CH664018A5

CH664018A5 - IMMUNOLOGICAL DETERMINATION METHOD AND REAGENT FOR IMMUNOLOGICAL DETERMINATIONS.

Info

Publication number: CH664018A5
Application number: CH416183A
Authority: CH
Inventors: Takashi Kudo; Toshiyuku Sugawara; Hiroshi Sato; Ei Mochida
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-07-31
Filing date: 1983-07-29
Publication date: 1988-01-29
Also published as: DE3327496A1; GB2125547B; GB2125547A; SE8304190D0; SE8304190L; GB8319459D0; AT385601B; NL8302708A; ATA276883A; CA1235062A; FR2531223A1; FR2531223B1

Description

BESCHREIBUNG DESCRIPTION

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein immunologisches Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Gesamtmenge zweier oder mehrerer Substanzen in einer Probe und auf ein Reagens zur Ausführung dieses Verfahrens. The present invention relates to an immunological method for the simultaneous determination of the total amount of two or more substances in a sample and to a reagent for carrying out this method.

Infolge der grossen Fortschritte der klinischen Medizin in letzter Zeit sind genauere Diagnosen und Behandlungsarten verschiedenster Krankheiten dadurch möglich geworden, dass eine Anzahl klinischer Untersuchungsmerkmale gemessen und die Ergebnisse verständlich interpretiert werden können. Die zur Zeit ausführbaren immunochemi-schen Bestimmungen benötigen jedoch noch zur Untersuchungauf ein einzelnes Merkmal etwa 1 bis 4 Tage, und daher sind zur Untersuchung auf mehrere Merkmale noch sehr viele Tage nötig. Aus diesem Grunde muss man auf einige der an sich notwendigen Tests verzichten, wenn die Gefahr besteht, dass der Patient nicht mehr rechtzeitig behandelt werden kann. Unter solchen Umständen ergibt sich natürlich die Möglichkeit, dass die Behandlung des Patienten nicht immer die richtige ist. As a result of the great advances in clinical medicine in recent times, more accurate diagnoses and types of treatment of various diseases have become possible by measuring a number of clinical examination features and interpreting the results in an understandable manner. The immunochemical determinations that can currently be carried out, however, still take about 1 to 4 days to examine for a single characteristic, and therefore a very long time is still required to examine for several characteristics. For this reason, one has to do without some of the tests that are necessary per se if there is a risk that the patient can no longer be treated in time. In such circumstances, there is of course a possibility that the patient's treatment is not always the right one.

Beispielsweise wird bei Krebs, der in der Rangliste der Sterbeursachen ganz oben steht, angenommen, dass die Bestimmung verschiedener Tumormerkmal-Stoffe für eine gute Frühdiagnose sehr wichtig ist und das Wissen von den Krankheitsbedingungen, die Beurteilung des therapeutischen Effekts, Feststellungeines Rückfalls usw. massgeblich beeinflusst. In solchen Fällen ist es eher angebracht und genauer, eine Anzahl von Tumormerkmal-Substanzen zu bestimmen und die Diagnose auf die kombinierte Beurteilung der Resultate abzustimmen, als nur von den Ergebnissen der Bestimmung einer einzigen Tumormerkmal-Sub-stanz zu urteilen. Wie aber schon oben angedeutet wurde, braucht es viele Tage, um mehrere Tumormerkmal-Substanzen zu bestimmen. Zur Bestimmung mehrerer Substanzen nacheinander müssen zudem mehrere bzw. grössere Proben genommen werden, z.B. Serum, Plasma usw., was die Schmerzen des Patienten vermehrt. For example, in cancer, which is at the top of the list of causes of death, it is assumed that the determination of various tumor feature substances is very important for a good early diagnosis and that knowledge of the disease conditions, assessment of the therapeutic effect, determination of a relapse, etc. has a significant influence . In such cases, it is more appropriate and more accurate to determine a number of tumor feature substances and tailor the diagnosis to the combined assessment of the results than to judge from the results of the determination of a single tumor feature substance. However, as already indicated above, it takes many days to determine several tumor feature substances. To determine several substances in succession, several or larger samples must also be taken, e.g. Serum, plasma, etc., which increases the patient's pain.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Gesamtmenge von zwei oder mehreren Substanzen zu entwickeln, die sich in einer Probe befinden, und zwar durch eine einzige Bestimmungsoperation. It is the object of the invention to develop a method for the simultaneous determination of the total amount of two or more substances which are in a sample, by means of a single determination operation.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Reagenzmittels zur gleichzeitigen Messung der in einer Another object of the invention is to provide a reagent for simultaneous measurement of the in a

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Probe anwesenden Gesamtmenge von zwei oder mehreren Substanzen durch eine einzige Bestimmungsoperation. Sample present total amount of two or more substances by a single determination operation.

Demgemäss bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein immunologisches Verfahren und ein Reagens nach den Ansprüchen 1 und 11. Accordingly, the present invention relates to an immunological method and a reagent according to claims 1 and 11.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist der Zeitbedarf zur Bestimmung beträchtlich verkürzt, weil zwei oder mehr Substanzen gleichzeitig bestimmfwerden. Auch kann die Probengrösse verglichen mit bisher üblichen Methoden verkleinert werden, bei denen in jeder Probe nur jeweils eine Einzelmessung vorgenommen wurde. The method according to the invention considerably shortens the time required for the determination because two or more substances are determined simultaneously. The size of the sample can also be reduced compared to previously customary methods, in which only one individual measurement was carried out in each sample.

In der Zeichnung sind Diagramme vorgestellt, die im Zusammenhang mit den nachstehenden Beispielen stehen. Es zeigen : The drawing shows diagrams that are related to the examples below. Show it :

Fig. 1 bis 4: die Standardkurven gemäss Beispiel 6, dort erläutert; 1 to 4: the standard curves according to Example 6, explained there;

Fig. 5 bis 8: die Standardkurven gemäss Beispiel 10; 5 to 8: the standard curves according to Example 10;

Fig. 9; die Standardkurven gemäss Beispiel 12; und Fig. 9; the standard curves according to Example 12; and

Fig. 10; die Verdünnungskurven gemäss Beispiel 13. Fig. 10; the dilution curves according to example 13.

Es wurde gefunden, dass zur Krebs-Frühdiagnose auf der Grundlage der Bestimmung von Tumormerkmal-Substanzen es bereits möglich ist, die Anwesenheit von Krebs mit Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, wenn man die Gesamtmenge der Merkmalsubstanzen bestimmt (vgl. nachstehende Beispiele 2,4,6 und 11 ), obwohl es natürlich besser wäre, wenn man Einzelbestimmungen ausführen würde, um zu erfahren, welche Tumormerkmal-Substanzen anwesend sind und in welchen Konzentrationen. Wie gesagt ist es aber wichtiger, sofort mit einer Therapie beginnen zu können. Auf der Grundlage der eben erwähnten Befunde wurde nach sehr eingehenden Forschungen und Studien gefunden, dass es möglich ist, die Gesamtmenge zweier oder mehrerer in einer Probe befindlichen Substanzen mit einer einzigen Bestimmungsoperation gleichzeitig zu bestimmen. Als Ergebnis ist festzuhalten, dass die Gesamtmenge von zwei oder mehreren zu bestimmenden Substanzen in einer einzigen Bestimmungsoperation auf Grund eines immunologischen Bestimmungsprinzips bestimmt werden kann. Dabei wird die Bestimmung so ausgeführt, dass man zunächst zwei oder mehrere unterschiedliche Antikörper, die gegen zwei oder mehrere zu bestimmende Antigene gerichtet sind, an den gleichen unlöslichen Träger bindet oder indem man zwei oder mehrere insolubilisierte Antikörper vermischt und verwendet, die man durch Bindung von Antikörpern, die gegen zwei oder mehrere unterschiedliche zu bestimmende Antigene gerichtet sind, an getrennte unlösliche Träger erhält. Dabei ist eine Veränderung der Reaktivität zwischen den zu bestimmenden Antigenen und den entsprechenden Antikörpern zu vermeiden. It was found that for early diagnosis of cancer on the basis of the determination of tumor feature substances, it is already possible to predict the presence of cancer with probability if the total amount of the feature substances is determined (see Examples 2,4,6 and 11 below ), although it would of course be better if individual determinations were carried out in order to find out which tumor feature substances are present and in which concentrations. As I said, it is more important to be able to start therapy immediately. On the basis of the findings just mentioned, after extensive research and studies, it was found that it is possible to determine the total amount of two or more substances in a sample at the same time with a single determination operation. As a result, it should be noted that the total amount of two or more substances to be determined can be determined in a single determination operation based on an immunological determination principle. The determination is carried out by first binding two or more different antibodies directed against two or more antigens to be determined to the same insoluble support or by mixing and using two or more insolubilized antibodies which are obtained by binding Antibodies, which are directed against two or more different antigens to be determined, on separate insoluble carriers. A change in the reactivity between the antigens to be determined and the corresponding antibodies should be avoided.

Die immunologischen Bestimmungsverfahren, die dem erfindungsgemässen Verfahren zugrunde liegen, werden bereits als Methoden zur Bestimmung physiologisch aktiver Substanzen angewandt, die sich in ausserordentlich kleinen Konzentrationen in bestimmten Probenflüssigkeiten wie Serum, Urin usw. finden. Beispiele sind Peptidhormone, Steroide, Proteine, dem menschlichen Körper zugeführte Medikamente und Drogen usw. Insbesondere wendet man die Reaktionen der Hämagglutination und der Latexagglutination an, da sie den Vorteil einfacher Analysendurchführung und kurzer Analysenzeiten haben. Das gleiche gilt für Enzym-Immunoanalysen, Radio-Immunoanalysen und Fluoro-Immunoanalysen, die man oft auf Grund der Vorteile hoher Empfindlichkeit und ausgezeichneter Quantitativität benutzt. The immunological determination methods on which the method according to the invention is based are already used as methods for determining physiologically active substances which are found in extremely small concentrations in certain sample liquids such as serum, urine, etc. Examples are peptide hormones, steroids, proteins, drugs and drugs supplied to the human body, etc. In particular, the reactions of hemagglutination and latex agglutination are used because they have the advantage of simple analysis and short analysis times. The same applies to enzyme immunoanalyses, radio immunoanalyses and fluoro immunoanalyses, which are often used due to the advantages of high sensitivity and excellent quantitative character.

Die Grundlagen dieser Bestimmungsmethoden sollen jetzt kurz beschrieben werden. The basics of these determination methods will now be briefly described.

( 1 ) Agglutinations-Reaktionen. Setzt man eine unbekannte Menge eines zu bestimmenden Antigens mit einem entsprechenden Antikörper um, der an einen teilchenför-migen Träger gebunden ist (nachstehend als «feste Phase» bezeichnet), beispielsweise rote Blutkörperchen, Polymerlatex usw., bindet sich das Antigen an den Antikörper an der festen Phase proportional der anwesenden Menge, und die feste Phase agglutiniert dadurch. Man misst das Ausmass der Agglutination, und man bestimmt die Menge des zu messenden Antigens durch Vergleich der Agglutinationsraten, die man bei der Zugabe der gleichen Substanz, aber mit bekannten Konzentrationen nach analogen Arbeitsweisen erhält. (1) Agglutination reactions. If an unknown amount of an antigen to be determined is reacted with a corresponding antibody which is bound to a particulate carrier (hereinafter referred to as the “solid phase”), for example red blood cells, polymer latex, etc., the antigen binds to the antibody the solid phase is proportional to the amount present, and the solid phase thereby agglutinates. The extent of agglutination is measured, and the amount of antigen to be measured is determined by comparing the agglutination rates that are obtained when the same substance is added, but with known concentrations according to analogous procedures.

(2) Sandwich-Verfahren. Wird eine unbekannte Menge eines unmarkierten Antigens, nämlich des zu bestimmenden Antigens, mit einem entsprechenden Antikörper umgesetzt, der an eine feste Phase gebunden ist (erste Reaktion), bindet sich das zu bestimmende Antigen an den Antikörper unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Setzt man eine gegebene Menge des gleichen Antikörpers, der mit einem Markierungsmittel markiert ist, mit dem genannten Antigen-Antikörper-Komplex um (zweite Reaktion), so wird der markierte Antikörper an den genannten Komplex gebunden, wobei jedoch ein Anteil des Antikörpers, der die Bindungskapazität des Komplexes übersteigt, ungebunden bleibt und weiterhin in freier Form vorliegt. Dann wird die feste Phase von der flüssigen Phase abgetrennt, die Aktivität des Markierungsmittels in der festen oder der flüssigen Phase gemessen und die Menge des unmarkierten, zu bestimmenden Antigens mittels einer Standardkurve (Eichkurve) bestimmt. Diese Eichkurven hat man zuvor durch analoges Vorgehen mit bekannten Konzentrationen an unmarkiertem Antigen gewonnen. (2) sandwich method. If an unknown amount of an unlabelled antigen, namely the antigen to be determined, is reacted with a corresponding antibody that is bound to a solid phase (first reaction), the antigen to be bound binds to the antibody to form an antigen-antibody complex. If a given amount of the same antibody, which is labeled with a labeling agent, is reacted with the said antigen-antibody complex (second reaction), the labeled antibody is bound to the said complex, but a portion of the antibody which is the Binding capacity of the complex exceeds, remains unbound and is still in free form. The solid phase is then separated from the liquid phase, the activity of the marking agent in the solid or the liquid phase is measured and the amount of the unlabeled antigen to be determined is determined by means of a standard curve (calibration curve). These calibration curves have previously been obtained by an analogous procedure with known concentrations of unlabelled antigen.

(3) Verfahren der konkurrenzierenden Reaktion : Setzt man eine unbekannte Menge eines unmarkierten Antigens (das zu bestimmende Antigen) und eine gegebene Menge eines markierten Antigens konkurrenzierend mit einem entsprechenden, an eine feste Phase gebundenen Antikörper um, so binden sich das unmarkierte und das markierte Antigen nach Massgabe ihrer Mengenverhältnisse an den Antikörper, derart, dass die Menge des an den Antikörper gebundenen markierten Antigens derjenigen des unmarkierten Antigens umgekehrt proportional ist. Danach trennt man die feste Phase von der flüssigen Phase ab, und die Aktivität des Markierungsmittels wird entweder in der festen oder in der flüssigen Phase gemessen. Aus den Messungen wird die Menge des zu bestimmenden Antigens auf Grund einer Eichkurve gewonnen, die man zuvor durch ähnliche Methoden mit der unmarkierten Substanz bei bekannten Konzentrationen aufgestellt hat. (3) Competitive reaction method: If an unknown amount of an unlabeled antigen (the antigen to be determined) and a given amount of a labeled antigen are competitively reacted with an appropriate antibody bound to a solid phase, the unlabeled and the labeled bind Antigen according to their proportions to the antibody such that the amount of labeled antigen bound to the antibody is inversely proportional to that of the unlabeled antigen. The solid phase is then separated from the liquid phase and the activity of the marking agent is measured either in the solid or in the liquid phase. The amount of the antigen to be determined is obtained from the measurements on the basis of a calibration curve which has previously been established by similar methods with the unlabeled substance at known concentrations.

