CH658670A5

CH658670A5 - METHOD FOR PRODUCING L-PHENYLALANINE BY REUSE OF PHENYLALANINE-AMMONIUM HYDROXIDE LYASE.

Info

Publication number: CH658670A5
Application number: CH5328/83A
Authority: CH
Inventors: Wayne Elliott Swann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-10-01
Filing date: 1983-09-30
Publication date: 1986-11-28
Also published as: IL69672A0; IT8368017A0; JPS5991890A; GB8325797D0; NL8303369A; SE8305151L; CA1206435A; ZA836626B; ES526165A1; DE3333246A1; GR79053B; BE897889A; DK452783A; BR8305366A; DK452783D0; DD217822A5; GB2127821A; FI833552A0; FR2533941B1; LU85019A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Phenylalanin durch die mittels Phenylala-nin-ammoniumhydroxid-lyase (PAL) katalysierte Reaktion von t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid, bei welchem ein hoher Grad an Aktivität des PAL-Katalysators aufrechterhalten und der Katalysator wieder verwendet werden kann. Das Verfahren ist in Patentanspruch 1 definiert. The present invention relates to a process for producing phenylalanine by the reaction of t-cinnamic acid and ammonium hydroxide catalyzed by phenylalamin ammonium hydroxide lyase (PAL), in which a high degree of activity of the PAL catalyst is maintained and the catalyst is restored can be used. The method is defined in claim 1.

L-Phenylalanin ist eine wesentliche Aminosäure, welche wichtig ist in der Ernährung und auf medizinischen Gebieten. L-phenylalanine is an essential amino acid, which is important in nutrition and in medical fields.

5 Es wurde kommerziell aus einer Vielzahl von Proteinen, einschliesslich Ovalbumin und Lactalbumin, isoliert. Ein bekanntes Laborverfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin verwendet das Enzym Phenylalanin-ammonium-lyase (im folgenden PAL genannt), um die reversible Reaktion: 5 It has been commercially isolated from a variety of proteins, including ovalbumin and lactalbumin. A well-known laboratory method for producing L-phenylalanine uses the enzyme phenylalanine ammonium lyase (hereinafter called PAL) to reverse the reaction:

10 10th

L-Phenylalanin -» trans-Zimtsäure + Ammoniumhydroxid zu katalysieren. Siehe britisches Patent No. 1 489 468 (vom 19. Oktober 1977). L-Phenylalanine - »catalyze trans-cinnamic acid + ammonium hydroxide. See British Patent No. 1,489,468 (October 19, 1977).

i5 Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt üblicherweise bei 80:20 zugunsten der t-Zimtsäure, und verschiedene Mittel wurden vorgeschlagen, um einen hohen Grad an Umwandlung zu L-Phenylalanin zu erzielen. Das britische Patent No. 1 489 468 beschreibt, dass eine Ausbeute an L-Phenylalanin, 20 welche sich zu 20% der theoretischen Ausbeute nähert, erzielt werden kann durch Verwendung einer grossen Masse an Zellen, welche den PAL-Katalysator enthalten, und eines Überschusses an Ammoniumionen. Gemäss dem Verfahren der genannten Patentschrift ist die Quelle für Ammoniumionen vor-25 zugsweise Ammoniumchlorid und die Reaktion wird bevorzugt bei einem pH zwischen 8,5 und 9,7 durchgeführt. i5 The equilibrium of this reaction is usually 80:20 in favor of t-cinnamic acid, and various means have been proposed to achieve a high degree of conversion to L-phenylalanine. British Patent No. 1,489,468 describes that a yield of L-phenylalanine, 20 which is close to 20% of the theoretical yield, can be achieved by using a large mass of cells containing the PAL catalyst and an excess of ammonium ions. According to the process of the patent mentioned, the source of ammonium ions is preferably ammonium chloride and the reaction is preferably carried out at a pH between 8.5 and 9.7.

