CN100382845C - 长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属基因工程技术、基因功能应用领域，涉及重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(HusTNFR)基因的新药用用途，本发明采用I型或II型长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体，通过急性、亚急性肝衰竭的经典动物模型，对小鼠暴发性肝功能衰竭进行干预，结果显示，其半衰期延长10倍以上，具有良好预防和治疗模型动物急性及亚急性肝衰竭的疗效，明显降低模型动物死亡率。其预防和治疗急性及亚急性肝衰竭的疗效较非长效HusTNFR有明显提高。

Description

长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途

技术领域

本发明属基因工程技术、基因功能应用领域，涉及重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(HusTNFR)基因的新药用用途，具体涉及长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(LHusTNFR)对急性及亚急性肝衰竭肝的预防和治疗用途。

背景技术

暴发性肝功能衰竭(fulminant hepatic failure，FHF)是指病前患者无肝病而短期内出现大量肝细胞坏死或肝功能严重损害，并在首发症状出现后8周或黄疸出现后10天内发生肝性脑病的一种综合征。其特点为起病急，病前危重，缺乏有效治疗手段，死亡率高。

肝细胞的急性炎症和坏死可导致两种不同的疾病：急性肝炎和暴发性肝功能衰竭(又称急性肝功能衰竭)。在急性肝炎中，由肝炎病毒造成的肝炎称为急性病毒性肝炎；由酒精引起的肝炎称为急性酒精性肝炎。虽然肝细胞坏死普遍存在于上述肝炎中，但坏死程度轻，不足以造成肝脏正常功能的运转障碍。FHF与各种类型的急性肝炎区别在于前者发生十分严重的肝细胞快速坏死，导致残存的正常肝细胞不能维持肝脏功能的正常运转而发生肝功能衰竭，由此引发急遽增高的死亡率。

在我国引起FHF的主要原因是肝炎病毒感染，其次为药物及毒物中毒，缺血缺氧，代谢紊乱，自身免疫性肝炎等等。目前尚没有特异性针对阻断肝细胞急性坏死发生的药物，因此无法有效防止因大面积肝细胞坏死所造成的肝功能衰竭，FHF死亡率一直难以降低。临床上迫切需要具有特异性快速阻止肝细胞急性坏死的药物以治疗肝功能衰竭。

近年来的研究发现，TNFα与其受体结合是激活肝细胞坏死的始发通路，在肝细胞损伤机制中占有重要地位。如果阻断TNFα与其受体结合，也就阻断了肝细胞坏死的始发通路，从而使药物治疗FHF成为可能。

目前直接阻断TNFα与其受体结合的TNFα抑制剂主要有两类：TNFα单克隆抗体，可溶性TNFα受体类似物。这些TNFα抑制剂进入体内可以与TNFα结合，从而从理论上阻止血液或细胞间液中TNFα与肝细胞膜上TNFα受体结合而激活肝细胞坏死通路。

近来有研究发现，TNFα单克隆抗体除阻断TNFα与I型受体结合外，还同时激活细胞膜上TNFα导致靶细胞凋亡的特点，因此不适合作为候选药物。

常规可溶性TNFα受体在一定程度上可降低绝大多数轻度肝细胞坏死、急性肝炎动物模型死亡率。但是，并且本领域人员至今无法得知其效果不理想的原因。因此，目前还难以在实践上将可溶性TNFα受体应用于临床治疗。

综上，本领域迫切需要找到TNFα受体对于肝细胞坏死疗效差的关键所在，以进一步对TNFα受体进行改良，使之能有效、快速阻止大面积肝细胞急性坏死的发生。从而在临床上真正成为用于防治急性、亚急性肝衰竭的良药。

发明内容

在本发明的第一方面，申请人提供了长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治大面积肝细胞坏死或肝衰竭药物中的用途。所述的肝衰竭是急性和/或亚急性肝衰竭。

在本发明的第二方面，如上述第一方面所述的用途，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体的半衰期为24-140小时(更优选的，为24-72小时)。

在本发明的第三方面，如上述第一方面所述的用途，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体选自：

a.人I型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白(更优选的，为人I型肿瘤坏死因子α受体的羧基末端与IgG：Fc片段的氨基末端相连接)，

b.人II型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白(更优选的，为人II型肿瘤坏死因子α受体的羧基末端与IgG：Fc片段的氨基末端相连接)，

c.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

d.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

e.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

f.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

h.用PEG-脂质体混合物包埋人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

i.用PEG-脂质体混合物包埋人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

j.人I型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白，或

k.人II型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白。

在本发明的第四方面，如上述第一方面所述的的用途，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体可使肝细胞的IL-6水平下降(or下降至)40-50％；或