(4) Immunometrische Verfahren : Setzt man eine unbekannte Menge eines unmarkierten Antigens, nämlich des zu bestimmenden Antigens, mit einer bekannten Menge eines entsprechenden, markierten Antikörpers um und gibt dann das gleiche Antigen, aber an eine feste Phase gebunden, zu, so reagiert es mit unumgesetztem markiertem Antikörper, und der markierte Antikörper bindet sich an das Antigen an der festen Phase in einer Menge, die zur Menge des unmarkierten Antigens umgekehrt proportional ist. Danach trennt man die feste Phase von der flüssigen Phase, und nun wird die Aktivität des Markierungsmittels in der festen oder flüssigen Phase gemessen. Die Menge an unmarkiertem Antigen ergibt sich aus einer Eichkurve, die man mit den unmarkierten Substanzen unter bekannten Konzentrationen erhalten hat. (4) Immunometric methods: If an unknown amount of an unlabelled antigen, namely the antigen to be determined, is reacted with a known amount of a corresponding, labeled antibody and then the same antigen, but bound to a solid phase, is added, it reacts with unreacted labeled antibody, and the labeled antibody binds to the antigen on the solid phase in an amount that is inversely proportional to the amount of the unlabelled antigen. The solid phase is then separated from the liquid phase and the activity of the marking agent in the solid or liquid phase is then measured. The amount of unlabeled antigen results from a calibration curve that was obtained with the unlabeled substances at known concentrations.

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren und ein Reagens zur gleichzeitigen Messung der Gesamtmenge zweier oder mehrerer Substanzen, die zu bestimmen sind The present invention provides a method and a reagent for simultaneously measuring the total amount of two or more substances to be determined

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und in einer Probe vorliegen, unter Ausnutzung der vorstehend beschriebenen Grundlagen immunologischer Bestimmungsverfahren. and present in a sample using the above-described principles of immunological determination methods.

Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren kann mit Hilfe beliebiger üblicher immunologischer Analysenverfahren ausgeübt werden, bei denen eine Bindung eines Antikörpers oder Antigens an einen unlöslichen Träger im Spiele ist, beispielsweise die Blutagglutinierungsreaktion, die Ag-glutinations-Verhinderungs-Reaktion, die Verfahren konkurrenzierender Reaktionen, das Sandwich-Verfahren, die immunomelrische Methode usw. The determination method according to the invention can be carried out with the aid of any conventional immunological analysis methods in which binding of an antibody or antigen to an insoluble carrier is involved, for example the blood agglutination reaction, the agglutination prevention reaction, the methods of competitive reactions, the sandwich Procedures, the immunomelric method, etc.

Es soll nun das erfindungsgemässe Verfahren in den Grundzügen beschrieben werden, wobei zur Erläuterung die Agglutinationsreaktion und die Sandwich-Methode als Beispiele dienen sollen. The basic principles of the method according to the invention will now be described, the agglutination reaction and the sandwich method being used as examples for explanation.

( 1 ) Agglutinationsreaktion : Soll eine Probe gemessen werden, in der die vier Substanzen A, B, C und D vermutet werden, so bindet man zunächst vier unterschiedliche Antikörper, die gegen die zu bestimmenden Substanzen gerichtet sind, nämlich den Anti-A-Antikörper, den Anti-B-Anti-körper, den Anti-C-Antikörper und den Anti-D-Antikörper, an den gleichen unlöslichen Träger, oder man bindet die Antikörper getrennt an unterschiedliche teilchenförmige unlösliche Träger. Dabei erhält man eine oder aber vier verschiedene Suspensionen unlöslicher teilchenförmigerTräger, die die vier Antikörper gebunden enthalten. Setzt man die Probe mit diesen Suspensionen um, binden sich die zu bestimmenden Substanzen A, B, C und D jeweils an ihre entsprechenden Antikörper an den Trägern, und es wird eine Agglutinierung der Trägerteilchen bewirkt. Durch Messung des Ausmasses der Agglutinierung kann man die Gesamtmenge der zwei oder mehreren zu bestimmenden Substanzen messen, die in der Untersuchungsprobe vorhanden waren. (1) Agglutination reaction: If a sample is to be measured in which the four substances A, B, C and D are suspected, four different antibodies which are directed against the substances to be determined, namely the anti-A antibody, are first bound , the anti-B antibody, the anti-C antibody and the anti-D antibody, on the same insoluble carrier, or the antibodies are bound separately to different particulate insoluble carriers. One or four different suspensions of insoluble particulate carriers which contain the four antibodies bound are obtained. If the sample is reacted with these suspensions, the substances to be determined A, B, C and D each bind to their corresponding antibodies on the carriers, and agglutination of the carrier particles is brought about. By measuring the extent of agglutination, one can measure the total amount of two or more substances to be determined that were present in the test sample.

(2) Sandwich-Methode: Soll eine Probe analysiert werden, in der die vier Substanzen A, B, C und D vermutet werden, so bindet man zunächst vier unterschiedliche Antikörper, die gegen die zu bestimmenden Substanzen gerichtet sind, nämlich den Anti-A-Antikörper, den Anti-B-Antikörper, den Anti-C-Antikörper und den Anti-D-Antikörper, an den gleichen unlöslichen Träger, oder man bindet sie getrennt an unterschiedliche unlösliche Träger. Man erhält einen oder aber vier verschiedene unlösliche Träger, die die vier Antikörper enthalten. Wird die Probe mit diesen unlöslichen Trägern umgesetzt, so binden sich die einzelnen zu bestimmenden Substanzen A, B, C und D jeweils an die entsprechenden Antikörper an den Trägern. Nach eventueller Abtrennung der festen Phase werden markierte Antikörper, die man durch Bindung eines Markierungsmittels an den Anti-A-Antikörper, Anti-B-Antikörper, Anti-C-Antikörper und Anti-D-Antikörper erhält, mit der festen Phase umgesetzt, wobei sich die jeweiligen markierten Antikörper mit den entsprechenden zu bestimmenden Substanzen verbinden. Dann wird die feste Phase abgetrennt und die Gesamtaktivität des an die feste Phase gebundenen Markierungsmittels gemessen. Auf diese Weise lässt sich die Gesamtmenge der zu bestimmenden vier Substanzen in einer einzigen Probe und zur gleichen Zeit bestimmen. (2) Sandwich method: If a sample is to be analyzed in which the four substances A, B, C and D are suspected, four different antibodies are first bound which are directed against the substances to be determined, namely the anti-A Antibodies, the anti-B antibody, the anti-C antibody and the anti-D antibody, to the same insoluble support, or they are bound separately to different insoluble supports. One or four different insoluble carriers are obtained which contain the four antibodies. If the sample is reacted with these insoluble carriers, the individual substances A, B, C and D to be bound each bind to the corresponding antibodies on the carriers. After any separation of the solid phase, labeled antibodies, which are obtained by binding a labeling agent to the anti-A antibody, anti-B antibody, anti-C antibody and anti-D antibody, are reacted with the solid phase, whereby the respective labeled antibodies combine with the corresponding substances to be determined. The solid phase is then separated off and the total activity of the marking agent bound to the solid phase is measured. In this way, the total amount of the four substances to be determined can be determined in a single sample and at the same time.

Ais unlöslicher teilchenförmigerTräger zur Ausführung der erfindungsgemässen Agglutinationsreaktion kann jeder der üblicherweise benutzten Träger verwendet werden. Es handelt sich beispielsweise um Bakterienzellen, rote Blutzellen usw., organische Polymerlatices wie Polystyrollatex, Latex von Polystyrolen mit eingebauten Carboxylgruppen, Latices von Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren, Latices solcher Copolymere, die Hydroxyl oder Carboxylgruppen eingebaut enthalten, Poiyvinylalkohol-Latex, Polyacrylat-Latex, Vinylacetat-Acryl-Copolymer-Latex usw.;anorganische Substanzen wie Kieselerde, Russ, Tonerde usw. Diese Stoffe können für sich oder in Kombination verwendet werden. Any of the commonly used carriers can be used as an insoluble particulate carrier for carrying out the agglutination reaction of the present invention. These are, for example, bacterial cells, red blood cells etc., organic polymer latexes such as polystyrene latex, latex of polystyrenes with built-in carboxyl groups, latices of styrene-divinylbenzene copolymers, latices of such copolymers which contain hydroxyl or carboxyl groups, polyvinyl alcohol latex, polyacrylate latex , Vinyl acetate-acrylic copolymer latex, etc.; inorganic substances such as silica, carbon black, alumina, etc. These substances can be used alone or in combination.

Als unlösliche Träger für die Sandwich-Methode, das Verfahren mit konkurrenzierenden Reaktionen und die immu-nometrische Methode bei der Durchführung der Erfindung kommen die Träger in Frage, die üblicherweise schon verwendet werden, wie Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylharze, Polytetrafluorethylen, Papier, Glas, Agarose usw., und zwar für sich oder in Kombination. Die Form des Trägers kann der Methode angepasst sein, z.B. Kugeln, Stäbe, Scheiben oder aber Behälter wie optische Messzellen, Reagenzgläser usw. Andere Formen sind ebenfalls anwendbar. As insoluble carriers for the sandwich method, the process with competitive reactions and the immunometric method in carrying out the invention, the carriers which are usually already used are used, such as polystyrene, polyethylene, polyacrylic resins, polytetrafluoroethylene, paper, glass, Agarose, etc., alone or in combination. The shape of the carrier can be adapted to the method, e.g. Balls, rods, disks or containers such as optical measuring cells, test tubes, etc. Other shapes can also be used.

Die in den erfindungsgemässen Bestimmungsverfahren verwendeten Antikörper können die normalen muliklonalen Antikörper sein. Die Verwendung monoklonaler Antikörper ergibt noch bessere Ergebnisse. Monoklonale Antikörper erhöhen beispielsweise die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmungen, verkürzen die Reaktionszeiten, verbessern die Spezifizität, vereinfachen die Analysenoperationen, gestatten den Ausschluss jeglicher unspezifischer Reaktionen und jeglicher Behinderungen von Reaktionen, die von anderen Komponenten der Probe wie Serum, Urin usw. herrühren können, u.a.m. Wenn monoklonale Antikörper bei der Agglutinierungsreaktion anzuwenden sind, so ist es erforderlich, in Kombination zwei oder mehrere monoklonale Antikörper entsprechend den unterschiedlichen Anti-genstellen einer der zu bestimmenden Substanzen einzusetzen, damit eine Agglutinierung eingeleitet wird. The antibodies used in the determination methods according to the invention can be the normal multiclonal antibodies. The use of monoclonal antibodies gives even better results. Monoclonal antibodies, for example, increase the sensitivity and accuracy of the determinations, shorten the reaction times, improve the specificity, simplify the analysis operations, allow the exclusion of any non-specific reactions and any hindrance to reactions which may result from other components of the sample such as serum, urine, etc. etc. If monoclonal antibodies are to be used in the agglutination reaction, it is necessary to use two or more monoclonal antibodies in combination corresponding to the different anti-gene sites of one of the substances to be determined, so that agglutination is initiated.

Als Arbeitsverfahren zum Binden von einem oder mehreren Antikörpern oder Antigenen an unlöslicheTräger können beispielsweise die in Clinica Chimica Acta 48, 15 (1973); Journal of Immunology 116, 1554(1976) und Science 158, 1570 (1967) beschriebenen Methoden angewandt werden. Wenn zwei oder mehrere Antikörper an einen einzigen unlöslichen Träger zu binden sind, so bereitet man am besten zunächst eine Antikörper-Lösung durch Vermischen der zu bindenden Antikörper in den gewünschten Mengenverhältnissen. Als Beispiel sei eine Lösung genannt, die 0,5 mg/ml Anti-AFP-Antikörper, 0,1 mg/ml Anti-HCG-Antikörper und 0,25 mg/ml Anti-CEA-Antikörper in 0,05 M phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung (PBS) vom pH 6,4 enthält. Diese Lösung wird dann in Berührung mit den unlöslichen Trägern gebracht, und man lässt die Reaktion bei 30 bis 56°C 2 bis 3 Stunden lang ablaufen. Nach der Umsetzung wäscht man die Träger mit physiologischer Salzlösung und erhält den gewünschten antikörpergebundenen Träger. For example, as a working method for binding one or more antibodies or antigens to insoluble carriers, those described in Clinica Chimica Acta 48, 15 (1973); Journal of Immunology 116, 1554 (1976) and Science 158, 1570 (1967) can be used. If two or more antibodies are to be bound to a single insoluble carrier, it is best to prepare an antibody solution first by mixing the antibodies to be bound in the desired proportions. An example is a solution that contains 0.5 mg / ml anti-AFP antibody, 0.1 mg / ml anti-HCG antibody and 0.25 mg / ml anti-CEA antibody in 0.05 M phosphate-buffered physiological Contains saline solution (PBS) of pH 6.4. This solution is then brought into contact with the insoluble carriers and the reaction is allowed to proceed at 30 to 56 ° C for 2 to 3 hours. After the reaction, the supports are washed with physiological saline and the desired antibody-bound support is obtained.

Will man einzeln den Anti-AFP-Antikörper, den Anti-HCG-Antikörper und den Anti-CEA-Antikörper an verschiedene unlösliche Träger binden, so löst man die einzelnen Antikörper getrennt in 0,05 M PBS vom pH 6,4 zu einer Konzentration von jeweils 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml bzw. 0,25 mg/ml, bringt die Lösungen dann einzeln in Berührung mit getrennten unlöslichen Trägern und lässt jedes Gemisch bei 30 bis 56°C 2 bis 3 Stunden lang reagieren. Nach der Reaktion werden die unlöslichen Träger dann mit physiologischer Salzlösung gewaschen, und man erhält die einzelnen, mit Antikörper versehenen Träger. If one wishes to bind the anti-AFP antibody, the anti-HCG antibody and the anti-CEA antibody individually to different insoluble carriers, the individual antibodies are dissolved separately in 0.05 M PBS of pH 6.4 to a concentration of 0.5 mg / ml, 0.1 mg / ml and 0.25 mg / ml, respectively, then individually brings the solutions into contact with separate insoluble carriers and leave each mixture at 30 to 56 ° C. for 2 to 3 hours react. After the reaction, the insoluble carriers are then washed with physiological saline, and the individual carriers provided with antibodies are obtained.

Das M ischungsverhältnis der einzelnen so erhaltenen Antikörper wählt man in vorteilhafter Weise im Bereich ( 1 bis 10) : ( 1 bis 10) : ( 1 bis 10), obschonesje nach der Menge jedes Antikörpers, der an den unlöslichen Träger zu binden ist, und dem Titer des erhaltenen unlöslichen Antikörpers schwanken und auch andere Werte annehmen kann. The mixing ratio of the individual antibodies thus obtained is advantageously selected in the range (1 to 10): (1 to 10): (1 to 10), although depending on the amount of each antibody to be bound to the insoluble support, and the titre of the insoluble antibody obtained can fluctuate and can also assume other values.

Die Menge jedes an unlösliche Träger zu bindenden Antikörpers beträgt bevorzugt jeweils 10 bis 0,05 mg/ml, insbesondere 5 bis 0,1 mg/ml, obschon sie je nach Art der zu The amount of each antibody to be bound to insoluble carrier is preferably in each case 10 to 0.05 mg / ml, in particular 5 to 0.1 mg / ml, although it depends on the nature of the

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bestimmenden Substanz, der Menge solcher Substanz in der Probe, dem Titer jedes Antikörpers usw. in praktisch beliebigen Grenzen schwanken kann. determining substance, the amount of such substance in the sample, the titer of each antibody, etc. can vary within practically any limits.

