CN100371031C - 扩张和/或修复椎间盘的材料和方法 - Google Patents

扩张和/或修复椎间盘的材料和方法 Download PDF

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Abstract

一种通过在椎间盘中施加干细胞材料来扩张和/或修复椎间盘的方法。干细胞可以是未分化的细胞，或者它们可以是已经分化但随后去分化的细胞。可通过干细胞暴露于诱导所需分化的试剂和/或环境来诱导它们表达至少一种人椎间盘细胞，如成纤维细胞、软骨细胞或脊索细胞的特征。在一些实施方案中，干细胞材料可连同胶原基材料一起提供，这种材料可以是富含胶原的晶格。干细胞材料可以作为干细胞分离物提供，这种分离物可以大体上不含非干细胞材料。其它治疗剂可以与干细胞材料一起施用。

Description

扩张和/或修复椎间盘的材料和方法
发明领域
本发明一般涉及扩张和/或修复椎间盘的材料和方法，更具体涉及用干细胞材料扩张和/或修复椎间盘的材料和方法。
发明背景
健康的椎间盘促进成对椎骨之间的运动，同时吸收和分散冲击。椎间盘由两部分组成：承担大部分负载的柔软中心核(髓核)和容纳并稳定核心材料的韧外环(纤维环)。
随着自然老化过程的进展，椎间盘会脱水、退化，对其充分垫衬和支撑椎体的能力造成负面影响。这种自然干缩出于更晚期阶段时通常称作“黑椎间盘”，因为椎间盘的脱水在磁共振成像[MRI]上出现，椎骨会彼此更靠近，压迫脊神经，引起疼痛，从而使患者感觉不适。
治疗椎间盘退化疾病的技术在此前主要依赖于更换椎间盘的方法。在这种情况下，在更换椎间盘之前通常要对脱水和/或退化的椎间盘进行扩张，而扩张材料主要是合成器件，植入椎间盘后，它们可充气或展开膨胀元件。
在最近研究中，提到多潜能和/或多能干细胞可能可用于医疗应用。多能干细胞是自我更新的细胞，它能够分化成体内发现的200多种不同细胞类型中的任何一种。胚胎多能干细胞和/或多能干细胞可表现为胚胎癌性(“EC”)细胞、胚胎生殖(“EG”)细胞或胚胎干(“ES”)细胞的特征。非胚胎多能细胞和/或多能干细胞可获自成人的体细胞。非胚胎多能干细胞包括，例如，神经干细胞、间充质干细胞、骨髓干细胞以及通过吸脂获得的干细胞。出于揭示的目的，胚胎多能细胞或多能细胞以及非胚胎多能细胞或多能细胞都被称为“干细胞”。换句话说，出于本发明揭示的目的，任何未分化成成熟细胞类型的细胞都可被称为“干细胞”。
间充质干细胞是衍生自包括骨髓基质、血液、真皮和骨膜在内的多种来源的成人多能细胞。这些细胞可在体外连续培养而不会自发分化。然而，在合适的条件下，间充质干细胞可被诱导分化成间充质谱系的细胞，包括脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、腱细胞(tenocyte)、韧带原性细胞(ligamentogenic cell)、肌原性细胞、骨髓基质细胞和真皮原性细胞(dermogenic cell)。
造血干细胞是能够自我更新并分化成包括红细胞、巨核细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、B细胞和T细胞在内的多种血细胞类型的多能细胞。造血干细胞可获自胎儿肝脏、成人骨髓或称为卫星细胞的单核肌肉前体细胞。
近来，通过将核转移到卵细胞来重新编程体细胞核的方法获得了人多能干细胞。那种称为治疗克隆的技术能将来自患者的多能干细胞用于自体移植治疗。类似地，多能干细胞可通过成人(非胚胎、非胎儿)哺乳动物组织分化产生。然而，迄今为止，这种多能或多潜能细胞从未被用于扩张扩张或修复椎间盘。
因此仍需要使用多潜能和/或多能干细胞来扩张或修复椎间盘的技术。本发明就是为了解决这种需求。
发明概述
简单说来，本发明一方面提供了通过将干细胞材料施用到椎间盘来扩张和/或修复椎间盘的方法。所述干细胞材料可以来自未分化的细胞，或者它可以来自已经分化但随后有回到未分化状态的细胞。无论将植入的细胞在选择用于椎间盘间隙之前是否开始分化，在一些实施方案中，这种干细胞材料包括在将材料植入椎间盘之前已经被诱导以表达至少一种人椎间盘细胞(如成纤维细胞、软骨细胞或脊索细胞)的特征的细胞。或者，未分化的干细胞材料和能够诱导干细胞分化的材料可在植入椎间盘间隙之前、之中或之后组合在一起，这样，这种干细胞材料便可在椎间盘间隙中分化以表达至少一种人椎间盘细胞的特征。
在一些实施方案中，这种干细胞材料是与一种胶原基材料组合提供的，所述胶原基材料可以是富含胶原的晶格。所述胶原基材料可以脱水形式提供，并在植入后再水化，或者也可以水化形式，如浆或凝胶提供。胶原基材料中可以包含交联剂，如戊二醛，用以促进胶原的交联。
此外，可以包含放射造影(radio-contrast)材料以增强成像。可以包含性能增强添加剂例如镇痛药和/或抗生素以提供另外的治疗益处。
在一些优选的实施方案中，所述干细胞材料是作为干细胞分离物提供的，这种分离物可以基本上不含非干细胞材料。
从以下描述，本发明的目的和优点将显而易见。
优选的实施方案的描述
为了加深对本发明原理的理解，下面将结合特定的优选实施方案进行介绍，叙述时将使用具体的语言。但应当理解，这些实施方案不对本发明的范围构成限制，本发明所涉领域的技术人员通常考虑到优选实施方案中的替代变更和进一步改进。
如上所述，本发明一方面涉及用干细胞材料来扩张或修复椎间盘的材料和方法。在最优选的实施方案中，干细胞材料被施加到在基本上完好的环中包含的椎间盘核。其它实施方案中，材料被施加到包含在受损或缺陷环中的椎间盘核。
