CN100392094C

CN100392094C - 细胞及细胞核微阵列制作方法

Info

Publication number: CN100392094C
Application number: CNB2005101002166A
Authority: CN
Inventors: 蒋会勇; 赵彤
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2025-10-12
Also published as: CN1818075A

Abstract

本发明细胞及细胞核微阵列制作方法，涉及生物芯片领域，具体涉及细胞及细胞核微阵列的制作方法。本发明细胞及细胞核微阵列制作方法含有以下步骤：a.将带孔石蜡块在-30～-10℃下冷冻20-40min，切片制成蜡膜，将蜡膜铺在硅化载玻片表面，在55-65℃加热5～15秒；b.将细胞或从石蜡包埋组织中提取的细胞核滴注在石蜡膜的孔中；c.在65℃下烘烤1小时，然后使用二甲苯脱蜡制成细胞或细胞核微阵列。本发明具有制作过程简单，可操作性强；阵列容量大等特点。同时本发明直接将细胞或细胞核加到载玻片上，不经过切片而使其完整性受到保护。

Description

细胞及细胞核微阵列制作方法

技术领域

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及细胞及细胞核微阵列的制作方法。

背景技术

荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)、mRNA原位杂交、免疫细胞化学基因蛋白的检测是分子遗传学及分子生物学领域中常用的技术，其实验对象可以是培养的细胞、新鲜组织或石蜡包埋的组织。组织微阵列(tissue microarray，TMA)是将数十个到上百个的组织样本整齐有序地排列在同一张载玻片上而形成的微缩组织切片，又称组织芯片(tissue chip)。在微阵列上进行FISH，mRNA原位杂交等实验具有高通量，一次实验可获得大量数据。使用阵列技术，可在原位对众多的肿瘤组织进行DNA、RNA及蛋白质水平进行高通量的研究。组织微阵列不仅有助于肿瘤表征、快速筛选癌的基因扩增，而且还可以进一步分析经过cDNA微阵列鉴定的新基因在肿瘤中的表达特征，综合评价其诊断和判定预后的意义，是一种快速经济的评价生物标志的方法。

基于组织微阵列的优点，有些学者们考虑能否将细胞也同样制成相似的阵列进行研究，Moskaluk CA，等2002年在Diagn Mol Pathol杂志，11卷上发表文章，阐述了三种利用培养细胞制作阵列的方法，分别为(1)将培养细胞固定，离心后包埋于石蜡组织，再利用组织阵列仪进行阵列制作；(2)将分散的细胞首先包埋于琼脂糖中，再进行石蜡包埋，制作阵列；(3)将细胞沉淀包埋于中空的琼脂糖膜中，再制作阵列。罗毅等(《一种优化的琼脂糖包埋细胞微阵列的制备方法》，《基础医学与临床》，2004年12月第24卷第6期)使用的方法是收集培养细胞，采用优化的低熔点琼脂糖包埋技术包埋目的细胞，再对细胞包埋块进行脱水和石蜡包埋，最后将细胞石蜡包埋块用组织微阵列仪制备成细胞微阵列。

上述所有方法均将细胞制成蜡块，然后石蜡切片，制作阵列。在制作过程中，除存在程序复杂，在切片过程中存在切断细胞而造成细胞破坏及遗传物质(DNA)丢失的现象，还常常存在以下问题：(1)细胞包埋前未充分分散，大块贴壁细胞团块既影响固定包埋效果，也影响免疫组化实验后的结果的观察；刮取细胞时可造成大量细胞破碎；(2)琼脂糖包埋后细胞未混匀，造成细胞密度在包埋块中很不均匀，对阵列制作和观察造成不利影响；(3)处理后的琼脂糖块用石蜡包埋后，可能因浸蜡不充分而不能切片，或在包埋块中残留大量琼脂糖形成大量空洞，干扰染色。

目前尚无将石蜡包埋组织中提取出的细胞核制成微阵列的报道。

发明内容

针对上述技术的缺点，本发明所要解决的问题在于提供一种细胞或细胞核微阵列制作方法。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法，含有以下步骤(见图1)：

a.将带孔石蜡切成蜡膜贴于载玻片上：

b.将细胞悬液或细胞核悬液滴注在石蜡膜的孔中；

c.经过烘烤及脱蜡制成细胞或细胞核微阵列。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法，带孔石蜡依据以下过程制备：利用组织微阵列仪在空白石蜡块上打孔，制成带孔石蜡。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法步骤a具体过程如下：将带孔石蜡块在-40～0℃下冷冻30-60min，切片制成蜡膜；将蜡膜贴在硅化载玻片上；在50-70℃下加热5～20秒。

