CH705318A1

CH705318A1 - Fluorescence detection system for detecting fluorescence radiation in time-control synchronism, has image sensor, which is operated to detect fluorescence radiation, where image sensor has multiple photo-detectors

Info

Publication number: CH705318A1
Application number: CH01220/11A
Authority: CH
Inventors: Peter Seitz; Christof Fattinger
Original assignee: Suisse Electronique Microtech
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2013-01-31
Also published as: CH705318B1

Abstract

The fluorescence detection system (100) has an image sensor (180), which is operated to detect a fluorescence radiation. The image sensor has multiple photo-detectors (185), where each photo-detector is operated to provide a fluorescence radiation detected in a corresponding number of output loads. The photo-detector has a load integrator, which is operated during a predetermined time interval. The output photocurrent charges are generated in response to the detected fluorescence radiation. An independent claim is included for a method for operating fluorescence detection system.

Description

GEBIET DER ERFINDUNGFIELD OF THE INVENTION

[0001] Die offenbarte Technik betrifft das Gebiet der Fluoreszenzabbildung und genauer gesagt das Gebiet der zeitaufgelösten Fluoreszenzabbildung. The disclosed technique relates to the field of fluorescence imaging, and more particularly to the field of time-resolved fluorescence imaging.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0002] Die offenbarte Technik wird aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung besser verständlich und anerkannt werden, wenn diese in Zusammenhang mit den Zeichnungen gesehen wird. Es zeigen: The disclosed technique will be better understood and appreciated from the detailed description below when taken in conjunction with the drawings. Show it:

[0003] Fig. 1 eine Abbildung einer Kurve der Amplitude als Funktion der Abklingzeit von Autofluoreszenz, Markierungsfluoreszenz und der Summe derselben (nachstehend: Gesamtfluoreszenz); FIG. 1 is a plot of a plot of amplitude as a function of autofluorescence decay time, tracer fluorescence and the sum thereof (hereinafter: total fluorescence); FIG.

[0004] Fig. 2 eine Abbildung eines schematischen Blockdiagramms eines zeitauflösenden Fluoreszenzdetektionssystems, das gemäss einer Ausführungsform der Erfindung aufgebaut ist und funktioniert; und FIG. 2 is an illustration of a schematic block diagram of a time-resolved fluorescence detection system constructed and operative in accordance with an embodiment of the invention; FIG. and

[0005] Fig. 3 eine Abbildung eines Ablaufschemas eines Verfahrens zur zeitaufgelösten Fluoreszenzdetektion gemäss einer Ausführungsform der Erfindung. 3 is an illustration of a flowchart of a method for time-resolved fluorescence detection according to an embodiment of the invention.

[0006] Es versteht sich, dass der Einfachheit und Übersichtlichkeit halber die in den Figuren gezeigten Elemente nicht unbedingt massstabsgetreu gezeichnet sind. Beispielsweise können die Abmessungen einiger Elemente im Verhältnis zu anderen Elementen der Übersichtlichkeit halber übertrieben sein. Ferner können gegebenenfalls Bezugsnummern in den Figuren wiederholt werden, um identische oder ähnliche Elemente anzugeben, ohne jedoch in der Beschreibung aller Figuren erwähnt zu werden. It is understood that for the sake of simplicity and clarity, the elements shown in the figures are not necessarily drawn to scale. For example, the dimensions of some elements may be exaggerated relative to other elements for clarity. Further, where appropriate, reference numerals may be repeated in the figures to indicate identical or similar elements, without, however, being mentioned in the description of all figures.

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIKGENERAL PRIOR ART

[0007] Systeme und Verfahren zur Fluoreszenzdetektion gehören zu den wichtigsten Hilfsmitteln der Biowissenschaft und werden verwendet, um die Eigenschaften von Prüfkörpern zu untersuchen, indem der Effekt der Fluoreszenz verwendet wird. Systems and methods for fluorescence detection are among the most important tools in the life sciences and are used to study the properties of test specimens by using the effect of fluorescence.

[0008] Um die Eigenschaften an verschiedenen Stellen der Prüfkörper zu untersuchen, wird ein optoelektronisches Abbildungssystem, wie etwa ein Lichtmikroskop, verwendet. Interessante organische oder anorganische Substanzen in einem Prüfkörper werden spezifisch mit Fluoreszenzmarkern, die nachstehend als «Fluorophore» bezeichnet werden, markiert. Der markiert wird mit Licht einer oder mehrerer spezifischer Wellenlängen beleuchtet, die in der Lage sind, die Fluorophore anzuregen. Diese Fluorophore emittieren dann eine Fluoreszenzstrahlung (nachstehend: «Markierungsfluoreszenz») auf einer längeren oder kürzeren Wellenlänge als das Anregungslicht. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie weist das emittierte Fluoreszenzlicht eine kürzere Wellenlänge als das Anregungslicht auf. Die Fluoreszenzstrahlung wird auf einer lichtempfindlichen Oberfläche abgebildet, wo sie erkannt wird, und das entsprechende Signal, das die erkannte Fluoreszenzstrahlung darstellt, wird weiter verarbeitet. In order to study the properties at various locations of the specimens, an opto-electronic imaging system, such as a light microscope, is used. Interesting organic or inorganic substances in a specimen are labeled specifically with fluorescent markers, hereinafter referred to as "fluorophores". The labeled is illuminated with light of one or more specific wavelengths capable of exciting the fluorophores. These fluorophores then emit fluorescence radiation (hereinafter: "label fluorescence") at a longer or shorter wavelength than the excitation light. In two-photon fluorescence microscopy, the emitted fluorescent light has a shorter wavelength than the excitation light. The fluorescence radiation is imaged on a photosensitive surface where it is detected and the corresponding signal representing the detected fluorescence radiation is processed further.

[0009] Viele biologische Prüfkörper enthalten erhebliche Mengen organischer Verbindungen, von denen mehrere eigenfluoreszierend sind, so dass sie so genannte Autofluoreszenz-Eigenschaften aufweisen. Zudem könnte der Behälter oder der Halter des Prüfkörpers ebenfalls Autofluoreszenz-Eigenschaften aufweisen, insbesondere wenn der Behälter Autofluoreszenzmoleküle umfasst, beispielsweise wenn der Behälter oder der Halter aus Glas oder einem Polymermaterial hergestellt ist. Diese Art von Fluorophoren wird nachstehend als «Autofluorophoren» bezeichnet. Entsprechend kann die Gesamtfluoreszenzstrahlung, die in einem Prüfkörper erzeugt wird, sowohl Autofluoreszenz- als auch Markierungsfluoreszenz-Komponenten jeweils von Autofluorophoren und Markierungsfluorophoren enthalten. Many biological specimens contain significant amounts of organic compounds, several of which are self-fluorescent, so that they have so-called autofluorescence properties. In addition, the container or holder of the specimen could also have autofluorescence properties, especially if the container comprises autofluorescent molecules, for example if the container or holder is made of glass or a polymer material. This type of fluorophore is referred to as "autofluorophore" below. Accordingly, the total fluorescence radiation generated in a specimen may include both autofluorescent and tracer fluorescence components from autofluorophors and tracer fluorophores, respectively.

[0010] Bisher wurden diverse Arten von Fluoreszenzsystemen und Verfahren vorgeschlagen in der Bemühung, Autofluoreszenz und Markierungsfluoreszenz in der Gesamtfluoreszenzstrahlung auseinander zu halten. Various types of fluorescence systems and methods have heretofore been proposed in an effort to distinguish autofluorescence and label fluorescence in the overall fluorescence radiation.

[0011] Die nachstehenden Veröffentlichungen behandeln dieses Problem, indem sie versuchen, eine Reduzierung des Autofluoreszenzlichtes des Hintergrundes zu erzielen. The following publications address this problem by trying to achieve a reduction of the background autofluorescence light.

[0012] Das US-Patent Nr. 3 013 467 im Namen von Minsky, mit dem Titel «Microscopy apparatus» offenbart ein optisches System, das ein Mittel umfasst, um eine punktförmige Lichtquelle zu erzeugen. Licht aus dieser punktförmigen Quelle wird auf einen zu vergrössernden Prüfkörper fokussiert, um ein punktförmiges Beobachtungsfeld zu beleuchten, das in dem Prüfkörper enthalten ist. Der beleuchtete Punkt wird dann als Bild des Punktes auf eine Lochblende fokussiert, und die Lichtstärke des Bildes wird von einer lichtempfindlichen Vorrichtung gemessen. Während das optische System feststehend bleibt, werden Mittel bereitgestellt, um den Prüfkörper in einem ausgewählten Muster über den Fokuspunkt der Beleuchtung zu bewegen, so dass ein ausgewählter Bereich des Prüfkörpers durch den Lichtpunkt geht und davon untersucht wird. Dieses Scanmuster, das der Prüfkörper durchquert, wird von einem identischen Scanmuster oder Raster auf einer Anzeigevorrichtung, wie etwa einer Kathodenstrahlröhre, wiedergegeben, der auch das Signal von der lichtempfindlichen Vorrichtung zugeführt wird. Der Rasterbereich geht weit über den ausgewählten Bereich des Prüfkörpers hinaus. Daher wird ein Bild des zweiten Prüfkörperbereichs in einem stark vergrösserten Massstab in dem Raster der Kathodenstrahlröhre wiedergegeben. U.S. Patent No. 3,013,467, in the name of Minsky, entitled "Microscopy Apparatus" discloses an optical system that includes means for generating a point source of light. Light from this point source is focused on a specimen to be magnified to illuminate a point observation field included in the specimen. The illuminated spot is then focused as an image of the spot on a pinhole and the light intensity of the image is measured by a photosensitive device. While the optical system remains stationary, means are provided to move the specimen over the focal point of the illumination in a selected pattern such that a selected portion of the specimen passes through and is inspected by the light spot. This scanning pattern traversing the specimen is reproduced from an identical scanning pattern or raster on a display device such as a cathode ray tube to which the signal is also supplied from the photosensitive device. The grid area extends far beyond the selected area of the specimen. Therefore, an image of the second specimen area is reproduced on a greatly enlarged scale in the raster of the CRT.

[0013] Das US-Patent Nr. 6 248 988 im Namen von Krantz, mit dem Titel «Conventional and confocal multi-spot Scanning optic microscope» offenbart ein optisches Mikroskopsystem umfassend ein Spot-Array-Beleuchtungssystem, das ein Mikrolinsen-Array oder ein Lochblenden-Array (oder beides) aufweist, um ein Array aus mehreren getrennten fokussierten Lichtpunkten zu erzeugen, das ein Objekt beleuchtet, ein Abbildungs- und Detektionssystem, das einen Array-Detektor mit Detektionselementen umfasst, die angeordnet sind, um gleichzeitig Licht für jeden Punkt zu erkennen, der von dem beleuchteten Objekt abgebildet wird, Mittel zum Scannen der Position des Arrays von getrennten Punkten im Verhältnis zum Objekt, die jeden Pixel abtasten, um ein Bild eines ganzen Feldes des Objekts in einem zusammenhängenden Durchgang zu erfassen. Ein Prozessor erstellt das Bild aus den Pixeldaten, die nacheinander von dem Detektor-Array empfangen werden. U.S. Patent No. 6,248,988, in the name of Krantz, entitled "Conventional and Confocal Multi-spot Scanning Optic Microscope" discloses an optical microscope system comprising a spot array illumination system including a microlens array Pinhole array (or both) to create an array of a plurality of separate focused spots of light illuminating an object, an imaging and detection system comprising an array detector with detection elements arranged to simultaneously light for each point to detect, which is imaged by the illuminated object, means for scanning the position of the array of separate points relative to the object, which scan each pixel to capture an image of an entire field of the object in a continuous passage. A processor creates the image from the pixel data received in succession from the detector array.