使肝细胞的MIP-2水平下降50-60％；或

使肝细胞的bcl-xl水平下降30-45％；或

使肝细胞的NF-κB水平下降30-45％。

在本发明的第五方面，一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：人肝细胞生长因子(huHGF)、还原型谷胱甘肽及苦参碱。

(i)有效量(如0.00001-50wt％，更优选的为0.0001-20wt％，最优选的为0.001-10wt％)的选自下组的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体：

a.人I型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

b.人II型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

c.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

d.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

e.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

f.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

h.用PEG-脂质体混合物包埋人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

i.用PEG-脂质体混合物包埋人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

j.人I型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白，或

k.人II型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在本发明的第六方面，如上述第五方面所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中还含有有效量的(如0.00001-50wt％，更优选的为0.0001-20wt％，最优选的为0.001-10wt％)一种或多种选自以下的药物：人肝细胞生长因子(huHGF)、还原型谷胱甘肽及苦参碱。

在本发明的第七方面，一种预防或治疗肝细胞坏死或肝衰竭的方法，其特征在于，给予需要治疗的人员有效量(如0.00001-50wt％，更优选的为0.0001-20wt％，最优选的为0.001-10wt％)的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体。本文所述的肝衰竭是急性和/或亚急性肝衰竭。

在本发明的第八方面，如上述的第七方面所述的方法，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体选自下组：

a.人I型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

b.人II型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

c.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

d.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

e.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

f.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

h.用PEG-脂质体混合物包埋人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

i.用PEG-脂质体混合物包埋人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

j.人I型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白，或

k.人II型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究和试验，首次发现防治大面积肝细胞急性坏死需要可溶性TNFα受体对肝细胞持续、稳定的阻断作用。即需在机体的血液及肝脏中维持稳定、持久的可溶性TNFα受体浓度。而对于急性肝炎中的轻度肝细胞坏死，作用时间短、脉冲型的常规TNFα受体即可取得效果。因此本发明人揭示了常规可溶性TNFα受体无法有效阻止急性肝衰竭中大面积急性肝细胞坏死的原因在于其在机体内半衰期短，不稳定，而无法维持稳定、持久抗肝细胞坏死的作用。因此，本发明人通过多种方法对TNFα受体进行改造，制备了一类可在机体血液及肝脏中维持稳定、持续治疗作用的长效的TNFα受体，有效延长了TNFα受体作为活性部分在体内的作用时间，大幅提高了TNFα受体防治急性肝细胞坏死的疗效，从而首次使改良后的TNFα受体可应用于大面积肝细胞坏死引起的急性、亚急性肝衰竭。基于此完成了本发明。

本发明的目的是提供重组可性肿瘤坏死因子α受体(HusTNFR)基因的新的药用用途，尤其是重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(HusTNFR)基因或修饰HusTNFR蛋白质后形成的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(LHusTNFR)的预防和治疗急性及亚急性肝衰竭的新用途。

本发明的进一步目的在于提供一种可较常规可溶性TNFα受体进一步大幅降低急性肝衰竭死亡率的药物。主要是通过延长可溶性TNFα受体药物的半衰期，延长药物的作用时间，以提高临床治疗疗效。

本发明采用长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体通过急性、亚急性肝衰竭的经典动物模型，对小鼠暴发性肝功能衰竭进行干预，结果显示，干预组与模型组的病死率分别为0和80％。

上述肿瘤坏死因子(TNF)为肿瘤坏死因子α与相应细胞膜受体结合的重组长效可溶性蛋白，包括长效人重组可溶性I型肿瘤坏死因子α受体(LHusTNFRI)及长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子α受体(LHusTNFRII)，其半衰期较普通人重组可溶性I型(HusTNFRI)及II型肿瘤坏死因子α受体(HusTNFRII)延长10倍以上。其存在形式是(1)HusTNFRI或HusTNFRII羧基末端连接人免疫球蛋白IgG：Fc片段，或(2)在氨基或羧基末端连接PEG，或(3)PEG-脂质体包裹HusTNFRI或HusTNFRII，或(4)在氨基或羧基末端连接人血清白蛋白。所述的LHusTNFRI及LHusTNFRII，其预防及治疗急性、亚急性肝衰竭的疗效明显好于HusTNFRI或HusTNFRII。