Bei der Ausführung der Bestimmungen stellt man die optimalen Bedingungen durch einfachen Versuch fest, da die Menge der anzuwendenden Probe, die Menge jedes markierten Antikörpers oder markierten Antigens sowie die einzelnen Reaktionsbedingungen wie Reaktionszeit, Reaktionstemperatur usw. von der Art jeder zu bestimmenden Substanz, dem Titer jedes verwendeten Antikörpers, der Art des Markierungsmittels usw. abhängen. When carrying out the determinations, the optimum conditions are determined by a simple experiment, since the amount of the sample to be used, the amount of each labeled antibody or labeled antigen and the individual reaction conditions such as reaction time, reaction temperature etc. depend on the type of each substance to be determined, the titer depend on each antibody used, the type of marker, etc.

Die Erzeugung des markierten Antikörpers und des markierten Antigens kann auf übliche Weise geschehen. The labeled antibody and the labeled antigen can be generated in the usual way.

Wenn das erfindungsgemässe Verfahren nach der Methode der konkurrenzierenden Reaktionen ausgeführt werden soll, so wird als markiertes Antigen ein solches verwendet, das sich an den insolubilisierten Antikörper in Konkurrenz mit der zu bestimmenden Substanz bindet, so dass im allgemeinen die gleiche Substanz wie die zu bestimmende Substanz als Antigen Verwendung findet. Es können jedoch die im menschlichen Körper vorkommenden physiologisch aktiven Substanzen an andere Körperkomponenten gebunden vorliegen oder einem partiellen Stoffwechsel unterliegen, und sie sind daher manchmal von analogen, ausserhalb des menschlichen Körpers vorliegenden Substanzen verschieden. In solchen Fällen kann demnach eine" Substanz, die praktisch die gleiche Reaktivität vom immunologischen Standpunkt aufweist, als mit der zu messenden Substanz identisch angesehen und eingesetzt werden. If the method according to the invention is to be carried out according to the competitive reaction method, the labeled antigen used is one which binds to the insolubilized antibody in competition with the substance to be determined, so that in general the same substance as the substance to be determined is used as an antigen. However, the physiologically active substances occurring in the human body may be bound to other body components or may be subject to a partial metabolism, and they are therefore sometimes different from analogous substances which are present outside the human body. In such cases, a "substance that has practically the same reactivity from the immunological point of view can be regarded and used as identical to the substance to be measured.

Obschon es die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, mindestens zwei Substanzen gleichzeitig zu bestimmen, ist es ebenfalls möglich, eine einzige Substanz mit Hilfe eines einzigen markierten Antikörpers zu bestimmen, auch wenn zwei oder mehrere insolubilisierte Antikörper verwendet werden, ausser wenn die zu bestimmenden Substanzen einander stören. Although the main object of the present invention is to determine at least two substances at the same time, it is also possible to determine a single substance with the aid of a single labeled antibody, even if two or more insolubilized antibodies are used, unless the substances to be determined are mutually exclusive to disturb.

Als Markierungsmittel können Enzyme wie Peroxidase, ß-Galactosidase, Alkaliphosphatase, Glucoseoxidase usw., Radioisotope wie 125J,3H usw., Fluore wie Fluorescein-iso-thiocyanat, Tetramethylrhodamin-isothiocyanat usw. eingesetzt werden. Enzymes such as peroxidase, β-galactosidase, alkali phosphatase, glucose oxidase etc., radioisotopes such as 125J, 3H etc., fluorine such as fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate etc. can be used as the labeling agent.

Bei der Agglutinierungsreaktion kann die Gesamtmenge der beiden oder mehreren zu bestimmenden Substanzen gleichzeitig gemessen werden, wenn man den Träger verwendet, der zwei oder mehrere Antikörper gebunden enthält und wie oben beschrieben erhältlich ist. Beim Sandwich-Verfahren und der Methode der konkurrenzierenden Reaktionen kann die Gesamtmenge der beiden oder mehreren zu bestimmenden Substanzen gleichzeitig gemessen werden, wenn man zwei oder mehrere markierte Antigene oder Antikörper verwendet, die den zwei oder mehreren Antikörpern entsprechen, die wie oben beschrieben an unlösliche Träger gebunden wurden. Weiterhin ist sowohl nach der Sandwich-Methode als auch nach der Methode der konkurrenzierenden Reaktionen die Bestimmung einer einzigen Substanz möglich, wenn man ein einziges markiertes Antigen oder einen einzigen markierten Antikörper verwendet. Beispielsweise gibt man eine geeignet verdünnte Probe in ein Reagenzglas, in dem ein Antikörper gebunden ist, und man lässt die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen. Nach deren Vervollständigung wird das Reagenzglas mit destilliertem Wasser gewaschen, ein markierter Antikörper wird zugegeben, und man lässt reagieren. Dann wird mit destilliertem Wasser gewaschen und die Aktivität des Markierungsmittels in der festen Phase, nämlich dem Reagenzglas, durch geeignete Mittel gemessen. Aus dem so erhaltenen Messwert kann man die Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe berechnen, und zwar auf Grund der Eichkurve, die man durch analoge Arbeitsschritte mit Standardsubstanzen bekannter Konzentrationen erhalten hat. Im beschriebenen Fall kann die Standardsubstanz entweder ein einzelnes Antigen oder ein Gemisch mehrerer Antigene sein. In the agglutination reaction, the total amount of the two or more substances to be determined can be measured at the same time by using the carrier which contains two or more antibodies bound and is obtainable as described above. In the sandwich method and the competitive reaction method, the total amount of the two or more substances to be determined can be measured at the same time by using two or more labeled antigens or antibodies which correspond to the two or more antibodies which are insoluble carriers as described above were bound. Furthermore, the determination of a single substance is possible both by the sandwich method and by the method of the competitive reactions if a single labeled antigen or a single labeled antibody is used. For example, a suitably diluted sample is placed in a test tube in which an antibody is bound and the antigen-antibody reaction is allowed to proceed. After completion, the test tube is washed with distilled water, a labeled antibody is added and allowed to react. Then it is washed with distilled water and the activity of the marking agent in the solid phase, namely the test tube, is measured by suitable means. The amount of the substance to be determined in the sample can be calculated from the measurement value obtained in this way, based on the calibration curve obtained by analogous working steps with standard substances of known concentrations. In the case described, the standard substance can either be a single antigen or a mixture of several antigens.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann man alle Substanzen bestimmen, die den üblichen immunologischen Bestimmungsmethoden zugänglich sind. Besonders wichtige Analysensubstanzen sind Tumormerkmal-Stoffe, die für die Früherkennung von Tumoren äusserst wichtig sind und auch die Beurteilung therapeutischer Wirkungen auf Tumoren gestatten. With the method according to the invention, it is possible to determine all substances which are accessible to the customary immunological determination methods. Particularly important analytical substances are tumor feature substances, which are extremely important for the early detection of tumors and also allow the assessment of therapeutic effects on tumors.

Beispiele solcher Merkmalstoffe sind Carcinoembryo-Antigen (Abkürzung: CEA), a-Fetoprotein (AFP), Human-Chorio-Gonadotropin (HCG), ß2-Microglobulin (ß2m), basisches Fetoprotein (BFP), Alkaliphosphatase (ALP), y-Glut-amyltranspeptidase (y-GTP), schwangerschaftsassoziiertes ß2-Glycoprotein (SPi), schwangerschaftsassoziiertes cu-Gly-coprotein (SP3), immunosuppressives Säureprotein (IAP), immunosuppressives « 2-Macroglobulin, Säure-Isoferritin, Fibrinogen, Haptoglobin, Calcitonin, Steroidhormone, Polyamine, DNA-Bindungsproteine, ai-Antitrypsin, Pan-creas-Oncofetalantigen, Galactosyltransferase (GT-II) usw. sowie noch viele andere zurZeit untersuchte Substanzen. Weiterhin seien als Substanzen, die bei der Diagnose und Prophylaxe von Hepatitis bedeutsam sind, die durch Infektion mit Hepatitisviren nach Bluttransfusionen hervorgerufen wird, die Antigene von Hepatitis-B-Viren (HBs, HBc, HBe) und Antigene für Hepatitis-Viren ausser A- und B-Hepatitis zu nennen. Examples of such characteristic substances are carcinoembryo antigen (abbreviation: CEA), a-fetoprotein (AFP), human chorio-gonadotropin (HCG), ß2-microglobulin (ß2m), basic fetoprotein (BFP), alkali phosphatase (ALP), y-glow -amyltranspeptidase (y-GTP), pregnancy-associated ß2-glycoprotein (SPi), pregnancy-associated cu-gly-coprotein (SP3), immunosuppressive acid protein (IAP), immunosuppressive «2-macroglobulin, acid isoferritin, fibrinogen, calcinoglobulin, haptoglobin Polyamines, DNA binding proteins, ai-antitrypsin, pan-areas-oncofetal antigen, galactosyltransferase (GT-II) etc. and many other substances currently under investigation. Furthermore, the substances which are important in the diagnosis and prophylaxis of hepatitis, which are caused by infection with hepatitis viruses after blood transfusions, are the antigens of hepatitis B viruses (HBs, HBc, HBe) and antigens for hepatitis viruses other than A- and to name B hepatitis.

Beispiele für Kombinationen zweier oder mehrerer unterschiedlicher Substanzen, die zu bestimmen sind, umfassen ( 1 ) AFP, CEA, HCG ; (2) SP3, Fibrinogen ; (3) AFP, CEA, HCG, SP3, Fibrinogen;(4) Fibrinogen, Haptoglobin, Ferritin ; (5) Haptoglobin, ß2m, immunosuppressives ct2-Macro-globulin, ai-Antitrypsin ; (6) ALP, y-GTP, GT-1I;(7) Polyamine, Steroidhormone;(8) HBs, HBc, HBe usw. Examples of combinations of two or more different substances to be determined include (1) AFP, CEA, HCG; (2) SP3, fibrinogen; (3) AFP, CEA, HCG, SP3, fibrinogen; (4) fibrinogen, haptoglobin, ferritin; (5) haptoglobin, β2m, immunosuppressive ct2 macroglobulin, ai-antitrypsin; (6) ALP, y-GTP, GT-1I; (7) polyamines, steroid hormones; (8) HBs, HBc, HBe, etc.

Die Ausführung der vorliegenden Erfindung führt zu verkürzten Bestimmungszeiten. Bisher mussten, wenn eine Anzahl von Antigenen zu bestimmen war, auf übliche Weise die einzelnen Antigene getrennt und nacheinander bestimmt werden, wobei viel Zeit verbraucht wurde. Jetzt kann zudem die Probenmenge beträchtlich verringert werden. The implementation of the present invention leads to shorter determination times. Until now, when a number of antigens had to be determined, the individual antigens had to be separated in the usual way and determined one after the other, with a lot of time being used. Now the amount of sample can also be reduced considerably.

Die Erfindung soll nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht werden. The invention will now be further illustrated by the following non-limiting examples.

Beispiel I Example I

Bestimmung der Gesamtmenge an Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin a) Herstellungeines Latex-Reagens mit gebundenem Antikörper Determination of the total amount of fibrinogen, haptoglobin and ferritin a) Preparation of a latex reagent with bound antibody

Man verdünnte Antifibrinogen-Antikörper (DAKO CO.), Antihaptoglobin-Antikörper (DAKO CO.) und Antiferritin-Antikörper(DAKO CO.) und mischte sie in 0.05 M phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung vom pH 6,4 (nachstehend als PBS abgekürzt). Die Mengen wurden so gewählt, dass sich Konzentrationen von 5 mg/ml, 1,8 mg/ml bzw. 0.7 mg/ml ergaben. Zu 2 ml der so erhaltenen Misch-Antikörper-Lösung wurde 0,5 ml einer 10%igen Polystyrol-latex-Suspension (gleichförmige Latexteilchen, Dow Chemical Co.) gegeben und das Ganze unter Rühren 2 Stunden lang bei 37°C umgesetzt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Gemisch abgekühlt (Eisbad), zentri-fugiert, mit PBS gewaschen und in PBS aufgeschlämmt, welches 1% Rinderserum-Albumin (Abkürzung: BSA) enthielt. Dies ist das Latex-Reagens mit gebundenen Antikörpern. Antifibrinogen antibodies (DAKO CO.), Antihaptoglobin antibodies (DAKO CO.) And antiferritin antibodies (DAKO CO.) Were diluted and mixed in 0.05 M phosphate-buffered physiological saline, pH 6.4 (hereinafter abbreviated as PBS). The amounts were chosen so that concentrations of 5 mg / ml, 1.8 mg / ml and 0.7 mg / ml resulted. 0.5 ml of a 10% strength polystyrene latex suspension (uniform latex particles, Dow Chemical Co.) was added to 2 ml of the mixed antibody solution thus obtained, and the whole was reacted with stirring at 37 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the mixture was cooled (ice bath), centrifuged, washed with PBS and slurried in PBS containing 1% bovine serum albumin (abbreviation: BSA). This is the latex reagent with bound antibodies.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

664 018 664 018

6 6

b) Herstellung der Standardlösungen b) Production of standard solutions

Fibrinogen (Sigma Co.). Haptoglobin (Sigma Co.) und Ferritin (Sigma Co.) wurden einzeln mit PBS, enthaltend-1% BSA. auf eine Konzentrationsreihe von 120, 60, 30, 15 und 0 Lig/ml. 12. 6, 3, 1,5 und 0 |ig/ml bzw. 0,8, 0,4, 0,2, 0.1 und 0 Lig/ml verdünnt. Fibrinogen (Sigma Co.). Haptoglobin (Sigma Co.) and ferritin (Sigma Co.) were treated individually with PBS containing 1% BSA. to a concentration series of 120, 60, 30, 15 and 0 lig / ml. 12. 6, 3, 1.5 and 0 | ig / ml or 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 and 0 lig / ml diluted.

c) Bestimmungen von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin c) Determinations of fibrinogen, haptoglobin and ferritin

Auf ein Glasplättchen brachte man 20 p.1 jeder der unter b) aufgeführten Lösungen von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin mit den angegebenen Konzentrationen. Dann wurden jeweils 50 (xl DER 1% BSA enthaltenden PBS sowie 20 ul des unter a) beschriebenen Reagens zugegeben. Man liess das Gemisch unter Rühren 3 Minuten reagieren, und dann wurde der Grad der Agglutination unter dem Mikroskop beobachtet. Eine Reaktion ohen Agglutination wurde als negativ (-) bewertet und Reaktionen mit Agglutination positiv( + , ++, + + +je nach Ausmass), dasergibt vier Stufen. Die Empfindlichkeit des Reagens gegenüber Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin betrug 15 ^g/ml, 1,5 H-g/ml bzw. 0.1 p.g/ml. 20 p.1 of each of the solutions of fibrinogen, haptoglobin and ferritin listed under b) were placed on a glass plate at the concentrations indicated. Then 50 (xl DER 1% BSA containing PBS and 20 ul of the reagent described under a) were added. The mixture was allowed to react with stirring for 3 minutes, and then the degree of agglutination was observed under the microscope. A reaction without agglutination was rated negative (-) and reactions with agglutination positive (+, ++, + + + depending on the extent), that gives four levels. The sensitivity of the reagent to fibrinogen, haptoglobin and ferritin was 15 ^ g / ml, 1.5 H-g / ml and 0.1 p.g / ml, respectively.