[0014] Die nachstehende Veröffentlichung offenbart einen alternativen Lösungsansatz, um zwischen Autofluoreszenz und Markierungsfluoreszenz zu unterscheiden, der auf Fluoreszenzsystemen und -verfahren basiert, bei denen die Richtungen der Beleuchtung und Beobachtung nicht mehr kollinear sind, um die Detektion von Autofluoreszenz zu vermeiden oder mindestens zu reduzieren. The following disclosure discloses an alternative approach to differentiate between autofluorescence and label fluorescence based on fluorescence systems and methods in which the directions of illumination and observation are no longer collinear to avoid or at least increase the detection of autofluorescence to reduce.

[0015] Die internationale Patentanmeldung WO 2009/088 874 im Namen von Brown et al., mit dem Titel «Optical Substrate for Microscopic Imaging of a Sample with Reduced Background Fluorescence», offenbart eine Substratform. die es einem Beleuchtungsstrahl ermöglicht, den Zielbereich zu erreichen, ohne durch unnötige Oberflächen innerhalb des optischen Systems zu gehen. Die Dicke und die Oberflächenwinkel des Substrats werden sorgfältig gewählt, um sowohl für die Beleuchtung als auch für die Sammel- oder Emissionsstrahlen getrennte Strahlenpfade bereitzustellen. [0015] International Patent Application WO 2009/088874 in the name of Brown et al., Entitled "Optical Substrate for Microscopic Imaging of a Sample with Reduced Background Fluorescence", discloses a substrate form. allowing an illumination beam to reach the target area without going through unnecessary surfaces within the optical system. The thickness and surface angles of the substrate are carefully chosen to provide separate beam paths for both the illumination and the collection or emission beams.

[0016] Noch andere Versuche, den Einfluss der Autofluoreszenz auf die Markierungsfluoreszenz zu reduzieren, basieren auf der Ausnutzung der relativ kurzen Abklingzeit der Autofluoreszenz im Vergleich zur Abklingzeit der Markierungsfluoreszenz der Fluoreszenzmarkierungen. Die Autofluoreszenz weist typischerweise eine Abklingzeit im Bereich von 1 bis 100 Nanosekunden auf. Falls ein Fluoreszenzmarker verwendet wird, bei dem die Abklingzeit der Markierungsfluoreszenz erheblich länger ist als die Abklingzeit der Autofluoreszenz eines Autofluorophors, kann man den Autofluoreszenzanteil von der Markierungsfluoreszenz in der Gesamtfluoreszenz unterscheiden, indem man eine gattergesteuerte Detektion des optischen Signals verwendet, das die Gesamtfluoreszenz darstellt, die mit einem Photodetektor umgesetzt wird, dessen Lichtempfindlichkeit während des Zeitraums, in dem die Autofluoreszenz in einem erheblichen Anteil vorliegt, vollständig unterdrückt werden kann. Yet other attempts to reduce the influence of autofluorescence on label fluorescence are based on exploiting the relatively short autofluorescence decay time compared to the cooldown of fluorescent label labeling fluorescence. Autofluorescence typically has a cooldown in the range of 1 to 100 nanoseconds. If a fluorescence label is used in which the decay time of the labeling fluorescence is significantly longer than the decay time of the autofluorescence of an autofluorophore, one can distinguish the autofluorescence component from the labeling fluorescence in the total fluorescence by using a gate-controlled detection of the optical signal representing the total fluorescence. which is reacted with a photodetector, whose photosensitivity can be completely suppressed during the period in which the autofluorescence is present in a significant proportion.

[0017] Mit Bezug auf Fig. 1 wird eine Kurve der Amplitude als Funktion der Abklingzeit von Autofluoreszenz, Markierungsfluoreszenz und der Summe von Autofluoreszenz und Markierungsfluoreszenz abgebildet, wobei die X-Achse die Abklingzeit (in willkürlichen Zeiteinheiten) und die Y-Achse die Amplitude (in willkürlichen Energieeinheiten) darstellt. Bei dem Beispiel aus Fig. 1 weist die Autofluoreszenz eine Abklingzeit auf, die siebenmal kürzer ist als die Markierungsfluoreszenz, während die Emissionsamplitude des Autofluorophors anfänglich zehnmal höher ist als die Emissionsamplitude des Markierungsfluorophors. Somit kann es bei diesem bestimmten Beispiel ausreichen, etwa 50 Zeiteinheiten abzuwarten, während deren die Autofluoreszenz auf einen derart niedrigen Pegel abgesunken ist, dass die Gesamtfluoreszenz praktisch ausschliesslich durch das Markierungsfluorophor verursacht wird. Referring to Figure 1, a plot of amplitude as a function of the cooldown of autofluorescence, tag fluorescence, and the sum of autofluorescence and tag fluorescence is plotted, where the x-axis is the decay time (at arbitrary time units) and the y-axis is the amplitude (in arbitrary energy units) represents. In the example of FIG. 1, the autofluorescence has a cooldown that is seven times shorter than the label fluorescence, while the emission amplitude of the autofluorophore is initially ten times higher than the emission amplitude of the label fluorophore. Thus, in this particular example, it may be sufficient to wait about 50 units of time during which the autofluorescence has dropped to such a low level that the total fluorescence is virtually exclusively caused by the tracer fluorophore.

[0018] Die folgenden Veröffentlichungen versuchen, den Einfluss der Autofluoreszenz zu reduzieren, indem sie das zuvor erläuterte Phänomen der unterschiedlichen Abklingzeiten zwischen Autofluoreszenz und Markierungsfluoreszenz ausnutzen. The following publications attempt to reduce the influence of autofluorescence by exploiting the previously discussed phenomenon of different cooldowns between autofluorescence and label fluorescence.

[0019] Die japanische Patentanmeldung Nr. 2006 194 770A im Namen von Tawara et al., mit dem Titel «Time-resolved fluorescence microscope» offenbart einen Laserstrahl, der aus einem Impulslaserstrahl-Generierungsmittel stammt, wobei der Laserstrahl durch einen Halbspiegel halbiert wird, und ein geteilter Strahl als Anregungslicht auf eine Probe gestrahlt wird. Ein nicht lineares optisches Element zum Erzeugen eines optischen Kerr-Effekts wird zwischen einem Paar Polarisationsplatten eingeschoben und angeordnet, deren Ablenkungsrichtungen sich in einem optischen Abbildungssystem orthogonal schneiden, um die Fluoreszenz zu kondensieren, die von der Probe generiert wird, und das Fluoreszenzbild der Probe zu bilden, wobei der andere Laserstrahl, der von dem Halbspiegel geteilt wird, als Ansteuerlicht auf ein nicht lineares optisches Element gestrahlt wird. Der optische Pfadunterschied zwischen dem Anregungslicht und dem Ansteuerlicht wird durch eine optische Verzögerungsschaltung angepasst, und das Fluoreszenzbild der Probe wird von einem zweidimensionalen Abbildungsmittel aufgenommen. Japanese Patent Application No. 2006 194 770A in the name of Tawara et al., Entitled "Time-resolved fluorescence microscope" discloses a laser beam originating from a pulsed laser beam generating means wherein the laser beam is halved by a half mirror, and a split beam is irradiated as an excitation light on a sample. A non-linear optical element for generating a Kerr optical effect is interposed and arranged between a pair of polarizing plates whose deflection directions intersect orthogonally in an imaging optical system to condense the fluorescence generated by the sample and the fluorescence image of the sample form, wherein the other laser beam which is divided by the half mirror is irradiated as a driving light to a non-linear optical element. The optical path difference between the excitation light and the driving light is adjusted by an optical delay circuit, and the fluorescent image of the sample is picked up by a two-dimensional imaging means.

[0020] Die US-Patentanmeldung Nr. 2008/0 265 177 im Namen von Connally et al., mit dem Titel «Fluorescence Detection» offenbart ein Fluoreszenzdetektionssystem, umfassend eine Strahlungsquelle, um eine Lichtemission zu generieren, um Fluoreszenz in einer fluoreszierend markierten Art zu erkennen, und einen Detektor zum Erkennen der Fluoreszenz, wobei entweder das Abklingen der Lichtemission aus der Strahlungsquelle derart ist, dass es eine Messung der Fluoreszenz zu einem Zeitpunkt ermöglicht, an dem die Fluoreszenz von der Autofluoreszenz unterscheidbar ist, oder der Detektor ein auf einem Chip befindlicher, verstärkter Detektor (CCD), um die Fluoreszenz zu erkennen, ist oder beides. US Patent Application No. 2008/0265177 in the name of Connally et al., Entitled "Fluorescence Detection" discloses a fluorescence detection system comprising a radiation source to generate a light emission to detect fluorescence in a fluorescently labeled manner and a detector for detecting fluorescence, wherein either the decay of the light emission from the radiation source is such as to allow measurement of the fluorescence at a time when the fluorescence is distinguishable from the autofluorescence, or the detector on one Chip, amplified detector (CCD) to detect the fluorescence is or both.

BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMENDESCRIPTION OF THE EMBODIMENTS

[0021] Es versteht sich, dass eine Ausführungsform ein Beispiel oder eine Umsetzung der Erfindungen ist. Das diverse Vorkommen von «einer Ausführungsform», «eine Ausführungsform» oder «einige Ausführungsformen» bezieht sich nicht unbedingt alle auf die gleichen Ausführungsformen. It is understood that an embodiment is an example or an implementation of the inventions. The various occurrences of "one embodiment," "one embodiment," or "some embodiments" are not necessarily all referring to the same embodiments.

[0022] Obwohl diverse Merkmale der Erfindung in Zusammenhang mit einer einzigen Ausführungsform beschrieben werden können, können die Merkmale auch getrennt oder in einer beliebigen geeigneten Kombination bereitgestellt werden. Obwohl andererseits die Erfindung hier der Übersichtlichkeit halber in Zusammenhang mit getrennten Ausführungsformen beschrieben werden kann, kann die Erfindung auch in einer einzigen Ausführungsform umgesetzt werden. Although various features of the invention may be described in conjunction with a single embodiment, the features may also be provided separately or in any suitable combination. On the other hand, although the invention may be described herein for clarity in connection with separate embodiments, the invention may be practiced in a single embodiment.

[0023] Es versteht sich, dass die Begriffe «enthaltend», «umfassend», «bestehend aus» und ihre grammatikalischen Varianten nicht das Hinzufügen eines oder mehrerer von Komponenten, Merkmalen, Schritten, Ganzzahlen oder Gruppen derselben ausschliesst. It is understood that the terms "including," "comprising," "consisting of," and their grammatical variants, do not exclude adding one or more of components, features, steps, integers, or groups thereof.

[0024] Die Erwähnung oder Identifizierung einer beliebigen Referenz in der Beschreibung einiger Ausführungsformen der Erfindung ist nicht als Zugeständnis zu deuten, dass eine derartige Referenz als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung zur Verfügung steht. The mention or identification of any reference in the description of some embodiments of the invention is not to be construed as an admission that such reference is prior art to the present invention.

[0025] Die Begriffe «oberer», «unterer», «rechts», «links», «unten», «unterhalb», «abgesenkt», «niedrig», «oben», «oberhalb», «angehoben», «hoch», «senkrecht» und «waagerecht» sowie ihre grammatikalischen Variationen, wie sie hier verwendet werden, geben nicht unbedingt an, dass beispielsweise eine «untere» Komponente unterhalb einer «oberen» Komponente vorliegt, oder dass eine Komponente, die sich «unterhalb» befindet, tatsächlich «unterhalb» einer anderen Komponente vorliegt, oder dass eine Komponente, die sich «oberhalb» befindet, tatsächlich «oberhalb» einer anderen Komponente vorliegt, da diese Richtungen, Komponenten oder beides ausgetauscht, umgedreht, räumlich bewegt, in einer diagonalen Orientierung oder Position eingesetzt, waagerecht oder senkrecht eingesetzt, oder ähnlich geändert werden können. Entsprechend versteht es sich, dass die Begriffe «unten», «unterhalb», «oben» und «oberhalb» hier rein beispielhaft verwendet werden können, um die relative Positionierung oder Anordnung von bestimmten Komponenten zu erläutern, um eine erste und eine zweite Komponente oder beide anzugeben. The terms upper, lower, right, left, bottom, below, lower, low, top "high", "vertical" and "horizontal" and their grammatical variations, as used herein, do not necessarily indicate, for example, that there is a "lower" component below an "upper" component, or that a component that is "below" Is actually "below" another component, or that a component "above" is actually "above" another component, since these directions, components, or both are exchanged, flipped, spatially moved, in a diagonal Orientation or position inserted, horizontally or vertically inserted, or can be changed similarly. Accordingly, it should be understood that the terms "bottom," "below," "top," and "above" may be used herein purely by way of example to explain the relative positioning or arrangement of particular components, a first and a second component, or to specify both.

