt gtg agg agc agg tgg cat tgt ggg acc acc ctc cat  1536
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His
            500                 505                 510
ggg gag cag ggc cat cct tgg ggc cgc ttt ggg gcg gct ctg aca gtg  1584
Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val
        515                 520                 525
cta ggg gac gtg aat ggg gac agt ctg gcg gat gtg gct att ggt gca  1632
Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala
    530                 535                 540
ccc gga gag gag gag aac aga ggt gct gtc tac ata ttt cat gga gcc  1680
Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala
545                 550                 555                 560
tcg aga cag gac atc gct ccc tcg cct agc cag cgg gtc act ggc tcc  1728
Ser Arg Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser
                565                 570                 575
cag ctc ttc ctg agg ctc caa tat ttt ggg cag tca tta agt ggg ggt  1776
Gln Leu Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly
            580                 585                 590
cag gac ctt aca cag gat ggc ctg gtg gac ctg gcc gtg gga gcc cag  1824
Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln
        595                 600                 605
ggg cac gtg ctg ctg ctt agg agt ctg cct ttg ctg aaa gtg ggg atc  1872
Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile
    610                 615                 620
tcc att aga ttt gcc ccc tca gag gtg gca aag act gtg tac cag tgc  1920
Ser Ile Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys
6625                 630                 635                     640
tgg gga agg act ccc act gtc ctc gaa gct gga gag gcc acc gtc tgt  1968
Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys
                645                 650                 655
ctc act gtc cgc aaa ggt tca cct gac ctg tta ggt gat gtc caa agc  2016
Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser
            660                 665                 670
tct gtc agg tat gat ctg gcg ttg gat ccg ggc cgt ctg att tct cgt  2064
Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg
        675                 680                 685
gcc att ttt gat gag acg aag aac tgc act ttg acc cga agg aag act  2112
Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr
    690                 695                 700
ctg ggg ctt ggt gat cac tgc gaa aca atg aag ctg ctt ttg cca gac  2160
Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp
705                 710                 715                 720
tgt gtg gag gat gca gtg acc cct atc atc ctg cgc ctt aac tta tcc  2208
Cys Val Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser
                725                 730                 735
ctg gca ggg gac tct gct cca tcc agg aac ctt cgt cct gtg ctg gct  2256
Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala
            740                 745                 750
gtg ggc tca caa gac cat gta aca gct tct ttc ccg ttt gag aag aac  2304
Val Gly Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn
        755                 760                 765
tgt aag cag gag ctc ctg tgt gag ggg aac ctg ggc gtc agc ttc aac  2352
Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn
    770                 775                 780
ttc tca ggc ctg cag gtc ttg gag gta gga agc tcc cca gag ctc act  2400
Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr
785                 790                 795                 800
gtg aca gta aca gtt tgg aat gag ggt gag gac agc tat gga acc tta  2448
Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu
                805                 810                 815
atc aag ttc tac tac cca gca gag cta tct tac cga cgg gtg aca aga  2496
Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg
            820                 825                 830
gcc cag caa cct cat ccg tac cca cta cgc ctg gca tgt gag gct gag  2544
Ala Gln Gln Pro His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu
        835                 840                 845
ccc acg ggc cag gag agc ctg agg agc agc agc tgt agc atc aat cac  2592
Pro Thr Gly Gln Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His
    850                 855                 860
ccc atc ttc cga gaa ggt gcc aag gcc acc ttc atg atc aca ttt gat  2640
Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp
865                 870                 875                 880
gtc tcc tac aag gcc ttc ctg gga gac agg ttg ctt ctg agg gcc agc  2688
Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser
                885                 890                 895
gca agc agt gag aat aat aag cct gaa acc agc aag act gcc ttc cag  2736
Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln
            900                 905                 910
ctg gag ctt ccg gtg aag tac acg gtc tat acc gtg atc agt agg cag  2784
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln
        915                 920                 925
gaa gat tct acc aag cat ttc aac ttc tca tct tcc cac ggg gag aga  2832
Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg
    930                 935                 940
cag aaa gag gcc gaa cat cga tat cgt gtg aat aac ctg agt cca ttg  2880
Gln Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945                 950                 955                 960
acg ctg gcc atc agc gtt aac ttc tgg gtc ccc atc ctt ctg aat ggt  2928
Thr Leu Ala Ile Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly
                965                 970                 975
gtg gcc gtg tgg gat gtg act ctg agg agc cca gca cag ggt gtc tcc  2976
Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser
            980                 985                 990
tgt gtg tca cag agg gaa cct cct caa cat tcc gac ctt ctg acc cag  3024
Cys Val Ser Gln Arg Glu Pro Pro Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln
        995                1000                1005
atc caa gga cgc tct gtg ctg gac tgc gcc atc gcc gac tgc ctg cac   3072
Ile Gln Gly Arg Ser Val Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His
   1010                1015                1020
ctc cgc tgt gac atc ccc tcc ttg ggc acc ctg gat gag ctt gac ttc   3120
Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe
1025               1030                1035                1040
att ctg aag ggc aac ctc agc ttc ggc tgg atc agt cag aca ttg cag   3168
Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln
               1045                1050                1055
aaa aag gtg ttg ctc ctg agt gag gct gaa atc aca ttc aac aca tct   3216
Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser
           1060                1065                1070
gtg tat tcc cag ctg ccg gga cag gag gca ttt ctg aga gcc cag gtg   3264
Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val
       1075                1080                1085
tca acg atg cta gaa gaa tac gtg gtc tat gag ccc gtc ttc ctc atg   3312
Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met
   1090                1095                1100
gtg ttc agc tca gtg gga ggt ctg ctg tta ctg gct ctc atc act gtg   3360
Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val
1105               1110                1115                1120
gcg ctg tac aag ctt ggc ttc ttc aaa cgt cag tat aaa gag atg ctg   3408
Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu
               1125                1130                1135
gat cta cca tct gca gat cct gac cca gcc ggc cag gca gat tcc aac   3456
Asp Leu Pro Ser Ala Asp Pro Asp Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn
           1140                1145                1150
cat gag act cct cca cat ctc acg tcc taggaatcta ctttcctgta         3503
His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr Ser
       1155                1160
tatctccaca attacgagat tggttttgct tttgcctatg aatctactgg catgggaaca 3563
agttctcttc agctctgggc tagcctggga aacttcccag aaatgatgcc ctacctcctg  3623
agctgggaga tttttatggt ttgcccatgt gtcagatttc agtgctgatc cacttttttt  3683
gcaagagcag gaatggggtc agcataaatt tacatatgga taagaactaa cacaagactg  3743
agtaatatgc tcaatattca atgtattgct tgtataaatt tttaaaaaat aaaatgaaan  3803
<210>53
<211>1161
<212>PRT
<213>小鼠
<400>53
Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser
  1               5                  10                  15
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg
         35                  40                  45
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly
    50                  55                  60
Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu
 65                  70                  75                  80
Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
                 85                  90                  95
Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala
            100                 105                 110
Gln Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu
        115                 120                 125
Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro
    130                 135                 140
Glu Cys Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met
            180                 185                 190
Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys
        195                 200                 205
Ser Ser Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu
225                 230                 235                 240
Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile
                245                 250                 255
Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His
            260                 265                 270
Val Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly
        275                 280                 285
Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr
    290                 295                 300
Ile Gly Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305                 310                 315                 320
Val Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala
                325                 330                 335
Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu
        355                 360                 365
Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro
    370                 375                 380
Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp
385                 390                 395                 400
Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys
                405                 410                 415
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly
            420                 425                 430
Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys
    450                 455                 460
Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly
465                 470                 475                 480
Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys
                485                 490                 495
Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His
            500                 505                 510
Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val
        515                 520                 525
Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala
    530                 535                 540
Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala
545                 550                 555                 560
Ser Arg Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser
                565                 570                 575
Gln Leu Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly
            580                 585                 590
Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln
        595                 600                 605
Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile
    610                 615                 620
Ser Ile Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys
625                 630                 635                 640
Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys
                645                 650                 655
Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser
            660                 665                 670
Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg
        675                 680                 685
Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr
    690                 695                 700
Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp
705                 710                 715                 720
Cys Val Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser
                725                 730                 735
Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala
            740                 745                 750
Val Gly Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn
        755                 760                 765
Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn
    770                 775                 780
Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr
785                 790                 795                 800
Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu
                805                 810                 815
Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg
            820                 825                 830
Ala Gln Gln Pro His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu
        835                 840                 845
Pro Thr Gly Gln Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His
    850                 855                 860
Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp
865                 870                 875                 880
Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser
                885                 890                 895
Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln
            900                 905                 910
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln
        915                 920                 925
Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg
    930                 935                 940
Gln Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945                 950                 955                 960
Thr Leu Ala Ile Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly
                965                 970                 975
Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser
            980                 985                 990
Cys Val Ser Gln Arg Glu Pro Pro Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln
        995                1000                1005
Ile Gln Gly Arg Ser Val Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His
   1010                1015                1020
Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe
1025               1030                1035                1040
Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln
               1045                1050                1055
Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser
           1060                1065                1070
Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val
       1075                1080                1085
Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met
   1090                1095                1100
Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val
1105               1110                1115                1120
Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu
               1125                1130                1135
Asp Leu Pro Ser Ala Asp Pro Asp Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn
           1140                1145                1150
His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr Ser
       1155                1160
<210>54
<211>3597
<212>DNA
<213>大鼠
<220>
<221>CDS
<222>(40)..(3522)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>54
agctttacag ctctctactt ctcagtgcac tgctcagtg atg gcc ggt gga gtt    54
                                           Met Ala Gly Gly Val
                                             1               5
gtg atc ctc ctg tgt ggc tgg gtc ctg gct tcc tgt cat ggg tct aac  102
Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Val Leu Ala Ser Cys His Gly Ser Asn
                 10                  15                  20
ctg gat gtg gag gaa ccc atc gtg ttc aga gag gat gca gcc agc ttt  150
Leu Asp Val Glu Glu Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Ala Ala Ser Phe
             25                  30                  35
gga cag act gtg gtg cag ttt ggt gga tct cga ctc gtg gtg gga gcc  198
Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala
         40                  45                  50
cct ctg gag gcg gtg gca gtc aac caa aca gga cgg ttg tat gac tgt  246
Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys
     55                  60                  65
gca cct gcc act ggc atg tgc cag ccc atc gta ctg cgc agt ccc cta  294
Ala Pro Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu
 70                  75                  80                  85
gag gca gtg aac atg tcc ctg ggc ctg tct ctg gtg act gcc acc aat  342
Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Ala Thr Asn
                 90                  95                 100
aac gcc cag ttg ctg gct tgt ggt cca act gca cag aga gct tgt gtg  390
Asn Ala Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg Ala Cys Val
            105                 110                 115
aag aac atg tat gcg aaa ggt tcc tgc ctc ctt ctc ggc tcc agc ttg  438
Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu
        120                 125                 130
cag ttc atc cag gca gtc cct gcc tcc atg cca gag tgt cca aga caa 486
Gln Phe Ile Gln Ala Val Pro Ala Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gln
    135                 140                 145
gag atg gac att gct ttc ctg att gat ggt tct ggc agc att aac caa  534
Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gln
150                 155                 160                 165
agg gac ttt gcc cag atg aag gac ttt gtc aaa gct ttg atg gga gag  582
Arg Asp Phe Ala Gln Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu Met Gly Glu
                170                 175                 180
ttt gcg agc acc agc acc ttg ttc tcc ctg atg caa tac tcg aac atc  630
Phe Ala Ser Thr Ser Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Ile
            185                 190                 195
ctg aag acc cat ttt acc ttc act gaa ttc aag aac atc ctg gac cct  678
Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro
        200                 205                 210
cag agc ctg gtg gat ccc att gtc cag ctg caa ggc ctg acc tac aca  726
Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Thr
    215                 220                 225
gcc aca ggc atc cgg aca gtg atg gaa gag cta ttt cat agc aag aat  774
Ala Thr Gly Ile Arg Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn
230                 235                 240                 245
ggg tcc cgt aaa agt gcc aag aag atc ctc ctt gtc atc aca gat ggg  822
Gly Ser Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly
                250                 255                 260
cag aaa tac aga gac ccc ctg gag tat agt gat gtc att ccc gcc gca  870
Gln Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Ala Ala
            265                 270                 275
gac aaa gct ggc atc att cgt tat gct att ggg gtg gga gat gcc ttc  918
Asp Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe
        280                 285                 290
cag gag ccc act gcc ctg aag gag ctg aac acc att ggc tca gct ccc  966
Gln Glu Pro Thr Ala Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Ala Pro
    295                 300                 305
cca cag gac cac gtg ttc aag gta ggc aac ttt gca gca ctt cgc agc  1014
Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe Ala Ala Leu Arg Ser
310                 315                 320                 325
atc cag agg caa ctt cag gag aaa atc ttc gcc att gag gga act caa  1062
Ile Gln Arg Gln Leu Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu Gly Thr Gln
                330                 335                 340
tca agg tca agt agt tcc ttt cag cac gag atg tca caa gaa ggt ttc  1110
Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe
            345                 350                 355
agt tca gct ctc aca tcg gat gga ccc gtt ctg ggg gcc gtg gga agc  1158
Ser Ser Ala Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala Val Gly Ser
        360                 365                 370
ttc agc tgg tcc gga ggt gcc ttc tta tat ccc cca aat acg aga ccc  1206
Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro
    375                 380                 385
acc ttt atc aac atg tct cag gag aat gtg gac atg aga gac tcc tac  1254
Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr
390                 395                 400                 405
ctg ggt tac tcc acc gca gtg gcc ttt tgg aag ggg gtt cac agc ctg  1302
Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Val Ala Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu
                410                 415                 420
atc ctg ggg gcc ccg cgt cac cag cac acg ggg aag gtt gtc atc ttt  1350
Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly LysVal Val Ile Phe
            425                 430                 435
acc cag gaa gcc agg cat tgg agg ccc aag tct gaa gtc aga ggg aca  1398
Thr Gln Glu Ala Arg His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr
        440                 445                 450
cag atc ggc tcc tac ttc ggg gcc tct ctc tgt tct gtg gac gtg gat  1446
Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp
    455                 460                 465
aga gat ggc agc acy gac ctg gtc ctg atc gga gcc ccc cat tac tat  1494
Arg Asp Gly Ser Xaa Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr
470                 475                 480                 485
gag cag acc cga ggg ggg cag gtc tca gtg ttc ccc gtg ccc ggt gtg  1542
Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Phe Pro Val Pro Gly Val
                490                 495                 500
agg ggc agg tgg cag tgt gag gcc acc ctc cac ggg gag cag ggc cat  1590
Arg Gly Arg Trp Gln Cys Glu Ala Thr Leu His Gly Glu Gln Gly His
            505                 510                 515
cct tgg ggc cgc ttt ggg gtg gct ctg aca gtg ctg ggg gac gta aac  1638
Pro Trp Gly Arg Phe Gly Val Ala Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn
        520                 525                 530
ggg gac aat ctg gca gac gtg gct att ggt gcc cct gga gag gag gag  1686
Gly Asp Asn Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly Glu Glu Glu
    535                 540                 545
agc aga ggt gct gtc tac ata ttt cat gga gcc tcg aga ctg gag atc  1734
Ser Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ile
550                 555                 560                 565
atg ccc tca ccc agc cag cgg gtc act ggc tcc cag ctc tcc ctg aga  1782
Met Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu Ser Leu Arg
                570                 575                 580
ctg cag tat ttt ggg cag tca ttg agt ggg ggt cag gac ctt aca cag  1830
Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp Leu Thr Gln
            585                 590                 595
gat ggc ctg gtg gac ctg gcc gtg gga gcc cag ggg cac gta ctg ctg  1878
Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His Val Leu Leu
        600                 605                 610
ctc agg agt ctg cct ctg ctg aaa gtg gag ctc tcc ata aga ttc gcc  1926
Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Ala
    615                 620                 625
ccc atg gag gtg gca aag gct gtg tac cag tgc tgg gaa agg act ccc  1974
Pro Met Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Thr Pro
630                 635                 640                 645
act gtc ctc gaa gct gga gag gcc act gtc tgt ctc act gtc cac aaa  2022
Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys
                650                 655                 660
ggc tca cct gac ctg tta ggt aat gtc caa ggc tct gtc agg tat gat  2070
Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asn Val Gln Gly Ser Val Arg Tyr Asp
