CH670890A5

CH670890A5 -

Info

Publication number: CH670890A5
Application number: CH1278/87A
Authority: CH
Inventors: Ulrich C Knopf
Original assignee: Agrogen Stiftung
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1987-04-03
Publication date: 1989-07-14
Also published as: DE3808798A1

Description

BESCHREIBUNG Vorrichtungen zum automatischen Zählen von mikroskopischen Partikeln in einem strömenden Medium sind seit längerer Zeit bekannt. Sie arbeiten im wesentlichen nach zwei verschiedenen Prinzipien : Bei der einen Art wird eine Suspension der zu zählenden Partikeln in einem elektrisch leitenden flüssigen Medium durch eine enge Kapillare geleitet. Beim Durchgang einer Partikel durch den engen Querschnitt der Kapillare resultiert eine Verminderung der Leitfähigkeit im Bereich der Kapillare, die mittels zweier unter Spannung stehender Elektroden gemessen und registriert wird. Der Messbereich kann sich dabei, wie z. B. im bekannten Coulter-Counter in der Längsrichtung der Kapillare erstrecken, d. h. es wird eine Widerstandsveränderung in der Längsachse der Kapillare gemessen. Bei einer andern Ausführungsform, wie sie z. B. aus der Deutschen Offenlegungsschrift 2 344 427 bekannt ist, wird der elektrische Widerstand an einer Stelle der Messkapillare in einer Richtung senkrecht zur Längsachse der Kapillare gemessen. Anstelle des elektrischen Widerstands kann auch die Kapazität zwischen den beiden Elektroden, bzw. deren Änderung als Messgrösse verwendet werden. In beiden Fällen ermöglicht dieses elektrische Messprinzip nicht nur eine Zählung, sondern auch eine Klassierung der Partikeln nach ihrer Grösse. DESCRIPTION Devices for the automatic counting of microscopic particles in a flowing medium have been known for a long time. They essentially work according to two different principles: In one type, a suspension of the particles to be counted in an electrically conductive liquid medium is passed through a narrow capillary. When a particle passes through the narrow cross-section of the capillary, the conductivity in the area of the capillary is reduced, which is measured and registered by means of two live electrodes. The measuring range can vary, e.g. B. in the known Coulter counter in the longitudinal direction of the capillary, d. H. a change in resistance in the longitudinal axis of the capillary is measured. In another embodiment, as z. B. is known from German Offenlegungsschrift 2,344,427, the electrical resistance is measured at one point on the measuring capillary in a direction perpendicular to the longitudinal axis of the capillary. Instead of the electrical resistance, the capacitance between the two electrodes or their change can also be used as a measurement variable. In both cases, this electrical measuring principle not only enables counting, but also classification of the particles according to their size.

Bei einer zweiten Art von Zählvorrichtungen wird ebenfalls ein Strom einer die Partikeln enthaltenden flüssigen Suspension durch eine Zählkammer geleitet; die Zählung erfolgt jedoch optisch, z. B. mittels eines auf die Zählstelle fokussierten Mikroskopobjektivs und einer zugehörigen Beleuchtungsvorrichtung. Der Durchgang eines Teilchens durch das Messfeld erzeugt in diesem Falle einen Lichtblitz, der mittels einer photoelektrischen Vorrichtung gezählt und registriert wird. Auch hier ist, auf Grund der Intensität des Lichtsignals, eine Klassierung der Teilchen nach ihrer Grösse möglich. Bei optischen Zählvorrichtungen der beschriebenen Art kann auch mit Fluoreszenz gearbeitet werden, wobei z. B. Partikeln verschiedener Art nach der Wellenlänge ihrer Fluoreszenzstrahlung unterschieden werden können. Eine Vorrichtung dieser Art ist z. B. in der Deutschen Patentschrift 2 709 399 beschrieben. Bei einer Weiterentwicklung dieses Messprinzips kann im Anschluss an die Messkammer noch eine Weiche in den Strom der Partikelsuspension eingebaut werden, welche imstande ist, die Teilchen aufgrund ihres zuvor in der Zählkammer festgestellten Signals auf verschiedene Strömungswege zu leiten und damit zu sortieren. In a second type of counting device, a stream of a liquid suspension containing the particles is also passed through a counting chamber; however, the count is made optically, e.g. B. by means of a microscope objective focused on the counting point and an associated lighting device. In this case, the passage of a particle through the measuring field generates a flash of light, which is counted and registered by means of a photoelectric device. Here too, the particles can be classified according to their size based on the intensity of the light signal. In optical counting devices of the type described, it is also possible to work with fluorescence. B. particles of different types can be distinguished according to the wavelength of their fluorescent radiation. A device of this type is e.g. B. described in German Patent 2,709,399. In a further development of this measuring principle, a switch can be installed in the flow of the particle suspension after the measuring chamber, which is able to direct the particles to different flow paths and thus to sort them based on the signal previously determined in the counting chamber.