在本发明的一个方面，干细胞材料被施加到椎间盘并被诱导以分化成椎间盘细胞。所述干细胞材料可包括从未分化的干细胞，如胚胎干细胞，或者它可以包括已经分化但随后去分化以恢复其多能或多潜能能力的干细胞。
无论施用何种类型的干细胞，所述细胞可被诱导以表达人椎间盘细胞的一种或多种特征。在一个实施方案中，所述细胞被诱导，在它们被施加到椎间盘之前(例如体外)显示椎间盘细胞的特征，而在其它实施方案中，所述细胞被诱导，在它们被施加到椎间盘之后(体内)显示椎间盘细胞的特征。
在一个优选的实施方案中，所述干细胞材料是脂衍生的干细胞材料。更具体地说，所述干细胞材料基本上不含其它细胞类型(例如，脂肪细胞、红细胞、其它间质细胞等)和胞外基质材料。最优选地，所述干细胞材料完全不含这种其它的细胞类型和基质材料。所述脂衍生的干细胞材料可以来自灵长类的脂肪组织，最优选的是来自接受脊髓移植的人。尽管所述干细胞材料可以是任何类型的干细胞，但中胚层来源的材料较佳。
当使用脂肪衍生的干细胞材料时，所述材料可用任何合适的方法获得。但通常，该方法开始于从来源动物中分离脂肪组织。当使用来自活供体的人脂肪间质细胞时，如外科手术或脂肪抽吸术等完全公认的方法是优选的。
获得脂肪组织后，优选从剩余的材料中分离干细胞。在一个优选的实施方案中，脂肪组织用生理相容性盐溶液(例如磷酸缓冲盐水)洗涤，然后剧烈搅拌并静置。这样可从脂肪组织中除去松散的物质(例如，受损的组织、血液、红细胞等)。洗涤和静置步骤可重复进行直到上清液相对不含碎屑。
剩余的细胞通常将以各种大小的块存在，因此优选对该材料进行处理以降解大的结构而使对细胞本身的损伤最小。一种方法是用削弱或破坏细胞之间的键的酶(例如，胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等)来处理经过洗涤的细胞块。这种酶处理的量和时间是可变的，这取决于处理条件，但这种酶的用途通常是此领域已知的。可用其它处理方法，如机械振荡、声能、热能等，来降解细胞块，这些方法可交替使用或者和酶处理一起使用。
降解步骤通常产生聚集的细胞(通常是脂质体)的浆液或悬液以及含有通常无间质细胞(例如，红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和干细胞)的液体组分。因此，分离过程中的下一个步骤是从间质细胞分离聚集的细胞。这可通过离心完成，把间质细胞压成被上清液覆盖的片状物。然后弃去上清并将片状物悬浮于生理相容性液体。
悬浮的细胞通常包括含有红细胞，在大多数方案中最好裂解红细胞。选择性裂解红细胞的方法是此领域已知的，并可使用任何合适的方法(例如，在高渗或低渗介质中培养)。如果红细胞被裂解，然后应从裂解物中分离剩余的细胞，通常是通过过滤或离心。无论红细胞是否裂解，悬浮的细胞可被洗涤、再离心和再悬浮一次或连续多次以得到较高纯度。
可用细胞分选仪或根据细胞大小和粒度(干细胞相对较小且无颗粒)来分离成人干细胞。可通过免疫组织化学的方法，例如通过淘选或用磁珠将它们分离。如果需要，任何分离本发明细胞的步骤和过程可手工进行。或者，分离这种细胞的方法可通过合适的装置来完成，许多装置是此领域已知的。
如上所述，在一些实施方案中，所述干细胞材料包含已经分化但随后又去分化以恢复其多能能力的细胞。一种实现这一目的的方法包括建立细胞培养物并处理细胞以逆转与分化有关的特定的染色体外遗改变。
细胞分化过程中发生的基因表达的可遗传变化部分是由于染色体构象的外遗改变。此外，染色体的松散凝集区含有转录活性基因，且染色体的高度凝集区含有转录沉默基因。染色体凝集和转录活性的状态部分是由DNA甲基化和组蛋白乙酰化控制的。CpG启动子内胞嘧啶的甲基化和过度甲基化与基因沉默有关，而未甲基化的DNA通常是转录活性的。
分化的成人体细胞显示出稳定且特定的甲基化模式，而多能细胞，如原始的生殖细胞和植入前胚胎，显示出去甲基化的全基因组模式。一些研究证实，甲基化的这些可遗传模式是可逆的。例如，已将鼠胸腺淋巴细胞与鼠胚胎生殖细胞融合，并证实了淋巴细胞细胞核的全基因组去甲基化。所得去甲基化的核随后显示出是多能的。
因此，在本发明的一个方面，用DNA去甲基化重新编程成人体细胞。去甲基化可抑制含有DNA的核苷酸甲基化。根据本发明，成人体细胞可以用一种试剂处理以促进或诱导DNA的去甲基化。在去甲基化步骤的一个实施方案中，成人体细胞用5-氮-2’-脱氧胞苷处理。将原始成人体细胞在含有0.1-100μM5-氮-2’-脱氧胞苷(SigmaChemical公司，St.Louis，Mo.)的正常生长培养基中培养1-10天，优选培养5天，以促进或诱导DNA的去甲基化。可用于去甲基化步骤的其它试剂包括，例如，甲基化酶特异性抗体或甲基化酶的其它抑制剂。
除了DNA甲基化和去甲基化的具体模式，通过染色质重塑酶，如组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶，也可调节总的转录模式。乙酰化的组蛋白以低于脱乙酰化的组蛋白的亲和力结合DNA，因此通常允许转录因子结合DNA。相反，脱乙酰化的组蛋白以较高亲和力结合DNA，阻遏了转录激活剂接近DNA，因此通常抑制转录。在本发明的另一个实施方案中，通过抑制或逆转组蛋白的脱乙酰化对原始成人体细胞重新编程。将原始成人体细胞培养在含有0.1-10000ng/ml制毛癣素A(Sigma Chemical公司，St.Louis，Mo.)的正常生长培养基中培养至少24小时。用制毛癣素A处理细胞显示可诱导或允许以前沉默的基因的表达。或者，细胞可用丁酸钠处理，这样也可抑制组蛋白脱乙酰化。任何可诱导或有利于组蛋白乙酰化或DNA甲基化中变化的试剂都可用来实现这个目的。