[0026] Obwohl einige beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung in dieser Hinsicht nicht eingeschränkt sind, können sich Diskussionen, die Begriffe wie zum Beispiel «verarbeiten», «berechnen», «rechnen», «bestimmen», «analysieren», «erstellen», «überprüfen», «identifizieren oder dergleichen verwenden, auf einen oder mehrere Vorgänge und/oder Prozesse eines Computers, einer Computerplattform, eines Computersystems oder einer anderen elektronischen Computervorrichtung beziehen, die Daten manipulieren und/oder umwandeln, die als physische (z.B. elektronische) Grössen innerhalb der Register und/oder Speicher oder eines anderen Informationsspeichermediums des Computers, die Anweisungen speichern können, um Vorgänge und/oder Prozesse und/oder Anwendungen auszuführen, dargestellt werden. Although some example embodiments of the invention are not limited in this regard, discussions that include terms such as, for example, «process», «calculate», «calculate», «determine», «analyze», «create», « check, "identify, or use, refer to, one or more processes and / or processes of a computer, computer platform, computer system, or other electronic computing device that manipulate and / or transform data that is stored as physical (eg, electronic) assets within the computer's registers and / or memory or other information storage medium that can store instructions to perform operations and / or processes and / or applications.

[0027] Es sei zu beachten, dass der Gebrauch der unbestimmten Artikel «ein, eine, ein», wenn sie ein Merkmal einleiten, keineswegs derart auszulegen ist, dass es nur ein Exemplar dieses Merkmals gibt, soweit nicht anders angegeben. Entsprechend umfassen die unbestimmten Artikel «ein, eine, ein», wie sie hier verwendet werden, die Bedeutung des Ausdrucks «mindestens eines» des gleichen Merkmals It should be noted that the use of the indefinite article "a, a, a" when they introduce a feature is by no means to be construed as meaning that there is only one copy of this feature unless otherwise stated. Accordingly, the indefinite articles "one, one, one" as used herein include the meaning of the phrase "at least one" of the same feature

[0028] Obwohl gegebenenfalls Zustandsdiagramme, Ablaufdiagramme oder beide verwendet werden können, um Ausführungsformen zu beschreiben, ist die Erfindung nicht auf diese Diagramme oder auf die entsprechenden Beschreibungen eingeschränkt. Beispielsweise muss ein Ablauf nicht durch jedes abgebildete Kästchen bzw. jeden Zustand in genau der gleichen Reihenfolge wie abgebildet und beschrieben gehen. Although state diagrams, flowcharts or both may be used to describe embodiments as appropriate, the invention is not limited to these diagrams or the corresponding descriptions. For example, a process does not have to go through each mapped box or state in exactly the same order as shown and described.

[0029] Der Begriff «Verfahren» bezieht sich auf Methoden, Mittel, Techniken und Prozeduren zum Bewerkstelligen einer bestimmten Aufgabe, wozu ohne Einschränkung Methoden, Mittel, Techniken und Prozeduren gehören, die entweder bekannt sind oder ohne Weiteres vom Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung aus bekannten Methoden, Mitteln, Techniken und Prozeduren entwickelt werden können. The term "method" refers to methods, means, techniques, and procedures for accomplishing a particular task, including, without limitation, methods, means, techniques, and procedures that are either or are readily apparent to those skilled in the art can be developed from known methods, means, techniques and procedures.

[0030] Obwohl gegebenenfalls Zustandsdiagramme, Ablaufdiagramme oder beides verwendet werden können, um Ausführungsformen zu beschreiben, ist die Erfindung nicht auf diese Diagramme oder auf die entsprechenden Beschreibungen eingeschränkt. Beispielsweise muss ein Ablauf nicht durch jedes abgebildete Kästchen bzw. jeden Zustand in genau der gleichen Reihenfolge wie abgebildet und beschrieben gehen. Although state diagrams, flowcharts, or both may be used to describe embodiments as appropriate, the invention is not limited to these diagrams or the corresponding descriptions. For example, a process does not have to go through each mapped box or state in exactly the same order as shown and described.

[0031] Die Beschreibungen, Beispiele, Verfahren und Materialien, die in den Ansprüchen und der Beschreibung vorgelegt werden, sind nicht als einschränkend sondern als rein beispielhaft auszulegen. The descriptions, examples, methods and materials presented in the claims and the description are not to be construed as limiting but as purely exemplary.

[0032] Der Begriff «Autofluoreszenz» umfasst jede andere Art angeregter Fluoreszenzstrahlung (z.B. Hintergrundbeleuchtung) als die Markierungsfluoreszenz, die sich auf die Fluoreszenzstrahlung bezieht, die für die Analyse des markierten Prüfkörpers interessant ist. The term "autofluorescence" includes any other type of excited fluorescence radiation (e.g., backlighting) than the labeling fluorescence related to fluorescence radiation of interest for the analysis of the labeled specimen.

[0033] Der Begriff «Strahlung», wie er hier verwendet wird, kann sich sowohl auf eine sichtbare als auch auf eine unsichtbare elektromagnetische Strahlung, wie beispielsweise auf Licht im ultravioletten Spektrum, beziehen. The term "radiation" as used herein may refer to both visible and invisible electromagnetic radiation, such as light in the ultraviolet spectrum.

[0034] Es sei zu beachten, dass obwohl der Begriff «Anregungslichtimpulse» in der gesamten Beschreibung mit der gleichen Nummer referenziert ist, um von einer spezifischen Lichtquelle emittiert zu werden, dies keineswegs als einschränkend auszulegen ist, insofern es für den Fachmann klar ist, dass diese Anregungslichtimpulse Änderungen erfahren könnten, beispielsweise im Hinblick auf die spektrale Bandbreite und/oder Stärke, wenn sie sich durch ein optisches Medium ausbreitet. It should be noted that although the term "excitation light pulses" is referenced throughout the description with the same number to be emitted from a specific light source, this is by no means to be construed as limiting, insofar as it is clear to those skilled in the art, that these excitation light pulses could undergo changes, for example, in terms of spectral bandwidth and / or strength as it propagates through an optical medium.

[0035] Entsprechend sei zu beachten, dass obwohl auf den Begriff «Gesamtfluoreszenzstrahlung» in der gesamten Beschreibung mit der gleichen Nummer referenziert ist, um von der Probe emittiert zu werden, dies keineswegs als einschränkend auszulegen ist, insofern es für den Fachmann klar ist, dass die Gesamtfluoreszenzstrahlung Änderungen erfahren kann, beispielsweise im Hinblick auf die spektrale Bandbreite und/oder Stärke, wenn sie sich durch ein optisches Medium ausbreitet. Accordingly, it should be noted that although the term "total fluorescence radiation" is referenced throughout the description with the same number to be emitted from the sample, this is by no means to be construed as limiting, insofar as it is clear to a person skilled in the art, that the total fluorescence radiation may undergo changes, for example, in terms of spectral bandwidth and / or strength as it propagates through an optical medium.

KURZDARSTELLUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMENBRIEF DESCRIPTION OF THE EMBODIMENTS

[0036] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Fluoreszenzdetektionssystem, das betriebsfähig ist, um eine Fluoreszenzstrahlung in zeitgesteuerter Synchronität zu erkennen. The present invention discloses a fluorescence detection system operable to detect fluorescence radiation in timed synchrony.

[0037] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzdetektionssystem einen Bildsensor, der betriebsfähig ist, um eine Fluoreszenzstrahlung zu erkennen. Der Bildsensor umfasst eine Vielzahl von Photodetektoren, wobei jeder Photodetektor betriebsfähig ist, um eine erkannte Fluoreszenzstrahlung in eine entsprechende Anzahl von Ausgangsladungen umzusetzen. In some embodiments, the fluorescence detection system comprises an image sensor operable to detect fluorescence radiation. The image sensor comprises a plurality of photodetectors, each photodetector operable to convert detected fluorescence radiation into a corresponding number of output charges.

[0038] Bei einigen Ausführungsformen umfasst jeder der Vielzahl von Photodetektoren mindestens einen Ladungsintegrierer, der betriebsfähig ist, um während eines vorherbestimmten Zeitintervalls die Ausgangsphotoladungen, die als Reaktion auf die erkannte Fluoreszenzstrahlung generiert werden, selektiv zu integrieren. In some embodiments, each of the plurality of photodetectors comprises at least one charge integrator operable to selectively integrate, during a predetermined time interval, the output photocharges generated in response to the detected fluorescence radiation.

[0039] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzdetektionssystem eine Vielzahl von elektrischen Driftfeldgeneratoren, die jeweils betriebsfähig mit der Vielzahl von Pixelsensoren gekoppelt sind. In some embodiments, the fluorescence detection system comprises a plurality of electrical drift field generators, each operably coupled to the plurality of pixel sensors.

[0040] Bei einigen Ausführungsformen ist die Vielzahl von elektrischen Driftfeldgeneratoren derart betriebsfähig, dass sie die Ausgangsladungen, die von jedem der Photodetektoren bereitgestellt werden, an den mindestens einen Ladungsintegrierer während eines vorherbestimmten Zeitintervalls selektiv übertragen. In some embodiments, the plurality of electrical drift field generators are operable to selectively transmit the output charges provided by each of the photodetectors to the at least one charge integrator during a predetermined time interval.

[0041] Bei einigen Ausführungsformen umfasst jeder der Vielzahl von Photodetektoren einen Verstärker, der betriebsfähig ist, um das Signal zu verstärken, das die Ausgangsphotoladungen darstellt, die als Reaktion auf die erkannte Fluoreszenzstrahlung generiert werden. In some embodiments, each of the plurality of photodetectors comprises an amplifier operable to amplify the signal representative of the output photocharges generated in response to the detected fluorescence radiation.

[0042] Bei einigen Ausführungsformen umfasst der Verstärker einen Regelkreisverstärker. In some embodiments, the amplifier comprises a loop amplifier.

[0043] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzdetektionssystem eine Strahlungsquelle, die betriebsfähig ist, um eine Sequenz von Anregungslichtimpulsen zu emittieren, die jeweilige Beleuchtungsperioden aufweisen, und einen Controller. Die Photodetektoren, die Strahlungsquelle und der Controller sind betriebsfähig miteinander gekoppelt. In some embodiments, the fluorescence detection system includes a radiation source operable to emit a sequence of excitation light pulses having respective illumination periods, and a controller. The photodetectors, the radiation source and the controller are operably coupled together.

[0044] Bei einigen Ausführungsformen ist der Bildsensor in einem Detektionsmodus, bei dem fluoreszenzinduzierte Photoladungen gespeichert und integriert werden, und in einem Nicht-Detektionsmodus, bei dem die fluoreszenzinduzierten Photoladungen verworfen werden, selektiv betriebsfähig. In some embodiments, the image sensor is selectively operable in a detection mode in which fluorescence-induced photocarriers are stored and integrated, and in a non-detection mode in which the fluorescence-induced photocarriers are discarded.

[0045] Bei einigen Ausführungsformen ist der Controller betriebsfähig, um selektiv zwischen dem Detektionsmodus und dem Nicht-Detektionsmodus der Photodetektoren in zeitgesteuerter Synchronität mit der Strahlungsquelle abzuwechseln. In some embodiments, the controller is operable to selectively alternate between the detection mode and the non-detection mode of the photodetectors in timed synchronism with the radiation source.