Sowohl bei Messkammern, die nach einem elektrischen Prinzip arbeiten, als auch bei solchen welche die Teilchen optisch erfassen, müssen verschiedene Probleme gelöst werden. Das eine ist das Koinzidenzproblem, d. h. die getrennte Zählung von Teilchen, die sich zur gleichen Zeit im Messbereich befinden. Dies kann, wie z. B. in der Deutschen Patentschrift 2 332 667 beschrieben, durch Vergleich des Messignals mit einem Normsignal oder auch mittels rein statistischer Wahrscheinlichkeitsüberlegungen geschehen. Various problems have to be solved both with measuring chambers that work according to an electrical principle and with those that optically detect the particles. One is the coincidence problem, i. H. the separate counting of particles that are in the measuring range at the same time. This can be done e.g. B. in German Patent 2,332,667, by comparing the measurement signal with a standard signal or by means of purely statistical probability considerations.

Ein weiteres Problem, welches sich insbesondere bei Zählvorrichtungen stellt, die nach dem optischen Prinzip arbeiten, ist die Aufgabe, den Partikelstrom so zu leiten, dass jede einzelne Partikel den Messbereich durchläuft. Dieser Messbereich ist, insbesondere bei der Verwendung von Mikroskopobjektiven mit hoher Apertur, in der Regel sehr eng begrenzt. Es muss auch dafür gesorgt werden, dass keine toten Räume auftreten können, in denen einzelne Partikel hängen bleiben und sich dadurch der Messung entziehen. Diese Probleme werden mit gutem Erfolg dadurch gelöst, Another problem, which arises in particular in the case of counting devices which operate on the optical principle, is the task of guiding the particle stream in such a way that each individual particle passes through the measuring range. This measuring range is usually very narrow, especially when using microscope objectives with a high aperture. It must also be ensured that no dead spaces can occur in which individual particles get caught and thus escape the measurement. These problems are successfully solved by

dass man einen Strom aus einer partikelfreien Flüssigkeit als Hüllstrom verwendet, in welchen die partikelhaltige Flüssigkeit als dünne fadenförmige Strömung eingeleitet wird. Vorzugsweise wird dabei der Hüllstrom senkrecht zur Richtung des Partikelstroms in die Messkammer eingeführt und dort umgelenkt. Der Partikelstrom wird an der Umlenkstelle in den Hüllstrom injiziert und passiert dann die Messstelle, senkrecht zur optischen Achse, als wohldefinierter Stromfaden innerhalb des Hüllstroms. Eine solche Vorrichtung ist that a stream of a particle-free liquid is used as the enveloping stream, into which the particle-containing liquid is introduced as a thin thread-like flow. The enveloping flow is preferably introduced into the measuring chamber perpendicular to the direction of the particle flow and deflected there. The particle stream is injected into the enveloping stream at the deflection point and then passes the measuring point, perpendicular to the optical axis, as a well-defined stream thread within the enveloping stream. Such a device is

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z. B. in der Deutschen Patentschrift 2 521 236 sowie in der Deutschen Offenlegungsschrift 2 344 427 beschrieben worden. e.g. B. have been described in German Patent 2,521,236 and in German Offenlegungsschrift 2,344,427.