所述的急性、亚急性肝衰竭的动物模型采用经典的D-氨基半乳糖与内毒素皮内注射大(小)鼠方法制做。所述动物模型48小时内其因肝衰竭而导致的死亡率高达60-80％。

本发明的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体通过

a.人I型TNFα受体(TNFR)与人IgG1：Fc片段融合基因表达的重组蛋白，或

b.人II型TNFα受体与人IgG1：Fc片段融合基因表达的重组蛋白，或

c.人I型TNFα受体蛋白氨基端与PEG联接，或

d.人I型TNFα受体蛋白羧基端与PEG联接，或

e.人II型TNFα受体蛋白氨基端与PEG联接，或

f.人II型TNFα受体蛋白羧基端与PEG联接，或

h.PEG-脂质体混合物包埋人I型TNFα受体蛋白，或

i.PEG-脂质体混合物包埋人II型TNFα受体蛋白，或

j.人I型TNFα受体与人血清白蛋白融合基因表达的重组蛋白，或

k.人II型TNFα受体与人血清白蛋白融合基因表达的重组蛋白

制备长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体(LHusTNFR)，用于预防D-氨基半乳糖与内毒素诱导小鼠急性肝衰竭模型动物(简称急性肝衰竭动物)，使急性肝衰竭动物的死亡率由80％下降至0％。使用LHusTNFR预防和治疗D-氨基半乳糖与内毒素诱导大鼠亚急性肝衰竭模型动物(简称亚急性肝衰竭动物)使亚急性肝衰竭动物的死亡率由80％下降至0％。结果显示，较长半衰期的I型或/和II型长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体，具有良好预防和治疗模型动物急性及亚急性肝衰竭的疗效，明显降低模型动物死亡率。表明长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体对急性及亚急性肝衰竭肝具有预防和治疗用途。可进一步制备大幅降低急性肝衰竭死亡率的药物。

本发明中，(1)SEQ ID NO：1的I型LHusTNFR基因的制备方法，包括将编码I型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO：1的1-172位)的基因与编码人免疫球蛋白γ1链Fc段(IgG1：Fc)氨基酸(即SEQ ID NO：1的173-403(优先与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选携带I型TNFR-IgG1：Fc融合片段的阳性克隆，核苷酸序列分析验证基因是否正确。

(2)SEQ ID NO：2的II型LHusTNFR基因的制备方法，包括将编码II型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO：2的1-235位)的基因与编码人免疫球蛋白γ1链Fc段(IgG1：Fc)氨基酸(即SEQ ID NO：2的236-467位)与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选携带II型TNFR-IgG1：Fc融合片段的阳性克隆，核苷酸序列分析验证基因是否正确。

将上述的I型及II型TNFR-IgG1：Fc的cDNA片段与表达载体重组，形成组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如pET28等。

上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用啤酒酵母菌BL21等。

本发明的表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，分离纯化LHusTNFR，经适当复性后即获得有活性的I型或II型LHusTNFR-IgG1：Fc。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，纽约：冷泉港实验室出版社)。

(3)将编码I型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO：1的1-172位)的cDNA与表达载体重组，形成重组表达质粒(SEQ ID NO：3)。

本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如pET28等。

上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌BL21等。上述表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，分离纯化I型HusTNFR，经适当复性后即获得有活性的I型HusTNFR。

将分子量(molecular weight，MW)2,0000以上的有活性的mPEG联接至I型HusTNFR的氨基端或羧基端，合成长效I型HusTNFR。本发明不限于特定的mPEG。在一优选实施方案中，本发明使用mPEG2-ALD，MW4,0000(Shearwatercorporation，New Jersey，USA)与I型HusTNFR的氨基端联接。使用mPEG2-NHSeaster，MW4,0000(Shearwater corporation，New Jersey，USA)与I型HusTNFR的羧基端联接。

反应式：mPEG-CHO+RNH₂+NaCNBH₃--→mPEG-CH₂-NHR

反应条件为PH7.9时间为12小时。

(4)将编码II型sTNFR(人)膜外氨基酸1-235的cDNA与表达载体重组，形成重组表达质粒(SEQ ID NO：4)。

本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如pET28等。

上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌BL21等。上述表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，分离纯化II型HusTNFR，经适当复性后即获得有活性的II型HusTNFR。

将分子量(molecular weight，MW)2,0000以上的有活性的mPEG联接至I型HusTNFR的氨基端或羧基端，合成长效II型HusTNFR。本发明不限于特定的mPEG。在一优选实施方案中，本发明使用mPEG2-ALD，MW4,0000(Shearwatercorporation，New Jersey，USA)与II型HusTNFR的氨基端联接。使用mPEG2-NHSeaster，MW4,0000(Shearwater corporation，New Jersey，USA)与II型HusTNFR的羧基端联接。