            665                 670                 675
ctg gcg tta gat ccg ggc cgc ctg att tct cgt gcc att ttt gat gag  2118
Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile Phe Asp Glu
        680                 685                 690
act aag aac tgc act ttg acg gga agg aag act ctg ggg ctt ggt gat  2166
Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp
    695                 700                 705
cac tgc gaa aca gtg aag ctg ctt ttg ccg gac tgt gtg gaa gat gca  2214
His Cys Glu Thr Val Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Ala
710                 715                 720                 725
gtg agc cct atc atc ctg cgc ctc aac ttt tcc ctg gtg aga gac tct  2262
Val Ser Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser
                730                 735                 740
gct tca ccc agg aac ctg cat cct gtg ctg gct gtg ggc tca caa gac  2310
Ala Ser Pro Arg Asn Leu His Pro Val Leu Ala Val Gly Ser Gln Asp
            745                 750                 755
cac ata act gct tct ctg ccg ttt gag aag aac tgt aag caa gaa ctc  2358
His Ile Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gln Glu Leu
        760                 765                 770
ctg tgt gag ggg gac ctg ggc atc agc ttt aac ttc tca ggc ctg cag  2406
Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln
    775                 780                 785
gtc ttg gtg gtg gga ggc tcc cca gag ctc act gtg aca gtc act gtg  2454
Val Leu Val Val Gly Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val
790                 795                 800                 805
tgg aat gag ggt gag gac agc tat gga act tta gtc aag ttc tac tac  2502
Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr
                810                 815                 820
cca gca ggg cta tct tac cga cgg gta aca ggg act cag caa cct cat  2550
Pro Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gln Gln Pro His
            825                 830                 835
cag tac cca cta cgc ttg gcc tgt gag gct gag ccc gct gcc cag gag  2598
Gln Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Ala Ala Gln Glu
        840                 845                 850
gac ctg agg agc agc agc tgt agc att aat cac ccc atc ttc cga gaa  2646
Asp Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu
    855                 860                 865
ggt gca aag acc acc ttc atg atc aca ttc gat gtc tcc tac aag gcc  2694
Gly Ala Lys Thr Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala
870                 875                 880                 885
ttc cta gga gac agg ttg ctt ctg agg gcc aaa gcc agc agt gag aat  2742
Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asn
                890                 895                 900
aat aag cct gat acc aac aag act gcc ttc cag ctg gag ctc cca gtg  2790
Asn Lys Pro Asp Thr Asn Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val
            905                 910                 915
aag tac acc gtc tat acc ctg atc agt agg caa gaa gat tcc acc aac  2838
Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Leu Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Asn
        920                 925                 930
cat gtc aac ttt tca tct tcc cac ggg ggg aga agg caa gaa gcc gca  2886
His Val Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gln Glu Ala Ala
    935                 940                 945
cat cgc tat cgt gtg aat aac ctg agt cca ctg aag ctg gcc gtc aga  2934
His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Ala Val Arg
950                 955                 960                 965
gtt aac ttc tgg gtc cct gtc ctt ctg aac ggt gtg gct gtg tgg gac  2982
Val Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp
                970                 975                 980
gtg act ctg agc agc cca gca cag ggt gtc tcc tgc gtg tcc cag atg  3030
Val Thr Leu Ser Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Met
            985                 990                 995
aaa cct cct cag aat ccc gac ttt ctg acc cag att cag aga cgt tct  3078
Lys Pro Pro Gln Asn Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Ser
       1000                1005                1010
gtg ctg gac tgc tcc att gct gac tgc ctg cac ttc cgc tgt gac atc  3126
Val Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu His Phe Arg Cys Asp Ile
   1015                1020                1025
ccc tcc ttg gac atc cag gat gaa ctt gac ttc att ctg agg ggc aac  3174
Pro Ser Leu Asp Ile Gln Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn
1030               1035                1040                1045
ctc agc ttc ggc tgg gtc agt cag aca ttg cag gaa aag gtg ttg ctt  3222
Leu Ser Phe Gly Trp Val Ser Gln Thr Leu Gln Glu Lys Val Leu Leu
               1050                1055                1060
gtg agt gag gct gaa atc act ttc gac aca tct gtg tac tcc cag ctg  3270
Val Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu
           1065                1070                1075
cca gga cag gag gca ttt ctg aga gcc cag gtg gag aca acg tta gaa  3318
Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu
       1080                1085                1090
gaa tac gtg gtc tat gag ccc atc ttc ctc gtg gcg ggc agc tcg gtg  3366
Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Ile Phe Leu Val Ala Gly Ser Ser Val
   1095                1100                1105
gga ggt ctg ctg tta ctg gct ctc atc aca gtg gta ctg tac aag ctt  3414
Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu
1110               1115                1120                1125
ggc ttc tyc aaa cgt cag tac aaa gaa atg ctg gac ggc aag gct gca  3462
Gly Phe Xaa Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala
               1130                1135                1140
gat cct gtc aca gcc ggc cag gca gat ttc ggc tgt gag act cct cca  3510
Asp Pro Val Thr Ala Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro
           1145                1150                1155
tat ctc gtg agc taggaatcca ctctcctgcc tatctctgca atgaagattg    3562
Tyr Leu Val Ser
       1160
gtcctgccta tgagtctact ggcatgggaa cgagt                         3597
<210>55
<211>1161
<212>PRT
<213>大鼠
<400>55
Met Ala Gly Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Val Leu Ala Ser
1                 5                  10                  15
Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Ile Val Phe Arg Glu
             20                  25                  30
Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg
         35                  40                  45
Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly
     50                  55                  60
Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Val
 65                  70                  75                  80
Leu Arg Ser Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu
                 85                  90                  95
Val Thr Ala Thr Asn Asn Ala Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala
            100                 105                 110
Gln Arg Ala Cys Val Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu
        115                 120                 125
Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Val Pro Ala Ser Met Pro
    130                 135                 140
Glu Cys Pro Arg Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ile Asn Gln Arg Asp Phe Ala Gln Met Lys Asp Phe Val Lys
                165                 170                 175
Ala Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Thr Ser Thr Leu Phe Ser Leu Met
            180                 185                 190
Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys
        195                 200                 205
Asn Ile Leu Asp Pro Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Ile Arg Thr Val Met Glu Glu Leu
225                 230                 235                 240
Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Leu
                245                 250                 255
Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp
            260                 265                 270
Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly
        275                 280                 285
Val Gly Asp Ala Phe Gln Glu Pro Thr Ala Leu Lys Glu Leu Asn Thr
    290                 295                 300
Ile Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe
305                 310                 315                 320
Ala Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Leu Gln Glu Lys Ile Phe Ala
                325                 330                 335
Ile Glu Gly Thr Gln Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu
        355                 360                 365
Gly Ala Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro
    370                 375                 380
Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp
385                 390                 395                 400
Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Val Ala Phe Trp Lys
                405                 410                 415
Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly
            420                 425                 430
Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ala Arg His Trp Arg Pro Lys Ser
        435                 440                 445
Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys
    450                 455                 460
Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa Asp Leu Val Leu Ile Gly
465                 470                 475                 480
Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Phe
                485                 490                 495
Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln Cys Glu Ala Thr Leu His
            500                 505                 510
Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Val Ala Leu Thr Val
        515                 520                 525
Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala
    530                 535                 540
Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala
545                 550                 555                 560
Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser
                565                 570                 575
Gln Leu Ser Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly
            580                 585                 590
Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln
        595                 600                 605
Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glu Leu
    610                 615                 620
Ser Ile Arg Phe Ala Pro Met Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Gln Cys
625                 630                 635                 640
Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys
                645                 650                 655
Leu Thr Val His Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asn Val Gln Gly
            660                 665                 670
Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg
        675                 680                 685
Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Gly Arg Lys Thr
    690                 695                 700
Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val Lys Leu Leu Leu Pro Asp
705                 710                 715                 720
Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe Ser
                725                 730                 735
Leu Val Arg Asp Ser Ala Ser Pro Arg Asn Leu His Pro Val Leu Ala
           740                 745                 750
Val Gly Ser Gln Asp His Ile Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn
        755                 760                 765
Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Ile Ser Phe Asn
    770                 775                 780
Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly Gly Ser Pro Glu Leu Thr
785                 790                 795                 800
Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu
                805                 810                 815
Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Gly
            820                 825                 830
Thr Gln Gln Pro His Gln Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu
        835                 840                 845
Pro Ala Ala Gln Glu Asp Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His
    850                 855                 860
Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Thr Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp
865                 870                 875                 880
Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Lys
                885                 890                 895
Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr Asn Lys Thr Ala Phe Gln
            900                 905                 910
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Leu Ile Ser Arg Gln
        915                 920                 925
Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Gly Arg
    930                 935                 940
Arg Gln Glu Ala Ala His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu
945                 950                 955                 960
Lys Leu Ala Val Arg Val Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
                965                 970                 975
Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser
            980                 985                 990
Cys Val Ser Gln Met Lys Pro Pro Gln Asn Pro Asp Phe Leu Thr Gln
        995                1000                1005
Ile Gln Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu His
   1010                1015                1020
Phe Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile Gln Asp Glu Leu Asp Phe
025                1030                1035                1040
Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Ser Gln Thr Leu Gln
               1045                1050                1055
Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
           1060                1065                1070
Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val
       1075                1080                1085
Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Ile Phe Leu Val
   1090                1095                1100
Ala Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val
105                1110                1115                1120
Val Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Xaa Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu
               1125                1130                1135
Asp Gly Lys Ala Ala Asp Pro Val Thr Ala Gly Gln Ala Asp Phe Gly
           1140                1145                1150
Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser
       1155                1160
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>56
cctgtcatgg gtctaacctg    20
<210>57
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>57
aggttagacc catgacagg     19
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>58
ggccttgcag ctggacaatg    20
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>59
ccaaagctgg ctgcatcctc tc    22
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>60
ccgcctgcca ctggcgtgtg c     21
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>61
cccagatgaa ggacttcgtc aa    22
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>62
gctgggatca ttcgctatgc       20
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>63
caatggatgg accagttctg g    21
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>64
cagatcggct cctactttgg      20
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>65
catggagcct cgagacagg       19
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>66
ccactgtcct cgaagctgga g         21
<210>67
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>67
cttcgtcctg tgctggctgt gggctc    26
<210>68
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>68
cgcctggcat gtgaggctga g         21
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>69
ccgtgatcag taggcaggaa g         21
<210>70
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>70
gtcacagagg gaacctcc          18
<210>71
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>71
gctcctgagt gaggctgaaa tca    23
<210>72
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>72
gagatgctgg atctaccatc tgc    23
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>73
ctgagctggg agatttttat gg     22
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>74
gtggatcagc actgaaatct g    21
<210>75
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>75
cgtttgaaga agccaagctt g    21
<210>76
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>76
cacagcggag gtgcaggcag      20
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>77
ctcactgctt gcgctggc        18
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>78
cggtaagata gctctgctgg    20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>79
gagcccacag ccagcacagg    20
<210>80
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>80
gatccaacgc cagatcatac c  21
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>81
cacggccagg tccaccaggc       20
<210>82
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>82
cacgtcccct agcactgtca g     21
<210>83
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>83
ttgacgaagt ccttcatctg gg    22
<210>84
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>84
gaactgcaag ctggagccca g     21
<210>85
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>85
ctggatgctg cgaagtgcta c                 21
<210>86
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>86
gccttggagc tggacgatgg c                 21
<210>87
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>87
gtaagatctc cagagtgtcc aagacaagag atg    33
<210>88
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>88
cttctcgagt gtgagagctg aactgaaacc ttc    33
<210>89
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>89
cgctgtgacg tcagagttga gtccaaatat gg                               32
<210>90
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>90
ggtgacacta tagaataggg c                                           21
<210>91
<211>18
<212>DNA
<213>小鼠
<400>91
aagcaggagc tcctgtgt                                               18
<210>92
<211>852
<212>DNA
<213>兔
<220>
<221>CDS
<222>(61)..(852)
<400>92
tgatctccct ccaggccact gttccctctc cacttcccct caccgctgca ctgctcagag 60
atg gcc ctt ggg gct gtg gtc ctc ctt ggg gtc ctg gct tct tac cac   108
Met Ala Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His
1                 5                  10                  15
gga ttc aac ttg gac gtg atg agc ggt gat ctt cca gga aga cgc agc  156
Gly Phe Asn Leu Asp Val Met Ser Gly Asp Leu Pro Gly Arg Arg Ser
             20                  25                  30
ggg ctt cgg gca gag cgt gat gca gtt tgg gga tct cga ctc gtg gtg  204
Gly Leu Arg Ala Glu Arg Asp Ala Val Trp Gly Ser Arg Leu Val Val
         35                  40                  45
gga gcc ccc ctg gcg gtg gtg tcg gcc aac cac aca gga cgg ctg tac  252
Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr
     50                  55                  60
gag tgt gcg cct gcc tcc ggc acc tgc acg ccc att ttc cca ttc atg  300
Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met
 65                  70                  75                  80
ccc ccc gaa gcc gtg aac atg tcc ctg ggc ctg tcc ctg gca gcc tcc  348
Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser
                 85                  90                  95
ccc aac cat tcc cag ctg ctg gct tgt ggc ccg acc gtg cat aga gcc  396
Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala
            100                 105                 110
tgc ggg gag gac gtg tac gcc cag ggt ttc tgt gtg ctg ctg gat gcc  444
Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala
        115                 120                 125
cac gca cag ccc atc ggg act gtg cca gct gcc ctg ccc gag tgc cca  492
His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro
    130                 135                 140
gat caa gag atg gac att gtc ttc ctg att gac ggc tct ggc agc att  540
Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile
145                 150                 155                 160
agc tca aat gac ttc cgc aag atg aag gac ttt gtc aga gct gtg atg  588
Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val Met
                165                 170                 175
gac cag ttc aag gac acc aac acc cag ttc tcg ctg atg cag tac tcc  636
Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser
            180                 185                 190
aat gtg ctg gtg aca cat ttc acc ttc agc agc ttc cgg aac agc tcc  684
Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser
        195                 200                 205
aat cct cag ggc cta gtg gag ccc att gtg cag ctg aca ggc ctc acg  732
Asn Pro Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly Leu Thr
    210                 215                 220
ttc acg gcc aca ggg atc ctg aaa gtg gtg aca gag ctg ttt caa acc  780
Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
aag aac ggg gcc cgc gaa agt gcc aag aag atc ctc atc gtc atc aca  828
Lys Asn Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr
                245                 250                 255
gat ggg cag aag tac aaa gcg gca    852
Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Ala Ala
            260
<210>93
<211>264
<212>PRT
<213>兔
<400>93
Met Ala Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His
1                 5                  10                  15
Gly Phe Asn Leu Asp Val Met Ser Gly Asp Leu Pro Gly Arg Arg Ser
             20                  25                  30
Gly Leu Arg Ala Glu Arg Asp Ala Val Trp Gly Ser Arg Leu Val Val
         35                  40                  45
Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr
     50                  55                  60
Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met
 65                  70                  75                  80
Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser
                 85                  90                  95
Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala
            100                 105                 110
Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala
        115                 120                 125
His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro
    130                 135                 140
Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val Met
                165                 170                 175
Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser
            180                 185                 190
Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser
        195                 200                 205
Asn Pro Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly Leu Thr
    210                 215                 220
Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Lys Asn Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr
                245                 250                 255
Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Ala Ala
            260
<210>94
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<4000>94
ctggtctgga ggtgccttcc tg                                          22
<210>95
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>95
cctgagcagg agcacctggc c                                           21
<210>96
<211>2499
<212>DNA
<213>智人
<400>96
atgaccttcg gcactgtgct tcttctgagt gtcctggctt cttatcatgg attcaacctg 60
gatgtggagg agcctacgat cttccaggag gatgcaggcg gctttgggca gagcgtggtg 120
cagttcggtg gatctcgact cgtggtggga gcacccctgg aggtggtggc ggccaaccag 180
acgggacggc tgtatgactg cgcagctgcc accggcatgt gccagcccat cccgctgcac 240
atccgccctg aggccgtgaa catgtccttg ggcctgaccc tggcagcctc caccaacggc 300
tcccggctcc tggcctgtgg cccgaccctg cacagagtct gtggggagaa ctcatactca 360
aagggttcct gcctcctgct gggctcgcgc tgggagatca tccagacagt ccccgacgcc 420
acgccagagt gtccacatca agagatggac atcgtcttcc tgattgacgg ctctggaagc 480
attgaccaaa atgactttaa ccagatgaag ggctttgtcc aagctgtcat gggccagttt 540
gagggcactg acaccctgtt tgcactgatg cagtactcaa acctcctgaa gatccacttc 600