Beispiel 2 Example 2

Bestimmungen in Serumproben von Patienten Unter Verwendung von Serumproben, die man von folgenden Personengruppen erhalten hatte: 18 Leberkrebspatienten, 20 Magenkrebspatienten, 20 Dickdarmkrebspatienten, 8 Lungenkrebspatienten, 25 Patienten mit verschiedenen benignen Geschwulsten und 20 gesunden Personen, wurden Bestimmungen nach dem erfindungsgemässen Verfahren ausgeführt. Die Arbeitsweisen bei den Bestimmungen waren analog denjenigen des Beispiels lc). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Determinations in Serum Samples from Patients Using serum samples obtained from the following groups of people: 18 liver cancer patients, 20 gastric cancer patients, 20 colon cancer patients, 8 lung cancer patients, 25 patients with various benign tumors and 20 healthy persons, determinations were carried out according to the method according to the invention. The procedures for the determinations were analogous to those of example lc). The results are summarized in Table 1.

Tabelle 1 Table 1

Krankheit bzw. Anzahl Bewertung positive Be- Illness or number of evaluations positive

Zustand Patienten - + ++ + + + Wertungen,0/» Condition patients - + ++ + + + evaluations, 0 / »

Leberkrebs Liver cancer

18 18th

1 1

2 2nd

9 9

6 6

94 94

Magenkrebs Stomach cancer

20 20th

3 3rd

4 4th

8 8th

5 5

85 85

Dickdarmkrebs Colon cancer

20 20th

2 2nd

3 3rd

7 7

8 8th

90 90

Lungenkrebs Lung cancer

8 8th

0 0

2 2nd

4 4th

2 2nd

100 100

Benigne Benign

Krankheiten Diseases

25 25th

19 19th

5 5

1 1

0 0

24 24th

Gesunde Personen Healthy people

20 20th

18 18th

2 2nd

0 0

10 10th

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurde bei Krebspatienten eine hohe prozentuale positive Bewertung gefunden, was die Nützlichkeit des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens bei der Überwachung und Diagnose von Krebspatienten bzw. krebsverdächtigen Personen beweist. As can be seen from Table 1, a high percentage positive evaluation was found in cancer patients, which proves the usefulness of the determination method according to the invention in the monitoring and diagnosis of cancer patients or suspected cancer patients.

Beispiel 3 Example 3

Bestimmung der Gesamtmenge von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin a) Herstellung eines Latex mit gebundenem Antikörper gegen Fibrinogen Determination of the total amount of fibrinogen, haptoglobin and ferritin a) Preparation of a latex with bound antibody against fibrinogen

Man verdünnte Antifibrinogen-Antikörper (DAKO CO.) mit PBS auf eine Konzentration von 5 mg/ml. Zu 2 ml dieser Verdünnung wurde 0,5 ml einer 10%igen Latexsuspension (Polystyrol-Latex, Dow Chemical Co., mittlerer Teilchendurchmesser 0,48 |im) gegeben, das Gemisch gerührt und bei 37°C 2 Stunden reagieren gelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Eisgekühlt, Antifibrinogen antibodies (DAKO CO.) Were diluted with PBS to a concentration of 5 mg / ml. 0.5 ml of a 10% latex suspension (polystyrene latex, Dow Chemical Co., average particle diameter 0.48 μm) was added to 2 ml of this dilution, the mixture was stirred and allowed to react at 37 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was ice-cooled,

zentrifugiert, mit PBS gewaschen und schliesslich in PBS enthaltend 1% BSA suspendiert. centrifuged, washed with PBS and finally suspended in PBS containing 1% BSA.

b) Herstellung eines Latex mit gebundenem Antikörper gegen Haptoglobin b) Preparation of a latex with bound antibody against haptoglobin

5 Man verdünnte Antihaptoglobin-Antikörper (DAKO CO.) mit PBS auf eine Konzentration von 1,8 mg/ml, und diese Verdünnung wurde analog Teil a) mit einer 10%igen Latexsuspension von Polystyrollatex zur Reaktion gebracht, wobei man den an Latex gebundenen Antihaptoglobin-Anti-10 körper erhielt. 5 Antihaptoglobin antibodies (DAKO CO.) Were diluted with PBS to a concentration of 1.8 mg / ml, and this dilution was reacted analogously to part a) with a 10% latex suspension of polystyrene latex, whereby the latex-bound Antihaptoglobin-Anti-10 body received.

c) Herstellung von Latex mit gebundenem Antikörper gegen Ferritin c) Production of latex with bound antibody against ferritin

Man verdünnte Antiferritin-Antikörper (DAKO CO.) mit 15 PBS auf eine Konzentration von 1,2 mg/ml, und diese Verdünnung wurde mit einer Suspension eines 10%igen Poly-styrol-Latex mit eingebauten Carboxylgruppen (Dow Chemical Co., mittlerer Teilchendurchmesser 0,25 jx) nach Art des Teils a) zur Erzeugung des an Latex gebundenen 20 Antiferritin-Antikörpers zur Reaktion gebracht. Antiferritin antibodies (DAKO CO.) Were diluted with 15 PBS to a concentration of 1.2 mg / ml, and this dilution was carried out with a suspension of a 10% polystyrene latex with incorporated carboxyl groups (Dow Chemical Co., medium Particle diameter 0.25 jx) brought about in the manner of part a) to produce the latex-bound 20 antiferritin antibody.

d) Herstellung des an Latex gebundenen Antikörper-Reagens d) Preparation of the antibody reagent bound to latex

Im Mengenverhältnis 2:5:1 vermischte man die gemäss Teilen a), b) und c) erhaltenen Suspensionen, nämlich den Antifibrinogen-Antikörper-Latex, den Antihaptoglobin-Antikörper-Latex und den Antiferritin-Antikörper-Latex. Man erhielt das gewünschte kombinierte Reagens. The suspensions obtained according to parts a), b) and c), namely the antifibrinogen-antibody latex, the antihaptoglobin-antibody latex and the antiferritin-antibody latex, were mixed in a ratio of 2: 5: 1. The desired combined reagent was obtained.

e) Bestimmung von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin 30 Jeweils 20 jil der nach Beispiel lb) erhaltenen Standardlösungen von Fibrinogen, Haptoglobin und Ferritin brachte man auf einen Objektträger, und zur Standardlösung auf dem Objektträger wurden je 50 ^.1 der 1% BSA enthaltenden PBS sowie 20 p.1 der Latexsuspension mit gebundenen Anti- e) Determination of fibrinogen, haptoglobin and ferritin 30 20 μl each of the standard solutions of fibrinogen, haptoglobin and ferritin obtained according to Example 1b) were placed on a slide, and the standard solution on the slide was each 50 ^ .1 of the 1% BSA-containing PBS as well as 20 p.1 of the latex suspension with bound anti

35 körpern, erhalten nach Abschnitt d) dieses Beispiels, 35 bodies obtained according to section d) of this example,

gegeben. Dieses Gemisch liess man durch Stehenlassen während 3 Minuten unter Rühren reagieren, und dann wurde das Ausmass der Agglutination unter dem Mikroskop beobachtet. Die Reaktionen ohne Agglutination wurden als 40 negativ ( — ) klassifiziert, während die Reaktionen mit Agglutination je nach Ausmass einfach ( + ), doppel (+ + ) oder dreifach positiv (+ + + ) bewertet wurden. Man wendete also eine vierstufige Bewertung an. Die Empfindlichkeit (Titer) des Reagens betrug nach diesen Messungen 15 ji.g/ml für 45 Fibrinogen, 1,5 |ig/ml für Haptoglobin und 0,1 (ig/ml für Ferritin. given. This mixture was allowed to react by stirring for 3 minutes, and then the extent of agglutination was observed under the microscope. The reactions without agglutination were classified as 40 negative (-), while the reactions with agglutination were rated as single (+), double (+ +) or triple positive (+ + +) depending on the extent. So a four-step evaluation was applied. The sensitivity (titer) of the reagent according to these measurements was 15 ji.g / ml for 45 fibrinogen, 1.5 | ig / ml for haptoglobin and 0.1 (ig / ml for ferritin.

Beispiel 4 Example 4

Bestimmungen an Serumproben von Patienten Determinations on patient serum samples

Mit dem Reagens gemäss Beispiel 3 wurden Serumproben so von 15 Patienten mit Leberkrebs, 20 Patienten mit Magenkrebs, 17 Patienten mit Dickdarmkrebs, 12 Patienten mit Lungenkrebs, 25 Patienten mit verschiedenen benignen Krankheiten und 20 gesunde Personen untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. With the reagent according to Example 3, serum samples of 15 patients with liver cancer, 20 patients with stomach cancer, 17 patients with colon cancer, 12 patients with lung cancer, 25 patients with various benign diseases and 20 healthy people were examined. The results are shown in Table 2.

Tabelle 2 Table 2

Krankheit, Illness,

Anzahl number

Bewertung rating

positive positive

Zustand Status

Personen people

- -

+ +

++ ++

++ + ++ +

Bewertung, % Rating, %

Leberkrebs Liver cancer

15 15

l l

2 2nd

7 7

5 5

93 93

Magenkrebs Stomach cancer

20 20th

3 3rd

4 4th

8 8th

5 5

85 85

Dickdarmkrebs Colon cancer

17 17th

2 2nd

6 6

7 7

88 88

Lungenkrebs Lung cancer

12 12

1 1

2 2nd

6 6

3 3rd

92 92

Benigne Benign

Krankheiten Diseases

25 25th

20 20th

4 4th

1 1

0 0

20 20th

Gesunde Personen Healthy people

20 20th

19 19th

1 1

0 0

5 5

7 7

664018 664018

Wie aus derTabelle 2 hervorgeht, ist den Krebspatienten eine sehr hohe positive Bewertung insgesamt zuzuordnen. Dadurch wird die Nützlichkeit der Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung eindrücklich nachgewiesen. As can be seen from Table 2, the cancer patients can be assigned a very high overall positive rating. This clearly demonstrates the usefulness of the determination method of the present invention.

Beispiel 5 Example 5

Herstellung von gereinigtem AFP und Anti-AFP-Antikörper a) Herstellung von gereinigtem AFP Production of Purified AFP and Anti-AFP Antibody a) Production of Purified AFP

Aus 5 1 Bauchhöhlenflüssigkeit von Leberkrebspatienten wurden durch Aussalzen mit Ammuniumsulfat 16,2 g rohes AFP-Extrakt gewonnen. Der rohe Extrakt wurde durch Affi-nitäts-Chromatographie unter Verwendung von 50 ml Sepha-rose 4B, die Antikörper gegen Kaninchen-AFP gebunden enthielt (1 mg Antikörper/ml Sepharose), gereinigt, wobei man 924 mg gereinigtes AFP erhielt. From 5 liters of abdominal cavity fluid from liver cancer patients, 16.2 g of crude AFP extract were obtained by salting out with ammonium sulfate. The crude extract was purified by affinity chromatography using 50 ml Sepha-rose 4B containing antibodies to rabbit AFP (1 mg antibody / ml Sepharose) to give 924 mg of purified AFP.

b) Herstellung von monoklonalem Anti-AFP-Antikörper b) Production of monoclonal anti-AFP antibody

50 ng des nach Abschnitt a) erhaltenen gereinigten AFP 50 ng of the purified AFP obtained according to section a)

wurden zusammen mit Freunds Komplettzusatz (FCA) einer weiblichen Maus BALB/c subkutan injiziert. Die Gaben wurden viermal im Abstand von je einer Woche wiederholt, und vierTage nach der letzten Verabreichung wurde die Milz isoliert und die Milzzellen gesammelt. Die Milzzellen wurden mit modifiziertem MEM-Milieu nach Dulbecco (D-MEM) gewaschen. 1 x I08 Zellen wurden gezählt und mit 1 x 107Mausmyelom-Zellen(P3-NSI/l-Ag 4-1) vermischt. Dann wurde in I ml D-MEM, enthaltend 42,5% Polyethy-lenglycol 1540 und 7,5% Dimethylsulfoxid, bei 37°C während einer Minute eine Zellfusion durchgeführt. Zu diesen Zellen wurde HAT-Milieu (RPMI-1640-Milieu, enthaltend Hypo-xanthin, Aminopterin, Thymidin und 10% Rinderfoetus-serum) bis auf 20 ml gegeben. Jeweils 0,2 ml der Mischung wurde in einem 96teiligen Mikroplatten-Kulturapparat 2 Wochen lang kultiviert, wonach man die Antikörperaktivität im Uberstehenden der sich ausgebreiteten gesammelten Kulturen bestimmte. were injected subcutaneously with Freund's Complete Supplement (FCA) of a BALB / c female mouse. The doses were repeated four times one week apart, and four days after the last administration, the spleen was isolated and the spleen cells were collected. The spleen cells were washed with a modified MEM medium according to Dulbecco (D-MEM). 1 x I08 cells were counted and mixed with 1 x 107 mouse myeloma cells (P3-NSI / l-Ag 4-1). Then, cell fusion was carried out in 37 ml of D-MEM containing 42.5% of polyethylene glycol 1540 and 7.5% of dimethyl sulfoxide at 37 ° C. for one minute. HAT medium (RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine and 10% bovine fetus serum) was added to these cells up to 20 ml. 0.2 ml portions of the mixture were cultured in a 96-part microplate culture apparatus for 2 weeks, after which the antibody activity in the supernatant of the spreading cultures was determined.

Dann wurden die Zellen der einzelnen Gefässe, die Aktivität zeigten, gesammelt und zu 40 ml Milieu RPM1-1640 gegeben, welches 10% Rinderfoetusserum undThymuszellen von BALB/c-Mäusen enthielt. Diese Zellsuspension wurde auf zwei 96gefässige Mikroplattenapparate verteilt und eine Woche lang kultiviert, wodurch man 9 Klone eines Anti-AFP-Antikörper-produzierenden Hybridoms erhielt. Diese wurden in Grosskulturen überführt, und 1 Liter des Überstehenden jeder erhaltenen Kultur wurde einer Affinitätschromatographie mit 50 ml einer Sephadose 4B, die gebundenes gereinigtes AFP enthielt (0,5 mg AFP/ml Sephadose), unterzogen, und man erhielt 4,2 bis 11,6 mg monoklonale Antikörper. Die Antikörper wurden mit den Chargen-Nummern 1 bis 9 versehen. The cells of the individual vessels showing activity were then collected and added to 40 ml of RPM1-1640 medium containing 10% bovine fetus serum and thymus cells from BALB / c mice. This cell suspension was divided into two 96-well microplate apparatus and cultured for one week to obtain 9 clones of an anti-AFP antibody-producing hybridoma. These were transferred to large cultures, and 1 liter of the supernatant of each culture obtained was subjected to affinity chromatography with 50 ml of Sephadose 4B containing bound purified AFP (0.5 mg AFP / ml Sephadose), and 4.2 to 11 were obtained , 6 mg of monoclonal antibodies. The antibodies were provided with batch numbers 1 to 9.

c) Identifizierung von Antigen-Erkennungsstellen c) Identification of antigen recognition sites

1 ) Herstellung von Reagenzgläsern mit gebundenem Anti-AFP-Antikörper 1) Production of test tubes with bound anti-AFP antibody

Jeweils 1 ml PSB, enthaltend 0,5 mg eines der neun Chargen der erhaltenen monoklonalen Anti-AFP-Anti-körper, wurden in jeweils ein Reagenzröhrchen aus Polystyrol gegeben, welche zuvor mit PBS gewaschen worden waren, und jedes Röhrchen wurde 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert, um die Bindung des Antikörpers an die Innenwandung des Reagenzröhrchens zu erleichtern. Nach der Reaktion wurden die Teströhrchen mit PBS gewaschen. Each 1 ml of PSB containing 0.5 mg of one of the nine batches of the obtained monoclonal anti-AFP antibodies was placed in a polystyrene test tube, which had been previously washed with PBS, and each tube was stirred for 3 hours Incubated at 37 ° C to facilitate the binding of the antibody to the inner wall of the test tube. After the reaction, the test tubes were washed with PBS.