S. Yamada et al., Appi. Environ. Microbiol., 42,773 bis 778 (1981) berichten, dass die Umwandlungsausbeute auf über 70% erhöht werden konnte durch Einstellung des pH 30 der Substratlösung auf 10,0 mit Salzsäure. Diese Bedingungen sind jedoch so hart, dass die PAL-Aktivität der wiedergewonnenen Zellen stark vermindert ist, so dass eine Wiederverwendung des Enzyms nicht durchführbar ist. Ausserdem beschreiben Yamada et al., dass die Immobilisierung des celula-35 ren Enzyms keinen Vorteil gegenüber der Verwendung intakter Zellen erbringt. Obwohl also mit dieser Methode eine hohe Konzentration an L-Phenylalanin anfänglich erzielt werden kann, macht die Unfähigkeit, das katalytische Enzym wieder zu verwenden, diese Methode für grosstechnische An-40 wendung unwirtschaftlich. S. Yamada et al., Appi. Environ. Microbiol., 42, 773 to 778 (1981) report that the conversion yield could be increased to over 70% by adjusting the pH 30 of the substrate solution to 10.0 with hydrochloric acid. However, these conditions are so severe that the PAL activity of the recovered cells is greatly reduced, so that the enzyme cannot be reused. In addition, Yamada et al. Describe that the immobilization of the celular enzyme has no advantage over the use of intact cells. Thus, although a high concentration of L-phenylalanine can be initially achieved with this method, the inability to reuse the catalytic enzyme renders this method uneconomical for large-scale use.

Es besteht daher noch immer ein Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid, bei welchem sowohl eine hohe Ausbeute an L-Phenylalanin erzielt wird als auch die PAL genü-45 gend katalytische Aktivität behält, um wieder verwendet werden zu können. Therefore, there is still a need for a process for producing L-phenylalanine from t-cinnamic acid and ammonium hydroxide which both achieves a high yield of L-phenylalanine and retains the PAL enough catalytic activity to be reused to be able to.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu ermöglichen zur Herstellung von L-Phenylalanin aus t-Zimtsäure, bei welchem das Produkt in hohen Konzen-50 trationen erzeugt wird und das PAL-Enzym wiederholt verwendet werden kann. It is therefore an object of the present invention to provide a process for producing L-phenylalanine from t-cinnamic acid, in which the product is produced in high concentrations and the PAL enzyme can be used repeatedly.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, bei welchem die Reaktion entweder als Freizellenbeschickungssystem (free cell 55 batch system) oder in einem immobilisierten Zell- oder Enzymsystem durchgeführt werden kann. Another object of the present invention is a process for the preparation of L-phenylalanine, in which the reaction can be carried out either as a free cell 55 batch system or in an immobilized cell or enzyme system.

Das Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch Reaktion von t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid in Gegenwart von Phenylalanin-ammoniumhydroxid-lyase wurde 6o derart verbessert, dass hohe Ausbeuten an L-Phenylalanin erhalten werden und ein hoher Grad an katalytischer Aktivität der PAL beibehalten wird. Unter kontrollierten Reaktionsbedingungen wird die Stabilität der PAL erhöht, so dass sie wiederholt verwendet werden kann, um L-Phenylalanin in hohen 65 Konzentrationen zu erzeugen. The process for the preparation of L-phenylalanine by reaction of t-cinnamic acid and ammonium hydroxide in the presence of phenylalanine ammonium hydroxide lyase has been improved in such a way that high yields of L-phenylalanine are obtained and a high degree of catalytic activity of the PAL is maintained. Under controlled reaction conditions, the stability of the PAL is increased so that it can be used repeatedly to produce L-phenylalanine in high concentrations.

Um dieses gewünschte Resultat zu erzielen, wird eine Substratlösung hergestellt durch Umsetzung der t-Zimtsäure mit einer Ammoniumionenquelle. Die Ammoniumionenquelle To achieve this desired result, a substrate solution is made by reacting the t-cinnamic acid with an ammonium ion source. The source of ammonium ions

3 3rd

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kann aus jedem nicht-halogenhaltigen Ammoniumsalz bestehen. Das pH der Substratlösung wird derart eingestellt, dass es vorzugsweise im Bereich von etwa 8,0 bis 10,0 liegt, unter Verwendung einer nicht-halogenhaltigen Säure, worauf die Lösung zu einer PAL-Quelle, wie einem freien intakten Zellsystem oder einem immobilisierten Zell- oder Enzymsystem, welches PAL enthält, zugesetzt wird. can consist of any non-halogen ammonium salt. The pH of the substrate solution is adjusted such that it is preferably in the range of about 8.0 to 10.0 using a non-halogen acid, and then the solution goes to a PAL source such as a free intact cell system or an immobilized cell - Or enzyme system, which contains PAL, is added.