accttcaccc aattccggac cagcccgagc cagcagagcc tggtggatcc catcgtccaa 660
ctgaaaggcc tgacgttcac ggccacgggc atcctgacag tggtgacaca gctatttcat 720
cataagaatg gggcccgaaa aagtgccaag aagatcctca ttgtcatcac agatgggcag 780
aagtacaaag accccctgga atacagtgat gtcatccccc aggcagagaa ggctggcatc 840
atccgctacg ctatcggggt gggacacgct ttccagggac ccactgccag gcaggagctg 900
aataccatca gctcagcgcc tccgcaggac cacgtgttca aggtggacaa ctttgcagcc 960
cttggcagca tccagaagca gctgcaggag aagatctatg cagttgaggg aacccagtcc 1020
agggcaagca gctccttcca gcacgagatg tcccaagaag gcttcagcac agccctcaca 1080
atggatggcc tcttcctggg ggctgtgggg agctttagct ggtctggagg tgccttcctg 1140
tatcccccaa atatgagccc caccttcatc aacatgtctc aggagaatgt ggacatgagg 1200
gactcttacc tgggttactc caccgagcta gccctgtgga agggggtaca gaacctggtc 1260
ctgggggccc cccgctacca gcataccggg aaggctgtca tcttcaccca ggtgtccagg 1320
caatggagga agaaggccga agtcacaggg acgcagatcg gctcctactt cggggcctcc 1380
ctctgctccg tggatgtgga cagcgatggc agcaccgacc tgatcctcat tggggccccc 1440
cattactatg agcagacccg agggggccag gtgtccgtgt gtcccttgcc tagggggagg 1500
gtgcagtggc agtgtgacgc tgttctccgt ggtgagcagg gccacccctg gggccgcttt 1560
ggggcagccc tgacagtgtt gggggatgtg aatgaggaca agctgataga cgtggccatt 1620
ggggccccgg gagagcagga gaaccggggt gctgtctacc tgtttcacgg agcctcagaa 1680
tccggcatca gcccctccca cagccagcgg attgccagct cccagctctc ccccaggctg 1740
cagtattttg ggcaggcgct gagtgggggt caggacctca cccaggatgg actgatggac 1800
ctggccgtgg gggcccgggg ccaggtgctc ctgctcagga gtctgccggt gctgaaagtg 1860
ggggtggcca tgagattcag ccctgtggag gtggccaagg ctgtgtaccg gtgctgggaa 1920
gagaagccca gtgccctgga agctggggac gccaccgtct gtctcaccat ccagaaaagc 1980
tcactggacc agctaggtga catccaaagc tctgtcaggt ttgatctggc actggaccca 2040
ggtcgtctga cttctcgtgc cattttcaat gaaaccaaga accccacttt gactcgaaga 2100
aaaaccctgg gactggggat tcactgtgaa accctgaagc tgcttttgcc agtgaggact 2160
ttgggttctg ggaaggggga gagaggagga gcccaaggct ggcctggagc acccccgttc 2220
tctgctgagc gaggtgggaa gggttaggat gttggggctg gagagaggga cattagggca 2280
ggagaacctg gctccacggc ttggagggag cactgtcagg gcagtgggga gtggatgcag 2340
tggaggagga cttgtggtgg agcgtagaga ggacagcagg ttcttgaaag cctgttctct 2400
ctcaggattg tgtggaggat gtggtgagcc ccatcattct gcacctcaac ttctcactgg 2460
tgagagagcc catcccctcc ccccagaacc tgcgtcctg                        2499
<210>97
<211>3956
<212>DNA
<213>智人
<400>97
tttaactgca ccaactttaa aatacgctat tggagctgga attaccgcgg ctgctggcac 60
cagacttgcc ctccaatgga tcctcgttaa aggatttaaa gtggactcat tccaattaca 120
gggcctcgaa agagtcctgt attgttattt ttcgtcacta cctccccggg tcgggagtgg 180
gtaatttgcg cgcctgctgc cttccttgga tgtggtagcc gtttctcagg ctccctctcc 240
ggaatcgaac cctgattccc cgtcacccgt ggtcaccatg gtaggcacgt gcagttcggt 300
ggatctcgac tcgtggtggg agcacccctg gaggtggtgg cggccaacca gacgggacgg 360
ctgtatgact gcgcagctgc caccggcatg tgccagccca tcccgctgca catccgccct 420
gaggccgtga acatgtcctt gggcctgacc ctggcagcct ccaccaacgg ctcccggctc 480
ctggcctgtg gcccgaccct gcacagagtc tgtggggaga actcatactc aaagggttcc 540
tgcctcctgc tgggctcgcg ctgggagatc atccagacag tccccgacgc cacgccagag 600
tgtccacatc aagagatgga catcgtcttc ctgattgacg gctctggaag cattgaccaa 660
aatgacttta accagatgaa gggctttgtc caagctgtca tgggccagtt tgagggcact 720
gacaccctgt ttgcactgat gcagtactca aacctcctga agatccactt caccttcacc 780
caattccgga ccagcccgag ccagcagagc ctggtggatc ccatcgtcca actgaaaggc 840
ctgacgttca cggccacggg catcctgaca gtggtgacac agctatttca tcataagaat 900
ggggcccgaa aaagtgccaa gaagatcctc attgtcatca cagatgggca gaagtacaaa 960
gaccccctgg aatacagtga tgtcatcccc caggcagaga aggctggcat catccgctac 1020
gctatcgggg tgggacacgc tttccaggga cccactgcca ggcaggagct gaataccatc 1080
agctcagcgc ctccgcagga ccacgtgttc aaggtggaca actttgcagc ccttggcagc 1140
atccagaagc agctgcagga gaagatctat gcagttgagg gaacccagtc cagggcaagc 1200
agctccttcc agcacgagat gtcccaagaa ggcttcagca cagccctcac aatggatggc 1260
ctcttcctgg gggctgtggg gagctttagc tggtctggag gtgccttcct gtatccccca 1320
aatatgagcc ccaccttcat caacatgtct caggagaatg tggacatgag ggactcttac 1380
ctgggttact ccaccgagct agccctgtgg aagggggtac agaacctggt cctgggggcc 1440
ccccgctacc agcataccgg gaaggctgtc atcttcaccc aggtgtccag gcaatggagg 1500
aagaaggccg aagtcacagg gacgcagatc ggctcctact tcggggcctc cctctgctcc 1560
gtggatgtgg acagcgatgg cagcaccgac ctgatcctca ttggggcccc ccattactat 1620
gagcagaccc gagggggcca ggtgtccgtg tgtcccttgc ctagggggag ggtgcagtgg 1680
cagtgtgacg ctgttctccg tggtgagcag ggccacccct ggggccgctt tggggcagcc 1740
ctgacagtgt tgggggatgt gaatgaggac aagctgatag acgtggccat tggggccccg 1800
ggagagcagg agaaccgggg tgctgtctac ctgtttcacg gagcctcaga atccggcatc 1860
agcccctccc acagccagcg gattgccagc tcccagctct cccccaggct gcagtatttt 1920
gggcaggcgc tgagtggggg tcaggacctc acccaggatg gactgatgga cctggccgtg 1980
ggggcccggg gccaggtgct cctgctcagg agtctgccgg tgctgaaagt gggggtggcc 2040
atgagattca gccctgtgga ggtggccaag gctgtgtacc ggtgctggga agagaagccc 2100
agtgccctgg aagctgggga cgccaccgtc tgtctcacca tccagaaaag ctcactggac 2160
cagctaggtg acatccaaag ctctgtcagg tttgatctgg cactggaccc aggtcgtctg 2220
acttctcgtg ccattttcaa tgaaaccaag aaccccactt tgactcgaag aaaaaccctg 2280
ggactgggga ttcactgtga aaccctgaag ctgcttttgc cagattgtgt ggaggatgtg 2340
gtgagcccca tcattctgca cctcaacttc tcactggtga gagagcccat cccctccccc 2400
cagaacctgc gtcctgtgct ggccgtgggc tcacaagacc tcttcactgc ttctctcccc 2460
ttcgagaaga actgtgggca agatggcctc tgtgaagggg acctgggtgt caccctcagc 2520
ttctcaggcc tgcagaccct gaccgtgggg agctccctgg agctcaacgt gattgtgact 2580
gtgtggaacg caggtgagga ttcctacgga accgtggtca gcctctacta tccagcaggg 2640
ctgtcgcacc gacgggtgtc aggagcccag aagcagcccc atcagagtgc cctgcgcctg 2700
gcatgtgaga cagtgcccac tgaggatgag ggcctaagaa gcagccgctg cagtgtcaac 2760
caccccatct tccatgaggg ctctaacggc accttcatag tcacattcga tgtctcctac 2820
aaggccaccc tgggagacag gatgcttatg agggccagtg caagcagtga gaacaataag 2880
gcttcaagca gcaaggccac cttccagctg gagctcccgg tgaagtatgc agtctacacc 2940
atgatcagca ggcaggaaga atccaccaag tacttcaact ttgcaacctc cgatgagaag 3000
aaaatgaaag aggctgagca tcgataccgt gtgaataacc tcagccagcg agatctggcc 3060
atcagcatta acttctgggt tcctgtcctg ctgaacgggg tggctgtgtg ggatgtggtc 3120
atggaggccc catctcagag tctcccctgt gtttcagaga gaaaacctcc ccagcattct 3180
gacttcctga cccagatttc aagaagtccc atgctggact gctccattgc tgactgcctg 3240
cagttccgct gtgacgtccc ctccttcagc gtccaggagg agctggattt caccctgaag 3300
ggcaatctca gtttcggctg ggtccgcgag acattgcaga agaaggtgtt ggtcgtgagt 3360
gtggctgaaa ttacgttcga cacatccgtg tactcccagc ttccaggaca ggaggcattt 3420
atgagagctc agatggagat ggtgctagaa gaagacgagg tctacaatgc cattcccatc 3480
atcatgggca gctctgtggg ggctctgcta ctgctggcgc tcatcacagc cacactgtac 3540
aagcttggct tcttcaaacg ccactacaag gaaatgctgg aggacaagcc tgaagacact 3600
gccacattca gtggggacga tttcagctgt gtggccccaa atgtgccttt gtcctaataa 3660
tccactttcc tgtttatctc taccactgtg ggctggactt gcttgcaacc ataaatcaac 3720
ttacatggaa acaacttctg catagatctg cactggccta agcaacctac caggtgctaa 3780
gcaccttctc ggagagatag agattgtcaa tgtttttaca tatctgtcca tctttttcag 3840
caatgaccca ctttttacag aagcaggcat ggtgccagca taaattttca tatgcttaag 3900
aattgtcaca tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctttag     3956
<210>98
<211>3785
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3483)
<400>98
atg acc ttc ggc act gtg ctt ctt ctg agt gtc ctg gct tct tat cat   48
Met Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His
  1               5                  10                  15
gga ttc aac ctg gat gtg gag gag cct acg atc ttc cag gag gat gca   96
Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala
             20                  25                  30
ggc ggc ttt ggg cag agc gtg gtg cag ttc ggt gga tct cga ctc gtg   144
Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
         35                  40                  45
gtg gga gca ccc ctg gag gtg gtg gcg gcc aac cag acg gga cgg ctg   192
Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu
     50                  55                  60
tat gac tgc gca gct gcc acc ggc atg tgc cag ccc atc ccg ctg cac  240
Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His
65                  70                  75                  80
atc cgc cct gag gcc gtg aac atg tcc ttg ggc ctg acc ctg gca gcc  288
Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala
                 85                  90                  95
tcc acc aac ggc tcc cgg ctc ctg gcc tgt ggc ccg acc ctg cac aga  336
Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg
            100                 105                 110
gtc tgt ggg gag aac tca tac tca aag ggt tcc tgc ctc ctg ctg ggc  384
Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
        115                 120                 125
tcg cgc tgg gag atc atc cag aca gtc ccc gac gcc acg cca gag tgt  432
Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys
    130                 135                 140
cca cat caa gag atg gac atc gtc ttc ctg att gac ggc tct gga agc  480
Pro His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
att gac caa aat gac ttt aac cag atg aag ggc ttt gtc caa gct gtc  528
Ile Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val
                165                 170                 175
atg ggc cag ttt gag ggc act gac acc ctg ttt gca ctg atg cag tac  576
Met Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr
            180                 185                 190
tca aac ctc ctg aag atc cac ttc acc ttc acc caa ttc cgg acc agc  624
Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser
        195                 200                 205
ccg agc cag cag agc ctg gtg gat ccc atc gtc caa ctg aaa ggc ctg  672
Pro Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu
    210                 215                 220
acg ttc acg gcc acg ggc atc ctg aca gtg gtg aca cag cta ttt cat  720
Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His
225                 230                 235                 240
cat aag aat ggg gcc cga aaa agt gcc aag aag atc ctc att gtc atc  768
His Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
                245                 250                 255
aca gat ggg cag aag tac aaa gac ccc ctg gaa tac agt gat gtc atc  816
Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile
            260                 265                 270
ccc cag gca gag aag gct ggc atc atc cgc tac gct atc ggg gtg gga  864
Pro Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile GlyVal Gly
        275                 280                 285
cac gct ttc cag gga ccc act gcc agg cag gag ctg aat acc atc agc  912
His Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser
    290                 295                 300
tca gcg cct ccg cag gac cac gtg ttc aag gtg gac aac ttt gca gcc  960
Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala
305                 310                 315                 320
ctt ggc agc atc cag aag cag ctg cag gag aag atc tat gca gtt gag  1008
Leu Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu
                325                 330                 335
gga acc cag tcc agg gca agc agc tcc ttc cag cac gag atg tcc caa  1056
Gly Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln
            340                 345                 350
gaa ggc ttc agc aca gcc ctc aca atg gat ggc ctc ttc ctg ggg gct  1104
Glu Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala
        355                 360                 365
gtg ggg agc ttt agc tgg tct gga ggt gcc ttc ctg tat ccc cca aat  1152
Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn
    370                 375                 380
atg agc ccc acc ttc atc aac atg tct cag gag aat gtg gac atg agg  1200
Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg
385                 390                 395                 400
gac tct tac ctg ggt tac tcc acc gag cta gcc ctg tgg aag ggg gta  1248
Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val
                405                 410                 415
cag aac ctg gtc ctg ggg gcc ccc cgc tac cag cat acc ggg aag gct  1296
Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala
            420                 425                 430
gtc atc ttc acc cag gtg tcc agg caa tgg agg aag aag gcc gaa gtc  1344
Val Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val
        435                 440                 445