2) Herstellung von enzym-markiertem Anti-AFP-Anti-körper 2) Production of enzyme-labeled anti-AFP anti-bodies

5 mg Meerrettich-Peroxydase (Boehringer Mannheim AG), Nr. 1 (nachstehend als HRPO abgekürzt) wurden in 1 ml 0,3 M Natriumbicarbonatpuffer gelöst, und zu dieser Lösung wurde 0,1 ml einer l%igen Lösung von l-Fluor-2,4-dinitrobenzol in Ethanol gegeben und die Mischung eine 5 mg of horseradish peroxidase (Boehringer Mannheim AG), No. 1 (hereinafter abbreviated as HRPO) were dissolved in 1 ml of 0.3 M sodium bicarbonate buffer, and 0.1 ml of a 1% solution of 1-fluorine was added to this solution. 2,4-dinitrobenzene in ethanol and the mixture a

Stunde lang reagieren gelassen. Dann wurde zum Gemisch 1,0 ml einer 0,06 M Natriumperjodatlösung gegeben, die Reaktion 30 Minuten lang ausgeführt, dann 1,0 ml einer 0,16 M Ethylenglykollösung zugegeben und die Reaktion 5 eine Stunde lang fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen eine 0,01 M Sosalösung vom pH 9,5 dialysiert. Zum Dialysat wurden je 5 mg der neun Chargen der monoklonalen Antikörper gemäss Abschnitt b) gegeben, und jedes Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang io umgesetzt. Dann wurden je 5 mg Natriumborhydrid zugegeben und die Mischungen über Nacht stehen gelassen. Dann wurden die Reaktionsgemische gegen 0,01 M PBS vom pH 7,2 dialysiert. Man erhielt nun HRPO-markierte monoklonale Anti-AFP-Antikörper. Let react for an hour. Then, 1.0 ml of a 0.06 M sodium periodate solution was added to the mixture, the reaction was carried out for 30 minutes, then 1.0 ml of a 0.16 M ethylene glycol solution was added, and the reaction was continued for 5 hours. The reaction mixture was dialyzed against a 0.01 M Sosal solution of pH 9.5. 5 mg each of the nine batches of the monoclonal antibodies according to section b) were added to the dialysate, and each mixture was reacted for 3 hours at room temperature. Then 5 mg sodium borohydride were added and the mixtures were left to stand overnight. Then the reaction mixtures were dialyzed against 0.01 M PBS of pH 7.2. HRPO-labeled monoclonal anti-AFP antibodies were now obtained.

15 3) Identifizierung der Antigen-Erkennungsstellen 15 3) Identification of the antigen recognition sites

In jedes der mit Anti-AFP-Antikörper gebundenen Reagenzröhrchen, hergestellt nach Absatz 1), wurden 0.1 ml der mit PBS verdünnten Standardlösung gegeben, derart, dass jedes Röhrchen 100 ng/ml des nach Abschnitt a) erzeugten 20 AFP und 0,4 ml einer lOOfachen Verdünnung der mit HRPO markierten Anti-AFP-Antikörper, erhalten nach Absatz 2), enthielt. Dann wurde die Reaktion 30 Minuten lang ausgeführt. Nach deren Vervollständigung wurde jedes Röhrchen ausgewaschen und mit 0,5 ml einer Enzymsubstratlösung 25 befüllt, enthaltend 20 mg/dl o-Phenylendiamin und 6 mM Wasserstoffperoxid. Man liess 30 Minuten lang reagieren. Zum Stoppen der Enzymreaktion wurden 2 ml 1 N Salzsäure zugegeben, und es wurde die optische Absorption des Reak-tionsgemischs bei 492 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in 3o Tabelle 3 aufgeführt, wobei das Pluszeichen eine farberzeu-gende Kombination und das Minuszeichen eine Kombination ohne Farbbildung anzeigt. In each of the test tubes bound with anti-AFP antibody, prepared according to paragraph 1), 0.1 ml of the standard solution diluted with PBS was added, such that each tube 100 ng / ml of the 20 AFP produced according to section a) and 0.4 ml a 100-fold dilution of the anti-AFP antibodies labeled with HRPO, obtained according to paragraph 2). Then the reaction was carried out for 30 minutes. After completion, each tube was washed out and filled with 0.5 ml of an enzyme substrate solution 25 containing 20 mg / dl o-phenylenediamine and 6 mM hydrogen peroxide. The reaction was allowed to take 30 minutes. To stop the enzyme reaction, 2 ml of 1N hydrochloric acid were added and the optical absorption of the reaction mixture at 492 nm was determined. The results are shown in Table 3o, the plus sign indicating a color-generating combination and the minus sign indicating a combination without color formation.

35 35

Tabelle 3 Table 3

HRPO-markierte Antikörper HRPO-labeled antibodies

3 4 5 6 7 3 4 5 6 7

40 40

1 1

— -

+ +

— -

+ +

— -

+ +

ö ö

D- D-

V- V-

;Q ; Q

2 2nd

— -

+ +

— -

+ +

— -

+ +

3 3rd

— -

_ _

— -

+ +

— -

+ +

— -

+ +

e e

45 45

< <

4 4th

+ +

— -

+ +

— -

5 5

- -

+ +

- -

+ +

- -

+ +

w w

6 6

+ +

— -

+ +

- -

50 50

7 7

- -

+ +

- -

+ +

- -

+■ + ■

+ +

o O

C/2 g C / 2 g

8 8th

+ +

- -

+ +

- -

9 9

+ +

55 55

60 Auf Grund der Differenz der Antigen-Erkennungsstellen wurden die 9 Chargen der monoklonalen Antikörper in drei Gruppen eingeteilt, nämlich eine erste Gruppe mit den Chargen 1,2,3, 5 und 7, eine zweite Gruppe mit der Charge 6, und die dritte Gruppe mit den Chargen 4,8 und 9. Diese 65 Gruppen wurden als Anti-AFP-Antikörper (A), (B) und (C) bezeichnet. Davon wird (A) als insolubilisierter Antikörper und (C) als markierter Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet werden. 60 Based on the difference in the antigen recognition sites, the 9 batches of monoclonal antibodies were divided into three groups, namely a first group with batches 1, 2, 3, 5 and 7, a second group with batch 6, and the third group with batches 4.8 and 9. These 65 groups were designated anti-AFP antibodies (A), (B) and (C). Of these, (A) will be used as the insolubilized antibody and (C) as the labeled antibody in the following examples.

664 018 664 018

8 8th

Beispiel 6 Example 6

Herstellung von gereinigtem CEA und von Anti-CEA-Antikörper a) Herstellung von gereinigtem CEA Production of Purified CEA and Anti-CEA Antibody a) Production of Purified CEA

40 g Dickdarmkrebsgewebe wurden zerkleinert und nach Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser in einem Homogenisator homogenisiert. Zu dieser Suspension gab man ein gleiches Volumen 1,2 M Perchlorsäure, und das Gemisch wurde unter Rühren 30 Minuten lang extrahiert. Dann wurde zentrifugiert und die erhaltene Flüssigkeit gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei man einen rohen CEA-Extrakt erhielt. 40 g of colon cancer tissue were crushed and, after adding 100 ml of distilled water, homogenized in a homogenizer. An equal volume of 1.2 M perchloric acid was added to this suspension and the mixture was extracted with stirring for 30 minutes. It was then centrifuged and the liquid obtained was dialyzed against distilled water to obtain a crude CEA extract.

Dieser rohe Extrakt wurde zu 10 ml aufkonzentriert und das Konzentrat an Sephadose 4B gelfiltriert, die mit PBS equilibriert war. Es wurde die erste Proteinfraktion gesammelt. Diese Fraktion wurde an Sephadex 200 auf ähnliche Weise equilibriert, erneut gelfiltriert, und es wurde die zweite Proteinfraktion gesammelt, die dann zu 2 ml eingeengt wurde, welche 135 mg gereinigtes CEA enthielten. This crude extract was concentrated to 10 ml and the concentrate was gel filtered on Sephadose 4B, which was equilibrated with PBS. The first protein fraction was collected. This fraction was similarly equilibrated on Sephadex 200, gel filtered again and the second protein fraction was collected which was then concentrated to 2 ml containing 135 mg of purified CEA.

b) Herstellung von monoklonalem Anti-CEA-Antikörper b) Preparation of anti-CEA monoclonal antibody

Aus dem in Abschnitt a) erhaltenen gereinigten CEA From the purified CEA obtained in section a)

wurden nach Verfahrensweisen analog Beispiel 5b) acht Klone eines Anti-CEA-Antikörper erzeugenden Hybridoms erhalten. Zur Immunisierung der Mäuse wurden bei jeder Verabreichung 30 (ig des gereinigten CEA verwendet. eight clones of an anti-CEA antibody-producing hybridoma were obtained by procedures analogous to Example 5b). 30 µg of purified CEA was used to immunize the mice with each administration.

Einer weiblichen Maus BALB/c wurden 1 x 106 Hybridom-Zellen intraperitoneal injiziert. Die Maus hatte 0,5 ml Pri-stan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, Wako Pure Chemicals Co. Ltd) intraperitoneal erhalten. Nach zwei Wochen wurde die Bauchhöhlenflüssigkeit abgezogen und an DEAE-Cellulose Chromatographien, die mit 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,0 ins Gleichgewicht gebracht war, und man erhielt in der nichtadsorbierten Fraktion einen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper. Nach dem Ergebnis des Identifizierungsversuchs der Antigen-Erkennungsstellen gemäss der Methode des Beispiels 5b) wurden die Antikörper in 3 Gruppen (5 Chargen, 2 Chargen, 1 Charge) eingeteilt, nämlich Anti-CEA-Antikörper (A), (B) und (C). Davon wird Antikörper (A) als insolubilisierter Antikörper und Antikörper (B) als markierter Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet. A female mouse BALB / c was injected 1 x 106 hybridoma cells intraperitoneally. The mouse had received 0.5 ml of pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane, Wako Pure Chemicals Co. Ltd) intraperitoneally. After two weeks, the abdominal fluid was withdrawn and on DEAE cellulose chromatographs, which had been equilibrated with 0.01 M phosphate buffer pH 7.0, and a monoclonal anti-CEA antibody was obtained in the non-adsorbed fraction. After the result of the attempt to identify the antigen recognition sites according to the method of Example 5b), the antibodies were divided into 3 groups (5 batches, 2 batches, 1 batch), namely anti-CEA antibodies (A), (B) and (C ). Of these, antibody (A) is used as the insolubilized antibody and antibody (B) as the labeled antibody in the following examples.

Beispiel 7 Example 7

Herstellung von HCG-ß und Anti-HCG-ß-Antikörper a) Herstellung der HCG-ß-Untereinheit Production of HCG-ß and anti-HCG-ß antibodies a) Production of the HCG-ß subunit

Diese Untereinheit wird im folgenden als HCG-b bezeichnet. This subunit is referred to below as HCG-b.

In 2 ml 0,025 M Phosphatpuffer pH 5,6 wurde 1 g HCG (2000 IE/mg)gelöst und an 3 g DEAE-Sephadex A-50, ausgeglichen mit dem gleichen Puffer, Chromatographien. Die mit 0,05 M Phosphatpuffer pH 5,6 eluierte Fraktion wurde gesammelt und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Man erhielt 308 mg gereinigtes HCG, das dann gefriergetrocknet wurde. 300 mg dieser Substanz wurden in 10 ml 10 M Harnstoff (pH 4,5) gelöst und bei 40°C eine Stunde lang umgesetzt, wonach an 2 g DEAE-Sephadex A-50, ausgeglichen mit einer Lösung enthaltend 0,03 M Glycin und 10 M Harnstoff, Chromatographien wurde. Die mit einer Lösung, enthaltend 0,2 M Glycin, 1 M NaCl und 8 M Harnstoff, eluierte Fraktion wurde gegen PBS dialysiert, und man erhielt 147 mg der Beta-Untereinheit (HCG-b). 1 g of HCG (2000 IU / mg) was dissolved in 2 ml of 0.025 M phosphate buffer pH 5.6 and chromatographed on 3 g of DEAE-Sephadex A-50, balanced with the same buffer. The fraction eluted with 0.05 M phosphate buffer pH 5.6 was collected and dialyzed against distilled water. 308 mg of purified HCG was obtained, which was then freeze-dried. 300 mg of this substance were dissolved in 10 ml of 10 M urea (pH 4.5) and reacted at 40 ° C. for one hour, after which 2 g of DEAE-Sephadex A-50, balanced with a solution containing 0.03 M glycine and 10 M urea that was chromatographed. The fraction eluted with a solution containing 0.2 M glycine, 1 M NaCl and 8 M urea was dialyzed against PBS and 147 mg of the beta subunit (HCG-b) was obtained.

b) Herstellung des Anti-HCG-b-Antikörpers b) Production of the anti-HCG-b antibody

Elf Chargen eines Anti-HCG-b-Antikörper produzierenden Hybridoms wurden aus der HCG-b-Untereinheit, erhalten nach obenstehendem Abschnitt a), nach Arbeitsweisen analog Beispiel 5b) gewonnen. An den Antikörpern, die man aus diesen Chargen erhielt, wurde die Identifizierung von Antigen-Erkennungsstellen nach der Verfahrensweise des Beispiels 5c) vorgenommen, und man konnte in zwei Gruppen (A) (8 Chargen) und (B) (2 Chargen) einteilen. Davon wird der Anti-HCG-b-Antikörper (A) als insolubilisierter Antikörper und die Gruppe (B) als markierter Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet werden. Bei der Prüfung dieser Antikörper auf Gegenreaktion mit Lutei-nisierungshormon (LH) unter Anwendung der obigen Kombination wurde die Reaktionsfähigkeit zu weniger als 1% bestimmt, wenn die Reaktionsfähigkeit des HCG mit 100% angesetzt wird. Eleven batches of a hybridoma producing anti-HCG-b antibodies were obtained from the HCG-b subunit, obtained according to section a) above, according to procedures analogous to Example 5b). The antibodies obtained from these batches were identified by antigen recognition sites according to the procedure of Example 5c) and could be divided into two groups (A) (8 batches) and (B) (2 batches). Of these, the anti-HCG-b antibody (A) will be used as the insolubilized antibody and the group (B) as the labeled antibody in the following examples. When testing these antibodies for backlash with luteinizing hormone (LH) using the above combination, the responsiveness was determined to be less than 1% when the HCG responsiveness was set at 100%.