反应式：mPEG-CHO+RNH₂+NaCNBH₃--→mPEG-CH₂-NHR

反应条件为PH7.9时间为12小时。

(5)将长循环脂质体-聚乙二醇衍生磷脂分别包封I型HusTNFR或II型HusTNFR，合成长效I型及II型HusTNFR。

在三乙胺催化的条件下，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(分子量744.04，美国Aanti Polar Lipids)与NHS-PEG₃₅₄₀-MAL(Nhydroxysulfosuccinimide-polyoxyethylene(MW3540)-maleimide)(分子量3477，美国Aanti PolarLipids)及TEA以摩尔比1∶1∶0.1在25℃条件下，反应6小时，经离心、蒸干及真空干燥得到DOPE-PEG-MAL(分子量为4108.04)

将上述制备的DOPE-PEG-MAL与EPC(L-α-Phosphatidylcholine，MW760.09)、cholesterol(MW386.67)及mPEG-2000-DOPE(MW得到2801.51)(美国Aanti Polar Lipids)在氯仿反应体系中以摩尔比200∶20∶10∶1，40℃水浴，100-150r/min旋转蒸发。在蒸干有机溶剂后加入PBS(PH7.4)，室温下充分水化。用Mini Extruder反复挤压，过100nm滤膜15次，即得到长循环脂质体-聚乙二醇衍生磷脂。

将溶于PBS的SEQ ID NO：3的I型HusTNFR或SEQ ID NO：4的II型HusTNFR加入上述长循环脂质体-聚乙二醇衍生磷脂的PBS溶液中，4℃旋涡振荡30min，通过CL-4B(Pharmacia，USA)去除游离的I型HusTNFR或II型HusTNFR，得到长效I型及II型HusTNFR。

(6)SEQ ID NO：5的I型LHusTNFR基因的制备方法，包括将编码I型sTNFR(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO：1的1-172位)的基因、G(n)S-linker(即173-182)与编码人血清白蛋白氨基酸(即SEQ ID NO：5的183-791与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选携带I型TNFR-人血清白蛋白融合片段的阳性克隆，核苷酸序列分析验证基因是否正确。

(7)SEQ ID NO：6的II型LHusTNFR基因的制备方法，包括将编码II型TNF(人)膜外氨基酸(即SEQ ID NO：2的1-235位)的基因、G(n)S-linker(即236-245)与编码人血清白蛋白氨基酸(即SEQ ID NO：6的246-854与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选携带II型TNFR-人血清白蛋白融合片段的阳性克隆，核苷酸序列分析验证基因是否正确。

将上述的I型及II型TNFα受体-人血清白蛋白的融合cDNA片段与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用酵母真核表达载体，例如啤酒酵母或pichia酵母等。

上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用啤酒酵母菌BL21等。

本发明的表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，分离纯化LHusTNFR，经适当复性后即获得有活性的LHusTNFR。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，纽约：冷泉港实验室出版社)。

经体内半衰期试验论证，上述方法制备的不同形式的LHusTNFR，其半衰期均大于24小时(为24-140小时)，达到长效的要求。而一般的可溶性肿瘤坏死因子α受体的半衰期仅为50分钟至2小时。

本发明采用基因工程方法对LHusTNFR进行生产，所得产品具有高效抗急性、亚急性肝衰竭的功能。与常规HusTNFR性质比较表明，LHusTNFR半衰期明显延长，预防及治疗急性、亚急性肝衰竭，降低死亡率的疗效明显提高。

本发明还提供了一种治疗肝细胞坏死或肝衰竭的药物组合物，它含有上述的长效可溶性肿瘤坏死因子α受体，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于肝细胞坏死或肝衰竭的治疗。此外，还可同时使用其它相关的治疗剂。这类治疗剂包括但不限于：人肝细胞生长因子(huHGF)、还原型谷胱甘肽及苦参碱。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的长效可溶性肿瘤坏死因子α受体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的长效可溶性肿瘤坏死因子α受体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如<分子克隆实验指南>(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，纽约：冷泉港实验室出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：以I型HusTNFR-IgG1：Fc为代表的长效人重组可溶性I型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(I型LHusTNFR)预防小鼠急性(爆发性)肝衰竭的实验

分别以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)或Con-A(T cell mitogensconcanavalin A)皮下注射制作小鼠爆发性肝衰竭模型，48小时死亡率分别为80％与50％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

通过上述制备的I型LHusTNFR(方法(1)制备的I型LHusTNFR-IgG1：Fc为预防药物)皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS组)或BALB/c小鼠(Con-A组)，剂量均为12.5mg/kg，为长效I型受体预防组；常规HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS组)或BALB/c小鼠(Con-A组)，剂量12.5mg/kg，为常规I型受体预防组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。16小时后预防组及对照组同时皮下注射GaIN/LPS或Con-A后观察48小时。48小时后，三组死亡率分别为：GaIN/LPS模型对照组80％(Con-A模型对照组为50％)，常规I型受体预防组50％(Con-A组为30％)，长效I型受体预防组0％(Con-A组为0)。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示，长效I型受体对GaIN/LPS急性肝衰预防组与常规I型受体预防组与对照组相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分别下降82.3％，44％；78.1％，52.2％；84.3％，37.8％，NF-kB水平分别下降87.4％及37.5％。上述结果显示I型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与I型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的急性肝衰竭。结果同时表明长效I型可溶性TNFα受体预防急性肝衰竭的效果较常规I型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例2 以II型HusTNFR-IgG1：Fc为代表的长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(II型LHusTNFR)预防小鼠急性(爆发性)肝衰竭的实验