aca ggg acg cag atc ggc tcc tac ttc ggg gcc tcc ctc tgc tcc gtg  1392
Thr Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val
    450                 455                 460
gat gtg gac agc gat ggc agc acc gac ctg atc ctc att ggg gcc ccc  1440
Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro
465                 470                 475                 480
cat tac tat gag cag acc cga ggg ggc cag gtg tcc gtg tgt ccc ttg  1488
His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu
                485                 490                 495
cct agg ggg agg gtg cag tgg cag tgt gac gct gtt ctc cgt ggt gag  1536
Pro Arg Gly Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu
            500                 505                 510
cag ggc cac ccc tgg ggc cgc ttt ggg gca gcc ctg aca gtg ttg ggg  1584
Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly
        515                 520                 525
gat gtg aat gag gac aag ctg ata gac gtg gcc att ggg gcc ccg gga  1632
Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly
    530                 535                 540
gag cag gag aac cgg ggt gct gtc tac ctg ttt cac gga gcc tca gaa  1680
Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser Glu
545                 550                 555                 560
tcc ggc atc agc ccc tcc cac agc cag cgg att gcc agc tcc cag ctc  1728
Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln Leu
                565                 570                 575
tcc ccc agg ctg cag tat ttt ggg cag gcg ctg agt ggg ggt cag gac  1776
Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln Asp
            580                 585                 590
ctc acc cag gat gga ctg atg gac ctg gcc gtg ggg gcc cgg ggc cag  1824
Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly Gln
        595                 600                 605
gtg ctc ctg ctc agg agt ctg ccg gtg ctg aaa gtg ggg gtg gcc atg  1872
Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala Met
    610                 615                 620
aga ttc agc cct gtg gag gtg gcc aag gct gtg tac cgg tgc tgg gaa  1920
Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp Glu
625                 630                 635                 640
gag aag ccc agt gcc ctg gaa gct ggg gac gcc acc gtc tgt ctc acc  1968
Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr
                645                 650                 655
atc cag aaa agc tca ctg gac cag cta ggt gac atc caa agc tct gtc  2016
Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val
            660                 665                 670
agg ttt gat ctg gca ctg gac cca ggt cgt ctg act tct cgt gcc att  2064
Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile
        675                 680                 685
ttc aat gaa acc aag aac ccc act ttg act cga aga aaa acc ctg gga  2112
Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
    690                 695                 700
ctg ggg att cac tgt gaa acc ctg aag ctg ctt ttg cca gat tgt gtg  2160
Leu Gly Ile His cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val
705                 710                 715                 720
gag gat gtg gtg agc ccc atc att ctg cac ctc aac ttc tca ctg gtg  2208
Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val
                725                 730                 735
aga gag ccc atc ccc tcc ccc cag aac ctg cgt cct gtg ctg gcc gtg  2256
Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val
            740                 745                 750
ggc tca caa gac ctc ttc act gct tct ctc ccc ttc gag aag aac tgt  2304
Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys
        755                 760                 765
ggg caa gat ggc ctc tgt gaa ggg gac ctg ggt gtc acc ctc agc ttc  2352
Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe
    770                 775                 780
tca ggc ctg cag acc ctg acc gtg ggg agc tcc ctg gag ctc aac gtg  2400
Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val
785                 790                 795                 800
att gtg act gtg tgg aac gca ggt gag gat tcc tac gga acc gtg gtc  2448
Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val
                805                 810                 815
agc ctc tac tat cca gca ggg ctg tcg cac cga cgg gtg tca gga gcc  2496
Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Ala
            820                 825                 830
cag aag cag ccc cat cag agt gcc ctg cgc ctg gca tgt gag aca gtg  2544
Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Val
        835                 840                 845
ccc act gag gat gag ggc cta aga agc agc cgc tgc agt gtc aac cac  2592
Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His
    850                 855                 860
ccc atc ttc cat gag ggc tct aac ggc acc ttc ata gtc aca ttc gat  2640
Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp
865                 870                 875                 880
gtc tcc tac aag gcc acc ctg gga gac agg atg ctt atg agg gcc agt  2688
Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala Ser
                885                 890                 895
gca agc agt gag aac aat aag gct tca agc agc aag gcc acc ttc cag  2736
Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gln
            900                 905                 910
ctg gag ctc ccg gtg aag tat gca gtc tac acc atg atc agc agg cag  2784
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gln
        915                 920                 925
gaa gaa tcc acc aag tac ttc aac ttt gca acc tcc gat gag aag aaa  2832
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys Lys
    930                 935                 940
atg aaa gag gct gag cat cga tac cgt gtg aat aac ctc agc cag cga  2880
Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln Arg
945                 950                 955                 960
gat ctg gcc atc agc att aac ttc tgg gtt cct gtc ctg ctg aac ggg  2928
Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
                965                 970                 975
gtg gct gtg tgg gat gtg gtc atg gag gcc cca tct cag agt ctc ccc  2976
Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu Pro
            980                 985                 990
tgt gtt tca gag aga aaa cct ccc cag cat tct gac ttc ctg acc cag  3024
Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr Gln
        995                1000                1005
att tca aga agt ccc atg ctg gac tgc tcc att gct gac tgc ctg cag  3072
Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu Gln
   1010                1015                1020
ttc cgc tgt gac gtc ccc tcc ttc agc gtc cag gag gag ctg gat ttc  3120
Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp Phe
1025               1030                1035                1040
acc ctg aag ggc aat ctc agt ttc ggc tgg gtc cgc gag aca ttg cag  3168
Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gln
               1045                1050                1055
aag aag gtg ttg gtc gtg agt gtg gct gaa att acg ttc gac aca tcc  3216
Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
           1060                1065                1070
gtg tac tcc cag ctt cca gga cag gag gca ttt atg aga gct cag atg  3264
Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln Met
       1075                1080                1085
gag atg gtg cta gaa gaa gac gag gtc tac aat gcc att ccc atc atc  3312
Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile Ile
   1090                1095                1100
atg ggc agc tct gtg ggg gct ctg cta ctg ctg gcg ctc atc aca gcc  3360
Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Ala
1105               1110                1115                1120
aca ctg tac aag ctt ggc ttc ttc aaa cgc cac tac aag gaa atg ctg  3408
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu
               1125                1130                1135
gag gac aag cct gaa gac act gcc aca ttc agt ggg gac gat ttc agc  3456
Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser
            1140                1145                1150
tgt gtg gcc cca aat gtg cct ttg tcc taataatcca ctttcctgtt         3503
Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser
       1155                1160
tatctctacc actgtgggct ggacttgctt gcaaccataa atcaacttac atggaaacaa 3563
cttctgcata gatctgcact ggcctaagca acctaccagg tgctaagcac cttctcggag 3623
agatagagat tgtcaatgtt tttacatatc tgtccatctt tttcagcaat gacccacttt 3683
ttacagaagc aggcatggtg ccagcataaa ttttcatatg cttaagaatt gtcacatgaa 3743
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaaa aaaaaaaaa aaaaaacttt ag                    3785
<210>99
<211>1161
<212>PRT
<213>智人
<400>99
Met Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His
  1               5                  10                  15
Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala
             20                  25                  30
Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val
         35                  40                  45
Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu
     50                  55                  60
Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His
 65                  70                  75                  80
Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala
                 85                  90                  95
Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg
            100                 105                 110
Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly
        115                 120                 125
Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys
    130                 135                 140
Pro His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
Ile Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val
               165                 170                 175
Met Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr
            180                 185                 190
Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser
        195                 200                 205
Pro Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu
    210                 215                 220
Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His
225                 230                 235                 240
His Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile
                245                 250                 255
Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile
            260                 265                 270
Pro Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly
        275                 280                 285
His Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser
    290                 295                 300
Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala
305                 310                 315                 320
Leu Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu
                325                 330                 335
Gly Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln
            340                 345                 350
Glu Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala
        355                 360                 365
Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn
    370                 375                 380
Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg
385                 390                 395                 400
Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val
                405                 410                 415
Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala
            420                 425                 430
Val Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val
         435                 440                 445
Thr Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val
    450                 455                 460
Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro
465                 470                 475                 480
His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu
                485                 490                 495