在又一个实施方案中，原始成人体细胞用染色质重塑蛋白处理，所述蛋白质优选为核质蛋白，这是一种有助于组蛋白H1与组蛋白B4和HMG1交换，从而有助于转录的激活的核伴侣。在一个优选的实施方案中，一转运肽(例如，Tat)融合到含有被施加到正常培养基中的细胞的核质蛋白的肽上。在核质蛋白处理停止之前组蛋白的交换得以进行。可以预见，可用任何此领域已知的有助于除去转录阻抑物并有助于核重塑的染色质重塑酶、试剂、嵌入剂或它们的组合来处理细胞。
在另一个实施方案，原始成人体细胞用去甲基化剂、脱乙酰化抑制剂或乙酰化启动子和/或核伴侣的组合处理，以促进核的重新编程。术语“核伴侣”在本文中是指任何有助于组蛋白H1或HMG1的其它转录阻抑物、组蛋白B4或其它转录激活剂交换的试剂。可以预见，任何可诱导或有助于组蛋白乙酰化或DNA甲基化的试剂都可用于本发明的实践。还可预见，可用任何此领域已知的有助于除去转录阻抑物并有助于核重塑的染色质重塑酶、试剂、嵌入剂或它们的组合来处理细胞。
此外，熟练技术人员可用此领域已知的阻断DNA甲基化、促进DNA去甲基化、阻断组蛋白脱乙酰化、促进组蛋白乙酰化和/或促进组蛋白H1与组蛋白B4或HMG1交换的其它试剂处理原始细胞，以便重新编程所述细胞的基因组。
成人体干细胞培养物可用一种或多种下列试剂处理以诱导中期停顿：G2-M细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白-A或细胞周期蛋白-B)、c-Mos、秋水仙素、秋水仙酰胺或任何其它可逆微管药物。可通过膜转位法将多肽试剂，如细胞周期蛋白-A，细胞周期蛋白-B或c-Mos，施加到细胞，该方法包括但不限于，微注射、脂质体介导的转位、或融合到转运肽的多肽的直接转位。或者，例如，在对可调型启动子如市售的Tet-on/Tet-off系统(Clontech，Palo Alto Calif.)的控制下，可通过阳离子脂质转导、微注射或电穿孔将编码细胞周期蛋白-A、细胞周期蛋白-B或c-Mos的多核苷酸构成的载体转染入培养的细胞。在细胞的中期停顿持续至少1-6个小时之后，可通过更换培养基(如用肽或微管毒物处理)或通过启动子阻抑(如多核苷酸载体转染)使细胞从中期停顿释放。
应该理解的是，易于获得的成人体细胞，最优选毛发外根鞘(0RS)细胞、表皮角质形成细胞或颊上皮细胞，可获自受试者并在本文所述的培养基中扩展，其中，所述受试者优选是人。细胞用一定量的去甲基化剂，优选约10μM 5-氮-2’-脱氧胞苷处理约5天，以诱导全基因组的去甲基化。这些细胞也可用脱乙酰化抑制剂或乙酰化启动子，优选100ng/ml或1μM制毛癣素A处理24小时，以促进组蛋白乙酰化。这些细胞也可用一定量含有核伴侣或其它染色质重塑酶(Fry和Peterson，同上)，优选核质蛋白或tat-核质蛋白的多肽处理以便于从DNA中除去转录阻抑物。
上述一个或多个步骤之后，用一定量使细胞在中期停顿的试剂，优选含有细胞周期蛋白-A或细胞周期蛋白-B的多肽，处理细胞30小时以诱导持续的有丝分裂停顿。然后通过用至少一种更换的培养基洗涤细胞使细胞从有丝分裂停顿中释放。
有丝分裂停顿步骤之后，附着的细胞被胰蛋白酶化、重铺并在设计用于支持干细胞生长的培养基中培养。在一个优选的实施方案中，重建的细胞在80％KNOCKOUT.RTM.DMEM、20％KNOCKOUT.RTM.SR(GIBCO/BRL，Bethesda Md.)、1mM谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、1％非必需氨基酸贮液(GIBCO/BRL，Bethesda Md.)、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和1000U/ml白血病抑制因子(ES细胞培养基)中在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层上传代。KNOCKOUT.RTM.DMEM和KNOCKOUT.RTM.SR是设计用于增强胚胎干细胞生长并保持其多能性的特殊配方。熟练的技术人员还可使用此领域已知的其它细胞培养基配方以增殖多能细胞。
提供干细胞之后，在本发明的一个方面，所述细胞被诱导以表达一种或多种人椎间盘细胞的特征。该过程可在体外或体内进行，这将在下面更详细讨论。如上所述，这些已开始表达成熟的人椎间盘细胞特征的细胞仍被称为“干细胞”。事实上，出于本发明叙述的目的，任何未分化成成熟细胞类型的细胞都可被称为“干细胞”。
在一个优选的实施方案中，重建的细胞直接在对维持干细胞不是最优但仍可使重建的细胞分化的条件下培养。通常，这种培养条件可缺乏血清，缺乏饲养细胞，含有高密度细胞，或含有一种或多种各种形态发生生长因子或分化因子，如用于培养具有规定表型的成熟细胞的培养基，具有所需和/或规定表型的成熟细胞，或特定的分化因子，例如视黄酸或神经生长因子。
一种处理类型是将本发明的细胞在已接触各自类型的待分化的成熟细胞(或其前体)的条件培养基中培养(例如，接触肌细胞的条件培养基可诱导肌原性分化，接触心瓣膜细胞的条件培养基可诱导分化成心瓣膜组织等)。
来自成人多能干细胞的扩展的体外培养物可通过生长因子和/或形态发生素体外处理来分化。当然，也可使用诱导分化的确定成分培养基。可将细胞暴露于约1μM-10μM胰岛素、约1μM-10μM运铁蛋白、约1ng/ml-10ng/ml转化生长因子(TGF)β1以及约10nM-50nM抗坏血酸-2-磷酸(50nM)来诱导软骨形成的分化。对于软骨形成的分化，优选以高密度(例如，每毫升约数百万细胞或用微量(micromass)培养技术)培养细胞，且也存在少量血清(例如，约1％-5％)。可将细胞暴露于约10-7M-10-10M地塞米松(例如，约1μM)并混合约10μM-50μM抗坏血酸-2-磷酸以及约10nM-50nM β-甘油磷酸来诱导成骨发育表型，所述培养基中还可含有血清(例如，牛血清、马血清等)。
