CN100360672C - 棉花金属硫蛋白基因GhMT1序列及其克隆与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及棉花中金属硫蛋白蛋白GhMT1基因的克隆、重组及耐盐性功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。通过构建棉花盐胁迫cDNA文库和对照cDNA文库，再进行差异筛选，获得一系列表达有显著差异的cDNA序列，其中有一条为棉花金属硫蛋白基因，将其命名为GhMT1。进一步利用该基因转化烟草，获得的转基因植株能在200mmol·L-1的盐浓度下较好生长。利用该基因转化水稻，获得该基因转基因植株能在100mmol·L-1的盐浓度下较好生长。因此，该基因是一个抗盐基因，可以用于转化盐敏感植物来提高其耐盐能力，对于盐敏感植物在盐碱地上的推广种植，具有重要的经济效益和社会效益。

Description

棉花金属硫蛋白基因GhMT1序列及其克隆与应用
(一)技术领域
本发明涉及棉花中金属硫蛋白基因GhMT1的克隆、重组及耐盐性功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。
(二)背景技术
高浓度的盐引起植物体内的离子失衡和高渗胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢特别是降低农作物产量。严重的盐胁迫或渗透胁迫会引起植物体内的第二胁迫——氧化胁迫的发生，甚至导致植物死亡。因此，盐胁迫受到人们的广泛关注，提高作物的耐盐性亦愈来愈受到人们的重视。通过转基因提高作物的耐盐能力是一条行之有效的办法。因此，寻找与盐胁迫有关的基因并研究其具体功能，以及调控途径具有重要的理论和实践意义。
本发明人通过构建棉花盐胁迫cDNA文库，利用差异筛选法获得了立一条棉花的金属硫蛋白基因GhMT1。进一步构建正义表达载体，转化烟草和水稻，转基因植株具有较高的耐盐性，烟草耐盐性可达200mM，水稻耐盐性可达100mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
(三)发明内容
本发明从棉花中分离出编码某一金属硫蛋白(GhMT1)的全长cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得的转基因植株耐盐性高达200mM。
从300mM NaCl处理的棉花幼苗和正常生长的棉花幼苗叶片中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA，构建棉花盐胁迫cDNA文库和正常棉花cDNA文库。使用反相Northern差异筛选法，获得一条全长的cDNA为487bp，包括三端多聚A尾巴。开放阅读框部分为192bp，由此推得具63个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的水稻、大麦、草莓、葡萄的金属硫蛋白的氨基酸同源性71.4％，表明经过上述筛选步骤得到了编码金属硫蛋白的基因。该基因序列如下：
序列表
(1)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征
*长度：414碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：棉花
(f)序列描述：SEQ IN NO.1
1   atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga
61  aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg
121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt
181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt
241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg
301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt
361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa
(2)SEQ IN NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：63氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述
1  MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC
61 GSH
用SmaI和SalI从pTriplEx2载体切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105.
转化烟草，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在10mM、100mM、200mM和300mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能较好的生长，具较高的耐盐能力。
转化水稻，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在10mM、50mM、100mM和150mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能较好的生长，具较高的耐盐能力。
根据上述技术，从棉花中分离出编码金属硫蛋白的基因GhMT1，该基因过量表达能导致转基因烟草以及水稻具较高的耐盐性。让该基因在棉花中表达，将会提高棉花的耐盐性；如果与特异启动子连接，对其表达进行时空和胁迫诱导进行调控，将更具有针对性，具有非常重要的经济效益和社会效益.
(四)附图说明
图1是野生型和转GhMT1基因烟草植株的盐处理后拍摄的图片：
横排表示NaCl浓度梯度，1代表野生型，2代表转基因植株。
图2是野生型和转GhMT1基因水稻植株的叶绿素含量的测定结果柱状图
横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示叶绿素含量；1代表野生型，2代表转基因植株。
图3是野生型和转GhMT1基因水稻植株的鲜重的测定结果柱状图
横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示植株鲜重；1代表野生型，2代表转基因植株。
(五)具体发明实施方式
实施例1：棉花金属硫蛋白基因GhMT1的获得
1.棉花幼苗的处理：棉花支棉3号生长10天的幼苗。400mM NaCl处理18小时，收集子叶；
2.总RNA的提取：采用RNAeasy plant mini kit(promoga公司产品)提取总RNA。
3.使用SMART cDNA Library Construction Kit构建棉花盐胁迫cDNA文库以及对照cDNA文库。
4.使用反相Northern差异筛选法筛选有表达差异的cDNA片断。
5.将携带有表达差异的cDNA片断的pTriplEx2载体转入大肠杆菌BM25.8。
6.序列测定：本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。获得一条487bp的cDNA片断。
7.同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较，确定它属于棉花金属硫蛋白基因。
实施例2：棉花金属硫蛋白基因GhMT1，如下序列：
(1)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征
*长度414碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：棉花
(f)序列描述：SEQ INNO.1
1   atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga
61  aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg
121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt
181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt
241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg
301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt
361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa
(3)SEQ IN NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：63氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述
1  MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC
61 GSH
实施例3：表达载体的构建
1.用SmaI和SalI两个限制性内切酶将该基因从pTriplEx2载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
2.将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。
实施例4：含有GhMT1转基因烟草的再生以及耐盐性鉴定
1.培养野生型烟草。
2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3.3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用10×MS培养基悬浮。
4.将烟草叶片切成小块，放入上述悬浮液浸泡10分钟。
5.侵染后的叶片切块置于分化培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，)上共培养2天，然后转入选择培养基(1×MS盐，3％蔗糖，pH5.8，4.5g/L卡拉胶，卡那霉素100毫克/升，头孢青霉素250毫克/升)筛选，得到抗性植株。
6.将抗性植株移入花盆，每两天浇含10mmolL-1，100mmolL-1，200mmolL-1和300mmolL-1氯化钠的1/2Hoagland营养液，20天后测定野生型和转基因植株的光合速率和叶绿素含量。
实施例5：含有GhMT1转基因水稻的再生以及耐盐性鉴定
1.去壳的成熟种子用10％的次氯酸钠消毒十分钟，然后用无菌水冲洗5次。
2.将水稻种子置于N6D2的培养基中诱导愈伤组织，20天后将成熟盾片处长出的愈伤组织继代于N6D2的培养基中。
3.在农杆菌侵染前将愈伤组织转移到新鲜的N6D2的培养基中培养4天。
4.挑取鉴定好的农杆菌单菌落于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
5.3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用N6D2的液体培养基悬浮。
6.将预培养的愈伤组织用农杆菌侵染20分钟。
7.用无菌滤纸洗去多余的农杆菌液，让后置于N6D2培养基中，26℃，黑暗，共培养3天。
8.将共培养后的愈伤用含有250mg/L的头孢霉素的N6D2液体培养基中，洗涤8次，再用无菌水洗干。
9.将愈伤组织转移到N6D2CH固体筛选培养基中，26℃，暗培养，每2周换一次培养基。
10.将反复筛选获得的抗性组织转移到N6D2CH+S高渗培养基中，26℃，暗培养2周。
11.将抗性组织转移到MSR分化培养基中，26℃，暗培养1周，再转为26℃，光16小时/暗8小时培养。
12.将再生的芽转到新鲜的MS培养基中，直至长出小植株。
13.将抗性植株移入花盆，每两天浇含10mmolL-1，50mmolL-1，100mmolL-1和150mmolL-1氯化钠的1/2Hoagland营养液，20天后测定野生型和转基因植株的叶绿素含量和植株鲜重。
序列表
<110>山东农业大学
<120>棉花金属硫蛋白基因GhMT1序列及其克隆与应用
<140>200510104301X
<141>2005-10-14
<160>1
<170> PatentIn version 3.1
<210>1
<211>414
<212>cDNA
<213>Gossypium hirsutum
<400>1
atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga     60
aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg    120
gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt    180
ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt    240
gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg    300
atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt    360
ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa          414