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann die Ammoniumionenquelle entweder durch direkten Zusatz eines Ammoniumsalzes einer beliebigen organischen Säure oder einer Mineralsäure zur t-Zimtsäure eingeführt werden oder indem man sie in der Substratlösung herstellt, z.B. durch Vermischen von Ammoni umhydroxid und einer halogenfreien Säure. In practicing the present invention, the ammonium ion source can be introduced either by directly adding an ammonium salt of any organic acid or a mineral acid to the t-cinnamic acid or by preparing it in the substrate solution, e.g. by mixing ammonium hydroxide and a halogen-free acid.

Die britische Patentschrift No. 1 489 468 offenbart, dass eine bevorzugte Quelle für Ammoniumionen ein Gemisch von Ammoniumchlorid und Ammoniumhydroxid darstellt (Seite 3, Zeilen 25 bis 26). Das Verfahren nach Yamada et al. verwendet ebenfalls Ammoniumchlorid. Im Gegensatz zu diesen Offenbarungen des Standes der Technik wurde nun gefunden, dass es vorteilhaft ist, wenn das Ammoniumsalz keine Halogenionen enthält. Es wurde gefunden, dass die Gegenwart von Halogenionen in den Substratlösungen die kata-lytische Aktivität von PAL inhibiert. Bevorzugte Ammoniumsalze umfassen daher Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumeitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat. Ein besonders bevorzugtes Ammoniumsalz ist Ammoniumsulfat. British Patent No. 1,489,468 discloses that a preferred source of ammonium ions is a mixture of ammonium chloride and ammonium hydroxide (page 3, lines 25 to 26). The Yamada et al. also uses ammonium chloride. In contrast to these disclosures of the prior art, it has now been found that it is advantageous if the ammonium salt does not contain any halogen ions. The presence of halogen ions in the substrate solutions was found to inhibit the catalytic activity of PAL. Preferred ammonium salts therefore include ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium citrate, ammonium acetate and ammonium phosphate. A particularly preferred ammonium salt is ammonium sulfate.

Es ist ferner wünschenswert, dass das Ammoniumsalz der Substratlösung in hohen Konzentrationen zugesetzt wird. Die Konzentration an Ammoniumionen liegt im allgemeinen zwischen etwa 0,1 bis 7,5 M, vorzugsweise zwischen etwa 1 und 5 M. Die hohe Konzentration an Ammoniumsalz erhöht die Konzentration des Ammoniumhydroxides im System und wirkt ausserdem als Puffer, so dass die pH-Einstellung der Reaktion leichtet reguliert werden kann. It is also desirable that the ammonium salt be added to the substrate solution in high concentrations. The concentration of ammonium ions is generally between about 0.1 to 7.5 M, preferably between about 1 and 5 M. The high concentration of ammonium salt increases the concentration of the ammonium hydroxide in the system and also acts as a buffer, so that the pH adjustment the reaction can be easily regulated.

Wenn die Konzentration an Ammoniumionen innerhalb der oben genannten Bereiche liegt, beträgt die Konzentration an t-Zimtsäure in der Lösung im allgemeinen etwa 30 bis etwa 200 mM und vorzugsweise etwa 60 bis etwa 150 mM. When the concentration of ammonium ions is within the above ranges, the concentration of t-cinnamic acid in the solution is generally about 30 to about 200 mM, and preferably about 60 to about 150 mM.