细胞在分化诱导培养基中培养适当时间(例如，几天至一周或数周)之后，可对细胞进行测定以确定它们实际上是否已分化得到所给细胞类型的物质品质。一种测量分化的方法本质上是测量端粒长度，未分化的干细胞的端粒长于分化的细胞，因此可测定细胞端粒酶活性水平。或者，可提取细胞的RNA或蛋白质并测定(通过Northern杂交、rtPCR、Western印迹分析等)表示所需表型的标记的存在。当然，细胞可用免疫组织化学方法测定或用组织特异性染料染色。类似地，可用骨特异性染料(例如，碱性磷酸酶、von Kossa等)染色细胞或探测骨特异性标记(例如，骨钙素、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、I型胶原、骨形态发生蛋白、cbfa等)的存在来测定成骨作用(ostogenesis)。可用软骨特异性染料(例如，阿辛蓝)染色细胞或探测细胞中软骨特异性分子(例如，培养基中的硫化的糖胺聚糖和蛋白聚糖(例如，角蛋白、软骨素等)、II型胶原等)的表达/生成来确定软骨发生。其它确定发育表型的方法是此领域已知的，任何这些方法都是适用的。例如，可根据大小和粒度分选细胞。此外，细胞可被用来产生单克隆抗体，然后可用单克隆抗体来确定它们是否优选结合给定的细胞类型。抗原性的相关性可证实干细胞已经沿着给定的发育途径分化。
或者，可在体内诱导干细胞表达一种或多种人椎间盘细胞的特征。这可通过几种方法实现，包括在椎间盘中提供外源干细胞，优选以高密度提供。干细胞可以与有或没有选择用来诱导人椎间盘细胞发育的试剂一起加入。
可诱导干细胞分化成人椎间盘细胞的因子是用于体外分化干细胞的因子。例如，转化生长因子(TGF)-β、抗坏血酸-2-磷酸、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、β-甘油磷酸、胰岛素、胰岛素样生长因子、运铁蛋白、氢化可的松以及其它精通此领域的技术人员已知的试剂可用于此目的。
无论细胞是否与上面提出的一种或多种诱导剂一起提供，应该理解，所述细胞可以培养或生长在已接触各自类型待分化的成熟细胞(或其前体)的条件中(例如，接触肌细胞的条件培养基可诱导肌原性分化，接触心瓣膜细胞的条件培养基可诱导分化成心瓣膜组织等)。当以高密度提供细胞时，这种处理尤其有效。
在本发明的另一方面，为便于使用干细胞材料来扩张脊椎盘，所述干细胞材料是在生物相容的晶格材料中提供的。通常，所述晶格含有来自与提供干细胞材料相同的脂肪组织的富含胶原的材料。理想的是，所述晶格随着时间可生物降解，这样它将随着干细胞材料的发育被吸收入体内。晶格还可包含激素，如生长因子、细胞因子和形态发生素(例如，视黄酸、aracadonic acid等)，所需的胞外基质分子(例如，纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)或所需的其它材料(例如，DNA、病毒、其它细胞类型等)。
为形成干细胞/富含胶原的晶格材料，将干细胞引入晶格使它们渗透进其中的间隙。例如，可将晶格浸入含有细胞的溶液或悬液，或将这种溶液或悬液灌注或注射到晶格中。一种特别优选的组合物是由包括富含胶原的晶格材料的悬液与分散在其中的干细胞材料交联形成的水凝胶。这种形成方法可使细胞分散在整个晶格中，更易于细胞渗透到晶格中。
适合包含入组合物的晶格可来自任何合适的来源(例如，基质胶)，并可通过一些商业来源获得合适的晶格(例如，合适的聚乙醇酸可获自以下来源，例如PuracBiochem.和Boehringer Ingelheim)。如上所述，富含胶原的晶格的较佳来源是提供干细胞的脂肪组织的非细胞部分，即基本上没有细胞的脂肪组织胞外基质材料。通常，这种脂衍生的晶格包括蛋白质，如蛋白聚糖、糖蛋白、类透明质酸(hyaluronan)、纤连蛋白、胶原(I型、II型、III型、IV型、V型、VI型等)，等等，它们作为细胞生长的优良基质。此外，脂衍生的晶格可包含激素，优选细胞因子和生长因子，以便于种入晶格的细胞生长。
所述脂衍生的晶格可分离自与上述类似的脂肪组织，除非它将出现在非细胞部分。例如，可对脂肪组织或其衍生物(例如，按上述方法离心后细胞部分)进行声能或热能处理和/或酶处理以回收晶格材料。同时，脂肪组织的细胞部分最好被破坏，例如通过用脂肪酶、去污剂、蛋白酶处理，和/或通过机械破裂或超声破裂处理(例如，用匀浆机或超声仪)。虽然分离的材料一开始可以是粘性材料，但根据所需最终用途，它随后可按照需要进行处理。例如，可对原始晶格材料进行处理(例如，渗析或用蛋白酶或酸等处理)以产生所需的晶格材料。因此，晶格可被制成水合形式，或者它可被干燥或冻干成基本上无水形式或粉末。之后，粉末可被再水合以用作细胞培养基质，例如通过将其悬浮在合适的细胞培养基中。在这方面，所述脂衍生的晶格可与上述其它合适的晶格材料混合。
在一些实施方案中，干细胞/富含胶原的晶格材料与额外的胶原基材料结合以用于扩张脊椎盘。额外的胶原基材料优选来源于天然、富含胶原的组织如椎间盘、筋膜、韧带、腱、去矿化的骨基质等。该材料可以是同源的、异源的、或异种的、或可以是人重组来源。在可替换的实施方案中，胶原基材料可以是一种合成的、胶原基材料。优选的富含胶原的组织的例子包括椎间盘环、阔筋膜、平面筋膜、前或后交叉韧带、髌腱、腘腱、四头肌腱、跟腱、皮肤和其它结缔组织。