[0046] Bei einigen Ausführungsformen umfasst jeder der Photodetektoren einen lichtempfindlichen Teil, um Photonen in Photoladungen umzuwandeln, und einen lichtunempfindlichen Teil, der mindestens einen elektrischen Schalter umfasst, und wobei der mindestens eine Ladungsintegrierer jeweils dem mindestens einen elektrischen Schalter zugewiesen ist; und einen Taktgeber, um den elektrischen Schalter derart zu steuern, dass Photoladungen, die in dem lichtempfindlichen Teil generiert werden, an den mindestens einen Ladungsintegrierer in zeitgesteuerter Synchronität mit Bezug auf die Anregungslichtimpulsen gegeben werden. In some embodiments, each of the photodetectors comprises a photosensitive member for converting photons into photo-charges, and a non-photosensitive member comprising at least one electrical switch, and wherein the at least one charge integrator is assigned to the at least one electrical switch; and a timer for controlling the electrical switch to apply photocurrents generated in the photosensitive member to the at least one charge integrator in timed synchronism with the excitation light pulses.

[0047] Bei einigen Ausführungsformen umfasst jeder Photodetektor ein lineares Zeitumwandlungselement länglicher Erstreckung und einen seitlichen elektrischen Feldgenerator. In some embodiments, each photodetector comprises a linear time conversion element of elongate extent and a lateral electric field generator.

[0048] Bei einigen Ausführungsformen sind das lineare Zeitumwandlungselement und der seitliche elektrische Feldgenerator betriebsfähig miteinander gekoppelt, so dass in dem linearen Zeitumwandlungselement ein seitliches Driftfeld generiert wird, wodurch das Absuchen von Photoladungen in dem Zeitumwandlungselement von einem ersten Ende bis zu einem zweiten Ende an der Längserstreckung des linearen Zeitumwandlungselements entlang ermöglicht wird. In some embodiments, the linear time conversion element and the side electric field generator are operably coupled to one another such that a lateral drift field is generated in the linear time conversion element, thereby scanning photo charges in the time conversion element from a first end to a second end on the time conversion element Longitudinal extent of the linear time conversion element along is made possible.

[0049] Bei einigen Ausführungsformen sind die Ladungsintegrierer in mindestens einer Reihe an der Längserstreckung des linearen Zeitumwandlungselements entlang angeordnet. In some embodiments, the charge integrators are arranged in at least one row along the length of the linear time conversion element.

[0050] Bei einigen Ausführungsformen sind die Ladungsintegrierer mit dem Zeitumwandlungselement jeweils an einer Vielzahl von beabstandeten Abtaststellen des Zeitumwandlungselements elektrisch gekoppelt. In some embodiments, the charge integrators are electrically coupled to the time conversion element at a plurality of spaced sample points of the time conversion element, respectively.

[0051] Bei einigen Ausführungsformen ist mindestens ein lichtempfindlicher Bereich, um Photonen in Photoladungen umzuwandeln, derart mit dem linearen Zeitumwandlungselement gekoppelt, dass die generierten Photoladungen in das lineare Zeitumwandlungselement eingespeist werden. In some embodiments, at least one photosensitive area to convert photons into photo charges is coupled to the linear time conversion element such that the generated photo charges are fed to the linear time conversion element.

[0052] Bei einigen Ausführungsformen ist die mindestens eine Ladeerkennungsschaltung an die Ladungsintegrierer elektrisch anschliessbar, um eine Photoladung zu erkennen, die durch mindestens einen Teil des linearen Zeitumwandlungselements an seiner Längserstreckung entlang gegangen ist. In some embodiments, the at least one charge detection circuit is electrically connectable to the charge integrators to detect a photo charge that has passed through at least a portion of the linear time conversion element along its length.

[0053] Bei einigen Ausführungsformen umfasst die Vielzahl von Photodetektoren jeweils eine Vielzahl von Rücksetztransistoren. In some embodiments, the plurality of photodetectors each include a plurality of reset transistors.

[0054] Bei einigen Ausführungsformen ist jeder Rücksetztransistor durch ein Rücksetzsignal derart steuerbar, dass solange das Rücksetzsignal den Rücksetztransistor offen hält, Photoladungen, die als Reaktion auf erkanntes Licht generiert werden, gleichzeitig abgeleitet werden, so dass sich die Photodetektoren im Nicht-Detektionsmodus befinden; und wobei, wenn der Rücksetztransistor geschlossen ist, die Photoladungen kumuliert werden, so dass die Photodetektoren in den Detektionsmodus gesetzt werden. In some embodiments, each reset transistor is controllable by a reset signal such that as long as the reset signal keeps the reset transistor open, photocurrents generated in response to detected light are simultaneously dissipated, such that the photodetectors are in the non-detection mode; and wherein, when the reset transistor is closed, the photocoads are cumulated so that the photodetectors are set in the detection mode.

[0055] Bei einigen Ausführungsformen umfasst jeder der Photodetektoren ferner einen Pixelinternen Verstärker. In some embodiments, each of the photodetectors further includes an in-pixel amplifier.

[0056] Die vorliegende Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zum Betreiben eines Fluoreszenzdetektionssystems. The present invention further discloses a method of operating a fluorescence detection system.

[0057] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise den Schritt des Abreicherns der Photodetektoren aus zuvor generierten Photoladungen. For example, in some embodiments, the method includes the step of depleting the photodetectors from previously generated photocoads.

[0058] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise den Schritt des Einstellens der Photodetektoren in einen Nicht-Detektionsmodus. For example, in some embodiments, the method includes the step of setting the photodetectors in a non-detection mode.

[0059] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise den Schritt des Beleuchtens mindestens einer mit Fluorophoren markierten Art mit einem Lichtimpuls. For example, in some embodiments, the method comprises the step of illuminating at least one fluorophore-labeled species with a light pulse.

[0060] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise nach einer vorherbestimmten Gatterverzögerung, die am Ende der Beleuchtungszeit beginnt, den Schritt des Einstellens der Photodetektoren in einen Detektionsmodus für eine vorherbestimmte Photonenexpositionsperiode. For example, in some embodiments, after a predetermined gate delay begins at the end of the lighting time, the method includes the step of setting the photodetectors in a detection mode for a predetermined photon exposure period.

[0061] Bei einigen Ausführungsformen wird die Dauer der Gatterverzögerung derart ausgewählt, dass das Verhältnis zwischen der Autofluoreszenz und der gewünschten Fluoreszenz, die durch den Lichtimpuls angeregt wird, gering genug ist, um eine zuverlässige Detektion der gewünschten Fluoreszenz durch die Photodetektoren sicherzustellen. In some embodiments, the duration of the gate delay is selected such that the ratio between the autofluorescence and the desired fluorescence excited by the light pulse is low enough to ensure reliable detection of the desired fluorescence by the photodetectors.

[0062] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise, solange das mindestens eine vorherbestimmte Beendigungskriterium nicht erfüllt ist, das Abreichern der Photodetektoren aus den zuvor generierten Photoladungen; das Einstellen der Photodetektoren in den Nicht-Detektionsmodus; das Beleuchten mindestens einer mit Fluorophoren markierten Art mit einem Lichtimpuls; und nach der vorherbestimmten Gatterverzögerung, die am Ende der Beleuchtungszeit beginnt, das Einstellen der Photodetektoren in den Detektionsmodus während der vorherbestimmten Photonenexpositionsperiode. For example, in some embodiments, as long as the at least one predetermined termination criterion is not met, the method comprises depleting the photodetectors from the previously generated photocoads; setting the photodetectors in the non-detection mode; illuminating at least one species labeled with fluorophores with a light pulse; and after the predetermined gate delay beginning at the end of the illumination time, setting the photodetectors in the detection mode during the predetermined photon exposure period.

[0063] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise den Schritt des mindestens zweimaligen Abtastens während der Expositionsperiode des Signals, das die Ausgangsladungen der erkannten Fluoreszenzstrahlung darstellt. For example, in some embodiments, the method includes the step of scanning at least twice during the exposure period of the signal representing the output charges of the detected fluorescence radiation.

[0064] Bei einigen Ausführungsformen wird der Zeitunterschied zwischen jedem Abtastschritt ausgewählt, um dem Unterschied der Abklingzeit zwischen mindestens zwei Fluorophormarkierungen zu entsprechen. In some embodiments, the time difference between each sampling step is selected to match the difference in cooldown between at least two fluorophore labels.

[0065] Bei einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren beispielsweise den Schritt des Bereitstellens von Informationen über die Fluoreszenz-Abklingeigenschaften der Licht emittierenden Fluorophormarkierung. For example, in some embodiments, the method includes the step of providing information about the fluorescence decay characteristics of the fluorophores emitting light emitting moieties.

Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

[0066] Die offenbarte Erfindung behebt die Nachteile nach dem Stand der Technik, indem sie ein alternatives System und Verfahren zur zeitaufgelösten Fluoreszenzdetektion bereitstellt, die eine Betriebsfähigkeit auf vergleichsweise niedrigen Spannungen, z.B. gleich oder kleiner als 10 V, ermöglichen und dabei eine kurze Gatterverzögerung, die z.B. gleich oder weniger als 1 Mikrosekunde dauert, und eine hohe Empfindlichkeit für die Fluoreszenzdetektion erreichen. Das System und das Verfahren zur zeitaufgelösten Fluoreszenzdetektion gemäss den Ausführungsformen der Erfindung sind betriebsfähig für die Analyse von Strukturen, Merkmalen und Eigenschaften von mikroskopischen oder makroskopischen Prüfkörpern. Solche Analysen können beispielsweise die Messung von molekularen Eigenschaften des Prüfkörpers umfassen (z.B. molekulare Konzentrationen, molekulare Interaktionen) und können für Hochleistungsmusterung, zellbasierte Assays, sekundäre Musterung, molekulare Pathologie und/oder andere analytische und/oder diagnostische Anwendungen verwendet werden. The disclosed invention overcomes the disadvantages of the prior art by providing an alternative system and method for time-resolved fluorescence detection which has operability at comparatively low voltages, e.g. equal to or less than 10 V, allowing a short gate delay, e.g. equal to or less than 1 microsecond, and achieve high sensitivity for fluorescence detection. The system and method for time-resolved fluorescence detection according to the embodiments of the invention are operable for the analysis of structures, features and properties of microscopic or macroscopic specimens. Such analyzes may include, for example, the measurement of molecular characteristics of the specimen (e.g., molecular concentrations, molecular interactions) and may be used for high performance patterning, cell based assays, secondary patterning, molecular pathology, and / or other analytical and / or diagnostic applications.

[0067] Das Fluoreszenzsystem gemäss den Ausführungsformen der Erfindung umfasst eine Strahlungsquelle, die betriebsfähig ist, um eine Sequenz von Anregungslichtimpulsen zu emittieren, von denen jeder eine Dauer von beispielsweise gleich oder weniger als 1 Mikrosekunde aufweist, einen Bildsensor und einen Controller. Das Fluoreszenzdetektionssystem kann gemäss den Ausführungsformen der Erfindung einen dichroitischen Spiegel, eine Bildgebungsoptik, ein Okular und ein Emissionsfilter umfassen. The fluorescence system according to embodiments of the invention comprises a radiation source operable to emit a sequence of excitation light pulses, each having a duration of, for example, equal to or less than 1 microsecond, an image sensor, and a controller. The fluorescence detection system according to the embodiments of the invention may comprise a dichroic mirror, imaging optics, an eyepiece, and an emission filter.

[0068] Die Strahlungsquelle ist betriebsfähig, um Anregungslichtimpulse auf einer oder mehreren Wellenlängen zu emittieren, die Fluoreszenzmoleküle (nachstehend: Fluorophore) in einem Prüfkörper anregen. The radiation source is operable to emit excitation light pulses at one or more wavelengths that excite fluorescent molecules (hereinafter: fluorophores) in a specimen.