Yamada et al. beschreiben, dass die Substratlösung auf ein pH von 10,0 eingestellt werden sollte. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedoch das pH im Bereich von etwa 8 bis 10 eingestellt werden und vorzugsweise liegt es im Bereich von etwa 8,5 bis etwa 9,5. Die Veröffentlichung von Yamada beschreibt ferner die Einstellung des pH der Substratlösung mit Salzsäure. Dies kann eine beträchtliche Menge an Chlorid in das Substrat einbringen. Im vorliegenden Verfahren wird jedoch das pH der Substratlösung mit einer nicht-halogenhaltigen Säure eingestellt. Bevorzugte Säuren zur Einstellung des pH sind Schwefelsäure, Phosphorsäure und Essigsäure, doch können auch andere halogenfreie Säuren verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Säure ist Schwefelsäure, da sie beim Zusatz zu einer Substratlösung, welche Ammoniumhydroxid enthält, unter Bildung von Ammoniumsulfat reagiert, welches ein bekanntes Mittel zur Enzymstabilisierung darstellt. Yamada et al. describe that the substrate solution should be adjusted to pH 10.0. In the process of the present invention, however, the pH can be adjusted in the range from about 8 to 10 and preferably it is in the range from about 8.5 to about 9.5. The Yamada publication also describes adjusting the pH of the substrate solution with hydrochloric acid. This can introduce a significant amount of chloride into the substrate. In the present process, however, the pH of the substrate solution is adjusted with a non-halogen-containing acid. Preferred acids to adjust the pH are sulfuric acid, phosphoric acid and acetic acid, but other halogen-free acids can also be used. A particularly preferred acid is sulfuric acid because, when added to a substrate solution containing ammonium hydroxide, it reacts to form ammonium sulfate, which is a known agent for enzyme stabilization.

Die Substratlösung wird im allgemeinen zu einer PAL enthaltenden Kulturbrühe, den aus einer solchen Brühe getrennten Zellen oder dem isolierten Enzym zugesetzt. Die PAL kann gemäss üblichen, bekannten Methoden erzeugt werden. Die durch PAL katalysierte Reaktion verläuft unter L-Phenylalanin erzeugenden Bedingungen, welche vorzugsweise eine Reaktionstemperatur von etwa 10 °C bis etwa 45 'C umfassen. Unter den Bedingungen des erfindungsge-mässen Verfahrens wird die Stabilität der PAL erhöht, so dass sie wiederholt verwendet werden kann, um L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen zu erzeugen. The substrate solution is generally added to a culture broth containing PAL, the cells separated from such broth or the isolated enzyme. The PAL can be generated according to customary, known methods. The PAL catalyzed reaction proceeds under L-phenylalanine generating conditions, which preferably include a reaction temperature of about 10 ° C to about 45 ° C. Under the conditions of the process according to the invention, the stability of the PAL is increased so that it can be used repeatedly to produce L-phenylalanine in high concentrations.

Das vorliegende Verfahren zur Erzeugung von L-Phenylalanin kann entweder als Freizellenbeschickungssystem oder als immobilisiertes Zell- oder Enzymsystem eingesetzt werden. Das Beschickungssystem kann entweder ein einfaches Beschickungssystem oder ein kontinuierliches Zufuhrbeschik-kungssystem sein. Wenn die PAL in einer Säule immobilisiert ist, kann die Säule als System mit einem einzelnen Durchgang, als Recyclisierungssystem oder als kontinuierliches Zu-fuhrrecyclisierungssystem verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Immobilisierung des PAL-Enzyms oder der en-zymhaltigen Zellen ist in der US-Patentanmeldung Serial No. 400 141, eingereicht am 20. Juli 1982, beschrieben. Wenn die PAL-Enzyme oder Zellen, welche das Enzym enthalten, an einer Säule immobilisiert werden, kann die Säule bei einer Temperatur von etwa 10 bis etwa 40 °C und vorzugsweise bei etwa 18 bis etwa 30 °C gehalten werden, wenn die Substratlösung durch die Säule gepumpt wird. The present method for producing L-phenylalanine can be used either as a free cell loading system or as an immobilized cell or enzyme system. The feed system can be either a simple feed system or a continuous feed feed system. When the PAL is immobilized in a column, the column can be used as a single pass system, as a recycling system or as a continuous supply recycling system. A preferred method for immobilizing the PAL enzyme or the enzyme-containing cells is described in US patent application Serial No. 400 141, filed July 20, 1982. When the PAL enzymes or cells containing the enzyme are immobilized on a column, the column can be maintained at a temperature of about 10 to about 40 ° C, and preferably about 18 to about 30 ° C when the substrate solution is through the column is pumped.