有或没有额外的胶原基材料的干细胞/富含胶原的晶格材料可以以适合导入椎间盘间隙的任何形式提供。例如，该材料可以是一种固体、多孔、编织、或非编织材料。该材料可作为颗粒或小块或作为纤维材料提供。
在一些实施方案中，这种与干细胞一起提供的胶原基材料以脱水状态提供，并在椎间盘中植入后“再水合”。在其它实施方案中，该胶原基材料是“湿”植入的。当该材料是“湿的”时，它可能是因为从未被脱水或已被脱水并重建。当重建时，该材料可用盐水或另一水介质重建，或者可用非水介质例如乙二醇或酒精重建。并且，当以“湿的”状态提供时，该材料可以作为凝胶、溶液、混悬液、分散体、乳剂、糊等提供。在最优选的实施方案中，该材料是一种适合通过皮下注射针注射入椎间盘的微粒和/或纤维材料。
在最优选的实施方案中，富含胶原的晶格材料和/或额外的胶原基材料作为尺寸范围在0.05mm和5mm之间的微粒提供。当使用例如阔筋膜或椎间盘环微粒的材料用作额外的胶原基材料时，微粒粒度优选从0.1mm到5mm。当使用例如去矿化的骨基质时，该微粒粒度优选从0.05mm到3mm。当使用材料的小塞时，该塞优选从0.5mm到5mm的尺寸范围。在一些实施方案中，可以使用较大尺寸的块例如尺寸达20mm的块。
可以使用多于一种类型的组织加工或制备该材料。例如，在适当情况下可优选干细胞/富含胶原的晶格材料与阔筋膜和/或去矿化的骨基质(DBM)的混合物，如可以是干细胞/富含胶原的晶格材料与DBM和环纤维材料的混合物。
可以在配方中加入交联剂以促进胶原材料的交联。例如，可以在配方中包含戊二醛或其它蛋白交联剂。交联剂可促进胶原分子间共价或非共价的交联。类似地，也可包含抑制蛋白变性的试剂。适合用于本发明的交联剂是本领域技术人员熟知的，可以不经过度的实验而选择。
当材料用作浆或凝胶时，也可包含促进浆或凝胶形成的添加剂。这些添加剂可以促进蛋白折叠、水结合、蛋白-蛋白相互作用和水固定。
此外，可以包含一种放射照相造影剂，例如硫酸钡，或一种放射造影染料，例如泛影葡胺+泛影酸钠制剂(HYPAQUE)，以帮助外科医生追踪所注射材料的运动和/或位置。适合用于椎间盘造影术的放射造影材料是本领域技术人员已知的，可以不经过度的实验而选择用于本发明。
最后，还可以包含对所注射的干细胞/胶原基材料提供好处的其它添加剂。这种添加剂包括镇痛药以减轻疼痛、抗生素以将潜在的细菌感染减至最低程度。
也可包含蛋白聚糖和/或其它多糖，以吸引和/或结合水来保持核水合。类似地，也可包含生长因子和/或其他细胞(例如椎间盘细胞、干细胞等)，以促进愈合、修复、再生和/或恢复椎间盘，和/或促进正常的椎间盘功能。适合用于本发明的添加剂是本领域技术人员已知的，可以不经过度的实验而选择。
在加入到椎间盘间隙之前，干细胞/胶原材料可被制成各种形式(例如固体、多孔、编织、非编织、微粒、凝胶、溶液、悬液、糊剂等)。在一个优选的实施方案中，所述材料在注射入椎间盘间隙之前是脱水的，它通过从椎间盘间隙吸收液体而再水合。在其它实施方案中，胶原材料是作为凝胶、浆液或其它在植入前水合的形式提供的。
干细胞材料/胶原基材料是“通过外科手术加入”到椎间盘间隙的。即该材料通过医务人员的介入被加入，以区别于通过身体的自然生长或再生过程而“加入”。外科手术过程优选地包括通过皮下注射针注射，尽管可使用胶原基材料导入椎间盘的其他外科手术方法。例如，该材料可通过扩张的环开口挤压、经导管灌注、经创伤或外科手术切口产生的开口插入，或通过其它侵入性或最小侵入性方法将该材料沉积入椎间盘间隙的方法被导入椎间盘。
就本发明材料和方法的优点而言，扩张椎间盘可恢复或改善椎间盘的自然状况和/或性能。此外，扩张可抑制或逆转脱水椎间盘的逐步退化。
下面介绍采用上述方法的具体实施例。应当理解，提供这些实施例是为了更完整地描述优选实施方案，而不是限制本发明的范围。
实施例1
从体组织获得干细胞材料
可从经受选择性外科手术的患者中获得原始脂肪抽吸术的抽吸物。进行吸脂之前，可给予患者肾上腺素以使血液对抽吸物的污染最小。然后对抽吸物进行粗滤使有关的脂肪组织块与相关液体废物分离。分离的组织用中性磷酸缓冲盐水冲洗，然后在37℃用0.075％w/v胶原酶在间歇搅拌下酶解约20分钟。
消化之后使胶原酶失效，然后将浆液在约260g下离心10分钟。这样产生了多层上清和一细胞团。然后除去上清并保存供将来使用。将细胞团重悬于裂解红细胞的溶液并在约25℃下不搅拌培育约10分钟。培育之后使培养基失效并将细胞在约250g再离心约10分钟。
第二次离心后将细胞团中的细胞悬浮，并通过台盼蓝(tryan blue)排斥和细胞数目来测定存活力。以1×106细胞/100mm平皿涂布细胞并在37℃、5％CO2下补充有约10％胎牛血清的培养基中生长。大部分细胞是不含可见脂质液滴的粘着的小的单核成纤维细胞样细胞。大部分细胞用油红0和von Kossa染色呈阴性。
可测定细胞端粒酶的表达(用市售的TRAP测定试剂盒)，该测定中包括HeLa细胞和NH-12细胞作为阳性对照。测定人包皮成纤维细胞和加热的HN-12细胞提取物中端粒酶阴性对照的活性。端粒酶活性通过用12.5％聚丙烯酰胺细胞分辨的磷成像端粒产物(phosphoimaging telomeric product)来测量。在来自脂肪组织的细胞和阳性对照中观察到了表明端粒酶活性并与干细胞的存在相一致的端粒梯(telometricladder)，但在阴性对照中未观察到。这些结果证实，可用这种技术从脂肪组织分离干细胞。
实施例2
在体外使体细胞去分化成多能干细胞