Pro Arg Gly Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu
            500                 505                 510
Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly
        515                 520                 525
Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly
    530                 535                 540
Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser Glu
545                 550                 555                 560
Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln Leu
                565                 570                 575
Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln Asp
            580                 585                 590
Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly Gln
        595                 600                 605
Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala Met
    610                 615                 620
Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp Glu
625                 630                 635                 640
Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr
                645                 650                 655
Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val
            660                 665                 670
Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile
        675                 680                 685
Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly
    690                 695                 700
Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val
705                 710                 715                 720
Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val
                725                 730                 735
Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val
            740                 745                 750
Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys
        755                 760                 765
Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe
    770                 775                 780
Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val
785                 790                 795                 800
Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val
                805                 810                 815
Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Ala
            820                 825                 830
Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Val
        835                 840                 845
Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His
    850                 855                 860
Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp
865                 870                 875                 880
Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala Ser
                885                 890                 895
Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gln
            900                 905                 910
Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gln
        915                 920                 925
Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys Lys
    930                 935                 940
Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln Arg
945                 950                 955                 960
Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly
                965                 970                 975
Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu Pro
            980                 985                 990
Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr Gln
        995                1000                1005
Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu Gln
   1010                1015                1020
Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp Phe
1025               1030                1035                1040
Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gln
               1045                1050                1055
Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser
           10660                10665                1070
Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln Met
       1075                1080                1085
Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile Ile
   1090                1095                1100
Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Ala
1105               1110                1115                1120
Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu
               1125                1130                1135
Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser
           1140                1145                1150
Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser
       1155                1160
<210>100
<211>1318
<212>DNA
<213>兔
<220>
<221>CDS
<222>(17)..(1255)
<400>100
aattcggcac gagctt ggg gct gtg gtc ctc ctt ggg gtc ctg gct tct tac 52
                  Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr
                    1               5                  10
cac gga ttc aac ttg gac gtg gat gag ccg gtg atc ttc cag gaa gac  100
His Gly Phe Asn Leu Asp Val Asp Glu Pro Val Ile Phe Gln Glu Asp
         15                  20                  25
gca gcg ggc ttc ggg cag agc gtg atg cag ttt gga gga tct cga ctc  148
Ala Ala Gly Phe Gly Gln Ser Val Met Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu
     30                  35                  40
gtg gtg gga gcc ccc ctg gcg gtg gtg tcg gcc aac cac aca gga cgg  196
Val Val Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg
45                  50                  55                  60
ctg tac gag tgt gcg cct gcc tcc ggc acc tgc acg ccc att ttc cca  244
Leu Tyr Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro
                 65                  70                  75
ttc atg ccc ccc gaa gcc gtg aac atg tcc ctg ggc ctg tcc ctg gca  292
Phe Met Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala
             80                  85                  90
gcc tcc ccc aac cat tcc cag ctg ctg gct tgt ggc ccg acc gtg cat  340
Ala Ser Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His
         95                 100                 105
aga gcc tgc ggg gag gac gtg tac gcc cag ggt ttc tgt gtg ctg ctg  388
Arg Ala Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu
    110                 115                 120
gat gcc cac gca cag ccc atc ggg act gtg cca gct gcc ctg ccc gag  436
Asp Ala His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu
125                 130                 135                 140
tgc cca gat caa gag atg gac att gtc ttc ctg att gac ggc tct ggc  484
Cys Pro Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly
                145                 150                 155
agc att agc tca aat gac ttc cgc aag atg aag gac ttt gtc aga gct  532
Ser Ile Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala
            160                 165                 170
gtg atg gac cag ttc aag gac acc aac acc cag ttc tcg ctg atg cag  580
Val Met Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln
        175                 180                 185
tac tcc aat gtg ctg gtg aca cat ttc acc ttc agc agc ttc cgg aac  628
Tyr Ser Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn
    190                 195                 200
agc tcc aat cct cag ggc cta gtg gag ccc att gtg cag ctg aca ggc  676
Ser Ser Asn Pro Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly
205                 210                 215                 220
ctc acg ttc acg gcc aca ggg atc ctg aaa gtg gtg aca gag ctg ttt  724
Leu Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe
                225                 230                 235
caa acc aag aac ggg gcc cgc gaa agt gcc aag aag atc ctc atc gtc  772
Gln Thr Lys Asn Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val
            240                 245                 250
atc aca gat ggg cag aag tac aaa gac ccc ctg cac tac agt gct gtc  820
Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu His Tyr Ser Ala Val
        255                 260                 265
atc cca cag gca gag cag gcg ggc atc atc cgc tac gcc atc ggg gtg  868
Ile Pro Gln Ala Glu Gln Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val
    270                 275                 280
ggg gac gcg ttc cag aaa ccc aca gcc agg cag gag ctg gac acc atc  916
Gly Asp Ala Phe Gln Lys Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asp Thr Ile
285                 290                 295                 300
gcc tcc gag ccg ccc gac gcc cac gtg ttc cag gtg gac aat ttc tca  964
Ala Ser Glu Pro Pro Asp Ala His Val Phe Gln Val Asp Asn Phe Ser
                305                 310                 315
gca ctc agc agc atc caa aag cag ctg tat gac agg atc ttt gcc gtc  1012
Ala Leu Ser Ser Ile Gln Lys Gln Leu Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Val
            320                 325                 330
gag gga acc ctg tca tcg gca agc acc tcc ttc cag cat gag atg tcc  1060
Glu Gly Thr Leu Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Gln His Glu Met Ser
        335                 340                 345
caa gag ggc ttc agc tca ctt ctc acc acg gaa gga ccg gtg ctg ggg  1108
Gln Glu Gly Phe Ser Ser Leu Leu Thr Thr Glu Gly Pro Val Leu Gly
    350                 355                 360
gct gtg ggc agc ttc gat tgg tcc ggg ggt gct ttc ctg tac ccc ccc  1156
Ala Val Gly Ser Phe Asp Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro
365                 370                 375                 380
ggc ggg agc ccc acc ttc atc aac atg tct cag cag aac gtg gac atg  1204
Gly Gly Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Gln Asn Val Asp Met
                385                 390                 395
agg gac tcc tac ctg ggt gag gaa ggg gtg ggg gtg ggg aca ggt ggg  1252
Arg Aap Ser Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Val Gly Val Gly Thr Gly Gly
            400                 405                 410
agc tgaggcttgg ggtggggtgg ggctgggctg ggaggggagg gaagaggagg       1305
Ser
ggagaggcaa aga                                                   1318
<210>10l
<211>413
<212>PRT
<213>兔
<400>101
Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His Gly Phe Asn
  1               5                  10                  15
Leu Asp Val Asp Glu Pro Val Ile Phe Gln Glu Asp Ala Ala Gly Phe
             20                  25                  30
Gly Gln Ser Val Met Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala
         35                  40                  45
Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Cys
     50                  55                  60
Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met Pro Pro
65                  70                  75                  80
Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser Pro Asn
                 85                  90                  95
His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala Cys Gly
            100                 105                 110
Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala His Ala
        115                 120                 125
Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro Asp Gln
    130                 135                 140
Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Ser
145                 150                 155                 160
Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val Met Asp Gln
                165                 170                 175
Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Val
            180                 185                 190
Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser Asn Pro
        195                 200                 205
Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly Leu Thr Phe Thr
    210                 215                 220
Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gln Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr Asp Gly
                245                 250                 255
Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu His Tyr Ser Ala Val Ile Pro Gln Ala
            260                 265                 270