Beispiel 8 Example 8

Bestimmung der Gesamtmenge an AFP, CEA und HCG Determination of the total amount of AFP, CEA and HCG

a) Herstellung von Reagenzröhrchen mit gebundenem Antikörper a) Preparation of test tubes with bound antibody

In Reagenzröhrchen aus Polystyrol gab man 1 ml der Lösung, enthaltend 0,1 mg/ml an monoklonalem Anti-AFP-Antikörper, 0,5 mg/ml monoklonalen Anti-CEA-Antikörper und 0,25 mg/ml monoklonalen Anti-HCG-Antikörper, hergestellt in den Beispielen 3,6 bzw. 7, und jedes Röhrchen wurde 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach Vervollständigung der Inkubation wurde jedes Röhrchen mit PBS gewaschen, und auf diese Weise stellte man die Reagenzröhrchen her, die Antikörper gebunden enthalten. 1 ml of the solution containing 0.1 mg / ml of anti-AFP monoclonal antibody, 0.5 mg / ml of anti-CEA monoclonal antibody and 0.25 mg / ml of anti-HCG monoclonal was added to polystyrene test tubes. Antibodies produced in Examples 3,6 and 7, respectively, and each tube was incubated at 37 ° C for 3 hours. After the incubation was completed, each tube was washed with PBS, and thus the test tubes containing antibody bound were prepared.

b) Herstellung der Standardlösungen b) Production of standard solutions

Das AFP nach Beispiel 5a), das CEA nach Beispiel 6a) und HCG (HCG Mochida; Mochida Pharmaceutical) wurden mit PBS enthaltend 1% BSA zu Lösungen mit den Konzentrationen 80,40,20, 10, 5 und 0 ng/ml; 80,40,20, 10,5 und 0 ng/ml und 80,40, 20, 10, 5 und 0 miu/ml verdünnt. The AFP according to Example 5a), the CEA according to Example 6a) and HCG (HCG Mochida; Mochida Pharmaceutical) were mixed with PBS containing 1% BSA to solutions with the concentrations 80, 40, 20, 10, 5 and 0 ng / ml; Diluted 80.40.20, 10.5 and 0 ng / ml and 80.40, 20, 10, 5 and 0 miu / ml.

c) Bestimmung von AFP, CEA und HCG In die Reagenzröhrchen gemäss obenstehendem Absatz a) wurden Anteile von 0,1 ml der Standardlösungen von AFP, CEA und HCG mit den einzelnen Konzentrationen gegeben, wonach noch 0,4 ml PBS, enthaltend 1% BSA, zugegeben wurde. Jede Reaktion wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ausgeführt. Nach Vervollständigung wurden die Röhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen. Die enzym-markierten Antikörper, hergestellt nach Beispielen 5, 6 und 7, wurden für sich verdünnt und in PBS enthaltend 1% BSA unter Bildung einer Lösung mit 2000facher Verdünnung des enzym-markierten Anti-AFP-Antikörpers, 800facher Verdünnung des enzym-markierten Anti-CEA-Antikörpers und 500facher Verdünnung des enzym-mar-kierten Anti-HCG-Antikörpers vermischt. Anteile von je 0,5 ml dieser Mischung wurden in die oben beschriebenen Röhrchen gegeben, und jede Reaktion liess man bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ablaufen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Röhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen, Anteile von 0,5 ml einer Substratlösung (6 mM/1 Wasserstoffperoxid und 20 mM/1 o-Phenylen-diamin in PBS) zugefügt und jede Reaktion bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang unter Lichtausschluss durchgeführt. Zum Abbruch der Reaktion wurden dann 2 ml 1 N Salzsäure zugegeben und die Lichtabsorption der Proben bei 492 nm gemessen. Zu Vergleichszwecken wurden dieselben Bestimmungen mit getrennten Antikörpern ausgeführt, die markiert waren. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 1 bis 4 dargestellt. Die Kombinationen von insolubilisierten Antikörpern und den markierten Antikörpern, deren Resultate in den Figuren dargestellt sind, finden sich in Tabelle 4 zusammengestellt. c) Determination of AFP, CEA and HCG In the test tubes according to paragraph a) above, portions of 0.1 ml of the standard solutions of AFP, CEA and HCG with the individual concentrations were added, followed by 0.4 ml of PBS containing 1% BSA was added. Each reaction was carried out at room temperature for 2 hours. After completion, the tubes were washed with distilled water. The enzyme-labeled antibodies, prepared according to Examples 5, 6 and 7, were diluted individually and in PBS containing 1% BSA to form a solution with a 2000-fold dilution of the enzyme-labeled anti-AFP antibody, 800-fold dilution of the enzyme-labeled anti -CEA antibody and 500-fold dilution of the enzyme-labeled anti-HCG antibody. 0.5 ml portions of this mixture were placed in the tubes described above and each reaction was allowed to proceed at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the tubes were washed with distilled water, 0.5 ml portions of a substrate solution (6 mM / 1 hydrogen peroxide and 20 mM / 1 o-phenylene diamine in PBS) were added, and each reaction at room temperature for 30 minutes with the exclusion of light carried out. To stop the reaction, 2 ml of 1N hydrochloric acid were then added and the light absorption of the samples was measured at 492 nm. For comparison purposes, the same determinations were carried out with separate antibodies that were labeled. The results are shown graphically in FIGS. 1 to 4. The combinations of insolubilized antibodies and the labeled antibodies, the results of which are shown in the figures, are summarized in Table 4.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

Tabelle 4 Table 4

9 9

664018 664018

Tabelle 5 (Fortsetzung) Table 5 (continued)

Insolubilisierter Antikörper Markierter Antikörper Insolubilized antibody Labeled antibody

Fig. 1 Anti-AFP-Antikörper, 1 anti-AFP antibody,

Anti-CEA-Antikörper und Anti-CEA antibodies and

Anti-HCG-Antikörper im Gemisch Anti-HCG antibodies in a mixture

Fig. 2 Anti-AFP-Antikörper, Anti-AFP-Antikörper Anti-CEA-Antikörper und allein Anti-HCG-Antikörper im Gemisch Fig. 2 anti-AFP antibodies, anti-AFP antibodies, anti-CEA antibodies and alone anti-HCG antibodies in a mixture

Fig. 3 Anti-CEA-Antikörper allein Fig. 3 anti-CEA antibody alone

Fig. 4 Anti-HCG-Antikörper allein Fig. 4 anti-HCG antibody alone

Aus den Ergebnissen, die in den Figuren dargestellt sind, geht hervor, dass AFP, CEA und HCG einzeln gemessen werden können, da sie nicht miteinander reagieren, wenn man die entsprechenden, markierten Antikörper einsetzt, auch wenn diese Substanzen in Mischung vorliegen, und dass nur die einzelnen einander entsprechenden Antigene und Antikörper miteinander reagieren, auch wenn man die markierten Antikörper als Gemisch anwendet, und dass die Reaktionsfähigkeiten durch die Anwesenheit von Fremd-. Stoffen nicht beeinflusst werden. The results, which are shown in the figures, show that AFP, CEA and HCG can be measured individually, since they do not react with one another when the corresponding labeled antibodies are used, even when these substances are present in a mixture, and that only the individual corresponding antigens and antibodies react with each other, even if the labeled antibodies are used as a mixture, and that the reaction capabilities are caused by the presence of foreign. Substances are not affected.

Beispiel 9 Example 9

Bestimmungen an Senunproben von Patienten Serumproben, entnommen von 10 Leberkrebs-Patienten, 10 Magenkrebs-Patienten, 10 Dickdarmkrebs-Patienten, 10 Patienten mit verschiedenen benignen Krankheiten und 10 gesunden Personen, wurden nach vorliegendem Verfahren auf die Gesamtmengen an AFP, CEA und HCG untersucht. Jede Bestimmung wurde entweder mit 0.1 ml Standardlösung oder 0,1 ml Serum nach der Arbeitsweise des Beispiels 8c) ausgeführt. Die Ergebnisse sind durch die Werte der direkten Absorption bei 492 nm und ausserdem durch einen auf CEA bezogenen Wert ausgedrückt, den man durch versuchsmäs-sige Übertragung des Absorptionswertes auf die CEA-Eich-kurve erhält. Zum weiteren Vergleich wurden AFP, CEA und HCG einzeln an den gleichen Proben bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 5. Determinations of Senun Samples from Patients Serum samples taken from 10 liver cancer patients, 10 gastric cancer patients, 10 colon cancer patients, 10 patients with various benign diseases and 10 healthy people were tested for the total amounts of AFP, CEA and HCG using the present method. Each determination was carried out using either 0.1 ml of standard solution or 0.1 ml of serum according to the procedure of Example 8c). The results are expressed by the values of the direct absorption at 492 nm and also by a value related to CEA, which is obtained by experimentally transferring the absorption value to the CEA calibration curve. For further comparison, AFP, CEA and HCG were determined individually on the same samples. The results can be found in Table 5.

Tabelle 5 Table 5

Krankheit illness

Erfindung invention

Vergleich comparison

Absorption absorption

CEA-bezo- CEA-related

AFP AFP

CEA CEA

HCG HCG

492 nm gener Wert ng/ml ng/ml miu/ml 492 nm gener value ng / ml ng / ml miu / ml

ng/ml ng / ml

Leberkrebs Liver cancer

0,570 0.570

20,0 20.0

20,1 20.1

2,1 2.1

2,0 2.0

0,392 0.392

10,7 10.7

10,5 10.5

5,8 5.8

1,8 1.8

1,608 1.608

85,2 85.2

101,8 101.8

1,1 1.1

3,1 3.1

0,231 0.231

4,0 4.0

2,3 2.3

2,2 2.2

2,0 2.0

3,205 3.205

147,5 147.5

158,7 158.7

0,8 0.8

2,0 2.0

0,261 0.261

5,3 5.3

0,2 0.2

0,3 0.3

4,4 4.4

1,758 1,758

99,7 99.7

60,1 60.1

51,1 51.1

3,5 3.5

0,431 0.431

10,2 10.2

12,3 12.3

1,2 1.2

2,7 2.7

0,818 0.818

32,0 32.0

33,9 33.9

0,8 0.8

1,3 1.3

0,211 0.211

57,1 57.1

63,2 63.2

0,5 0.5

1,5 1.5

Magen stomach

0,473 0.473

15,0 15.0

4,0 4.0

8,8 8.8

4,1 4.1

krebs cancer

0,915 0.915

27,5 27.5

1,7 1.7

0,7 0.7

30,1 30.1

0,731 0.731

28,8 28.8

1,5 1.5

1,3 1.3

30,8 30.8

Krankheit illness

Erfindung invention

Vergleich comparison

Absorption absorption

CEA-bezo- CEA-related

AFP AFP

CEA CEA

HCG HCG

ng/ml ng / ml

0,321 0.321

7,1 7.1

3,1 3.1

4,1 4.1

0,9 0.9

0,492 0.492

19,8 19.8

1,1 1.1

1,7 1.7

21,1 21.1

0,501 0.501

16,8 16.8

1,0 1.0

17,2 17.2

0,8 0.8

0,481 0.481

18,1 18.1

16,3 16.3

0,3 0.3

4,1 4.1

0,336 0.336

8,1 8.1

4,4 4.4

1,1 1.1

3,1 3.1

0,270 0.270

5,1 5.1

1,0 1.0

2,2 2.2

3,7 3.7

0,260 0.260

4,7 4.7

2,0 2.0

1,0 1.0

4,0 4.0

Dickdarm Large intestine

0,788 0.788

4,4 4.4

3,2 3.2

0,8 0.8

2,1 2.1

krebs cancer

3,109 3,109

138,5 138.5

1,5 1.5

152,1 152.1

2,1 2.1

1,121 1.121

50,3 50.3

4,0 4.0

50,5 50.5

3,3 3.3

0,228 0.228

3,8 3.8

1,0 1.0

2,8 2.8

0,9 0.9

0,388 0.388

10,1 10.1

1,5 1.5

11,1 11.1

0,8 0.8

0,470 0.470

14,8 14.8

1,2 1.2

13,0 13.0

3,2 3.2

0,323 0.323

6,9 6.9

8,8 8.8

0,7 0.7

1,4 1.4

0,450 0.450

13,9 13.9

10,3 10.3

6,1 6.1

1,5 1.5

2,712 2,712

119,3 119.3

138,1 138.1

1,5 1.5

1,8 1.8

0,620 0.620

20,9 20.9

2,5 2.5

21,8 21.8

2,0 2.0

Benigne Benign

0,231 0.231

4,0 4.0

1,3 1.3

0,3 0.3

3,0 3.0

Syndrome Syndromes

0,219 0.219

3,8 3.8

1,3 1.3

0,2 0.2

1,9 1.9

0,320 0.320

6,9 6.9

3,1 3.1

3,2 3.2

2,2 2.2

0,301 0.301

6,0 6.0

2,1 2.1

3,1 3.1

2,5 2.5

0,371 0.371

9,8 9.8

2,2 2.2

6,1 6.1

1,1 1.1

0,333 0.333

8,5 8.5

2,5 2.5

1,8 1.8

3,5 3.5

0,261 0.261

4,9 4.9

0,8 0.8

2,1 2.1

3,3 3.3

0,321 0.321

7,1 7.1

2,9 2.9

2,2 2.2

0,271 0.271

5,1 5.1

0,8 0.8

3,1 3.1

2,8 2.8

0,270 0.270

5,1 5.1

4,1 4.1

0,9 0.9

1,0 1.0

Gesundes Healthy

0,230 0.230

4,0 4.0

1,1 1.1

1,2 1.2

2,2 2.2

Indi Indi

0,241 0.241

4,2 4.2

1,2 1.2

1,3 1.3

2,2 2.2

viduum viduum

0,281 0.281

5,3 5.3

3,1 3.1

1,5 1.5

3,2 3.2

0,267 0.267

4,8 4.8

0,7 0.7

1,5 1.5

3,8 3.8

0,259 0.259

4,7 4.7

0,7 0.7

2,8 2.8

3,3 3.3

0,268 0.268

4,8 4.8

2,0 2.0

2,1 2.1

2,0 2.0

0,221 0.221

3,7 3.7

1,1 1.1

1,5 1.5

1,8 1.8

0,260 0.260

4,7 4.7

0,8 0.8

3,1 3.1

1,7 1.7

0,253 0.253

4,5 4.5

0,7 0.7

2,1 2.1

0,231 0.231

4,0 4.0

0,7 0.7

0,9 0.9

2,1 2.1

Die untenstehende Tabelle 6 zeigt die prozentuale positive Beurteilung von Patienten mit den jeweiligen Krankheiten, die man durch Bestimmung von Einzelmerkmalen erhält unter der Annahme, dass die diagnostischen Standardwerte für ein vermutetes Auftreten von Krebs 10 ng/ml oder darüber für AFP, 5 ng/ml oder darüber für CEA und mindestens 5 miu/ml für HCG betragen. Tabelle 6 gibt ebenfalls die prozentualen positiven Ergebnisse an, die man an den gleichen Proben der gleichen Patienten erhält, wenn man in Tabelle 5 eine Absorption von 0,350 und darüber bzw. einen CEA-bezogenen Wert von 8,5 ng/ml und darüber als krebsanzeigend ansieht. Table 6 below shows the percentage positive assessment of patients with the respective diseases, which can be obtained by determining individual characteristics, on the assumption that the diagnostic standard values for a suspected occurrence of cancer are 10 ng / ml or above for AFP, 5 ng / ml or above for CEA and at least 5 miu / ml for HCG. Table 6 also gives the percentage positive results obtained on the same samples from the same patients when Table 5 had an absorption of 0.350 and above or a CEA-related value of 8.5 ng / ml and above as a carcinogen looks at.