成人角质形成细胞获自Clonetics(San Diego，CA)，并根据“角质形成细胞系统说明”(BioWhittaker，目录号AA-1000)中的说明在37℃、5-10％CO2下在角质形成细胞生长培养基中生长。当成人角质形成细胞有约40-80％铺满时，在培养物中加入10-25μM5-氮-2’-脱氧胞苷(Sigma，St Louis，MO)。用5-氮-2’-脱氧胞苷培养4天后在培养物中加入100-250ng/ml制毛癣素(Sigma，St Louis，MO)。将培养物再培养1天，并取样测定端粒酶活性。
测定在10-25μM 5-氮-2’-脱氧胞苷中暴露5天并在100-250ng/ml制毛癣素中暴露1天的角质形成细胞以及未暴露于这些试剂的细胞端粒酶的表达(用市售的TRAP测定试剂盒)。和阳性对照(HeLa细胞和NH-12细胞)和阴性对照(人包皮成纤维细胞和加热的HN-12细胞提取物)一起测定这些细胞。端粒酶活性通过用12.5％聚丙烯酰胺细胞分辨的磷成像端粒产物来测量。在阳性对照和在10-25μM5-氮-2’-脱氧胞苷中暴露5天并在100-250ng/ml制毛癣素中暴露1天的角质形成细胞中观察到了表明端粒酶活性并与干细胞的存在相一致的端粒梯。这些结果证实，在10-25μM 5-氮-2’-脱氧胞苷中暴露5天并在100-250ng/ml制毛癣素中暴露1天的角质形成细胞具有增加的端粒酶活性，这与干细胞样表型相一致。
实施例3
干细胞在体外的生长
干细胞在37℃和5％CO2下，在补充有10％胎牛血清的DMEM构成的细胞培养基中培养。在这些条件下，细胞可传代至少5次而不会分化，且不会丧失它们的发育表型。
实施例4
多能干细胞分化成特定细胞类型
将高密度干细胞(约7×106细胞/ml)在由以下物质构成的培养基中培养数周：DMEM，补充有1％FBS、6.25μM胰岛素、6.25μg/ml运铁蛋白(transferring)、10ng/ml转化生长因子β1(TGF-β-1)和50nM抗坏血酸2-磷酸1％ABAM。
数周后对组织培养物进行组织学分析并在第2、7和14天用H&E、阿辛蓝(alcainblue)、甲苯蓝(toludene blue)和Goldner三色染色进行石蜡切片。还测试了样品与培养的抗软骨素-4-硫酸和硫酸角蛋白以及II型胶原的抗体的结合。将组织培养物样品染色以定性评估组织培养物中存在的基质的量。未暴露于软骨形成培养基的对照干细胞未显示分化成软骨形成细胞的证据。暴露于软骨形成培养基的干细胞显示了分化成软骨形成细胞的证据，早在暴露于软骨形成培养基48小时后就形成了具有软骨周细胞的明显边界的软骨球形小结(cartilaginous spheroid nodule)。
实施例5
将干细胞/富含胶原的晶格材料注射入椎间盘间隙
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。用小直径皮下注射针将干细胞/胶原组合物通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。干细胞/胶原组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例6
将干细胞/富含胶原的晶格材料注射入椎间盘间隙
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在组织处理期间分离之后将胶原和干细胞合并。再将干细胞/胶原组合物悬浮在盐水或任何其它合适的介质中。用皮下注射针将悬液通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。悬液在注射后包含在椎间盘间隙内。介质随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例7
将干细胞/富含胶原的晶格材料注射入椎间盘间隙
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。干细胞被悬浮在体外并随后与胶原合并。再将干细胞/胶原组合物悬浮在盐水或任何其它合适的介质中。用皮下注射针将悬液通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。悬液在注射后包含在椎间盘间隙内。介质随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例8
添加放射造影染料
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入放射照相造影染料，然后用小直径皮下注射针使其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。干细胞/胶原/染料组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。含有放射照相造影染料的过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例9
添加镇痛药
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入利多卡因的镇痛药，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。干细胞/胶原/镇痛药组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例10
添加生长因子