分别以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)或Con-A(T cell mitogensconcanavalin A)皮下注射制作小鼠爆发性肝衰竭模型，48小时死亡率分别为80％与50％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

通过本发明制备的II型LHusTNFR(方法(2)制备的II型LHusTNFR-IgG1：Fc为预防药物)皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS组)或BALB/c小鼠(Con-A组)，剂量均为12.5mg/kg，为长效II型受体预防组；常规HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS组)或BALB/c小鼠(Con-A组)，剂量12.5mmg/kg，为常规II型受体预防组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。16小时后预防组及对照组同时皮下注射GaIN/LPS或Con-A后观察48小时。皮下注射GaIN/LPS 48小时后，三组死亡率分别为：GaIN/LPS模型对照组80％(Con-A模型对照组为50％)，常规I型受体预防组50％(Con-A组为30％)，长效I型受体预防组0％(Con-A组为0)。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xLmRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示，长效II型受体对GaIN/LPS急性肝衰竭预防组与常规II型受体预防组与对照组相比IL-6，MIP-2及bcl-xLmRNA水平分别下降78.3％，44％；72.1％，52.2％；77.3％，37.8％，NF-kB水平分别下降78.4％及37.5％。上述结果显示II型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与II型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜II型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的急性肝衰竭。结果同时表明长效II型可溶性TNFα受体预防急性肝衰竭的效果较常规II型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例3 以II型HusTNFR-人血清白蛋白为代表的长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(II型LHusTNFR)预防小鼠急性(爆发性)肝衰竭的实验

分别以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)或Con-A(T cell mitogensconcanavalin A)皮下注射制作小鼠爆发性肝衰竭模型，48小时死亡率分别为80％与50％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

通过本发明制备的II型LHusTNFR(方法(6)制备的II型LHusTNFR-人血清白蛋白为预防药物)皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS组)或BALB/c小鼠(Con-A组)，剂量介于为5-30mg/kg，为长效II型受体预防组；常规HusTNFR皮下注射C57BL/6小鼠(GaIN/LPS组)或BALB/c小鼠(Con-A组)，剂量12.5mg/kg，为常规II型受体预防组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。16小时后预防组及对照组同时皮下注射GaIN/LPS或Con-A后观察48小时。皮下注射GaIN/LPS 48小时后，三组死亡率分别为：GaIN/LPS模型对照组80％(Con-A模型对照组为50％)，常规I型受体预防组50％(Con-A组为30％)，长效I型受体预防组0％(Con-A组为0)。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示，长效II型受体对GaIN/LPS急性肝衰竭预防组中IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平均比对照组与常规II型受体预防组明显下降，下降幅度介于30-60％之间。NK-κB分别下降60％及32％。上述结果显示II型TNFR-人血清白蛋白通过阻断急性肝衰竭中TNFα与I型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的急性肝衰竭。结果同时表明长效II型可溶性TNFα受体预防急性肝衰竭的效果较常规II型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例4：以I型HusTNFR-IgG1：Fc为代表的长效人重组可溶性I型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(I型LHusTNFR)预防大鼠亚急性肝衰竭的实验

以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亚急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

通过本发明制备的I型LHusTNFR(方法(1)制备的I型LHusTNFR-IgG1：Fc为预防药物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为长效I型受体预防组；常规HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为常规I型受体预防组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。16小时后预防组及对照组同时皮下注射GaIN/LPS后观察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三组死亡率分别为：对照组60％，常规I型受体预防组44％，长效I型受体预防组0％。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示长效I型受体预防组与常规I型受体预防组与对照组相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分别下降90.5％，46.7％；78.1％，52.2％；84.3％，37.8％，NF-kB水平分别下降87.4％及37.5％。上述结果显示I型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与I型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的亚急性肝衰竭。结果同时表明长效I型可溶性TNFα受体预防亚急性肝衰竭的效果较常规I型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例5：以II型HusTNFR-IgG1：Fc为代表的长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(II型LHusTNFR)预防大鼠亚急性肝衰竭的实验

以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亚急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

