CN100364558C - 高丽参提取物在预防和治疗肌肉萎缩性疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生制药技术领域，所述高丽参提取物为红参提取物。本发明将高丽参经过水煎煮，纱布过滤，得到浓缩提取物。用该提取物灌胃小鼠，能显著刺激小鼠骨骼肌中PGC-1α的表达。本发明阐明了高丽参提取物刺激PGC-1α蛋白在骨骼肌中的表达，可作为预防和治疗肌肉萎缩性疾病的药物。
Description
一、技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及制备预防和治疗肌肉萎缩性疾病的药物。
二、背景技术
肌肉萎缩是指横纹肌营养不良，肌肉体积较正常缩小，肌肉纤维变细或消失。废用和疾病均可导致肌肉萎缩，进而导致肌无力使患者失去生活能力甚至死亡。目前，对于肌肉萎缩的预防和治疗还没有行之有效的方法。
骨骼肌主要由I型(慢肌)和II型(快肌)肌肉组成，I型肌比II型肌含有更多的线粒体，以氧化代谢作为主要能量来源，而II型肌主要以糖酵解产生ATP，同时伴有酸性物质的产生，因此，II型肌更易于疲劳。
PGC-1α是转录因子共活化因子，它不直接与DNA结合，而是通过与结合在DNA上的转录因子结合，发挥其调节功能。其功能包括，1：参与适应性产热的调节；2：参与线粒体生成的调节；3：参与褐色脂肪细胞的分化(Puigserver P，et alEndocrine Rewiews 24(1)：78-90，2003)。最近，又发现PGC-1α在I型肌中的表达高于II型肌，转基因鼠表明，PGC-1α能促进I型肌的生成(Lin J，et.al.Nature418：797-801，2002)。持续性锻炼也能通过上调PGC-1α来促进I型肌的生成(Baar K，et al.FASEB，16：1879-1886，2002.Norrbom J.et al.J Appl.Physiol96：189-194，2004)。因此，上调PGC-1α促进I型肌的生成，对于治疗肌肉萎缩具有重要意义，但持续性锻炼显然有其局限性。
高丽参即具有治疗疾病的功能，又有强身健体的功能。中医讲究的是“阴阳调和”，认为疾病是由于寒热失调所引起的，这些理论体系显得过于虚幻，缺少现代分子生物学研究支持。因此，我们以高丽参提取物为研究对象，充分运用分子生物学手段，揭示高丽参能上调骨骼肌中的PGC-1α，进而促进I型肌的生成，同时，为预防和治疗肌肉萎缩提供新的疗效显著的药物。
三、发明内容
本发明的目的是提出利用高丽参提取物，制备预防和治疗肌肉萎缩性疾病的药物。
本发明的技术解决方案：
本发明所述高丽参提取物为红参提取物。
1.高丽参的提取和浓缩过程：20克高丽参(红参)加入200-300毫升的蒸馏水(10-15毫升蒸馏水/克高丽参)，煎煮30分钟，留取上清，残渣重复上述过程一次。两次上清经3层纱布过滤，用蒸馏水将药液调至50ml，得到浓度为0.4g/ml的高丽参药液，于4℃保存；
2.高丽参刺激小鼠骨骼肌PGC-1α的表达：按10mg/g的量每日灌胃，共14日，发现15日后，PGC-1α在腓肠肌中增加4倍，比目鱼肌中增加1.4倍。
本发明的有益效果是为中药治疗肌肉萎缩性疾病提供了现代分子生物学的理论依据。本发明首次阐明了高丽参提取物具有刺激PGC-1a表达的效应，更重要的是，该结果提示高丽参可用于肌肉萎缩的预防和治疗。目前中医和现代分子生物学的研究还没有很好的结合起来，中药作用的调节途径和靶位点更是知之甚少。本研究室与合作者首次提出PGC-1a是肌肉类型的决定因子(Lin J，et.al.Nature 418：797-801，2002.)，在慢肌(I型肌肉)的形成中发挥了重要作用，同时，PGC-1a可以刺激线粒体的生成，提高肌肉的氧化能力，这些都是改善肌肉状态、抵抗疲劳的先决条件，因此，高丽参可以用来预防和治疗肌肉萎缩性疾病。
四、附图说明
图1为给药小鼠15日腓肠肌中PGC-1a表达的变化。1为对照组，2为给药组。
图2为给药小鼠15日比目鱼肌中PGC-1a表达的变化。1为对照组，2为给药组。
五、具体实施方式
本发明把高丽参经水两次煎煮、过滤等步骤，得到高丽参提取物。灌胃小鼠，分离腓肠肌和比目鱼肌，用real-time PCR方法测定PGC-1a的表达，结果证明高丽参提取物提高了骨骼肌组织中PGC-la的表达。
材料与来源
试剂：，Trizol购自Invitrogen公司；逆转录酶和Tag酶购于大连宝生物工程有限公司。
手术器械：剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。
其它器材：Heidolph DIAX900匀浆器：ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR仪；C57BL/6小鼠购于南京大学模式动物中心
实施例
1.高丽参的提取和浓缩20g高丽参(红参)加入200ml的蒸馏水，加热至沸腾后，煎煮30分钟，留取上清，残渣重复上述过程一次。两次上清经3层纱布过滤，将药液调至50ml，得到浓度为0.4g/ml的高丽参药液，于4℃保存。
2.小鼠给药及组织的分离保存实验用小鼠为SPF级的野生型雄性小鼠，品系C57BL/6，8-10周龄，饲养于南京市鼓楼医院动物实验中心。用灌胃针按10mg/g药量每日灌胃给药，对照组小鼠用等体积的生理盐水灌胃，第15日将小鼠颈椎脱臼法处死。剪开腿部皮肤并分离之，以跟腱为标志，分离腓肠肌和比目鱼肌，生理盐水漂洗干净，立即放于冻存管中，于液氮中保存备用。
3.组织RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR取适量组织加1ml Trizol于Heidolph DIAX900组织匀浆器将组织充分匀浆(3档90秒)，将匀浆液转入洁净的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，13200rpm离心10分钟，小心吸取上清至另一洁净的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，13200rpm离心10分钟，弃上清，75％乙醇洗涤沉淀，室温干燥，20μl DEPC水溶解，紫外分光法检测浓度和纯度。2μg RNA用于逆转录，反应体系为20μl，含2μg RNA，1mMdNTP，RNA酶抑制剂1U/μl，Olig(dT)18引物2.5 pmol/μl，AMV逆转录酶0.5U/μl，轻轻混匀，42℃1小时，冰上放置2分钟，所得cDNA可用于real-timePCR。real-time PCR为20μl反应体系，分别含0.5μl(检测GAPDH)和1.5μl(检测PGC-1a)cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，各1pmol/μl上、下游引物及相应的探针，0.025 U/μlTag酶，混匀。PCR反应条件：95℃5分钟，95℃30秒，60℃60秒(40个循环)72℃延伸3分钟。引物序列，GAPDH：上游引物：5’-tgt gtc cgt cgt gga tct ga-3’，下游引物5’-cct gct tca cca cct tct tga-3’，探针序列：5’-ccg cct gga gaa acc tgc caa gta tg-3’；PGC-1α：上游引物：5’-tga cac aac gcg gacaga a-3’，下游引物5’-cgg tgc att cct caa ttt ca-3’，探针序列：5’-tga gag acc gct ttgaag ttt ttg-3’。结果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，见附图。
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1.高丽参提取物在制备预防和治疗肌肉萎缩性疾病药物中的应用。
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