Glu Gln Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe
        275                 280                 285
Gln Lys Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asp Thr Ile Ala Ser Glu Pro
    290                 295                 300
Pro Asp Ala His Val Phe Gln Val Asp Asn Phe Ser Ala Leu Ser Ser
305                 310                 315                 320
Ile Gln Lys Gln Leu Tyr Arg Arg Ile Phe Ala Val Glu Gly Thr Leu
                325                 330                 335
Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe
            340                 345                 350
Ser Ser Leu Leu Thr Thr Glu Gly Pro Val Leu Gly Ala Val Gly Ser
        355                 360                 365
Phe Asp Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Gly Gly Ser Pro
    370                 375                 380
Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Gln Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Gly Glu Glu Gly Val Gly Val Gly Thr Gly Gly Ser
                405                 410
<210>102
<211>1484
<212>DNA
<213>兔
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1482)
<400>102
gat gtc cag agc tcc atc agc tat gat ctg gca ctg gac cca ggc cgc  48
Asp Val Gln Ser Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
ctg gtc tct cgg gcc att ttt caa gag acc cag aac cag act tta act  96
Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Gln Asn Gln Thr Leu Thr
             20                  25                  30
cga agg aag acc ctg ggg ctg ggg cgt cac tgt gaa acc atg agg cta  144
Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu
         35                  40                  45
ctt ttg cca gac tgc gta gag gac gtg gtg aac ccc atc gtc ctg cac  192
Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His
     50                  55                  60
ctc aac ttc tcc ctg gag gga cag cca atc ctc tca tcc cag aat ctg  240
Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gln Pro Ile Leu Ser Ser Gln Asn Leu
 65                  70                  75                  80
cgc cct gtg ctg gcc acg ggc tcg cag gac cac ttc att gcc tcc ctc  288
Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp His Phe Ile Ala Ser Leu
                 85                  90                  95
ccc ttt gag aag aac tgc gga caa gat cgc ctg tgt gag ggg gac ctg  336
Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu
             100                 105                 110
agc atc agc ttc aac ttc tcg ggc ttg aat acc ctg ctg gtg ggg ctc  384
Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu
         115                 120                 125
tcc ctg gag ctc aca gtg aca gtg acc gtg cgg aat gag ggc gag gac  432
Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp
     130                 135                 140
tcc tat ggg acc gcc atc acc ctc tac tac cca gca ggg cta tcc tac  480
Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr
145                 150                 155                 160
agg cgg gtg tcg ggc cag aca caa ccc tgg cag cgc ccc ctg cac ctc  528
Arg Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Pro Trp Gln Arg Pro Leu His Leu
                165                 170                 175
gca tgt gag gct gta cct acc gag agc gag ggc ttg agg agt acc agc  576
Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser
            180                 185                 190
tgc agc gtc aac cac ccc atc ttc caa ggg ggt gct cag ggc act ttc  624
Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ala Gln Gly Thr Phe
        195                 200                 205
gta gtc aag ttc gat gtc tcc tcc aag gcc agc ctg ggt gac agg ttg  672
Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu
    210                 215                 220
ctc atg ggg gcc agt gcc agc agt gag aat aat aag cct gcg agc aac  720
Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn
225                 230                 235                 240
aag acc tcc ttt gag ctg gaa ctg cca gtg aaa tac gct gtc tac atg  768
Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met
                245                 250                 255
atg atc aca agg cac gaa ggc tcc acc agg ttc ttc aac ttt tcc act  816
Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr
            260                 265                 270
tcc gct gag aag agc agc aaa gag gcc gag cac cgc tat cgg gtg aac  864
Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn
        275                 280                 285
aac ctg agt ctg cga gat gtg gcc gtc agc gtg gac ttc tgg gcc ccc  912
Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro
    290                 295                 300
gtg cag ctg aac gga gca gct gtg tgg gac gtg gcg gtg gag gcc cct  960
Val Gln Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro
305                 310                 315                 320
gcc cag agc ctg ccc tgt gcg cgg gag agg gaa cct ccg agg acc tct  1008
Ala Gln Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser
                325                 330                 335
gac ctg agc cgg gtc ccg ggg agt ccc gtg ctg gac tgc agc gtt gcg  1056
Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala
            340                 345                 350
cac tgc ctg agg ttc cgc tgc cac atc ccc tcc ttc agc gcc aag gag  1104
His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu
        355                 360                 365
gag ctc cac ttc acc ctg aag ggc aac ctc agc ttc gcc tgg gtc agc  1152
Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Ala Trp Val Ser
    370                 375                 380
cag atg ctg caa aag aag gtg tcg gtg gtg agt gtg gcc gag atc acc  1200
Gln Met Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr
385                 390                 395                 400
ttc aac agg gcc gtg tac tcc caa gtt ccg ggc gag gag ccc ttt atg  1248
Phe Asn Arg Ala Val Tyr Ser Gln Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met
                405                 410                 415
aga gcc cag gtg gag acg gtg ctg gag gag tat gag gag cac gac ccc  1296
Arg Ala Gln Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro
            420                 425                 430
gtc ccc ctg gtg gtg ggc agc tgt gtg ggc ggc ctg ctg ctg ctg gct  1344
Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala
        435                 440                 445
ctc atc tca gcc acc ctg tac aag ctt ggc ttc ttc aag cgc cgg tac  1392
Leu Ile Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr
    450                 455                 460
aag gag atg ctg ggc gag aaa ccg gga gac gcg gcc acc ttc ccc ggg  1440
Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Phe Pro Gly
465                 470                 475                 480
gag gac gcc agc tgc ggg gct tca gat ttg cct ttg tcc cag tg       1484
Glu Asp Ala Ser Cys Gly Ala Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gln
                485                 490
<210>103
<211>494
<212>PRT
<213>兔
<400>103
Asp Val Gln Ser Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Gln Asn Gln Thr Leu Thr
             20                  25                  30
Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu
         35                  40                  45
Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His
     50                  55                  60
Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gln Pro Ile Leu Ser Ser Gln Asn Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp His Phe Ile Ala Ser Leu
                 85                  90                  95
Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu
            100                 105                 110
Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu
        115                 120                 125
Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp
    130                 135                 140
Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Pro Trp Gln Arg Pro Leu His Leu
                165                 170                 175
Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser
            180                 185                 190
Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ala Gln Gly Thr Phe
        195                 200                 205
Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu
    210                 215                 220
Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn
225                 230                 235                 240
Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met
                245                 250                 255
Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr
            260                 265                 270
Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn
        275                 280                 285
Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro
    290                 295                 300
Val Gln Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro
305                 310                 315                 320
Ala Gln Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser
                325                 330                 335
Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala
            340                 345                 350
His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu
        355                 360                 365
Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Ala Trp Val Ser
    370                 375                 380
Gln Met Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr
385                 390                 395                 400
Phe Asn Arg Ala Val Tyr Ser Gln Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met
                405                 410                 415
Arg Ala Gln Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro
            420                 425                 430
Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly LeuLeu Leu Leu Ala
        435                 440                 445
Leu Ile Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr
    450                 455                 460
Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Phe Pro Gly
465                 470                 475                 480
Glu Asp Ala Ser Cys Gly Ala Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gln
                485                 490
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<213>猴
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Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala
  1               5                  10
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<211>14
<212>PRT
<213>猴
<400>110
Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Xaa Glu Asp Ala
  1               5                  10
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<212>PRT
<213>猴
<400>111
Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala
  1               5                  10                  15
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<211>17
<212>PRT
<213>智人
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Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala Gly
  1               5                  10                  15
G1y
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<211>16
<212>PRT
<213>智人
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Phe Asn Leu Asp Thr Glu Glu Leu Thr Ala Phe Val Asp Ser Ala Gly
  1               5                  10                  15
<210>114
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>114
Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg
  1               5                  10                  15
Gly

Claims (8)

1.抗αd抗体在制备用于促进压缩损伤导致的脊髓损伤后的运动恢复的药物中的用途。
2.抗αd抗体在制备用于抑制压缩损伤导致的脊髓损伤后的运动损害的药物中的用途。
3.抗αd抗体在制备用于限制压缩损伤导致的脊髓损伤后的运动障碍的药物中的用途。
4.抗αd抗体在制备用于限制压缩损伤导致的脊髓损伤后的自主神经和感觉功能障碍的药物中的用途。
5.权利要求1-4的任意一项的用途，其中所述抗αd单克隆抗体由选自217L(ATCC保藏号HB12701)和226H(ATCC保藏号12502)的杂交瘤分泌。
6.权利要求1-4的任意一项的用途，其中所述抗αd单克隆抗体与217L(ATCC保藏号HB12701)或226H(ATCC保藏号12502)竞争结合αd。
7.权利要求1-6的任意一项的用途，其中所述抗αd单克隆抗体抑制与αd配体的结合。
8.权利要求7的用途，其中所述配体选自ICAM-R和VCAM-1。
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