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入一种或多种生长因子，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。优选的生长因子包括那些可诱导干细胞分化成能促进椎间盘愈合和/或再生的表型的生长因子。生长因子的例子包括转化生长因子β、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子等。干细胞/胶原/生长因子组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例11
添加额外的胶原基材料
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入一种或多种类型的胶原，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。优选的胶原包括那些来自椎间盘、筋膜、韧带、腱、去矿化的骨基质等富含胶原的组织或结缔组织的胶原。干细胞/胶原组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞-胶原晶格。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例12
添加多糖
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入一种或多种类型的多糖，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。优选的多糖包括那些来自动物或植物的多糖，如透明质酸、脱乙酰壳多糖、几丁质、纤维素、琼脂等。干细胞/胶原/多糖组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞/胶原/多糖基质。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例13
添加额外的生物材料
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入一种或多种生物材料，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。优选的生物材料包括白蛋白、血纤蛋白、丝、弹性蛋白、角蛋白，以及其它合成的亲水性聚合物或水凝胶，如聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇等。干细胞/胶原/生物材料组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞/胶原/生物材料基质。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例14
添加多种额外的组分
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入放射照相造影染料、镇痛药、生长因子、填充剂和盐水，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。填充剂可以是上述胶原、多糖或生物材料中的一种或多种。最终的组合物在注射后包含在椎间盘间隙内。含有放射照相造影染料和盐水的过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下最终的基质。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
实施例15
添加交联剂
通过脂肪抽吸法从患者中取出足够的脂肪组织，以这样的方式处理组织即从其余组织中分离基本上不含脂肪细胞和红细胞的干细胞和富含胶原的晶格。在干细胞/胶原组合物中加入戊二醛之类的胶原交联剂，然后用小直径皮下注射针将其通过完整的环直接注射入核椎间盘间隙。注射后胶原在椎间盘间隙中进行交联。过量体液随后从椎间盘间隙渗出并留下干细胞/交联的胶原基质。单次注射较为理想，但也可进行额外的注射以实现合适的物理扩张和生物恢复水平。
尽管附图和说明书已经对本发明作了阐释，但应当理解这些附图和描述仅仅出于说明的目的，不对本发明特征构成限制。应当理解，所显示和描述的仅仅是优选实施方案，在本发明主旨范围之内的所有变化形式和改进形式都在本发明保护范围之内。本发明的材料和方法的其它实施例揭示在申请人的待批美国专利申请No.10/245,955中，该申请被全文纳入本文作为参考。

Claims (34)

1.一种已用外科手术在椎间盘中加入干细胞材料处理的椎间盘。
2.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘已通过加入从未开始分化的干细胞处理。
3.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘已通过加入已经开始分化但又已经返回未分化状态的干细胞处理。
4.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘已通过加入表达至少一种人椎间盘细胞的特征的干细胞处理。
5.如权利要求4所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘已通过加入选择性地诱导以表达至少一种人椎间盘细胞的特征的干细胞处理。