Für das Sortieren der Partikel auf Grund von in der Zählkammer identifizierten Eigenschaften sind zwei grundsätzlich verschiedene Verfahren bekanntgeworden. Das ältere Verfahren basiert auf der elektrostatischen Ablenkung frei fallender geladener Tröpfchen. Dabei wird der Partikelstrom nach dem Passieren der Zählkammer durch eine Düse gepresst und gleichzeitig mittels einer piezoelektrisch betriebenen Ultraschallquelle in feinste Tröpfchen zerteilt, die frei fallend in einen offenen Raum geleitet werden. Zur Aussonderung von einzelnen, auf Grund von optischen Merkmalen in der Zählkammer identifizierten Partikeln werden die sie enthaltenden Tröpfchen beim Zerstäubungsvorgang elektrisch aufgeladen, wobei mittels einer Zeitverzögerungsvorrichtung die für den Weg der Partikel von der Zählkammer bis zur Zerstäuberdüse benötigte Zeit berücksichtigt wird. Im Fallraum passieren die Tröpfchen geladene Elektroden ; elektrisch geladene Tröpfchen werden ausgelenkt und können in einer separaten Sammelvorrichtung aufgefangen werden. Two fundamentally different methods have become known for sorting the particles on the basis of properties identified in the counting chamber. The older method is based on the electrostatic deflection of freely falling charged droplets. After passing through the counting chamber, the particle stream is pressed through a nozzle and, at the same time, broken down into the finest droplets by means of a piezoelectrically operated ultrasound source, which are guided freely into an open space. To separate out individual particles identified on the basis of optical features in the counting chamber, the droplets containing them are electrically charged during the atomization process, the time required for the particles to travel from the counting chamber to the atomizer nozzle being taken into account by means of a time delay device. In the drop room, the droplets pass charged electrodes; electrically charged droplets are deflected and can be collected in a separate collection device.

Diese Art von Sortiervorrichtung besitzt verschiedene Nachteile, die sich besonders beim Arbeiten mit Partikeln biologischen Ursprungs auswirken: Beim Zerstäubungsvor-gang treten verhältnismässig starke Kräfte auf, wobei empfindliche Partikel mechanisch beschädigt werden können. Noch schwerwiegender ist die Tatsache, dass die Partikel das geschlossene Röhrensystem bei der Zerstäubung verlassen und in einen freien Luftraum austreten. Die Gefahr der Kontamination ist bei diesem Vorgang sehr gross, und die Einhaltung steriler Bedingungen wird praktisch verunmöglicht. This type of sorting device has various disadvantages, which are particularly important when working with particles of biological origin: During the atomization process, relatively strong forces occur, and sensitive particles can be mechanically damaged. Even more serious is the fact that the particles leave the closed tube system during atomization and exit into a free air space. The risk of contamination is very high in this process, and compliance with sterile conditions is practically impossible.