Tabelle 6 Table 6

Krankheit Erfin- AFP CEA HCG Eine oder mehrere bzw. Zustand dung Merkmalsubstanzen Disease Invention- AFP CEA HCG One or more or condition characteristic substances

% % % % % %%%%%

Leberkrebs 80 80 20 0 80 Magenkrebs 60 10 20 30 60 Liver cancer 80 80 20 0 80 gastric cancer 60 10 20 30 60

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

664 018 664 018

10 10th

Tabelle 6 (Fortsetzung) Table 6 (continued)

Krankheit illness

Erfin Erfin

AFP AFP

CEA CEA

HCG HCG

Eine oder mehrere bzw. Zustand dung One or more or condition dung

Merkmalsubstanzen Feature substances

% %

Dickdarmkrebs 60 Colon cancer 60

10 10th

60 60

0 0

60 60

Benigne Benign

10 10th

0 0

10 10th

0 0

10 10th

Krankheiten Diseases

Gesunde Healthy

0 0

Personen people

Wenn man weiterhin die prozentualen positiven Befunde bei den Patienten mit den genannten Krankheiten unter der Annahme berechnet, dass ein Patient krebspositiv ist, wenn mindestens eine der drei separat bestimmten Tumormerkmal-Substanzen für sich den minimalen Standardwert übersteigt, sind die prozentualen positiven Befunde gemäss der letzten Spalte obiger Tabelle 6 identisch mit den Werten, die man bei gemeinsamer Bestimmung erhält (zweite Spalte in Tabelle 6). Dies bedeutet, dass man bei der Krebsdiagnose nicht notwendigerweise die Tumormerkmalsubstanzen einzeln messen muss, sondern dass eine verlässliche Diagnose von der Gesamtbestimmung abgeleitet werden kann. If one continues to calculate the percentage positive results in the patients with the named diseases on the assumption that a patient is cancer positive if at least one of the three separately determined tumor feature substances exceeds the minimum standard value, the percentage positive results are according to the last Column in table 6 above identical with the values obtained when the determination is made together (second column in table 6). This means that in cancer diagnosis one does not necessarily have to measure the tumor feature substances individually, but that a reliable diagnosis can be derived from the overall determination.

Beispiel 10 Example 10

Bestimmung der Gesamtmenge an AFP, CEA lind HCG Determination of the total amount of AFP, CEA and HCG

a) Herstellung des Reagens: an Polystyrolperlen gebundener Antikörper a) Preparation of the reagent: Antibody bound to polystyrene beads

Die nach den Beispielen 5, 6 und 7 erzeugten monoklonalen Anti-AFP-Antikörper, Anti-CEA-Antikörper und Anti-HCG-Antikörper wurden auf Konzentrationen von 1,0, 0,8 und 0,5 mg/ml verdünnt. In jede Lösung wurden Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 2,5 mm eingetaucht, und man beliess die Perlen 3 Stunden bei 37°C in jeder Lösung. Nach der Reaktion wurden die Perlen mit PBS gewaschen. Jede Reagenziengruppe bestand aus 3 Perlen, deren jede einen anderen Antikörper gebunden enthielt. The monoclonal anti-AFP antibodies, anti-CEA antibodies and anti-HCG antibodies generated according to Examples 5, 6 and 7 were diluted to concentrations of 1.0, 0.8 and 0.5 mg / ml. Polystyrene beads with a diameter of 2.5 mm were immersed in each solution and the beads were left in each solution for 3 hours at 37 ° C. After the reaction, the beads were washed with PBS. Each reagent group consisted of 3 beads, each of which contained a different antibody bound.

b) Bestimmung von AFP, CEA und HCG b) Determination of AFP, CEA and HCG

In Reagenzgläser 10x60 mm gab man Anteile von je 0,1 ml der Standardlösungen von AFP, CEA und HCG, mit den einzelnen Konzentrationen, die man gemäss Beispiel 8b) erhalten hatte, dann jeweils 0,4 ml PBS enthaltend 1 % BSA, und eine Gruppe des Reagens, bestehend aus drei Polystyrolperlen mit den daran gebundenen unterschiedlichen Antikörpern. Nach Rühren liess man die Umsetzung bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ablaufen. Danach wurden die Polystyrolperlen mit destilliertem Wasser abgewaschen. In test tubes 10x60 mm, portions of 0.1 ml each of the standard solutions of AFP, CEA and HCG were added, with the individual concentrations which had been obtained according to Example 8b), then in each case 0.4 ml of PBS containing 1% BSA, and one Group of the reagent, consisting of three polystyrene beads with the different antibodies bound to them. After stirring, the reaction was allowed to proceed at room temperature for 2 hours. The polystyrene beads were then washed off with distilled water.

Die enzym-markierten Antikörper, hergestellt nach Beispielen 5, 6 und 7, wurden separat verdünnt und in PBS, enthaltend 1% BSA, vermischt, derart, dass man eine Mischlösung mit folgenden Verdünnungen erhielt: 2500fache Verdünnung des enzym-markierten Anti-AFP-Antikörpers; lOOOfache Verdünnung des markierten Anti-CEA-Antikör-pers und 650fache Verdünnung des markierten Anti-HCG-Antikörpers. Zu den oben beschriebenen Polystyrolperlen wurden Anteile von 0,5 ml der Mischlösung gegeben und jede Reaktion bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang ausgeführt. Danach wurden die Polystyrolperlen mit destilliertem Wasser abgewaschen, Anteile von 0,5 ml der Substratlösung (6 mM/1 Wasserstoffperoxid und 20 mM/1 o-Phenylen-diamin in PBS) zugegeben und jede Mischung bei Zimmertemperatur unter Lichtabschluss 30 Minuten lang stehen gelassen. Zum Reaktionsabbruch wurden 2 ml 1 N-HC1 zugefügt. Dann wurde die Absorption bei einer Lichtwellenlänge von 492 nm gemessen. Zu Vergleichszwecken wurden die gleichen Reaktionen mit den einzelnen markierten Antikörpern separat, also unvermischt, ausgeführt. Die Ergebnisse finden sich graphisch dargestellt in Fig. 5 bis 8. Die verwendeten Kombinationen aus insolubilisiertem Antikörper und markiertem Antikörper sind in Tabelle 7 aufgeführt. The enzyme-labeled antibodies, prepared according to Examples 5, 6 and 7, were diluted separately and mixed in PBS containing 1% BSA in such a way that a mixed solution was obtained with the following dilutions: 2500-fold dilution of the enzyme-labeled anti-AFP Antibody; 100-fold dilution of the labeled anti-CEA antibody and 650-fold dilution of the labeled anti-HCG antibody. To the polystyrene beads described above, 0.5 ml portions of the mixed solution were added and each reaction was carried out at room temperature for 2 hours. The polystyrene beads were then washed off with distilled water, 0.5 ml portions of the substrate solution (6 mM / 1 hydrogen peroxide and 20 mM / 1 o-phenylenediamine in PBS) were added, and each mixture was left to stand at room temperature with the light off for 30 minutes. To stop the reaction, 2 ml of 1N-HC1 were added. Then the absorption was measured at a light wavelength of 492 nm. For comparison purposes, the same reactions were carried out separately, ie unmixed, with the individual labeled antibodies. The results are shown graphically in FIGS. 5 to 8. The combinations of insolubilized antibody and labeled antibody used are listed in Table 7.

Tabelle 7 Table 7

Insolubilis. Antikörper Insolubilis. antibody

Markierter Antikörper Labeled antibody

Fig. 5 Fig. 5

Drei Perlen gemeinsam (Perle mit Anti-AFP-AK, Perle mit Anti-CEA-AK und Three pearls in common (pearl with anti-AFP-AK, pearl with anti-CEA-AK and

Perle mit Anti-HCG-AK) Pearl with anti-HCG-AK)

Anti-AFP-Antikörper, Anti-CEA-Antikörper und Anti-AFP antibodies, anti-CEA antibodies and

Anti-HCG-Antikörper (Gemisch) Anti-HCG antibody (mixture)

Fig. 6 Fig. 6

Anti-AFP-Antikörper Anti-AFP antibody

Fig. 7 Fig. 7

Anti-CEA-Antikörper Anti-CEA antibodies

Fig. 8 Fig. 8

Anti-HCG-Antikörper Anti-HCG antibody

Aus diesen Ergebnissen kann man ähnlich wie in Beispiel 8 entnehmen, dass AFP, CEA und HCG wegen des Fehlens gegenseitiger Reaktivitäten separat bestimmt werden können, wenn man die entsprechenden, markierten Antikörper verwendet, auch wenn diese Substanzen in Mischung vorliegen, und dass nur die sich entsprechenden Antigene und Antikörper miteinander reagieren, auch wenn die markierten Antikörper im Gemisch eingesetzt werden;auch wird die Reaktionsfähigkeit durch die Anwesenheit von Fremdsubstanzen nicht beeinflusst. From these results, it can be seen, similarly to Example 8, that AFP, CEA and HCG can be determined separately because of the lack of mutual reactivities if the corresponding, labeled antibodies are used, even if these substances are present in a mixture, and that only those the corresponding antigens and antibodies react with each other, even if the labeled antibodies are used in a mixture; nor is the reactivity influenced by the presence of foreign substances.

Beispiel 11 Example 11

Bestimmungen an Serumproben von Patienten Serumproben von 10 Leberkrebs-Patienten, 10 Magenkrebs-Patienten, 10 Dickdarmkrebs-Patienten, 10 Patienten mit verschiedenen benignen Krankheiten und 10 gesunden Personen wurden auf die Gesamtmenge an AFP, CEA und HCG untersucht. Für jede Bestimmung wurde 0,1 ml der Standardlösung oder des Serums angewendet, die Arbeitsweise war diejenige des Beispiels 8c). Die Ergebnisse sind als unmittelbare Ablesungen der Absorptionswerte bei 492 nm und ausserdem als CEA-bezogene Werte ausgedrückt, die man durch versuchsweise Übertragung der Messwerte auf die CEA-Eichkurve erhält. Zum Vergleich wurden AFP, CEA und HCG an den gleichen Proben separat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Serum Sample Determinations from Patients Serum samples from 10 liver cancer patients, 10 gastric cancer patients, 10 colon cancer patients, 10 patients with various benign diseases and 10 healthy subjects were examined for the total amount of AFP, CEA and HCG. 0.1 ml of the standard solution or serum was used for each determination, the procedure was that of Example 8c). The results are expressed as direct readings of the absorption values at 492 nm and also as CEA-related values that are obtained by experimentally transferring the measured values to the CEA calibration curve. For comparison, AFP, CEA and HCG were determined separately on the same samples. The results are summarized in Table 8.

Tabelle 8 Table 8

Krankheit Erfindung Disease invention

Vergleich comparison

Absorption absorption

CEA-bezo- CEA-related

AFP AFP

CEA CEA

HCG HCG

ng/ml ng / ml

Leberkrebs 1,55< Liver cancer 1.55 <

80 < 80 <

320,5 320.5

9,6 9.6

1,2 1.2

1,55< 1.55 <

80< 80 <

173,6 173.6

3,0 3.0

1,4 1.4

0,221 0.221

5,6 5.6

4,0 4.0

0,6 0.6

1,4 1.4

0,186 0.186

58,1 58.1

57,3 57.3

0,3 0.3

3,0 3.0

0,518 0.518

21,6 21.6

13,8 13.8

7,2 7.2

1,6 1.6

0,197 0.197

4,3 4.3

1,4 1.4

0,3 0.3

2,3 2.3

1,547 1,547

79,8 79.8

82,1 82.1

1,1 1.1

1,2 1.2

0,374 0.374

13,9 13.9

11,8 11.8

0,3 0.3

2,6 2.6

0,473 0.473

19,2 19.2

20,5 20.5

0,5 0.5

1,5 1.5

1,368 1,368

68,8 68.8

73,0 73.0

2,3 2.3

1,2 1.2

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

11 11

664018 664018

Tabelle 8 (Fortsetzung) Table 8 (continued)

Krankheit illness

Erfindung invention

Vergleich comparison

Absorption absorption

CEA-bezo- CEA-related

AFP AFP

CEA CEA

HCG HCG

ng/ml ng / ml

Magen stomach

0,175 0.175

3,1 3.1

1,6 1.6

0,3 0.3

1,6 1.6

krebs cancer

0,582 0.582

25,0 25.0

4,9 4.9

0,6 0.6

20,3 20.3

0,207 0.207

4,8 4.8

2,7 2.7

1,4 1.4

1,2 1.2

0,313 0.313

10,6 10.6

3,3 3.3

7,2 7.2

1,8 1.8

0,481 0.481

19,6 19.6

5,2 5.2

0,3 0.3

15,9 15.9

0,475 0.475

19,3 19.3

17,1 17.1

0,7 0.7

2,2 2.2

0,238 0.238

6,5 6.5

1,1 1.1

2,4 2.4

1,3 1.3

0,207 0.207

4,8 4.8

2,3 2.3

1,1 1.1

1,6 1.6

0,322 0.322

11,1 11.1

4,9 4.9

5,2 5.2

1,5 1.5

0,339 0.339

12,0 12.0

3,5 3.5

0,2 0.2

8,1 8.1

Dickdarm Large intestine

0,582 0.582

25,0 25.0

13,0 13.0

12,2 12.2

1,4 1.4

krebs cancer

0,245 0.245

6,9 6.9

4,5 4.5

0,6 0.6

1,6 1.6

0,864 0.864

40,2 40.2

8,0 8.0

32,2 32.2

3,0 3.0

0,785 0.785

35,9 35.9

1,6 1.6

35,0 35.0

1,1 1.1

0,516 0.516

21,5 21.5

4,6 4.6

17,7 17.7

1,2 1.2

0,249 0.249

7,1 7.1

1,2 1.2

4,0 4.0

2,0 2.0

0,192 0.192

4,0 4.0

1,5 1.5

1,3 1.3

1,7 1.7

0,269 0.269

8,2 8.2

7,0 7.0

0,4 0.4

1,1 1.1

0,339 0.339

12,0 12.0

2,6 2.6

5,9 5.9

4,2 4.2

1,110 1,110

53,8 53.8

3,3 3.3

54,1 54.1

1,6 1.6

Benigne Benign

0,232 0.232

6,2 6.2

5,2 5.2

0,2 0.2

1,0 1.0

Syndrome Syndromes

0,265 0.265

8,0 8.0

7,3 7.3

0,4 0.4

1,1 1.1

0,230 0.230

6,1 6.1

2,3 2.3

0,8 0.8

3,0 3.0

0,249 0.249

7,1 7.1

3,4 3.4

1,4 1.4

2,5 2.5

0,177 0.177

3,2 3.2

1,7 1.7

0,3 0.3

1,9 1.9

0,247 0.247

7,0 7.0

1,9 1.9

4,0 4.0

1,2 1.2

0,484 0.484

19,8 19.8

4,2 4.2

12,4 12.4

3,8 3.8

0,245 0.245

6,9 6.9

2,2 2.2

0,7 0.7

4,0 4.0

0,216 0.216

5,3 5.3

3,8 3.8

1,4 1.4

1,1 1.1

0,203 0.203

4,6 4.6

2,8 2.8

1,8 1.8

1,2 1.2

Gesundes Healthy

0,155 0.155

2,0 2.0

1,2 1.2

0,2 0.2

1,0 1.0

Indi Indi

0,165 0.165

2,5 2.5

2,0 2.0

0,2 0.2

1,0 1.0

viduum viduum

0,168 0.168

2,7 2.7

1,8 1.8

0,3 0.3

1,2 1.2

0,157 0.157

2,1 2.1

1,4 1.4

0,5 0.5

0,7 0.7

0,161 0.161

2,3 2.3

1,0 1.0

0,3 0.3

1,0 1.0

0,192 0.192

4,0 4.0

2,1 2.1

0,2 0.2

2,0 2.0

0,181 0.181

3,4 3.4

1,0 1.0

1,6 1.6

1,3 1.3

0,155 0.155

2,0 2.0

0,8 0.8

0,3 0.3

1,0 1.0

0,157 0.157

2,1 2.1

0,8 0.8

0,4 0.4

1,4 1.4

0,155 0.155

2,0 2.0

0,6 0.6

0,3 0.3

1,4 1.4

Die nachstehende Tabelle 9 zeigt die prozentuale positive Beurteilung von Patienten mit den jeweiligen Krankheiten bzw. Zuständen, die man durch Bestimmung von Einzelmerkmalen erhält, unter der Annahme, dass die diagnostischen Standardwerte für ein vermutetes Auftreten von Krebs mindestens 10 ng/ml für AFP, mindestens 5 ng/ml für CEA und mindestens 5 miu/11 für HCG betragen. Tabelle 9 gibt ebenfalls die prozentualen positiven Befunde an, die man erhält, wenn man in Tabelle 8 bei der Bestimmung der Gesamtmenge der drei Substanzen nach der Erfindung eine Absorption von 0,350 bei 492 nm oder einen auf CEA bezogenen Wert von 8,5 ng/ml und darüber als krebsanzeigend ansieht. Table 9 below shows the percentage positive assessment of patients with the respective diseases or conditions, which can be obtained by determining individual characteristics, on the assumption that the diagnostic standard values for a suspected occurrence of cancer are at least 10 ng / ml for AFP, at least 5 ng / ml for CEA and at least 5 miu / 11 for HCG. Table 9 also gives the percentage positive results obtained when, in Table 8, the determination of the total amount of the three substances according to the invention shows an absorption of 0.350 at 492 nm or a value of 8.5 ng / ml based on CEA and consider it cancer-indicating.