本发明所述的带孔蜡块冷冻温度，较好是-30～-10℃，最好是-20℃，冷冻时间较好是20～40min，最好是30min。

本发明所述的蜡膜加热温度较好是55-65℃，最好是60℃，加热时间较好是5～15秒，最好是10秒。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法中所用的石蜡，可以用实验室常用的组织包埋石蜡。本发明所用的石蜡熔点较好是50～70℃，最好是60℃。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法中，所述的石蜡膜尺寸最好是2.2×2.2cm，石蜡膜上孔直径0.6mm，两个孔中心的距离为1.1mm，石蜡膜厚20μm。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法步骤c中，烘烤温度为65℃，烘烤时间为1小时。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法步骤c中，脱蜡采用本领域常用的方法。具体采用二甲苯脱蜡。

本发明所述的细胞为培养细胞，可以是悬浮生长的培养细胞，如悬浮生长培养的淋巴瘤的DG75细胞株。本发明所述的细胞也可以是贴壁生长的培养细胞，如贴壁生长的鼻咽癌CNE1细胞。

本发明细胞或细胞核微阵列制备方法步骤b中，悬浮生长的细胞悬液制备方法包括清洗及固定操作。其中清洗采用本领域常用的细胞清洗方法。本发明所述的对悬浮细胞的清洗方法最好采用PBS清洗方法。具体过程如下：将生长液室温下1500转/分离心5min后加入PBS(磷酸盐缓冲液)清洗细胞；然后室温下1500转/分，离心5min，吸出上清液，保留少许液体。

本发明所述的悬浮细胞的固定方法采用本领域常用的细胞固定方法。具体过程如下：在清洗后的细胞中缓慢加入10ml固定液，混合均匀；悬液在室温中静置15min后，1500转/分离心5min；吸出上清液，加入2ml新鲜的固定剂；在细胞计数板上计算细胞的密度，调整密度1×10⁴/μl，得到细胞悬液。

本发明所述的贴壁生长的细胞悬液制备方法包括消化、清洗及固定操作。其中消化采用本领域常用的细胞消化方法。本发明所述的对贴壁细胞的消化方法最好采用胰蛋白酶消化方法。具体过程如下：在细胞培养瓶中加入胰蛋白酶，调整终浓度为0.25％，置37℃消化10min。

本发明所述的贴壁细胞的清洗方法采用本领域常用的细胞清洗方法。本发明所述的对贴壁细胞的清洗方法最好采用PBS清洗方法。具体过程如下：将生长液室温下1500转/分离心5min后加入PBS(磷酸盐缓冲液)清洗细胞；然后室温下1500转/分，离心5min，吸出上清液，保留少许液体。

本发明所述的贴壁细胞的固定方法采用本领域常用的细胞固定方法。具体过程如下：在清洗后的生长液中缓慢加入10ml固定液，混合均匀；悬液在室温中静置15min后，1500转/分离心5min；吸出上清，加入2ml新鲜的固定剂；在细胞计数板上计算细胞的密度，调整密度1×10⁴/μl，得到细胞悬液。

本发明所述的固定液为甲醇和冰醋酸的混合液(甲醇体积：冰醋酸体积＝1∶3)。

本发明所述的细胞核悬液制备方法包括：组织切片、脱腊、水化、蛋白酶K消化、细胞核悬液的制作。

本发明上述的组织切片采用本领域常用的方法。具体步骤如下：石蜡切片机对包裹组织的石蜡进行切片。

本发明上述的脱蜡采用本领域常用的方法。具体采用二甲苯脱蜡。

本发明上述的水化采用本领域常用的方法。具体步骤如下：在离心管中加入1ml乙醇轻微振荡10min；倒出乙醇，换入新鲜乙醇再振荡10min；80％乙醇20ml，70％的乙醇1ml逐级脱水，每次10min；弃去乙醇，加入1ml水离心后形成疏松的组织沉淀物，尽量倒去或吸出水分。

本发明上述的消化采用本领域常用的方法。具体步骤如下：在水化液中加入蛋白酶K消化液(TE中0.1mg/ml的蛋白酶K和0.5％SDS)，37℃孵育轻微振荡，消化2小时。