Weit besseren Schutz gegen Kontamination bietet die andere bekanntgewordene Art von Sortiervorrichtungen, bei welcher die die Partikeln führende Flüssikeit während des ganzen Zähl- und Sortiervorgangs in einem geschlossenen Röhrensystem verbleibt. Bei dieser Vorrichtung teilt sich der Flüssigkeitskanal stromabwärts der Zählkammer in zwei Arme. Im Normalzustand fliesst der die Partikeln enthaltende Stromfaden mit einem Teil der Hüllflüssigkeit ausschliesslich durch den einen dieser Arme ; durch den andern Arm der Verzweigung fliesst dabei lediglich ein kleiner Teil der Hüllflüssigkeit. Durch eine in der Nähe der Verzweigung befindliche piezoelektrische Vorrichtung kann ein sehr kurz dauernder Schlag ausgelöst werden; die Stosswelle bewirkt eine momentane Einschnürung des Stromfadens, und während einer sehr kurzen Zeit (ca. 40 (isec) die Ableitung eines kleinen Flüssigkeitstropfens in den zweiten Arm der Verzweigung. Durch genaue Einstellung der Zeitverzögerung zwischen Zählkammer und Sortierweiche gelingt es dabei, einzelne, in der Zählkammer identifizierte Partikeln mit grosser Genauigkeit auszusortieren und separat aufzufangen, wobei eine Sortiergeschwindigkeit von 1000 Partikeln pro Sekunde ohne besondere Schwierigkeit erreichbar ist. The other known type of sorting device offers far better protection against contamination, in which the liquid carrying the particles remains in a closed tube system during the entire counting and sorting process. In this device, the liquid channel divides into two arms downstream of the counting chamber. In the normal state, the current filament containing the particles with part of the sheath liquid flows exclusively through one of these arms; only a small part of the sheath liquid flows through the other arm of the branch. A very short duration shock can be triggered by a piezoelectric device located near the branch; the shock wave causes a momentary constriction of the current thread, and for a very short time (approx. 40 (isec) the discharge of a small drop of liquid into the second arm of the branch. By precisely setting the time delay between the counting chamber and the sorting switch, individual, in Sort out identified particles in the counting chamber with great accuracy and collect them separately, whereby a sorting speed of 1000 particles per second can be achieved without any particular difficulty.

Trotz ihrer technischen Vorzüge weist auch die eben beschriebene Sortiervorrichtung noch gewisse Mängel auf, die sich beim Sortieren von Partikeln biologischen Ursprungs nachteilig auswirken können: Zellen und ihre Bestandteile, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, neigen oft zur Konglomeration und können damit grössere Partikel bilden, welche die Kanäle des Zähl- und Sortiersystems, insbesondere an engen Stellen und Umlenkpunkten, verstopfen. Grössere Partikel können auch bei der Präparation durch ungenügende Zerteilung des biologischen Materials entstehen. Eine weitere Störquelle bilden Luftblasen, die, falls sie ins System gelangen, sich an der Unterseite des Deckglases festsetzen, die Strömung stören und im Bereich des optischen Strahlengangs den Zählvorgang unterbrechen können. Beide Störquellen, verstopfende Konglomerate und Despite its technical advantages, the sorting device just described still has certain defects which can have a disadvantageous effect when sorting particles of biological origin: cells and their constituents which are suspended in a liquid often tend to conglomerate and can thus form larger particles, which clog the channels of the counting and sorting system, especially in narrow places and deflection points. Larger particles can also arise during preparation due to insufficient fragmentation of the biological material. Another source of interference is air bubbles, which, if they get into the system, attach themselves to the underside of the cover slip, disrupt the flow and can interrupt the counting process in the area of the optical beam path. Both sources of interference, clogging conglomerates and

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Luftblasen können bei den bisher bekannten Vorrichtungen nur durch Öffnen der Zählkammer unter Wegnahme des Deckglases entfernt werden. Damit wird jedesmal die Sterilität des Systems in Frage gestellt, was beim Zählen und Sortieren biologischen Materials und insbesondere bei seiner weiteren Verwendung ein schwer zu überwindendes Hindernis bildet. In the previously known devices, air bubbles can only be removed by opening the counting chamber with the cover glass removed. This always questions the sterility of the system, which is a difficult obstacle to overcome when counting and sorting biological material and especially when it is used.