通过本发明制备的I型LHusTNFR(方法(2)制备的II型LHusTNFR-IgG1：Fc为预防药物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为长效II型受体预防组；常规HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为常规II型受体预防组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。16小时后预防组及对照组同时皮下注射GaIN/LPS后观察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三组死亡率分别为：对照组60％，常规II型受体预防组44％，长效I型受体预防组0％。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示长效II型受体预防组与常规II型受体预防组与对照组相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分别下降88.5％，46.7％；68.1％，52.2％；78.3％，37.8％，NF-kB水平分别下降92.1％及37.5％。上述结果显示II型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与I型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的急性肝衰竭。结果同时表明长效II型可溶性TNFα受体预防急性肝衰竭的效果较常规II型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例6：以II型HusTNFR-人血清白蛋白为代表的长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(II型LHusTNFR)预防大鼠亚急性肝衰竭的实验

以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亚急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

通过本发明制备的II型LHusTNFR(方法(6)制备的II型LHusTNFR-人血清白蛋白为预防药物)皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量5-30mg/kg，为长效II型受体预防组；常规HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为常规II型受体预防组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。16小时后预防组及对照组同时皮下注射GaIN/LPS后观察一周。皮下注射GaIN/LPS一周，三组死亡率分别为：对照组60％，常规II型受体预防组44％，长效I型受体预防组0％。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示长效II型受体对GaIN/LPS急性肝衰竭预防组中IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平均比对照组与常规II型受体预防组明显下降，下降幅度介于25-55％之间。NK-κB分别下降51％及27％。上述结果显示II型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与I型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的急性肝衰竭。结果同时表明长效II型可溶性TNFα受体预防急性肝衰竭的效果较常规II型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例7：以II型HusTNFR-IgG1：Fc为代表的长效人重组可溶性I型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(I型LHusTNFR)治疗大鼠亚急性肝衰竭的实验

以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亚急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

采用皮下注射GaIN/LPS制作亚急性肝衰竭大鼠模型。8小时后皮下注射I型LHusTNFR(方法(1)制备的I型LHusTNFR-IgG1：Fc为预防药物)，剂量12.5mg/kg，为长效I型受体治疗组；常规HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为常规I型受体治疗组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。观察一周。GaIN/LPS注射后一周，三组死亡率分别为：对照组60％，常规I型受体预防组30％，长效I型受体预防组0％。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示长效I型受体预防组与常规I型受体预防组与对照组相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分别下降90.5％，46.7％；78.1％，52.2％；84.3％，37.8％，NF-kB水平分别下降87.4％及37.5％。上述结果显示I型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与I型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的亚急性肝衰竭。结果同时表明长效I型可溶性TNFα受体治疗亚急性肝衰竭的效果较常规I型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例8：以II型HusTNFR-IgG1：Fc为代表的长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(II型LHusTNFR)治疗大鼠亚急性肝衰竭的实验

以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亚急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

采用皮下注射GaIN/LPS制作亚急性肝衰竭大鼠模型。8小时后皮下注射II型LHusTNFR(方法(1)制备的II型LHusTNFR-IgG1：Fc为预防药物)，剂量12.5mg/kg，为长效II型受体治疗组；常规HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为常规II型受体治疗组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。观察一周。GaIN/LPS注射后一周，三组死亡率分别为：对照组60％，常规II型受体预防组30％，长效II型受体预防组0％。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示长效II型受体预防组与常规II型受体预防组与对照组相比IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平分别下降89％，44.3％；76％，49％及83％、35.2％，NF-kB水平分别下降79.6％及36％。上述结果显示II型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与II型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的亚急性肝衰竭。结果同时表明长效II型可溶性TNFα受体治疗亚急性肝衰竭的效果较常规II型可溶性TNFα受体有大幅提高。

实施例9：以II型HusTNFR-人血清白蛋白为代表的长效人重组可溶性II型肿瘤坏死因子(TNF)α受体(II型LHusTNFR)治疗大鼠亚急性肝衰竭的实验

以D-氨基半乳糖/内毒素(GaIN/LPS)皮下注射制作大鼠亚急性肝衰竭模型，一周死亡率60％。肝脏大体标本显示肝脏严重充血、肿大；HE染色的病理切片显示大面积、重度的肝细胞坏死。