本发明上述的细胞核悬液的制作具体步骤如下：消化液1000转/分离心5sec后，取上层悬液作为细胞核悬液。

本发明所述细胞悬液或细胞核悬液滴注操作是利用微量加样器将细胞悬液或细胞核悬液加于石蜡膜形成的孔中，使细胞或细胞核局限于载玻片的固定位置。

本发明所述的细胞或细胞核微阵列制备方法具有制作过程简单，可操作性强；阵列容量大等特点。同时本发明直接将细胞或细胞核悬液注入到铺在载玻片上石蜡膜形成的孔中，不经过切片而使其完整性受到保护。

附图说明

图1制作细胞或细胞核微阵列流程图，图中两条相互垂直的虚线将图面分成三块，其中垂直虚线的左边为细胞或包埋组织的处理流程，右边为有腊模孔载玻片的制作流程，水平虚线的下方为微阵列的制作流程；

图2空白蜡块打孔的示意图；

图3带孔石蜡膜贴于载玻片的示意图；

图4本发明细胞核微阵列染色(HE染色)后的示意图；

图5弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞核微阵列染色(DAPI染色)后的示意图，图放大100倍；

图6弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞微阵列放大示意图，FISH检测Bcl-2//IgH融合基因，图中白色箭头指示为有基因重排的细胞，有两个融合信号及一个绿色信号，一个橙色信号，红色箭头显示没有基因重排的细胞为两个绿色信号及两个橙色信；

图7细胞阵列中L428细胞所在点的放大示意图，免疫组化检测NF-κB蛋白表达，图中胞浆染成棕黄色的为阳性。

具体实施方式

以下实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

一、培养细胞的处理：贴壁生长的细胞，对人类鼻咽癌CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、5-8F和6-10B鼻咽癌细胞株及转染了KIAA1173基因的6-10B细胞，共7个细胞株进行培养，首先用0.25％胰蛋白酶进行培养的细胞消化，磷酸盐缓冲液进行冲洗三次，每次以1500转/分，离心5min，然后以1∶3(体积比)的甲醇及冰醋酸溶液固定15min，调整细胞悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的0.6mm针具在空白蜡块上打孔，孔的数目为7×7。将制好的带孔蜡块于-20℃下冷冻30min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置60℃烤箱中烤10秒。

三、细胞微阵列的制作：将步骤一得到的细胞悬液分别注入石蜡膜中的孔内，每个细胞株注7个孔，共49个孔，记住每种细胞株在阵列中的位置；将蜡膜于65℃加热1小时；然后置二甲苯脱蜡二次，分别为40min及20min；空气中晾干后即制成由细胞构成的微阵列，对阵列进行HE染色或DAPI染色以观察阵列内细胞分布情况。

四、本阵列的应用：

利用该阵列进行mRNA原位杂交的检测。结果显示KIAA1173基因mRNAd在CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、5-8F和6-10B鼻咽癌细胞株表达均为阴性。转染KIAA1173基因的6-10B细胞中呈强阳性表达。

实施例2

一、从石蜡组织中提取细胞核。60例弥漫性大B细胞淋巴瘤首先进行HE染色，观察肿瘤细胞的分布情况，切片(共三片)，厚度为10微米；将蜡片放入1.5ml的聚丙烯离心管中，加入二甲苯1ml，轻微振荡10min，缓慢倒出二甲苯液，加入新鲜的二甲苯轻微振荡10min；弃去二甲苯加入1ml乙醇轻微振荡10min，倒出乙醇，换入新鲜乙醇再振荡10min，80％乙醇20ml，70％的乙醇1ml逐级脱水，每次10min，弃去乙醇，加入50ml水离心后形成疏松的组织沉淀物；加入1ml的蛋白酶K消化液(TE中0.1mg/ml的蛋白酶K和0.5％SDS)，37℃孵育轻微振荡，消化2小时；将混合物充分振荡后以1000转/分，离心5sec，上清即为得到的细胞核悬液。调整悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的0.6mm针具在空白蜡块上打孔，共制作10×10个孔(如图2所示)。将制好的带孔蜡块于-15℃下冷冻20min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置65℃烤箱中烤15sec(如图3)。

三、细胞核微阵列的制作：将步骤一得到的细胞核悬液注入石蜡膜中的孔内，然后将蜡膜于60℃加热0.5小时；然后置二甲苯脱蜡二次，分别为40min及20min；空气中晾干后即制成由细胞核构成的微阵列，对阵列进行HE染色或DAPI染色以观察阵列内细胞分布情况(如图4，图5)。