[0069] Das Fluoreszenzsystem ist betriebsfähig und derart konfiguriert, dass mindestens ein Teil des Fluoreszenzlichtes, das aus den Fluorophoren austritt, auf den Bildsensor fällt und von diesem in entsprechende Photoladungen umgesetzt, kumuliert und in den jeweiligen Photodetektoren gespeichert wird. Genauer gesagt umfasst der Bildsensor eine Vielzahl von Photodetektoren, wobei jeder Photodetektor mindestens einen Ladungsintegrierer umfasst, der betriebsfähig ist, um während eines vorherbestimmten Zeitintervalls die Ausgangsphotoladungen, die jeweils in dem mindestens einen Ladungsintegrierer als Reaktion auf die erkannte Fluoreszenzstrahlung generiert werden, selektiv zu integrieren. Entsprechend weist jeder Photodetektor Fähigkeiten zum Abtasten und Integrieren von Photosignalen mit Bezug auf jedes der abgetasteten elektrischen Signale, die in dem mindestens einen der Photodetektoren des Bildsensors generiert werden können, auf. The fluorescence system is operable and configured such that at least a portion of the fluorescent light exiting the fluorophores falls on the image sensor and is converted by it into corresponding photocoads, accumulated, and stored in the respective photodetectors. More particularly, the image sensor comprises a plurality of photodetectors, each photodetector comprising at least one charge integrator operable to selectively integrate, during a predetermined time interval, the output photocharges respectively generated in the at least one charge integrator in response to the detected fluorescence radiation. Accordingly, each photodetector has capabilities for scanning and integrating photosignals with respect to each of the sampled electrical signals that may be generated in the at least one of the photodetectors of the image sensor.

[0070] Der Controller ist derart betriebsfähig mit der Strahlungsquelle und dem Bildsensor gekoppelt, dass er die Emission der Anregungslichtimpulse und die Abtastintervalle der Photodetektoren in zeitgesteuerter Synchronisation ermöglicht, so dass von der erkannten Gesamtfluoreszenz der Anteil der Autofluoreszenz im Vergleich zum Anteil der Markierungsfluoreszenz geringfügig ist. Daraufhin wird Hintergrundrauschen, das ansonsten durch die Autofluoreszenz verursacht würde, zumindest reduziert. The controller is operatively coupled to the radiation source and the image sensor to enable the emission of the excitation light pulses and the sampling intervals of the photodetectors in timed synchronization such that the fraction of autofluorescence of the total fluorescence detected is small compared to the fraction of the marker fluorescence , As a result, background noise that would otherwise be caused by autofluorescence is at least reduced.

[0071] Das Verfahren gemäss den Ausführungsformen der Erfindung kann unter anderem den Schritt der Lichtimpulsemission, die zeitgesteuerte Fluoreszenzdetektion und die wiederholte und gleichzeitige Integration einer Photoladung in allen Photodetektoren umfassen, bis ein ausreichend hoher elektrischer Signalpegel erreicht ist, woraufhin die jeweiligen elektrischen Signale des mindestens einen Ladungsintegrierers zur Weiterverarbeitung ausgelesen werden. Die elektrischen Signale stellen die integrierten Photoladungen dar. The method according to the embodiments of the invention may include, inter alia, the step of light pulse emission, the timed fluorescence detection and the repeated and simultaneous integration of a photo charge in all photodetectors until a sufficiently high electrical signal level is reached, whereupon the respective electrical signals of the at least a charge integrator can be read out for further processing. The electrical signals represent the integrated photo charges.

[0072] Es wird nun Bezug genommen auf Fig. 2. Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung kann ein Fluoreszenzdetektionssystem 100, das betriebsfähig ist, um auf zeitgattergesteuerte bzw. zeitgesteuerte Art und Weise eine Fluoreszenzdetektion zu erkennen, beispielsweise eine Strahlungsquelle 110, die betriebsfähig ist, um Anregungslichtimpulse 112 zu emittieren; ein Schmalband-Erregungsfilter 130; einen dichroitischen Spiegel 140; ein Bildgebungsobjektiv 150; ein Emissionsfilter 160; ein Okular 170; einen Bildsensor 180, der eine Vielzahl von Photodetektoren 185 umfasst, die alle miteinander optisch gekoppelt sein können, wie es nachstehend erläutert wird, und einen Controller 190 umfassen. Das Fluoreszenzdetektionssystem 100 kann ferner einen (nicht gezeigten) Behälter umfassen, der dazu geeignet ist, um einen Prüfkörper 120 aufzunehmen, der Markierungsfluorophore 121 umfassen kann. Referring now to Figure 2, in accordance with one embodiment of the invention, a fluorescence detection system 100 operable to detect fluorescence detection in a time-gated fashion, such as a radiation source 110 that is operable, to emit excitation light pulses 112; a narrow band excitation filter 130; a dichroic mirror 140; an imaging lens 150; an emission filter 160; an eyepiece 170; an image sensor 180 that includes a plurality of photodetectors 185, all of which may be optically coupled to one another, as discussed below, and a controller 190. The fluorescence detection system 100 may further include a container (not shown) adapted to receive a sample 120 that may include labeling fluorophores 121.

[0073] Die Strahlungsquelle 110 kann beispielsweise als einstellbare optische parametrische Oszillator- (OPO) Laser, gepulste Laserdioden, gepulste Leuchtdioden (LED), modengekoppelte oder gütegeschaltete Laser oder als eine andere geeignete Strahlungsquelle, wie sie beispielsweise in der Technik bekannt ist, umgesetzt werden. The radiation source 110 can be implemented, for example, as tunable optical parametric oscillator (OPO) lasers, pulsed laser diodes, pulsed light emitting diodes (LED), mode locked or Q-switched lasers, or as another suitable radiation source, such as known in the art ,

[0074] Die Wellenlänge der Anregungslichtimpulse 112 wird derart ausgewählt, dass mindestens einige der Markierungsfluorophore 121 angeregt werden, um als Reaktion eine Gesamtfluoreszenzstrahlung 114 auszustrahlen, die eine Markierungsfluoreszenz-und eine Autofluoreszenz-Strahlungskomponente umfassen kann. Bei einigen Ausführungsformen kann die Bandbreite der Anregungslichtimpulse 112 die Absorptionsbandbreite der Markierungsfluorophore 121 mindestens teilweise überlagern oder einbeziehen. Um die Bandbreite der Anregungslichtimpulse 112 derart zu reduzieren, dass sie die Absorptionsbandbreite aus den Anregungslichtimpulsen 112 um mindestens 50 % ausschliesst, kann das Anregungsfilter 130 beispielsweise zwischen der Strahlungsquelle 110 und dem dichroitischen Spiegel 140 verwendet werden. Dies könnte beispielsweise notwendig sein, wenn gepulste LEDs als Strahlungsquellen verwendet werden. The wavelength of the excitation light pulses 112 is selected such that at least some of the marker fluorophores 121 are excited to emit in response a total fluorescence radiation 114 that may include a marker fluorescence and an autofluorescent radiation component. In some embodiments, the bandwidth of the excitation light pulses 112 may at least partially overlay or include the absorption bandwidth of the marker fluorophores 121. In order to reduce the bandwidth of the excitation light pulses 112 so as to exclude the absorption bandwidth from the excitation light pulses 112 by at least 50%, the excitation filter 130 may be used, for example, between the radiation source 110 and the dichroic mirror 140. This might be necessary, for example, if pulsed LEDs are used as radiation sources.

[0075] Ferner können die Anregungslichtimpulse 112, die von der Strahlungsquelle 110 emittiert werden, eine Impulsabklingzeit aufweisen, die kürzer ist als die charakteristische Abklingzeit der emittierten Markierungsfluoreszenzstrahlung, die als Reaktion auf einfallende Anregungslichtimpulse 112 aus den Markierungsfluorophoren 121 angeregt wird, so dass der Lichtimpuls nach einem gewissen Zeitraum die Markierungsfluoreszenz-Strahlungskomponente der Gesamtfluoreszenzstrahlung 114 nicht stören kann. Dadurch wird diese messbar und von den Anregungslichtimpulsen 112 unterscheidbar. Further, the excitation light pulses 112 emitted from the radiation source 110 may have a pulse decay time that is shorter than the characteristic decay time of the emitted marker fluorescence radiation that is excited from the marker fluorophores 121 in response to incident excitation light pulses 112 such that the light pulse after a certain period of time, the marking fluorescence radiation component of the total fluorescence radiation 114 can not interfere. This makes them measurable and distinguishable from the excitation light pulses 112.

[0076] Je nach den charakteristischen Abklingzeiten der Markierungsfluorophore 121. kann die notwendige Dauer der Anregungslichtimpulse 112 beispielsweise von 10 Pikosekunden bis 1 Mikrosekunde reichen. Depending on the characteristic decay times of the marking fluorophores 121, the necessary duration of the excitation light pulses 112 can range, for example, from 10 picoseconds to 1 microsecond.

[0077] Das Anregungsfilter 130 kann im Verhältnis zur Ausbreitungsrichtung der Anregungslichtimpulse 112, die von der Strahlungsquelle 110 emittiert werden, zwischen der Strahlungsquelle 110 und dem dichroitischen Spiegel 140 positioniert sein. Ferner kann das Bildgebungsobjektiv 150 im Verhältnis zur Ausbreitungsrichtung der Anregungslichtimpulse 112 zwischen dem (nicht gezeigten) Behälter und dem dichroitischen Spiegel 140 positioniert sein. Mit anderen Worten kann die Strahlungsquelle 110 optisch mit dem dichroitischen Spiegel 140 derart gekoppelt sein, dass der dichroitische Spiegel 140 die emittierten Anregungslichtimpulse 112 in Richtung auf das Bildgebungsobjektiv 150 ablenkt; und das Bildgebungsobjektiv 150 kann mit dem (nicht gezeigten) Behälter derart optisch gekoppelt sein, dass Anregungslichtimpulse 112, die das Bildgebungsobjektiv 150 verlassen, auf den (nicht gezeigten) Behälter einfallen, der einen Prüfkörper 120 enthalten kann, der Markierungsfluorophore 121 umfasst. The excitation filter 130 may be positioned between the radiation source 110 and the dichroic mirror 140 in proportion to the propagation direction of the excitation light pulses 112 emitted from the radiation source 110. Further, the imaging lens 150 may be positioned between the container (not shown) and the dichroic mirror 140 in proportion to the direction of propagation of the excitation light pulses 112. In other words, the radiation source 110 may be optically coupled to the dichroic mirror 140 such that the dichroic mirror 140 deflects the emitted excitation light pulses 112 toward the imaging objective 150; and the imaging objective 150 may be optically coupled to the container (not shown) such that excitation light pulses 112 exiting the imaging objective 150 are incident on the container (not shown), which may include a specimen 120 comprising marking fluorophores 121.

[0078] Anregungslichtimpulse 112, die auf Markierungsfluorophore einfallen, haben eine Stärke und eine spektrale Bandbreite, welche die Anregung der Markierungsfluorophore 121 verursachen, d.h. die Markierungsfluorophore 121 können als Reaktion auf einfallende Anregungslichtimpulse 112 ausgelöst werden, um eine Markierungsfluoreszenzstrahlung zu emittieren. Wie hier jedoch erläutert, können die Anregungslichtimpulse 112 auch die Anregung von Autofluorophoren auslösen, deren Summe hier als «Gesamtfluoreszenzstrahlung» bezeichnet wird. Die Gesamtfluoreszenzstrahlung 114 wird von dem Bildgebungsobjektiv 150 und dem dichroitischen Spiegel 140 gesammelt und verbreitet sich durch diese hindurch. Der dichroitische Spiegel 140 kann eine Grenzwellenlänge aufweisen, welche die Übertragung einer Markierungsfluoreszenzstrahlung, die von den Markierungsfluorophoren 121 emittiert werden kann, erlaubt, dabei aber die Anregungsstrahlung oder Hintergrundstrahlung anderer Wellenlängen absorbiert. Excitation light pulses 112 incident on labeling fluorophores have a magnitude and spectral bandwidth which cause excitation of the labeling fluorophores 121, i. E. the marker fluorophores 121 may be triggered in response to incident excitation light pulses 112 to emit a marker fluorescence radiation. However, as explained herein, the excitation light pulses 112 may also trigger the excitation of autofluorophores, the sum of which is referred to herein as "total fluorescence radiation." The total fluorescence radiation 114 is collected by the imaging lens 150 and the dichroic mirror 140 and propagates therethrough. The dichroic mirror 140 may have a cut-off wavelength that allows the transmission of a marker fluorescent radiation that can be emitted from the marker fluorophores 121, but absorbs the excitation radiation or background radiation of other wavelengths.