Aus diesem Grund konnten z. B. Pflanzenzellen, Konglomerate aus Pflanzenzellen und pflanzliche Protoplasten mit den bisher bekannten Vorrichtungen nicht oder nur unter grossen Schwierigkeiten sortiert werden. Die Anlage von selektionierten sterilen Zellinien bzw. deren Regeneration zu ganzen Pflanzen, beispielsweise zur Züchtung neuer Sorten aus selektionierten Zellen, Zellkonglomeraten und Protoplasten, war deshalb praktisch unmöglich. For this reason, z. B. plant cells, conglomerates of plant cells and plant protoplasts with the previously known devices are not sorted or only with great difficulty. The creation of selected sterile cell lines or their regeneration into whole plants, for example for the cultivation of new varieties from selected cells, cell conglomerates and protoplasts, was therefore practically impossible.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung der beschriebenen Art zum Zählen, Klassieren und Sortieren von mikroskopischen Partikeln, bei welcher verstopfende Partikel und Luftblasen ohne Öffnung der Zählkammer aus dem System entfernt werden können. In einer ersten Ausführungsform umfasst die Erfindung einen in die Zählkammer mündenden Stutzen, der an seinem äusseren Ende über ein Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist. Im Falle einer Störung kann ein verstopfendes Teilchen oder eine Luftblase durch kurzes Öffnen des Ventils auf einfache Weise abgesaugt werden. In einer zweiten Ausführungsform, die sich speziell für die Entfernung von am Deckglas haftenden Blasen eignet, wird in das Deckglas an geeigneter Stelle eine kleine Pore gebohrt, die in einen nach aussen führenden Stutzen mündet, wobei der Stutzen wiederum über ein Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist. Durch kurzes Öffnen des Ventils können am Deckglas haftende Luftblasen auf einfache Weise abgesogen werden. The present invention relates to a device of the type described for counting, classifying and sorting microscopic particles, in which clogging particles and air bubbles can be removed from the system without opening the counting chamber. In a first embodiment, the invention comprises a nozzle opening into the counting chamber, which is connected at its outer end to a vacuum source via a valve. In the event of a malfunction, a clogging particle or an air bubble can be easily extracted by briefly opening the valve. In a second embodiment, which is particularly suitable for removing bubbles adhering to the cover slip, a small pore is drilled into the cover slip at a suitable point, which opens into an outwardly leading connection piece, the connection piece in turn being connected to a vacuum source via a valve is. By briefly opening the valve, air bubbles adhering to the coverslip can be easily extracted.

Trotz ihrer relativen Einfachheit bietet die Erfindung beim Zählen und Sortieren von Partikeln biologischen Ursprungs gegenüber den bisher bekannten Vorrichtungen grosse Vorteile und ermöglicht die Lösung von bisher nicht oder nur schwer durchführbaren Arbeiten. So werden z. B. beim Anlegen von Zellkulturen aus pflanzlichen Zellen und insbesondere bei der Regeneration von ganzen Pflanzen bevorzugt Konglomerate von Zellen verwendet, weil sie gegenüber einzelnen Zellen bzw. Protoplasten sich allgemein als besser regenerationsfähig erweisen. Wegen der dauernden Verstopfungsgefahr war das Zählen und Aussortieren solcher Konglomerate mit den bekannten Vorrichtungen kaum durchführbar. Die Möglichkeit, verstopfende Partikel ohne Sterilitätsverlust aus dem System entfernen zu können, erweist sich deshalb als unerlässliche Vorbedingung, um biologische Materialien dieser Art überhaupt sortieren zu können. Luftblasen treten vor allem am Anfang eines Zähl-und Sortiervorgangs auf, sowie dann, wenn der Flüssigkeitsstrom im System durch Ansaugen aufrechterhalten wird. Kleine Undichtigkeiten auf der Eintrittsseite können in diesem Fall bewirken, dass während des ganzen Zählvorgangs gelegentlich Luftblasen in die Kammer gelangen können. Die Möglichkeit, diese Luftblasen auf einfache Weise zu entfernen, erleichtert auch in diesem Fall das Arbeiten mit der Zähl- und Sortiervorrichtung ganz wesentlich. Despite its relative simplicity, the invention offers great advantages when counting and sorting particles of biological origin compared to the previously known devices and enables the solution of work which has hitherto been impossible or difficult to carry out. So z. B. when creating cell cultures from plant cells and in particular when regenerating whole plants, conglomerates of cells are preferably used because they generally prove to be better capable of regeneration compared to individual cells or protoplasts. Because of the constant risk of clogging, counting and sorting out such conglomerates was hardly feasible with the known devices. The ability to remove clogging particles from the system without loss of sterility has therefore proven to be an essential prerequisite for being able to sort biological materials of this type at all. Air bubbles occur especially at the beginning of a counting and sorting process, as well as when the liquid flow in the system is maintained by suction. In this case, small leaks on the inlet side can occasionally cause air bubbles to get into the chamber during the entire counting process. The possibility of removing these air bubbles in a simple manner also makes working with the counting and sorting device considerably easier in this case.