四、本阵列的应用：

利用该阵列进行荧光原位杂交(FISH)检测。利用细胞核微阵列进行FISH时，60例弥漫性大B细胞淋巴瘤标本均一次性提取细胞核成功。第一次进行FISH时，有53(88.3％)例成功；未成功的标本重新制做阵列进行试验，全部成功(100％)。所做FISH图像背景低，信号强，定位准确，完全可以满足实验需要。所用Bcl-2//IgH融合基因探针，探测到正常的淋巴细胞为两个橙色及两个绿色信号。有Bcl-2//IgH融合基因的细胞可发现两个黄色融合信号，一个绿色信号及一个橙色信号(图6)。同时还发现一些肿瘤细胞中有多个橙色信号，说明在部分肿瘤细胞内存在bcl-2基因扩增。

实施例3

一、培养细胞的处理：悬浮生长的细胞，对L428，DG75及jurkit共3个淋巴瘤细胞株进行培养，选择生长状态良好的细胞，磷酸盐缓冲液进行冲洗三次，每次以1500转/分，离心5min，然后以1∶3的甲醇及冰醋酸溶液固定15min，调整细胞悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的1.0mm针具在空白蜡块上打孔，孔的数目为4×4。将制好的带孔蜡块于-10℃下冷冻15min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置60℃烤箱中烤5sec。

三、细胞微阵列的制作：将步骤一得到的细胞悬液分别注入石蜡膜中的孔内，每个细胞株注5或6个孔，共16个孔，记住每种细胞株在阵列中的位置；然后将蜡膜于65℃加热2小时：然后置二甲苯脱蜡二次，分别为20min及15min；空气中晾干后即制成由细胞构成的微阵列。

四、本阵列的应用。

利用该阵列进行免疫细胞化学检测，检测NF-κB蛋白在细胞中的表达，发现在L428及DG75细胞系中，呈阳性表达(图7)，在jurkit细胞系中阴性表达。

实施例4

一、从石蜡组织中提取细胞核。选择南方医院病理科存档的大肠癌标本60例，转移淋巴结标本60例，首先进行HE染色，观察肿瘤细胞的分布情况，切片(共三片)，厚度为20微米。将蜡片放入1.5ml的聚丙烯离心管中，加入二甲苯1ml，轻微振荡10min；缓慢倒出二甲苯液，加入新鲜的二甲苯轻微振荡10min；弃去二甲苯加入1ml乙醇轻微振荡10min；倒出乙醇，换入新鲜乙醇再振荡10min；80％乙醇20ml，70％的乙醇1ml逐级脱水，每次10min；弃去乙醇，加入50ml水离心后形成疏松的组织沉淀物；加入1ml的蛋白酶K消化液(TE中0.1mg/ml的蛋白酶K和0.5％SDS)，37℃孵育轻微振荡，消化2小时；将混合物充分振荡后以1000转/分，离心5sec，上清即为得到的细胞核悬液。调整悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的0.6mm针具在空白蜡块上打孔，共制作11×11个孔。将制好的带孔蜡块于-20℃下冷冻20min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置70℃烤箱中烤5sec。

三、细胞核微阵列的制作：将步骤一得到的细胞核悬液注入石蜡膜中的孔内，记住每个病例在阵列中的位置，然后将蜡膜于60℃干烤0.5小时；然后置二甲苯脱蜡二次，分别为20min及20min；空气中晾干后即制成由细胞核构成的微阵列

四、本阵列的应用。

利用该阵列进行荧光原位杂交(FISH)检测，检测的是大肠癌P53基因的扩增情况，将P53基因的荧光探针与17号染色体着丝粒探针混合，形成双色荧光原位杂交，检测阵列中121个点，有110个点获得较强的杂交信号，其中17号染色体着丝粒探针用spectrumgreen标记，为绿色，p53基因为spectrum orange标记，为橙红色。

实施例5

一、培养细胞的处理。贴壁生长的细胞，对人类大肠癌LOVO，SW480，SW620，HLT116，LS174，HT29共6个细胞株进行培养，首先用0.25％胰蛋白酶进行消化，磷酸盐缓冲液进行冲洗三次，每次以1500转/分，离心5min，然后以1∶3的甲醇及冰醋酸溶液固定15min，调整细胞悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的1.0mm针具在空白蜡块上打孔，孔的数目为6×6。将制好的带孔蜡块于-20℃下冷冻30min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置60℃烤箱中烤5sec。

三、细胞微阵列的制作：将步骤一得到的细胞悬液分别注入石蜡膜中的孔内，每个细胞株注6个孔，共36个孔，记住每种细胞株在阵列中的位置；然后将蜡膜于65℃加热2小时；然后置二甲苯脱蜡二次，分别为30min及20min；空气中晾干后即制成由细胞构成的微阵列。