Das Reaktionsgemisch kann durch übliche Methoden für die L-Phenylalaninerzeugung analysiert werden. Wenn Schwefelsäure anstelle von Salzsäure in der Substratlösung verwendet wird, wird das L-Phenylalanin in etwa der acht- bis zehnfachen Menge im Vergleich zur Erzeugung in Gegenwart von Salzsäure erzeugt. Wenn das PAL-Enzym immobilisiert wurde, zeigt es eine etwa 50%ige Retention der Aktivität nach 41 Tagen Reaktionsdauer. Dies steht im Gegensatz zu der 20%igen Retention nach 24 Stunden, welche von Yamada et al. beschrieben wurde. The reaction mixture can be analyzed by conventional methods for L-phenylalanine production. When sulfuric acid is used instead of hydrochloric acid in the substrate solution, the L-phenylalanine is produced in about eight to ten times the amount compared to the generation in the presence of hydrochloric acid. When immobilized, the PAL enzyme shows approximately 50% retention of activity after 41 days of reaction. This is in contrast to the 20% retention after 24 hours, which has been described by Yamada et al. has been described.

Das L-Phenylalanin kann aus dem Reaktionsgemisch nach üblichen Verfahren isoliert werden. The L-phenylalanine can be isolated from the reaction mixture by conventional methods.

Die folgenden Präparationen und Beispiele illustrieren das erfindungsgemässe Verfahren. The following preparations and examples illustrate the method according to the invention.

Präparation I Preparation I

Ein Kulturmedium wurde nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt: A culture medium was prepared according to the following general procedure:

Zu 1 Litter deionisiertem Wasser wurden 10 g Pepton, 10 g Hefeextrakt, 0,5 g D,L-Phenylalanin, 5 g Natriumchlorid und 5 g L-Isoleucin zugesetzt. Das pH wurde mit Schwefelsäure auf 6,0 eingestellt und das Gemisch bei 120 °C während 10 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm3 im Autoklaven erhitzt. Auf diese Weise entstand ein Standard-Ausgangsmedium für Kulturröhrchen und Schüttelflaschen. To 1 liter of deionized water were added 10 g peptone, 10 g yeast extract, 0.5 g D, L-phenylalanine, 5 g sodium chloride and 5 g L-isoleucine. The pH was adjusted to 6.0 with sulfuric acid and the mixture was heated in an autoclave at 120 ° C. for 10 minutes at a pressure of 1.05 kg / cm 3. In this way, a standard starting medium for culture tubes and shake bottles was created.

Präparation 2 Preparation 2

Das allgemeine Verfahren von Präparation 1 wurde befolgt, jedoch 100 mM Kaliumjodid (KI) zu dem Medium zugesetzt. Dies bildet ein hochinduzierendes Auswahlmedium. The general procedure of Preparation 1 was followed, but 100 mM potassium iodide (KI) was added to the medium. This forms a highly inducing selection medium.

Präparation 3 Preparation 3

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wurde befolgt, jedoch wurden 200 mM KI zum Medium zugesetzt. Dies bildet ebenfalls ein hochinduzierendes Auswahlmedium. The general procedure of Example 1 was followed, but 200 mM KI was added to the medium. This also forms a highly inducing selection medium.

Präparation 4 Preparation 4

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 wurde befolgt, jedoch 15 g Hefeextrakt anstelle des Peptons verwendet. 200 mM KI wurden ebenfalls zugesetzt. Dies ergab ein hochinduzierendes Schüttelflaschen-Produktionsmedium. The general procedure of Example 1 was followed, but 15 g of yeast extract was used in place of the pepton. 200 mM KI was also added. This resulted in a highly inducing shake bottle production medium.

Präparation 5 Preparation 5

Ein Fermentationsmedium wurde nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 4 hergestellt, jedoch Natriumchlorid und L-Isoleucin weggelassen. Dies ergab ein hochinduzierendes Fermentationserzeugungsmedium. A fermentation medium was prepared according to the general procedure of Example 4, but sodium chloride and L-isoleucine were omitted. This resulted in a high induction fermentation generation medium.