Claims (3)

1.一个棉花金属硫蛋白基因GhMT1，其特征在于它具有下述所示的核苷酸序列：
1   atggctgaca agtgtggcaa ctgcgattgc gctgacaaga gccagtgtgt gaagaaagga
61  aacagcttgg tcattgagac tgaggagagc tacatcagca ccgtagtggt cgagcctctg
121 gcagagaacg atggcaagtg caagtgcgga actagctgca gctgcacaaa ctgcacatgt
181 ggcagtcact aagcagacat atagaatgat gaagtttggg acctaaaaag aataaaagtt
241 gggttgaata atttgtgtct tttgttgtag tttgagtgtg ttttcttgtc tatctgtccg
301 atgattgtct atgtctctca ttttatacaa tgatggaatg accatgtcaa tggcctttgt
361 ctgattaatg aactattatt agtacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa。
2.根据权利要求1所述的一个棉花金属硫蛋白基因GhMT1，其特征在于该基因编码下述所示的氨基酸序列：
1  MADKCGNCDC ADKSQCVKKG NSLVIETEES YISTVVVEPL AENDGKCKCG TSCSCTNCTC
61 GSH。
3.根据权利要求1所述的一个棉花金属硫蛋白基因GhMT1的用途，其特征在于该基因在烟草和水稻中过量表达，能有效提高转基因植株的耐盐性。
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