Die Erfindung und ihre Wirkungsweise sind in den Figuren la, lb und 2 erläutert, wobei die in den Figuren gezeigte Anordnung den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken soll. Die Zählkammer (5) sowie die halbzylindrischen Kanäle (8,10 und 11) sind in dem Block (14) eingeschnitten. Durch den Stutzen (4) wird die Flüssigkeit mit den zu zählenden Partikeln, und bei (6), senkrecht dazu, die partikelfreie Flüssigkeit für den Hüllstrom eingeführt. Die in der Figur nicht gezeigte optische Zählvorrichtung The invention and its mode of operation are illustrated in FIGS. 1 a, 1 b and 2, the arrangement shown in the figures not intended to limit the scope of the invention in any way. The counting chamber (5) and the semi-cylindrical channels (8, 10 and 11) are cut in the block (14). Through the nozzle (4), the liquid with the particles to be counted, and at (6), perpendicular to it, the particle-free liquid for the envelope flow is introduced. The optical counting device, not shown in the figure

3 3rd

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befindet sich über der Zählkammer in der Nähe des Ausgangs zum Kanal (8). Der Stutzen (7), der über ein in der Figur nicht gezeigtes Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden ist, dient im Bedarfsfall für das Absaugen von verstopfenden Partikeln und/oder Luftblasen aus der Zählkammer. is located above the counting chamber near the exit to the channel (8). The nozzle (7), which is connected to a vacuum source via a valve (not shown in the figure), is used, if necessary, for the suction of clogged particles and / or air bubbles from the counting chamber.

An der Stelle (9) befindet sich eine Verzweigung, die so geformt ist, dass der grösste Teil des Flüssigkeitsstroms mit dem zentralen, die Partikeln enthaltenden Stromfaden durch den Kanal (11), und nur ein kleiner Teil des partikelfreien Hüllstroms durch den Kanal (10) abfliesst. Mittels der piezoelektrischen Vorrichtung (12) werden nun, ausgelöst durch die Zählvorrichtung in der Kammer (5), auf eine in der Nähe der Verzweigung (9) liegende Stelle des Kanals (11) kurze Schläge ausgeführt, die eine momentane Verengung des Stromquerschnitts im Kanal (11) und während ganz kurzer Zeit eine Ableitung des partikelführenden Stromfadens in den Kanal (10) bewirken. Dabei muss, zwischen dem At point (9) there is a branch which is shaped in such a way that most of the liquid flow with the central flow thread containing the particles through the channel (11), and only a small part of the particle-free envelope flow through the channel (10 ) flows off. By means of the piezoelectric device (12), triggered by the counting device in the chamber (5), short strikes are carried out on a location of the channel (11) near the branch (9), which momentarily narrows the current cross section in the channel (11) and for a very short time lead to a discharge of the particle-carrying current thread into the channel (10). It must be between the