[0079] Nach einigen Ausführungsformen der Erfindung kann das Fluoreszenzdetektionssystem 100 betriebsfähig sein, um die Gesamtfluoreszenzstrahlung 114, die durch den dichroitischen Spiegel 140 hindurch übertragen wird, beispielsweise unter Verwendung eines Emissionsfilters 160, das im Verhältnis zur Ausbreitungsrichtung der Gesamtfluoreszenzstrahlung 114 unterhalb des dichroitischen Spiegels 140 positioniert ist, weiter spektral einschränken, wobei das Emissionsfilter 160 entsprechend geeignete spektrale Bandbreitenfiltereigenschaften aufweist. According to some embodiments of the invention, the fluorescence detection system 100 may be operable to control the total fluorescence radiation 114 transmitted through the dichroic mirror 140, for example using an emission filter 160 that is proportional to the propagation direction of the total fluorescence radiation 114 below the dichroic mirror 140 is positioned, further spectrally restricting, wherein the emission filter 160 has correspondingly suitable spectral bandwidth filter characteristics.

[0080] Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung kann das Okular 170 unterhalb des dichroitischen Spiegels 140 oder, wenn es auf das Emissionsfilter 160 angewendet wird, im Verhältnis zur Ausbreitungsrichtung der Gesamtfluoreszenzstrahlung 114, d.h. zwischen dem Bildsensor 180 und dem dichroitischen Spiegel 140 oder dem Emissionsfilter 160, positioniert sein, so dass die Gesamtfluoreszenzstrahlung 114 dann von dem Okular 170 geführt werden kann, um auf die Oberfläche des Bildsensors 180 einzufallen. According to one embodiment of the invention, the eyepiece 170 may be positioned below the dichroic mirror 140 or, when applied to the emission filter 160, in proportion to the propagation direction of the total fluorescence radiation 114, i. between the image sensor 180 and the dichroic mirror 140 or the emission filter 160, so that the total fluorescent radiation 114 can then be guided by the eyepiece 170 to be incident on the surface of the image sensor 180.

[0081] Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung kann das Fluoreszenzdetektionssystem 100 derart betriebsfähig sein, dass mindestens ein Teil der Autofluoreszenzstrahlung (die z.B. von der Oberfläche des Behälters und/oder des Prüfkörpers 120 ausgeht), die durch die Anregungslichtimpulse 112 angeregt wird, eventuell nicht auf den Bildsensor 180 einfällt, d.h. davon ausgeschlossen wird, auf dem Bildsensor 180 abgebildet zu werden, um die negativen Auswirkungen, die durch die Autofluoreszenzstrahlung verursacht werden, mindestens zu reduzieren. Zum Beispiel bei Ausführungsformen, bei denen das Fluoreszenzdetektionssystem 100 das Bildgebungsobjektiv 150 und/oder das Okular 170 umfasst, können sie beispielsweise im Verhältnis zu dem (nicht gezeigten) Behälter derart konfiguriert und positioniert sein, dass mindestens ein Teil der Autofluoreszenzstrahlung, die angeregt werden kann, von dem Bildgebungsobjektiv 150 und/oder dem Okular 170 als nicht abgebildet übrig bleibt. Genauer gesagt kann eine Reduzierung des abgebildeten Teils der Autofluoreszenzstrahlung bei einigen Ausführungsformen ausgebildet sein, indem beispielsweise eine konfokale Multispot-Scaneinrichtung verwendet wird und/oder indem eine optische Weitfeldabbildungseinrichtung verwendet wird, die eine grosse nummerische Apertur, beispielsweise von mehr als 0,2, aufweist. In some embodiments of the invention, the fluorescence detection system 100 may be operable such that at least a portion of the autofluorescence radiation (eg, emanating from the surface of the container and / or the specimen 120) that is excited by the excitation light pulses 112 may not be present the image sensor 180 is incident, ie being at least imaged on the image sensor 180 to at least reduce the negative effects caused by the autofluorescence radiation. For example, in embodiments where the fluorescence detection system 100 includes the imaging lens 150 and / or the eyepiece 170, they may be configured and positioned, for example relative to the container (not shown), such that at least a portion of the autofluorescence radiation that can be excited of the imaging lens 150 and / or the eyepiece 170 remains as not shown. More specifically, in some embodiments, a reduction in the imaged portion of the autofluorescence radiation may be accomplished using, for example, a multi-spot confocal scanning device and / or employing a wide-field optical imaging device having a large numerical aperture, for example greater than 0.2 ,

[0082] Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Bildsensor 180 eine Vielzahl von Photodetektoren 185, die mindestens einen (nicht gezeigten) Ladungsintegrierer umfassen. Jeder Photodetektor 185 weist im Verhältnis zur Emission der Anregungslichtimpulse 112 eine zeitgesteuerte Betriebsfähigkeit auf. Ferner ist jeder Photodetektor 185 betriebsfähig, um während eines vorherbestimmten Zeitintervalls (nicht gezeigte) Photoladungen zu integrieren, die als Reaktion auf die Gesamtfluoreszenzstrahlung 114 generiert werden, die von den Photodetektoren 185 erkannt wird. Mit anderen Worten weist der Bildsensor 180 mit Bezug auf lokal generierte Photoladungen, die von den Photodetektoren 185 generiert werden, Integrationsfähigkeiten auf. According to one embodiment of the invention, the image sensor 180 comprises a plurality of photodetectors 185 comprising at least one charge integrator (not shown). Each photodetector 185 has a timed operational capability relative to the emission of the excitation light pulses 112. Further, each photodetector 185 is operable to integrate, during a predetermined time interval, photo-charges (not shown) generated in response to the total fluorescence radiation 114 detected by the photodetectors 185. In other words, the image sensor 180 has integrating capabilities with respect to locally generated photocoads generated by the photodetectors 185.

[0083] Bei einigen Ausführungsformen kann jeder Photodetektor 185 betriebsfähig sein, um eine Vielzahl von Abtastschritten während des vorherbestimmten Zeitintervalls auszuführen und um die Photoladungen bezüglich der verschiedenen Abtastschritte in den entsprechenden Ladungsintegrierern zu integrieren. Die Abtastintervalle, die der Bildsensor 180 erreichen kann, können bei einigen Ausführungsformen geringer sein als die Abklingzeit der Markierungsfluorophore 121. Entsprechend kann der Bildsensor 180 betriebsfähig sein, um eine Markierungsfluoreszenz bezüglich der Markierungsfluorophore 121 abzubilden, die unterschiedliche Abklingzeiten für die Markierungsfluoreszenzstrahlung aufweisen. Ferner kann die Markierungsfluoreszenzstrahlung der gleichen Markierungsfluorophore 121 mindestens zweimal während der Abklingzeit der Markierungsfluoreszenzstrahlung abgetastet werden. In some embodiments, each photodetector 185 may be operable to perform a plurality of sampling steps during the predetermined time interval and to integrate the photocharge with respect to the various sampling steps in the respective charge integrators. The sampling intervals that the image sensor 180 may reach may, in some embodiments, be less than the cooldown of the marker fluorophores 121. Accordingly, the image sensor 180 may be operable to image a marker fluorescence with respect to the marker fluorophores 121 having different cooldowns for the marker fluorescence radiation. Furthermore, the marking fluorescence radiation of the same marking fluorophores 121 may be scanned at least twice during the decay time of the marking fluorescence radiation.

[0084] Der Bildsensor 180 kann beispielsweise umgesetzt werden, wie es in dem US-Patent Nr. 5 856 667 im Namen von Seitz et al., mit dem Titel «Device and method for the detection and demodulation of an intensity-modulated radiation field» (667), beispielsweise mit Bezug auf den Abschnitt mit dem Titel «Kurzdarstellung der Erfindung», Fig. 2, Fig. 3, und die Ansprüche offenbart wird. Die Umsetzung des Bildsensors 180 gemäss 667 ermöglicht Abtastintervalle z.B. von gleich oder weniger als 10 Nanosekunden bei Ansteuerspannungen von gleich oder weniger als 5 V. For example, the image sensor 180 may be implemented as described in U.S. Patent No. 5,856,667, in the name of Seitz et al., Entitled "Device and method for the detection and demodulation of an intensity-modulated radiation field "(667), for example, with reference to the section entitled" Summary of the Invention ", Figs. 2, 3, and the claims are disclosed. The implementation of the image sensor 180 according to 667 allows sampling intervals e.g. equal to or less than 10 nanoseconds at drive voltages equal to or less than 5 V.

[0085] Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung kann der Bildsensor 180 beispielsweise umgesetzt werden, wie es in der europäischen Patentanmeldung Nr. 2 182 523 (523) im Namen von P. Seitz, mit dem Titel «Charge sampling device and method», z.B. in dem Abschnitt mit dem Titel «Kurzdarstellung der Erfindung», «Beschreibung der Figuren», «Ausführliche Beschreibung der Zeichnung», den «Ansprüchen», in Verbindung mit den entsprechenden Figuren offenbart wird. Ausführungsformen des Bildsensors 180, die wie in 523 erläutert umgesetzt werden, können betriebsfähig sein, um Zeitabtastintervalle z.B. von weniger als 1 Nanosekunde zu erreichen, was im Allgemeinen geringer ist als die Abklingzeit der Markierungsfluoreszenzstrahlung. For example, in some embodiments of the invention, image sensor 180 may be implemented as described in European Patent Application No. 2,182,523 (523) in the name of P. Seitz, entitled "Charge Sampling Device and Method", e.g. in the section entitled "Summary of the invention", "Description of the figures", "Detailed description of the drawing", the "claims", in conjunction with the corresponding figures. Embodiments of the image sensor 180 that are implemented as illustrated in FIG. 523 may be operable to provide time sampling intervals, e.g. of less than 1 nanosecond, which is generally less than the cooldown of the tag fluorescence radiation.

[0086] Bei einigen Ausführungsformen kann der Bildsensor 180 als Komplementär-Metalloxid-Halbleiter- (CMOS) Bildsensor umgesetzt sein, bei dem alle (nicht gezeigten) Rücksetztransistoren der individuellen Photodetektoren 185 von einem (nicht gezeigten) gemeinsamen Rücksetzsignal gesteuert werden. Solange dieses Rücksetzsignal die Rücksetztransistoren offen hält, werden die Photoladungen, die sich aus dem erkannten Licht ergeben, gleichzeitig abgeleitet. Erst wenn die Rücksetztransistoren ausgeschaltet sind, werden die Photodetektoren 185 lichtempfindlich und beginnen die Expositionsperiode. Dadurch dass das Rücksetzsignal zum selektiven Öffnen und Schliessen der Rücksetztransistoren gesteuert wird, sind die Photodetektoren 185 in zeitgesteuerter Synchronität, die notwendig ist, um eine zeitgesteuerte Funktionalität des Fluoreszenzdetektionssystems 100 gemäss den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen, betriebsfähig. In some embodiments, the image sensor 180 may be implemented as a Complementary Metal Oxide Semiconductor (CMOS) image sensor in which all reset transistors (not shown) of the individual photodetectors 185 are controlled by a common reset signal (not shown). As long as this reset signal keeps the reset transistors open, the photocurrent resulting from the detected light will be dissipated simultaneously. Only when the reset transistors are turned off, the photodetectors 185 become photosensitive and begin the exposure period. By controlling the reset signal to selectively open and close the reset transistors, the timed synchronous photodetectors 185 necessary to enable timed functionality of the fluorescence detection system 100 according to embodiments of the present invention are operable.