6.如权利要求5所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料与选自转化生长因子(TGF)-β、抗坏血酸-2-磷酸、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、β-甘油磷酸、胰岛素、胰岛素样生长因子、运铁蛋白、氢化可的松的一个成员接触来选择性地诱导所述干细胞材料以表达至少一种人椎间盘细胞的特征。
7.如权利要求5所述的椎间盘，其特征在于，已通过所述干细胞材料与所需表型的成熟细胞接触来选择性地诱导所述干细胞材料以表达至少一种人椎间盘细胞的特征。
8.如权利要求4所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料包含表达至少一种成纤维细胞特征的干细胞。
9.如权利要求5所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料包含已诱导以表达至少一种成纤维细胞特征的干细胞。
10.如权利要求4所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料包含表达至少一种软骨细胞特征的干细胞。
11.如权利要求5所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料包含已诱导以表达至少一种软骨细胞特征的干细胞。
12.如权利要求4所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料包含表达至少一种脊索细胞特征的干细胞。
13.如权利要求5所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料包含已诱导以表达至少一种脊索细胞特征的干细胞。
14.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料衍生自分化的细胞。
15.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料衍生自未分化的细胞。
16.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料收获自用外科手术加入所述组合物的人。
17.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，在将材料加入椎间盘之前将所述干细胞材料和非干细胞材料分离。
18.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞材料不含非干细胞材料。
19.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述干细胞放置在富含胶原的晶格中。
20.如权利要求19所述的椎间盘，其特征在于，所述富含胶原的晶格材料收获自用外科手术加入所述组合物的人。
21.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘还包含用外科手术植入的胶原基材料。
22.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘还包含有效诱导干细胞分化成椎间盘细胞的材料。
23.如权利要求22所述的椎间盘，其特征在于，所述有效诱导干细胞分化成椎间盘细胞的材料包括选自下组的一个成员：转化生长因子(TGF)-β、抗坏血酸-2-磷酸、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、β-甘油磷酸、胰岛素、胰岛素样生长因子、运铁蛋白、氢化可的松。
24.如权利要求22所述的椎间盘，其特征在于，所述有效诱导干细胞分化成椎间盘细胞的材料包括具有所需表型的成熟细胞。
25.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和交联剂处理。
26.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和放射造影剂处理。
27.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和镇痛药处理。
28.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和抗生素处理。
29.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和至少一种多糖处理。
30.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和蛋白聚糖处理。
31.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和生长因子处理。
32.如权利要求1所述的椎间盘，其特征在于，所述椎间盘用外科手术加入干细胞材料和有效促进椎间盘愈合、修复、再生和/或恢复，和/或有助于合适的椎间盘功能的一种或多种其它细胞类型处理。
33.一种诱导干细胞材料表达至少一种人椎间盘细胞特征的方法，所述方法包括将干细胞材料引入椎间盘间隙并使所述干细胞材料与形态发生生长因子或分化因子接触。
34.一种诱导干细胞材料表达至少一种人椎间盘细胞特征的方法，所述方法包括将干细胞材料引入椎间盘间隙并使所述干细胞材料与所需表型的成熟细胞接触。
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