四、本阵列的应用。

利用该阵列进行荧光原位杂交(FISH)检测，检测的是大肠癌P53基因的扩增情况及17号染色体扩增情况，全部细胞芯均能得到良好的荧光原位杂交信号，背景低，信号强。

实施例6

一、培养细胞的处理。悬浮生长的细胞，对南方医院门诊采集的60例可疑白血病的患者进行淋巴细胞培养，对培养的细胞先以磷酸盐缓冲液进行冲洗三次，每次以1500转/分，离心5min，然后以1∶3的甲醇及冰醋酸溶液固定15min，调整细胞悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的0.6mm针具在空白蜡块上打孔，孔的数目为8×8。将制好的带孔蜡块于-10℃下冷冻15min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置60℃烤箱中烤5sec。

三、细胞微阵列的制作：将步骤一得到的细胞悬液分别注入石蜡膜中的孔内，每个细胞株注1到2个孔，共64个孔，记住每个病例在阵列中的位置；然后将蜡膜于65℃加热2小时；然后置二甲苯脱蜡二次，分别为20min及15min；空气中晾干后即制成由细胞构成的微阵列。

四、本阵列的应用。

利用该阵列进行荧光原位杂交，检测在自血病中常见的bcr/abl基因融合，在所有的病例子中均得到了良好的荧光信号。

实施例7

一、从石蜡组织中提取细胞核。选择南方医院病理科存档的肺癌标本50例，转移淋巴结标本50例，首先进行HE染色，观察肿瘤细胞的分布情况，切片(共三片)，厚度为20微米，将蜡片放入1.5ml的聚丙烯离心管中，加入二甲苯1ml，轻微振荡10min；缓慢倒出二甲苯液，加入新鲜的二甲苯轻微振荡10min；弃去二甲苯加入1ml乙醇轻微振荡10min；倒出乙醇，换入新鲜乙醇再振荡10min；80％乙醇20ml，70％的乙醇1ml逐级脱水，每次10min；弃去乙醇，加入50ml水离心后形成疏松的组织沉淀物；加入1ml的蛋白酶K消化液(TE中0.1mg/ml的蛋白酶K和0.5％SDS)，37℃孵育轻微振荡，过夜；将混合物充分振荡后以1000转/分，离心5sec，上清即为得到的细胞核悬液。调整悬液的浓度为1×10⁴/μl待用。

二、微阵列蜡膜的制作：首先做一个空白蜡块，然后以组织微阵列仪的0.6mm针具在空白蜡块上打孔，共制作10×10个孔。将制好的带孔蜡块于-20℃下冷冻20min；切厚为20μm片，贴于硅化的玻片上，置70℃烤箱中烤5sec。

四、本阵列的应用。

利用该阵列进行荧光原位杂交(FISH)检测，检测的是肺癌17号染色扩增的情况，采用17号染色体着丝粒探针，用spectrum green标记，为绿色。100个细胞芯中，有96个荧光原位杂效效果良好。

Claims

1.一种细胞或细胞核微阵列制备方法，含有以下步骤：首先制备空白石蜡块，然后打孔，其特征在于先将带孔石蜡块在-30～-10℃下冷冻20～40分钟，切片制成蜡膜，将蜡膜铺在硅化载玻片表面，在55～65℃下加热5～15秒；然后将细胞悬液或细胞核悬液滴注在石蜡膜的孔中；在65℃下烘烤1小时后使用二甲苯脱蜡。

2.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，其中带孔石蜡块的冷冻温度为-20℃。

3.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，其中带孔石蜡块的冷冻时间是30分钟。

4.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，其中将蜡膜铺在硅化载玻片表面加热温度是60℃。

5.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，其中将蜡膜铺在硅化载玻片表面加热时间是10秒。

6.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，所述石蜡膜尺寸是2.2×2.2cm，石蜡膜上孔直径0.6mm，两个孔中心的距离为1.1mm，石蜡膜厚20μm。

7.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，所述细胞是悬浮生长的培养细胞。

8.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，所述细胞是贴壁生长的培养细胞。

9.权利要求1所述的细胞或细胞核微阵列制备方法，所述的细胞核悬液制备方法包括：对包裹组织的石蜡块切片；使用二甲苯对组织切片脱蜡；使用乙醇水化；在水化液中加入蛋白酶K消化液，37℃孵育轻微振荡，消化2小时；消化液1000转/分离心5秒，取上层悬液为细胞核悬液。