[0087] Bei Ausführungsformen der Erfindung kann die Empfindlichkeit des Bildsensors 180 beispielsweise umgesetzt werden, wie es in der europäischen Patentanmeldung Nr. EP2 160 012 (012) im Namen von Lotto et al., mit dem Titel «Highly sensitive Single photon imaging device», z.B. in die Abschnitten mit dem Titel «Beschreibung der Figuren» ausser Fig. 1, «Kurzdarstellung einiger Ausführungsformen der Erfindung», «Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung», «Ansprüche», «Geänderte Ansprüche...» und in den entsprechenden Figuren offenbart wird. Entsprechend kann der Bildsensor 180, der auf der CMOS-Technologie basiert, wie beispielsweise zuvor erläutert, ferner verstärkt werden, indem man eine pixelinterne Verstärkungsschaltung verwendet. Eine derartige Verstärkungsschaltung umgeht die Notwendigkeit der Verwendung erhöhter Spannungen, wie es bei Photodetektoren 185 der Fall ist, die auf der Basis der Nutzung eines die Photoladung multiplizierenden Lawineneffekts funktionieren. Das Ausleserauschen des Bildsensors 180, den man als «pixelverstärkten Halbleiterbildsensor» bezeichnen kann, wenn er wie in 012 erläutert umgesetzt ist, kann bei Raumtemperatur, die beispielsweise von 20 °C bis 30 °C reicht, gleich oder kleiner als beispielsweise 1 Elektronen-Effektivwert (r.m.s.) sein. Da die Photodetektoren 185 des Bildsensors 180 umgesetzt werden, wie in 012 offenbart, einen lokalen Rücksetztransistor verwenden, kann ein derartiger pixelverstärkter Halbleiterbildsensor für die Ausbildung eines hoch empfindlichen Fluoreszenzdetektionssystems 100 verwendet werden, das in zeitgesteuerter Synchronität gemäss den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betriebsfähig ist. In embodiments of the invention, the sensitivity of the image sensor 180 can be implemented, for example, as described in European Patent Application No. EP2 160 012 (012) in the name of Lotto et al., Entitled "Highly sensitive single photon imaging device". , eg in the sections entitled "Description of the figures" except Fig. 1, "Brief description of some embodiments of the invention", "Description of the embodiments of the invention", "Claims", "Amended claims ..." and in the corresponding figures , Accordingly, the image sensor 180 based on the CMOS technology, as explained above, for example, can be further amplified by using a pixel-in-pixel amplifying circuit. Such a gain circuit obviates the need for using increased voltages, as is the case with photodetectors 185, which operate based on the use of an avalanche effect multiplying the photocharge. The readout noise of the image sensor 180, which may be referred to as a "pixel-enhanced solid-state image sensor" when implemented as illustrated in Fig. 012, may be equal to or less than, for example, 1 electron RMS at room temperature, for example, from 20 ° C to 30 ° C to be (rms). Because the photodetectors 185 of the image sensor 180 are converted, as disclosed in 012, using a local reset transistor, such a pixel enhanced solid state image sensor can be used to form a high sensitivity fluorescence detection system 100 that is operable in timed synchrony according to embodiments of the present invention.

[0088] Die zeitgesteuerten Betriebsfähigkeiten des Fluoreszenzdetektionssystems 100 gemäss den Ausführungsformen der Erfindung werden hier nachstehend ausführlicher erläutert. The timed operating capabilities of the fluorescence detection system 100 according to the embodiments of the invention will be explained in more detail hereinafter.

[0089] Die Photodetektoren 185 des Bildsensors 180 und der Strahlungsquelle 110 sind miteinander mit dem Controller 190 betriebsfähig gekoppelt, so dass dieser die Photodetektoren 185 und Strahlungsquelle 110 in zeitgesteuerter (oder mit anderen Worten zeitaufgelöster) Synchronität betreiben kann. Genauer gesagt ist der Controller 190 betriebsfähig, um den Betrieb zwischen der-Strahlungsquelle 110 und dem Bildsensor 180 zu synchronisieren, so dass es ein Zeitgatter zwischen der Emission von Anregungslichtimpulsen 112 und dem Beginn der Sequenz des Integrierens und Auslesens der Photoladungen gibt. Mit anderen Worten wird der Startpunkt der Expositionsperiode, während der die Detektion von Photonen ermöglicht ist, in zeitgesteuerter Synchronität mit dem Einleiten der Emission eines Anregungslichtimpulses 112 synchronisiert, d.h. der Controller 190 verwendet eine Gatterverzögerung zwischen jeder Einleitung der Emission eines Anregungslichtimpulses 112 und dem Beginn der Expositionsperiode (Integrationsperiode) der Photodetektoren 185. Diese Gatterverzögerung wird derart gemäss der Abklingzeit der Autofluoreszenz ausgewählt, dass das Verhältnis zwischen Markierungsfluoreszenz und Autofluoreszenz hoch genug ist, um eine zuverlässige Detektion der Markierungsfluoreszenz zu ermöglichen, wobei das Verhältnis einen der Werte aufweist, wie sie beispielsweise in der US-Patentanmeldung Nr. US2008/0265177 im Namen von Connally et al., mit dem Titel «Fluorescence detection» (177), in dem Abschnitt mit dem Titel «Kurzdarstellung der Erfindung» offenbart werden. Die Gatterverzögerung kann beispielsweise gemäss der Gatterverzögerung ausgewählt werden, die in dem Abschnitt mit dem Titel «Kurzdarstellung der Erfindung» bei ’177 offenbart wird. Auf jeden Fall wird die Gatterverzögerung gemäss den Abklingeigenschaften des Autofluorophors und des Markierungsfluorophors ausgewählt. The photodetectors 185 of the image sensor 180 and the radiation source 110 are operatively coupled together to the controller 190 so that they can operate the photodetectors 185 and radiation source 110 in timed (or in other words time-resolved) synchronicity. More specifically, the controller 190 is operable to synchronize the operation between the radiation source 110 and the image sensor 180 such that there is a timing gate between the emission of excitation light pulses 112 and the beginning of the sequence of integrating and reading the photo-charges. In other words, the starting point of the exposure period during which the detection of photons is enabled is synchronized in timed synchronism with the initiation of the emission of an excitation light pulse 112, i. the controller 190 uses a gate delay between each initiation of the emission of an excitation light pulse 112 and the beginning of the exposure period (integration period) of the photodetectors 185. This gate delay is selected according to the cooldown of autofluorescence such that the ratio between labeling fluorescence and autofluorescence is high enough to provide a permitting reliable detection of the label fluorescence, the ratio having one of the values set forth, for example, in U.S. Patent Application No. US2008 / 0265177 in the name of Connally et al., entitled "Fluorescence detection" (177) entitled "Brief Description of the Invention". For example, the gate delay may be selected according to the gate delay disclosed in the section titled "Summary of the Invention" at '177. In any case, the gate delay is selected according to the decay characteristics of the autofluorophore and the labeling fluorophore.

[0090] Entsprechend kann der Controller 190 einen (nicht gezeigten) Speicher, der (nicht gezeigte) Anweisungen speichert, und einen (nicht gezeigten) Prozessor umfassen, wobei die Ausführung der Anweisungen durch den Prozessor zu einer Fluoreszenzdetektionsanwendung führt, die den zeitgesteuerten synchronisierten Betrieb zwischen der Strahlungsquelle 110 und den Photodetektoren 185 ermöglicht. Correspondingly, the controller 190 may include a memory (not shown) storing instructions (not shown) and a processor (not shown), wherein execution of the instructions by the processor results in a fluorescence detection application having the timed synchronized operation between the radiation source 110 and the photodetectors 185.

[0091] Zusätzlich mit Bezug auf Fig. 3kann diese Fluoreszenzanwendung gemäss einer Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Fluoreszenzdetektion, beispielsweise durch Ausführen der folgenden Schritte, umsetzen: [0091] In addition, referring to Figure 3, this fluorescence application according to one embodiment of the invention can implement a method of fluorescence detection, for example by performing the following steps:

[0092] Wie in Block 300 angegeben, kann das Verfahren den Schritt des Abreicherns der Photodetektoren 185 umfassen. Daraufhin werden Photoladungen, die in den Photodetektoren 185 generiert und zuvor gespeichert worden sein können, aus diesen entfernt. As indicated in block 300, the method may include the step of depleting the photodetectors 185. Thereupon, photocurrents which may have been generated in the photodetectors 185 and previously stored may be removed therefrom.

[0093] Wie in Block 302 angegeben, kann das Verfahren dann den Schritt des Einstellens der Photodetektoren 185 auf einen Nicht-Detektionsmodus umfassen, was dazu führt, dass die Photodetektoren 185 alle Photoladungen ableiten, die durch einfallende Photonen erstellt werden. As indicated in block 302, the method may then include the step of adjusting the photodetectors 185 to a non-detection mode, causing the photodetectors 185 to derive all of the photo-charges created by incident photons.

[0094] Wie in Block 304 angegeben, kann das Verfahren die Emission eines ersten Anregungslichtimpulses vorherbestimmter Länge und spektraler Wellenlänge umfassen, z.B. durch Einschalten der Strahlungsquelle 110. Die Emission eines ersten Anregungsimpulses kann derart gerichtet sein, dass der Prüfkörper 120 durch den ersten Anregungslichtimpuls beleuchtet wird. Angesichts der Tatsache, dass die Dauer des ersten Anregungslichtimpulses vorherbestimmt und somit bekannt ist, ist die Beleuchtungsperiode, während der der Prüfkörper 120 beleuchtet wird, ebenfalls bekannter Dauer. As indicated in block 304, the method may include the emission of a first excitation light pulse of predetermined length and spectral wavelength, e.g. by switching on the radiation source 110. The emission of a first excitation pulse may be directed such that the specimen 120 is illuminated by the first excitation light pulse. In view of the fact that the duration of the first excitation light pulse is predetermined and thus known, the illumination period during which the specimen 120 is illuminated is also known duration.

[0095] Wie in Block angegeben 304, kann das Verfahren dann nach dem Ablaufen einer vorherbestimmten Gatterverzögerung, die am Ende der Beleuchtungsperiode beginnen kann, den Schritt des Einstellens der Photodetektoren 185 auf den Detektionsmodus während einer vorherbestimmten Photonenexpositionsperiode umfassen. Die Gatterverzögerung wird derart ausgewählt, dass die Autofluoreszenzstrahlung auf ausreichend niedrige Pegel abklingt, welche die zuverlässige Detektion der Markierungsautofluoreszenz ermöglichen. Die Gatterverzögerung kann beispielsweise derart ausgewählt werden, dass die Autofluoreszenzstrahlung, die in der Gesamtfluoreszenzstrahlung vorliegen könnte, auf gleich oder weniger als einen der folgenden Prozentwerte ihrer ursprünglichen Stärke abklingt: 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, oder gleich oder weniger als 0,01%. Während der vorherbestimmten Expositionsperiode integrieren, d.h. kumulieren und speichern, die Photodetektoren 185 des Bildsensors 180 die lokal generierten Photoladungen lokal in mindestens einem (nicht gezeigten) Ladungsintegrierer, der in jedem der Photodetektoren 185 enthalten ist. Bei Ausführungsformen, bei denen jeder Photodetektor 185 eine Vielzahl von Ladungsintegrierern umfasst, können Photoladungen, die während der Expositionsperiode generiert wurden, während jeweiligen Abtastperioden abgetastet und mit Bezug auf jede Abtastperiode sequenziell auf die Vielzahl von Ladungsintegrierern zur Integration gerichtet werden. Der Controller 190 kann das Abtasten der Photoladungen und ihre Integration in die Vielzahl von Ladungsintegrierern mit Bezug auf die Vielzahl von Abtastperioden steuern. As indicated in block 304, after the passage of a predetermined gate delay, which may begin at the end of the lighting period, the method may then include the step of adjusting the photodetectors 185 to the detection mode during a predetermined photon exposure period. The gate delay is selected such that the autofluorescence radiation decays to sufficiently low levels that enable reliable detection of the marker autofluorescence. For example, the gate delay may be selected such that the autofluorescence radiation that might be present in the total fluorescence radiation fades to less than or equal to one of the following percentages of its original strength: 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%. , 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, or equal to or less than 0, 01%. Integrate during the predetermined exposure period, i. The photodetectors 185 of the image sensor 180 locally accumulate and store the locally generated photocoads in at least one charge integrator (not shown) included in each of the photodetectors 185. In embodiments in which each photodetector 185 comprises a plurality of charge integrators, photocurrents generated during the exposure period may be sampled during respective sampling periods and sequentially directed to the plurality of charge integrators for integration with respect to each sampling period. The controller 190 may control the scanning of the photo-charges and their integration into the plurality of charge integrators with respect to the plurality of sampling periods.