Tabelle 9 Table 9

% %

Leberkrebs Liver cancer

80 80

20 20th

0 0

80 80

Magenkrebs Stomach cancer

60 60

10 10th

20 20th

30 30th

60 60

Dickdarmkrebs Colon cancer

60 60

10 10th

60 60

0 0

60 60

Benigne Benign

10 10th

0 0

10 10th

0 0

10 10th

Krankheiten Diseases

Gesundie Healthy

0 0

Personen people

Wenn man weiterhin die prozentualen positiven Befunde bei den Patienten mit den genannten Krankheiten unter der Annahme berechnet, dass ein Patient krebspositiv ist, wenn mindestens eine der drei separat bestimmten Tumor-merkmal-Substanzen für sich den minimalen Standardwert übersteigt, so sind die prozentualen positiven Befunde gemäss der letzten Spalte der Tabelle 9 den Werten gleich, die man bei gemeinsamer Bestimmung erhält (zweite Spalte in Tabelle 9). Dies bedeutet, dass man bei der Krebsdiagnose die Tumormerkmal-Substanzen nicht separat zu messen braucht, sondern dass eine verlässliche Diagnose von der Gesamtbestimmung abgeleitet werden kann. If one further calculates the percentage positive results in the patients with the named diseases on the assumption that a patient is cancer positive if at least one of the three separately determined tumor feature substances exceeds the minimum standard value, then the percentage positive results are according to the last column of Table 9, the values obtained when the determination is made together (second column in Table 9). This means that you do not have to measure the tumor feature substances separately when diagnosing cancer, but that a reliable diagnosis can be derived from the overall determination.

Beispiel 12 Example 12

Bestimmung der Gesamtmenge an Fibrinogen und SPs a) Herstellung des Reagens: An Sepharose 4B gebundener Antikörper Determination of the Total Amount of Fibrinogen and SPs a) Preparation of the Reagent: Antibody bound to Sepharose 4B

Antifibrinogen-Antikörper und Anti-SP3-Antikörper (beide DAKO CO.) wurden jeweils mit 0,1 M Natriumbicar-bonatpuffer pH 8,3 auf Konzentrationen von 5 bzw. 3 mg/ml verdünnt. Zu Anteilen von je 0,5 ml dieser Verdünnungen wurden Anteile von 5 ml Sepharose 4B gegeben, die mit CNBr aktiviert war (Pharmacia Co.), und man liess bei Zimmertemperatur 2 Stunden lang reagieren. Danach wurde mit 0,1 M Acetatpuffer, enthaltend 0,5 M NaCl, und dann mit PBS gewaschen. Man erhält an Sepharose 4B gebundenen Antifibrinogen-Antikörper und Anti-SP3-Antikörper. Die beiden Stoffe vermischte man im Verhältnis 1:1: Antifibrinogen antibodies and anti-SP3 antibodies (both DAKO CO.) Were each diluted with 0.1 M sodium bicarbonate buffer pH 8.3 to concentrations of 5 and 3 mg / ml, respectively. To 0.5 ml portions of these dilutions were added 5 ml portions of Sepharose 4B activated with CNBr (Pharmacia Co.) and allowed to react at room temperature for 2 hours. It was then washed with 0.1 M acetate buffer containing 0.5 M NaCl and then with PBS. Antifibrinogen antibody and anti-SP3 antibody bound to Sepharose 4B are obtained. The two substances were mixed in a ratio of 1: 1:

b) Herstellung von Fibrinogen-Standardlösungen b) Preparation of standard fibrinogen solutions

Fibrinogen (Sigma Co.) wurde mit PBS, enthaltend 1% Fibrinogen (Sigma Co.) was treated with PBS containing 1%

BSA, zu Standardlösungen mit 80,40,20, 10,5 und 0 ug/ml verdünnt. BSA, diluted to standard solutions with 80.40.20, 10.5 and 0 µg / ml.

c) Herstellung von SP3-Standardlösungen c) Production of SP3 standard solutions

Nach der Methode von Hans Bohn u. Mitarb. (Blut Band 33,377-378, 1976) wurden 5 kg Placenta mit PBS extrahiert, unter Verwendung von Rivanol und Ammoniumsulfat fraktioniert und mit 50 ml Sepharose 4B mit daran gebundenem Anti-SP3-Antikörper(l mg Antikörper/ml Sepharose) durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Man erhielt 3,7 mg gereinigtes SP3. Diese Substanz wurde mit PBS, enthaltend 1% BSA, zu Standardlösungen mit 80,40,20, 10, 5 und 0 ug/ml verdünnt. According to the method of Hans Bohn u. Employee (Blood Volume 33, 377-378, 1976), 5 kg placenta was extracted with PBS, fractionated using rivanol and ammonium sulfate and with 50 ml Sepharose 4B with attached anti-SP3 antibody (1 mg antibody / ml Sepharose) by affinity chromatography cleaned. 3.7 mg of purified SP3 were obtained. This substance was diluted with PBS containing 1% BSA to standard solutions with 80, 40, 20, 10, 5 and 0 µg / ml.

d) Herstellung von enzym-markiertem Antifibrinogen-Antikörper und enzym-markiertem Anti-SP3-Antikörper d) Production of enzyme-labeled anti-fibrinogen antibody and enzyme-labeled anti-SP3 antibody

Derenzym-markierte Antifibrinogen-Antikörper und der enzym-markierte Anti-SP3-Antikörper wurde, ausgehend von den unmarkierten Antikörpern, nach der Vorschrift des Beispiels 5c) 2) hergestellt. The enzyme-labeled anti-fibrinogen antibody and the enzyme-labeled anti-SP3 antibody were prepared, starting from the unlabeled antibodies, according to the procedure of Example 5c) 2).

e) Bestimmung von Fibrinogen und SP3 e) Determination of fibrinogen and SP3

In separate Reagenzröhrchen wurden 0,1 ml der Fibrinogen- oder SP3-Standardlösung mit den jeweiligen Konzen5 0.1 ml of the fibrinogen or SP3 standard solution with the respective concentrations5 was placed in separate test tubes

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

664 018 664 018

12 12

trationen (erhalten nach Abschnitt b) bzw. c) dieses Beispiels) sowie 0,4 ml PBS, enthaltend 1% BSA, und 0,2 ml des nach Abschnitt a) dieses Beispiels hergestellten Reagens gegeben. Nach Umrühren liess man bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen. Dann wurde der Inhalt jedes Röhr- s chens zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die nach Abschnitt d) hergestellten enzym-markierten Antikörper wurden nach Verdünnung so vermischt, dass die Mischlösung eine 1500fache Verdünnung des enzym-markierten Antifibrinogen-Antikörpers und eine lOOOfache Ver- io dünnung des markierten Anti-SP3-Antikörpers darstellte. Anteile von 0,5 ml der Lösung wurden in die oben genannten Röhrchen gegeben, und man liess bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen. Danach wurde der Inhalt der Röhrchen zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewa- is sehen. Nach Zugabe von 0,5 ml der Substratlösung (6 mM/1 H:0: und 20 mM/1 o-Phenylendiamin in PBS) wurde jedes Gemisch bei Zimmertemperatur unter Lichtabschluss umgesetzt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml 1 N HCl abgebrochen. Die Absorption der Proben 20 wurde bei 492 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt. trations (obtained according to section b) or c) of this example) and 0.4 ml of PBS containing 1% BSA and 0.2 ml of the reagent prepared according to section a) of this example. After stirring, the mixture was left to stand at room temperature for one hour. Then the contents of each tube were centrifuged and washed with distilled water. The enzyme-labeled antibodies prepared according to section d) were mixed after dilution in such a way that the mixed solution represented a 1500-fold dilution of the enzyme-labeled antifibrinogen antibody and a 100-fold dilution of the labeled anti-SP3 antibody. 0.5 ml portions of the solution were placed in the above tubes and allowed to stand at room temperature for one hour. The contents of the tubes were then centrifuged and washed with distilled water. After adding 0.5 ml of the substrate solution (6 mM / 1 H: 0: and 20 mM / 1 o-phenylenediamine in PBS), each mixture was reacted at room temperature with the light being switched off. After 30 minutes, the reaction was stopped by adding 2 ml of 1N HCl. The absorption of samples 20 was measured at 492 nm. The results are shown in Fig. 9.

Beispiel 13 Example 13

Bestimmung der Gesamtmenge an AFP, CEA und HCG 25 a) Herstellung der Standardlösungen Das in Beispiel 5a) hergestellte AFP, das in Beispiel 6a) erhaltene CEA und das HCG (Mochida) wurden mit PBS, enthaltend l°/o BSA, zu Lösungen mit 80 ng/ml, 80 ng/mi bzw. 80 miu/ml verarbeitet, und diese Lösungen wurden in 30 Determination of the Total Amount of AFP, CEA and HCG 25 a) Preparation of the Standard Solutions The AFP prepared in Example 5a), the CEA obtained in Example 6a) and the HCG (Mochida) were mixed with PBS containing 10% BSA 80 ng / ml, 80 ng / ml and 80 miu / ml, respectively, and these solutions were prepared in 30

verschiedenen Verhältnissen vermischt (Tabelle 10), wobei man 5 verschiedene Mischlösungen erhielt. mixed different ratios (Table 10), whereby 5 different mixed solutions were obtained.

Tabelle 10 Table 10

Nr. Mischlösung No mixed solution

AFP AFP

CEA CEA

HCG HCG

1 1

l l l l

2 2nd

5 5

1 1

3 3rd

1 1

5 5

1 1

4 4th

1 1

5 5

3 3rd

2 2nd

1 1

Jede der fünf Lösungen der Tabelle 10 wurde dann zweifach, vierfach und achtfach mit PBS, enthaltend 1% BSA, zu Standardlösungen verdünnt. Each of the five solutions in Table 10 was then diluted two, four and eight times with PBS containing 1% BSA to standard solutions.

b) Bestimmung von AFP, CEA und HCG Unter Anwendung von Anteilen von je 0,1 ml der gemäss Abschnitt a) erhaltenen Standardlösungen und der Mischungen der drei unterschiedlichen markierten Antikörper wurden die Bestimmungen nach der Vorschrift des Beispiels 8c) durchgeführt. Die diesbezüglichen Eichkurven sind in Fig. 10 dargestellt. Selbst wenn man die Standardlösungen des AFP, CEA und HCG in Mischung einsetzt, erhält man Eichkurven ähnlich Fig. 1. Dies weist darauf hin, dass AFP, CEA und HCG einzeln bestimmt werden können, auch wenn sie miteinander vermischt vorliegen. Daher kann die Gesamtmenge als Messwert des erfindungsgemässen Verfahrens bestimmt werden. b) Determination of AFP, CEA and HCG Using 0.1 ml portions of the standard solutions obtained in accordance with section a) and the mixtures of the three different labeled antibodies, the determinations were carried out according to the procedure of Example 8c). The relevant calibration curves are shown in FIG. 10. Even if the standard solutions of the AFP, CEA and HCG are used in a mixture, calibration curves similar to FIG. 1 are obtained. This indicates that AFP, CEA and HCG can be determined individually, even if they are mixed together. The total quantity can therefore be determined as a measured value of the method according to the invention.

B B

5 Blatt Zeichnungen 5 sheets of drawings

Claims

664 018

2nd

PATENT CLAIMS

1. Immunological method for the simultaneous determination of the total amount of two or more substances in a sample, characterized in that a sample containing two or more substances to be determined is reacted simultaneously with two or more insolubilized antibodies or antigens and the substances mentioned on the basis measures an immunological reaction that occurs between the named substances and the two or more insolubilized antibodies or antigens.

2. Determination method according to claim 1, characterized in that said two or more insolubilized antibodies or antigens are bound together to an insoluble carrier.

Determination method according to claim 1, characterized in that said two or more insolubilized antibodies or antigens are each individually bound to separate insoluble carriers.

4. The determination method according to claim 2, characterized in that the insoluble carrier is red blood cells, a polymer latex, carbon black or the inner wall of a reaction vessel.

Determination method according to claim 3, characterized in that the insoluble carrier is red blood cells, a polymer latex or soot.

6. Determination method according to one of claims 1 to 3, characterized in that said immunological reaction is an agglutination reaction or an ag-glutination prevention reaction.

Determination method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the method is an enzymatic immunoanalysis, a radio-immunoanalysis or a fluoro-immunoanalysis.

8. Determination method according to claim 7, characterized in that it is otherwise a sandwich method, a competition reaction method or an immunometric method.

9. Determination method according to one of claims 1 to 3 and 6 to 8, characterized in that the said antibodies are those which are directed against tumor feature substances.

10. Determination method according to one of claims 1 to 3 and 6 to 9, characterized in that the antibodies are monoclonal antibodies.

11. A reagent for performing the determination method according to claim 1, which is capable of reacting with a sample containing two or more substances to be determined by an immunological reaction,

characterized in that it contains or consists of a mixture of at least two insolubilized antibodies or insolubilized antigens.

12. Reagent according to claim 11, characterized in that said two or more insolubilized antibodies or insolubilized antigens are bound together on a common insoluble carrier.

Reagent according to claim 11, characterized in that said two or more insolubilized antibodies or insolubilized antigens are each bound to separate insoluble carriers.

14. Reagent according to claim 12, characterized in that red blood cells, high-molecular latex, soot or the inner wall of a reaction vessel are present as the insoluble carrier.

15. Reagent according to claim 13, characterized in that red blood cells, a polymer latex or soot is present as the insoluble carrier.

16. Reagent according to one of claims 11 to 13, characterized in that it is able to participate in an agglutination reaction or an agglutination prevention reaction.

17. Reagent according to one of claims 11 to 13, characterized in that it is designed for use in an immunological determination method, namely enzyme immunoanalysis, radio immunoanalysis or fluorine immunoanalysis.

18. Reagent according to claim 17, characterized in that the said determination method is a sandwich method, a competition reaction method or an immunometric method.

19. Reagent according to one of claims 11 to 13, characterized in that the said antibodies are those which are directed against tumor feature substances.

20. Reagent according to one of claims 11 to 13, characterized in that the said antibodies are monoclonal antibodies.