4 4th

Moment der Erkennung einer auszusondernden Partikel in der Messkammer, und dem Signal für die Ableitung an der Verzweigung (9) eine Zeitverzögerung eingebaut werden, die genau der Transportzeit über diese Strecke entspricht, s In den Figuren 1 a und 1 b ist das den Block (14) mit der Messkammer (5) bedeckende Deckglas (1) mit der Pore (13) dargestellt, wobei Figur la eine Gesamtansicht und Figur lb einen vergrösserten Ausschnitt zeigt. Über der Pore (13) ist der Block (2) mit dem Anschlussstutzen (3) aufgekittet, io Dieser Stutzen ist über ein in der Figur nicht gezeigtes Ventil mit einer Unterdruckquelle verbunden. Auf der Unterseite des Deckglases (1) sich ansammelnde Luftblasen und andere Verunreinigungen werden dadurch bei Bedarf oder laufend abgesogen und so aus der Messkammer entfernt. The moment of detection of a particle to be separated out in the measuring chamber and the signal for the derivation at the branch (9), a time delay is built in which corresponds exactly to the transport time over this distance, s In FIGS. 1 a and 1 b this is the block ( 14) with the measuring chamber (5) covering glass (1) with the pore (13) shown, Figure la shows an overall view and Figure lb shows an enlarged section. The block (2) with the connection piece (3) is cemented over the pore (13), this piece is connected to a vacuum source via a valve (not shown in the figure). Air bubbles and other contaminants that accumulate on the underside of the cover slip (1) are thereby drawn off as required or continuously and are thus removed from the measuring chamber.

15 Beide Ausführungsformen der Erfindung, der Saugstutzen (7) und die Pore (13) mit dem Anschlussstutzen (3) können je einzeln für sich oder auch gleichzeitig in der Zähl- und Sortiervorrichtung verwendet werden. 15 Both embodiments of the invention, the suction port (7) and the pore (13) with the connection port (3) can each be used individually or simultaneously in the counting and sorting device.

B B

1 Blatt Zeichnungen 1 sheet of drawings

Claims

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1. Device for counting, classifying and sorting microscopic particles suspended in a flowing liquid, in particular living cells, cell organelles and their genomes, with an injection device in which the liquid stream containing the particles is surrounded with a particle-free envelope stream, a counting chamber in which the particle stream is penetrated by a light beam directed perpendicularly to the direction of flow, an optical counting device actuated by this light beam with a microscope objective focused on the particle stream, a photomultiplier and associated counting and classifying electronics, and a liquid separator located downstream of the counting chamber the optical device identified particles can be sorted out by means of a piezoelectrically generated pressure wave, characterized in that the optical counting chamber with a device for suctioning air bubbles and / or mechanical impurities.

2. Device according to claim 1, characterized in that the suction device consists of a in the counting chamber (5) protruding nozzle (7) which is connected via a valve to be actuated as required to a vacuum source.

3. Device according to claim 1, characterized in that the suction device consists of a pore (13) drilled in the cover glass of the counting chamber, which opens on the outside of the cover glass into a connection piece (3) which also has a valve to be operated as required is connected to a vacuum source.

4. Use of the device according to one of claims 1 to 3 for counting and sorting out individual particles and / or conglomerates consisting of several particles on the basis of optical distinguishing features.

5. Use of the device according to claim 4, characterized in that the particles are living cells, protoplasts, fused protoplasts or their fusion products, cell organelles or chromosomes or genomes, preferably of vegetable origin.

6. Use of the device according to claims 4 and 5, characterized in that the particles are distinguished on the basis of their size in accordance with the intensity of the light reflected by them.

7. Use of the device according to claims 4 and 5, characterized in that the particles are selected on the basis of their intrinsic color or a color difference caused by external coloration in accordance with the wavelength of the light reflected by them.

8. Use of the device according to claims 4 and 5, characterized in that the particles are selected on the basis of their own fluorescence acquired by staining or by attachment of antibodies in accordance with the wavelength of the fluorescent light emitted by them.