Präparation 6 Preparation 6

Drei Kulturmedien wurden hergestellt wie in Präparationen 1,2 und 3 beschrieben. Ein PAL erzeugender Stamm von Three culture media were prepared as described in Preparations 1, 2 and 3. A PAL producing strain of

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

658 670 658 670

Rhodotorula rubra (ATCC No. 4056), welches auf Schräg-nähragar gehalten wurde, wurde verwendet, um 4,5 cm3 jeder Teströhrchenkultur zu impfen. Die Röhrchen wurden sodann bei 30 °C und 250 Touren pro Minute auf einer Schüttelvorrichtung gehalten. Sieben Übertragungen (0,2 cm3) von jedem Röhrchen in 4,5 ml frisches Kulturmedium wurden nach 24 oder 48 Stunden durchgeführt. Die Kulturröhrchen wurden verwendet, um 200 cm3 Medium in 1000 ml Schüttelflaschen zu impfen. Eine Flasche von jedem Medium wurde nach 3 Stunden und nach 54 Stunden geerntet. Die Zellausbeute nach 30 Stunden betrug durchschnittlich 14 g Paste/Liter und nach 54 Stunden durchschnittlich 29 g Paste/Liter. Die PAL-Aktivität von 100 mM KI war 31 % höher als diejenige der Kontrolle. Die PAL-Aktivität von 200 mM KI war 39% höher als diejenige der Kontrolle. Rhodotorula rubra (ATCC No. 4056), which was kept on slanted nutrient agar, was used to inoculate 4.5 cm3 of each test tube culture. The tubes were then held on a shaker at 30 ° C and 250 rpm. Seven transfers (0.2 cm3) of each tube in 4.5 ml of fresh culture medium were made after 24 or 48 hours. The culture tubes were used to inoculate 200 cm3 of medium in 1000 ml shake flasks. A bottle of each medium was harvested after 3 hours and after 54 hours. The cell yield after 30 hours was on average 14 g paste / liter and after 54 hours on average 29 g paste / liter. The 100 mM KI PAL activity was 31% higher than that of the control. The PAL activity of 200 mM KI was 39% higher than that of the control.

Präparation 7 Preparation 7

Das allgemeine Verfahren von Präparation 6 zur Züchtung der R. rubra -Zellen in 200 mM KI -hochinduzierendem Medium wurde angewendet mit Ausnahme, dass 25 Selektionsübertragungen der 200 mM KI-Kultur durchgeführt wurden. Ferner wurde 24 Stunden nachdem die Schüttelflasche geimpft worden war, 2,5% des Mediums verwendet, um 15 frische (Endflaschen) Schüttelflaschen zu beimpfen, und nach 24 Stunden Kulturdauer wurden diese Flaschen geerntet. Die Zellausbeuten und die PAL-Aktivität wurden bei einigen Flaschen und den gesammelten Endzellpastenprodukt bestimmt. Die höchste PAL-Aktivität von 28,7 g Paste/Liter Medium betrug 18,4 Einheiten/Gramm Paste (528 Einheiten PAL/Liter). (1 Einheit = 1 Mol L-Phenylalanin umgewandelt zu t-Zimtsäure und Ammoniumhydroxid/Minute bei 30 °C). Die Aktivität wurde nach einer Modifikation der Methode von Kalghatgi und Subba Rao, Biochem. J. 149,67 bis 72,1975, bestimmt. Das gesammelte Endprodukt wies 15,0 Einheiten PAL/Gramm Paste bei 27 g Paste/Liter durchschnittlicher Zellausbeute (405 Einheiten PAL/Liter) auf. The general procedure of Preparation 6 for growing R. rubra cells in 200 mM KI highly inducing medium was used, except that 25 selection transfers of the 200 mM KI culture were performed. Furthermore, 24 hours after the shake bottle was inoculated, 2.5% of the medium was used to inoculate 15 fresh (end bottles) shake bottles and after 24 hours of culture, these bottles were harvested. Cell yields and PAL activity were determined on some bottles and the final cell paste product collected. The highest PAL activity of 28.7 g paste / liter medium was 18.4 units / gram paste (528 units PAL / liter). (1 unit = 1 mol L-phenylalanine converted to t-cinnamic acid and ammonium hydroxide / minute at 30 ° C). The activity was determined according to a modification of the method by Kalghatgi and Subba Rao, Biochem. J. 149.67 to 72.1975. The final product collected had 15.0 units of PAL / gram of paste with 27 g of paste / liter of average cell yield (405 units of PAL / liter).