[0096] Wie in Block 306 angegeben, kann das Verfahren dann das Zurücksetzen der Photodetektoren 185 in den Nicht-Detektionsmodus umfassen. As indicated in block 306, the method may then include resetting the photodetectors 185 to the non-detection mode.

[0097] Wie in Block 308 angegeben, kann das Verfahren ferner den Schritt des Bestimmens, ob mindestens ein Beendigungskriterium erfüllt ist, umfassen, und wenn nicht, die Schritte 300 bis 306 wiederholen, bis mindestens ein Beendigungskriterium erfüllt ist. Dieses Beendigungskriterium kann beispielsweise einen minimalen, vorherbestimmten Ladesignalschwellenpegel definieren, wobei das Ladesignal die Photonen darstellt, die von dem Bildsensor 180 erkannt werden und in Photoladungen umgesetzt werden. Wenn das generierte Ladesignal den vorherbestimmten Lagesignalschwellenpegel übersteigt, ist das Beendigungskriterium erfüllt. As indicated in block 308, the method may further comprise the step of determining whether at least one termination criteria is met, and if not, repeating steps 300-306 until at least one termination criterion is met. For example, this termination criteria may define a minimum predetermined charging signal threshold level, wherein the charging signal represents the photons detected by the image sensor 180 and converted into photo-charges. When the generated charging signal exceeds the predetermined position signal threshold level, the termination criterion is satisfied.

[0098] Alternativ kann das Beendigungskriterium beispielsweise die Anzahl der Anregungslichtimpulse 112 betreffen, die von der Strahlungsquelle 110 emittiert werden, d.h. bei einigen Ausführungsformen der Erfindung kann die Anzahl der Anregungslichtimpulse 112, die von der Strahlungsquelle 110 emittiert werden, vorherbestimmt werden. Wie oft die Photodetektoren 185 für eine vorherbestimmte Expositionsperiode auf den Detektionsmodus eingestellt werden, kann somit ebenfalls entsprechend vorherbestimmt werden. Zusätzlich oder alternativ kann das Beendigungskriterium ein Zeitlimit für den Betrieb der Strahlungsquelle 110, des Bildsensors 180 und/oder der Strahlungsquelle 110 definieren. Alternatively, the termination criterion may, for example, relate to the number of excitation light pulses 112 emitted by the radiation source 110, i. In some embodiments of the invention, the number of excitation light pulses 112 emitted by the radiation source 110 may be predetermined. The number of times the photodetectors 185 are set to the detection mode for a predetermined exposure period can thus also be predetermined accordingly. Additionally or alternatively, the termination criterion may define a time limit for the operation of the radiation source 110, the image sensor 180, and / or the radiation source 110.

[0099] Wenn, wie in Block 310 angegeben, das mindestens eine Beendigungskriterium erfüllt ist, umfasst das Verfahren den Schritt des Auslesens der kumulierten Photoladungen. When, as indicated in block 310, the at least one termination criterion is met, the method includes the step of reading the accumulated photocarried charges.

[0100] Wie in Block 312 angegeben, kann das Verfahren dann den Schritt des Ausführens einer Analyse des Prüfkörpers 120 basierend auf den ausgelesenen Photoladungen umfassen. As indicated in block 312, the method may then include the step of performing an analysis of the specimen 120 based on the read photovoltaic charges.

[0101] Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung kann die Strahlungsquelle 110 von dem Controller 190 gesteuert werden, beispielsweise wenn die Strahlungsquelle 110 z.B. durch eine gepulste LED oder Laserdiode umgesetzt wird. Bei alternativen Ausführungsformen der Erfindung ist die Strahlungsquelle 110 von dem Controller 190 eventuell nicht steuerbar, beispielsweise wenn die Strahlungsquelle 110 z.B. durch einen modengekoppelten Laser umgesetzt wird. In diesem Fall kann der Controller 190 zusammen mit einem (nicht gezeigten) Impulsdetektor, der betriebsfähig ist, um die Emission von Anregungslichtimpulsen 112 beispielsweise unter Verwendung eines schnellen Photosensors, auf dessen lichtempfindlicher Oberfläche mindestens ein Teil der emittierten Anregungslichtimpulse 112 auftrifft, zu erkennen, betriebsfähig sein. In some embodiments of the invention, the radiation source 110 may be controlled by the controller 190, for example when the radiation source 110 is e.g. is implemented by a pulsed LED or laser diode. In alternative embodiments of the invention, the radiation source 110 may not be controllable by the controller 190, for example if the radiation source 110 is e.g. is implemented by a mode-locked laser. In this case, the controller 190 may be operable in conjunction with a pulse detector (not shown) operable to detect the emission of excitation light pulses 112 using, for example, a fast photosensor on the photosensitive surface of which at least a portion of the emitted excitation light pulses 112 are incident be.

[0102] Das Verfahren zur Fluoreszenzdetektion kann mit demjenigen identisch sein, das zuvor mit Bezug auf Fig. 3 erläutert wurde, ausser dass die Zeitgatterverzögerung beginnt, sobald z.B. durch den Controller 190 zum ersten Mal bestimmt wird, dass der Teil des Anregungslichtimpulses 112, der auf den Impulsdetektor trifft, einen vorherbestimmten Impulsschwellenpegel überschreitet, und nicht mit der Ausgabe eines Befehls durch den Controller 190 an die Strahlungsquelle 110, Anregungslichtimpulse 112 zu emittieren. The method of fluorescence detection may be identical to that previously discussed with reference to Fig. 3, except that the timing gate delay begins as soon as e.g. is determined by the controller 190 for the first time that the portion of the excitation light pulse 112 impinging on the pulse detector exceeds a predetermined threshold pulse level, and not with the issuance of a command by the controller 190 to the radiation source 110 to emit excitation light pulses 112.

[0103] Es sei zu beachten, dass obwohl sich der Begriff «Zeitgatterverzögerung», wie er hier verwendet wird, auf die Periode bezieht, die nach dem Ablaufen der Dauer jedes der Anregungsimpulse und/oder sobald der Teil der Anregungslichtimpulse 112 einen vorherbestimmten Impulsschwellenpegel überschreitet, beginnt, dies keineswegs als Einschränkung zu deuten ist. Bei einigen Ausführungsformen kann die Zeitgatterverzögerung beispielsweise nach dem Ausgeben eines Befehls zum Starten des Betriebs der Strahlungsquelle 110 beginnen. In diesem Fall kann die Zeitgatterverzögerung auch die Impulsdauer der jeweiligen Anregungslichtimpulse 112 umfassen. It should be noted that although the term "timing gate delay" as used herein refers to the period that elapses after the duration of each of the excitation pulses and / or as soon as the portion of excitation light pulses 112 exceeds a predetermined threshold pulse level , begins, this is by no means to be interpreted as a limitation. For example, in some embodiments, the timing gate delay may begin after issuing a command to start the operation of the radiation source 110. In this case, the timing gate delay may also include the pulse duration of the respective excitation light pulses 112.

Claims

A fluorescence detection system (100) operable to detect fluorescence radiation in timed synchronicity, the system comprising: an image sensor (180) operable to detect fluorescence radiation; wherein the image sensor (180) comprises a plurality of photodetectors (185), each photodetector (185) operable to convert a detected fluorescence radiation into a corresponding number of output charges; characterized in that each of the plurality of photodetectors (185) comprises at least one charge integrator operable to selectively integrate, during a predetermined time interval, the output photocharges generated in response to the detected fluorescence radiation.

2. Fluorescence detection system (100) according to claim 1, comprising: a plurality of electrical drift field generators operably coupled to the plurality of pixel sensors, respectively, wherein the plurality of electrical drift field generators are operable selectively to selectively supply the output charges provided by each of the photodetectors to the at least one charge integrator transfer.

The fluorescence detection system (100) of claim 1 or 2, wherein each of the plurality of photodetectors comprises an amplifier operable to amplify the signal representative of the output photocharges generated in response to the detected fluorescence radiation.

The fluorescence detection system (100) of claim 3, wherein the amplifier is a loop amplifier.

5. Fluorescence detection system according to one of the preceding claims, comprising: a radiation source (110) operable to emit a sequence of excitation light pulses having respective periods of illumination; and a controller (190); wherein the photodetectors (185), the radiation source (110) and the controller (190) are operably coupled together; wherein the photodetectors (185) are selectively operable in a detection mode in which fluorescence-induced photocarriers are stored and integrated, and in a non-detection mode in which fluorescence-induced photocarriers are discarded; wherein the controller (190) is operable to selectively alternate between the detection mode and the non-detection mode of the photodetectors in timed synchronism with the radiation source (110).

6. fluorescence detection system (100) according to any one of the preceding claims, wherein each of the photodetectors comprises a photosensitive member for converting photons into photo-charges and a non-photosensitive member comprising at least one electrical switch, and the at least one charge integrator is respectively assigned to the at least one electrical switch; and [comprising] a clock for controlling the electrical switch so that photocurrents generated in the photosensitive member are given to the at least one charge integrator in timed synchronism with respect to the excitation light pulses.

The fluorescence detection system (100) of any one of claims 1 to 5, wherein each photodetector comprises: a linear time conversion element of elongated extent; and a side electric field generator; wherein the linear time conversion element and the lateral electric field generator are operable to be coupled together such that a lateral drift field is generated in the linear time conversion element which scans photo charges in the time conversion element from a first end to a second end at the longitudinal extent allows the linear time conversion element along; wherein the charge integrators are arranged in at least one row along the longitudinal extent of the linear time conversion element; wherein the charge integrators are electrically coupled to the time conversion element at a plurality of discretely spaced sample points of the time conversion element, respectively; at least one photosensitive region for converting photons into photo-charges coupled to the linear time conversion element such that generated photo charges are applied to the linear time conversion element; and at least one charge detection circuit electrically connected to the charge integrators to detect a photo charge that has passed through at least a portion of the linear time conversion element along its longitudinal extent.

8. fluorescence detection system (100) according to one of claims 1 to 5, wherein the plurality of photodetectors each comprise a plurality of reset transistors; each reset transistor being controllable by a reset signal such that as long as the reset signal keeps the reset transistor open, photocurrents generated in response to detected light are simultaneously dissipated, the photodetectors thus being in the non-detection mode; and wherein, when the reset transistor is closed, the photo-charges are accumulated, the photodetectors thus being in the detection mode.

The fluorescence detection system (100) of claim 8, wherein each of the photodetectors further comprises a pixel-internal amplifier.

10. A method for operating a fluorescence detection system (100) according to one of the preceding claims, comprising the following steps: a) (300) passing the photodetectors from previously generated photocoads; b) (302) setting the photodetectors to a non-detection mode; c) (304) illuminating at least one fluorophore-labeled test specimen with a light pulse; and d) (306) after a predetermined gate delay beginning at the end of the lighting period, setting the photodetectors to a detection mode for a predetermined photon exposure period; wherein the duration of the gate delay is selected such that the ratio between autofluorescence and desired fluorescence generated by the first light pulse is low enough to ensure reliable detection of the desired fluorescence by the photodetectors.

11. A method of operating a fluorescence detection system (100) according to claim 10, further comprising the steps of: e) (310) determining if at least one termination criterion is met, and if not, f) repeating steps a) to d). and if so, (312) read the accumulated photocarrier.

12. A method of operating a fluorescence detection system (100) according to any one of claims 10 to 12, comprising the following step: sampling at least twice during the exposure period of the signal representing the output charges of the detected fluorescence radiation.

The method of operating a fluorescence detection system (100) of claim 12, wherein the time difference between each sampling step is selected to correspond to the difference in decay time between at least two fluorophore labels.

14. A method of operating a fluorescence detection system (100) according to claim 12 or 13, comprising the step of providing information about the fluorescence decay time characteristics of the fluorophoric light emitting label.