采用皮下注射GaIN/LPS制作亚急性肝衰竭大鼠模型。8小时后皮下注射II型LHusTNFR(方法(6)制备的II型LHusTNFR-人血清白蛋白为预防药物)，剂量5-30mg/kg，为长效II型受体治疗组；常规HusTNFR皮下注射Spraque-Dawley大鼠，剂量12.5mg/kg，为常规II型受体治疗组；对照组为皮下注射相同体积生理盐水的同类小鼠。观察一周。GaIN/LPS注射后一周，三组死亡率分别为：对照组60％，常规II型受体预防组30％，长效II型受体预防组0％。大体病理显示长效I型受体预防组肝脏仅轻度充血肿胀，HE染色显示肝细胞呈轻度、点灶状坏死，未见对照组大面积肝细胞坏死。提取肝脏总RNA及核蛋白，运用real-time PCR检测IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平，EMSA检测NF-kB水平。结果显示长效II型受体对GaIN/LPS急性肝衰竭预防组中IL-6，MIP-2及bcl-xL mRNA水平均比对照组与常规II型受体预防组明显下降，下降幅度介于20-50％之间。NK-κB分别下降41％及24％。上述结果显示II型可溶性TNFα受体通过阻断急性肝衰竭中TNFα与II型受体的结合，抑制TNFα通过对肝细胞膜I型受体向胞核传导信号导致肝细胞坏死而发生的亚急性肝衰竭。结果同时表明长效II型可溶性TNFα受体治疗亚急性肝衰竭的效果较常规II型可溶性TNFα受体有大幅提高。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>李，海

<120>长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治肝衰竭药物中的用途

<130>1i2005

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>403

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser

1                5                   10                   15

Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys

            20                   25                   30

Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser

        35                   40                   45

Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys

    50                   55                   60

Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp

65                   70                  75                   80

   Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp

                    85                  90                   95

   Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly

               100                  105                  110

   Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys

           115                  120                  125

   His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn

       130                  135                 140

   Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu

   145                  150                 155

160

   Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Glu Pro Lys Ser Cys

                    165                 170                  175

   Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

                180                 185                  190

   Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

           195                  200                  205

   Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

       210                  215                 220

   Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

   225                  230                 235

240

   His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

                    245                 250                  255

   Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                260                 265                  270

   Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile

           275                  280                  285

   Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

       290                  295                  300

   Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

   305                 310                  315

320

   Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

                    325                 330                  335

   Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

               340                  345                  350

   Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

           355                  360                  365

   Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

       370                  375                  380

   His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

   385                  390                 395

400

   Pro Gly Lys

   <210>2

   <211>467

   <212>PRT

   <213>Homo sapiens

   <400>2

   Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser

   1               5                    10                   15

   Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys

               20                   25                   30

   Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr

           35                   40                   45

   Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu

       50                   55                   60

   Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser

   65                   70                  75                   80

   Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys

                    85                  90                   95

   Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys

               100                  105                  110

   Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala

           115                  120                  125

   Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro

       130                  135                 140

   Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His

   145                  150                 155

160

   Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala

                        165             170                  175

   Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val

               180                  185                  190

   His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr

           195                  200                  205

   Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly

       210                  215                  220

   Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys

   225                  230                 235

240

   Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

                    245                 250                  255

   Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

               260                  265                  270

   Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

           275                  280                  285

   Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

       290                  295                  300

   His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

   305                  310                 315

320

   Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                    325                 330                  335

   Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Leu Ala Leu Pro Ala Pro Ile

                340                 345                  350

   Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

           355                  360                  365

   Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

       370                  375                  380

   Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

   385                  390                 395

400

   Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                    405                 410                  415

   Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

                420                 425                  430

   Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

           435                  440                  445

   His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

       450                  455                 460

   Pro Gly Lys

   465

   <210>3

   <211>171

   <212>PRT

   <213>Homo sapiens

   <400>3

   Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser

   1                5                   10                   15

   Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys

               20                   25                   30

   Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser

           35                   40                   45

   Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys

       50                   55                   60

   Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp

   65                   70                   75                  80

   Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp

                   85                   90                   95

   Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly

               100                  105                  110

   Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys

           115                  120                  125

   His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn

       130                  135                  140

   Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu

   145                  150                 155

160

   Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr

                    165                 170

<210>4

<211>235

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser

1                5                    10                  15

Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys

            20                   25                   30

Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr

        35                   40                   45

Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu

    50                   55                   60

Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser

65                   70                  75                   80

Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys

                 85                  90                   95

Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys

             100                 105                  110

Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala

        115                  120                  125

Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro

    130                  135                 140

   Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His

   145                  150                 155

160

   Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala

                    165                 170                  175

   Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val

               180                  185                  190

   His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr

           195                  200                  205

   Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly

       210                  215                  220

   Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp

   225                  230                 235

   <210>5

   <211>790

   <212>PRT

   <213>人类

   <400>5

   Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser

   1                5                   10                    15

Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys

            20                   25                   30

Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser

        35                   40                   45

Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys

    50                   55                   60

Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp

65                   70                   75                  80

Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp

                 85                   90                  95

Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly

             100                 105                  110

Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys

        115                  120                  125

His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn

    130                  135                  140

Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu

145                  150                  155                 160

Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Met Gly Gly Gly Gly

                 165                 170                  175

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu phe

             180                 185                  190

Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His

         195                 200                  205

Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe

    210                  215                  220

Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro

225                  230                  235                 240

Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys

                 245                 250                  255

Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His

             260                 265                  270

Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr

        275                  280                  285

Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn

    290                  295                  300

Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu

305                  310                  315                 320

Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu

                 325                  330                 335

Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro

             340                 345                  350

Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala

        355                  360                  365

Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu

    370                  375                  380

Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

385                  390                 395                  400

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe

                 405                  410                 415

Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu

            420                  425                  430

Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr

        435                  440                  445

Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp

    450                  455                  460

Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu

465                  470                  475                 480

Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala

                 485                  490                 495

Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala

            500                   505                 510

Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys

        515                  520                  525

Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro

    530                  535                  540

Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr

545                  550                  555                 560

Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala

                565                   570                 575

Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu

             580                 585                  590

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe

        595                  600                  605

Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser

    610                  615                  620

Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

625                  630                  635                 640

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp

                 645                  650                 655

Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr

            660                  665                  670

Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn

        675                  680                  685

Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val  Pro

    690                  695                  700

Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr

705                  710                 715                  720

Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu

                 725                 730                  735

Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val

             740                 745                  750

Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp

        755                  760                  765

Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser

    770                  775                  780

Gln Ala Ala Leu Gly Leu

785                  790

<210>6

<211>854

<212>PRT

<213>人类

<400>6

Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser

1                5                   10                    15

Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys

             20                   25                  30

Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr

        35                   40                   45

Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu

    50                   55                    60

Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser

65                   70                   75                  80

Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys

                 85                   90                   95

Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys

             100                 105                  110

Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala

        115                  120                  125

Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro

    130                  135                  140

Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His

145                  150                  155                 160

Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala

                 165                 170                  175

Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val

             180                 185                  190

His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr

        195                  200                  205

Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly

    210                  215                  220

Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser

225                  230                  235                 240

Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe

                 245                  250                 255

Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His

            260                  265                  270

Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe

        275                  280                  285

Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro

    290                  295                  300

Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys

305                  310                 315                  320

Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His

                 325                  330                 335

Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr

            340                  345                  350

Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn

        355                  360                  365

Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu

    370                  375                  380

Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu

385                  390                 395                  400

Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro

                 405                 410                  415

Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala

             420                 425                  430

Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu

        435                  440                  445

Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

    450                  455                  460

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe

465                  470                  475                 480

Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu

                 485                  490                 495

Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr

            500                  505                  510

Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp

        515                  520                  525

Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu

    530                  535                  540

Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala

545                  550                  555                 560

Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala

                 565                  570                 575

Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys

            580                  585                  590

Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro

        595                  600                  605

Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr

    610                  615                  620

Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala

625                  630                  635                 640

Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu

                 645                  650                 655

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe

            660                  665                  670

Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser

        675                  680                  685

Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

    690                  695                  700

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp

705                  710                  715                 720

Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr

                 725                  730                 735

Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn

             740                 745                  750

Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro

        755                  760                  765

Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr

    770                  775                  780

Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu

785                  790                  795                 800

Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val

                 805                  810                 815

Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp

             820                 825                  830

Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser

        835                  840                  845

Gln Ala Ala Leu Gly Leu

    850

Claims (7)

1.长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体在制备防治大面积肝细胞坏死或肝衰竭药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体的半衰期为24-140小时。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体选自：

a.人I型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

b.人II型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

c.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

d.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

e.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

f.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

h.用PEG-脂质体混合物包埋人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

i.用PEG-脂质体混合物包埋人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

j.人I型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白，或

k.人II型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体可使肝细胞的IL-6水平下降或下降至40-50％；或

使肝细胞的MIP-2水平下降50-60％；或

使肝细胞的bcl-xl水平下降30-45％；或

使肝细胞的NF-κB水平下降30-45％。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝衰竭是急性和/或亚急性肝衰竭。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：人肝细胞生长因子、还原型谷胱甘肽及苦参碱，和

(i)有效量为0.00001-50wt％选自下组的长效人重组可溶性肿瘤坏死因子α受体：

a.人I型肿瘤坏死因子α受体与人IgG1：Fc片段的融合蛋白，

b.人II型肿瘤坏死因子α受体与入IgG1：Fc片段的融合蛋白，

c.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

d.人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

e.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白氨基端与PEG联接的产物，

f.人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白羧基端与PEG联接的产物，

h.用PEG-脂质体混合物包埋人I型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

i.用PEG-脂质体混合物包埋人II型肿瘤坏死因子α受体蛋白的产物，

j.人I型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白，或

k.人II型肿瘤坏死因子α受体与人血清白蛋白的融合蛋白；以及

ii药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中还含有有效量为0.00001-50wt％的一种或多种选自以下的药物：

人肝细胞生长因子、还原型谷胱甘肽及苦参碱。