Beispiel 1 example 1

A) Eine Ammoniumcinnamat-Substratlösung wurde nach folgendem allgemeinen Verfahren hergestellt. Zimtsäure wurde zu Ammoniumhydroxid (28%) zugesetzt, bis sie aufgelöst war. Wasser und Säuren wurden dann zugesetzt, um das Substratvolumen bzw. das pH einzustellen. Die Zimtsäurekonzentration, die Ammoniumhydroxidkonzentration und das pH (Menge an zugesetzter Säure) variiert in den folgenden Beispielen, entsprechend variiert auch die Menge an erzeugtem Ammoniumsalz. A) An ammonium cinnamate substrate solution was prepared by the following general procedure. Cinnamic acid was added to ammonium hydroxide (28%) until it dissolved. Water and acids were then added to adjust the substrate volume and pH. The cinnamic acid concentration, the ammonium hydroxide concentration and the pH (amount of acid added) vary in the following examples, and accordingly the amount of ammonium salt produced also varies.

B) Die Wirkung von hohen Halogenkonzentrationen aus PAL wurde untersucht unter Verwendung verschiedener Säuren zur Herabsetzung des pH der Substratlösung. Zwei Substrate, welche nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 8 hergestellt wurden, wurden zubereitet (60 mM CA; 7,5 M NH3; pH 10,0). Lösung A wurde unter Verwendung von Salzsäure auf das gewünschte pH eingestellt, und das pH der Lösung LB wurde unter Verwendung von Schwefelsäure eingestellt. Zellen von R. rubra, gezüchtet wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden in Bechergläser verbracht, welche durch Wassermäntel auf 30 "C gehalten wurden. In zeitlichen Abständen wurden Proben entnommen und auf ihren L-Phe-nylalaningehalt untersucht unter Verwendung von sowohl Dünnschichtchromatographie wie L-Aminosäure-oxydase-enzym-Methoden. Es wurde gefunden, dass die Substratlösung A (enthaltend Ammoniumchlorid) das PAL-Enzym inhibiert. Substratlösung B -Zellen erzeugten zehnmal mehr L-Phenylalanin (nach 24 Stunden Reaktionsdauer) als die Substratlösung A -Zellen. B) The effect of high halogen concentrations from PAL was examined using different acids to lower the pH of the substrate solution. Two substrates prepared according to the general procedure of Example 8 were prepared (60mM CA; 7.5M NH3; pH 10.0). Solution A was adjusted to the desired pH using hydrochloric acid and the pH of solution LB was adjusted using sulfuric acid. R. rubra cells, grown as described in Example 4, were placed in beakers which were kept at 30 ° C. by water jackets. Samples were taken at intervals and checked for their L-phenylalanine content using both thin layer chromatography and L -Amino acid oxidase enzyme methods: It was found that substrate solution A (containing ammonium chloride) inhibits the PAL enzyme .. Substrate solution B cells produced ten times more L-phenylalanine (after a reaction time of 24 hours) than substrate solution A cells.

Beispiel 2 Example 2

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 1 B wurde durchgeführt, wobei Phosphorsäure mit Schwefelsäure verglichen wurde. Die Zellen von R. rubra in dem mit Phosphorsäure auf das gewünschte pH eingestellte Substrat erzeugten 90% 5 der Menge an L-Phenylalanin, welche unter Verwendung von Schwefelsäure zur Einstellung des pH erhalten wurden. The general procedure of Example 1B was carried out comparing phosphoric acid with sulfuric acid. The R. rubra cells in the substrate adjusted to the desired pH with phosphoric acid produced 90% 5 of the amount of L-phenylalanine obtained using sulfuric acid to adjust the pH.

Beispiel 3 Example 3

Das allgemeine Verfahren von Beispiel I B wurde durch-lo geführt zum Vergleich von Essigsäure mit Schwefelsäure. Die Menge an L-Phenylalanin, welche in den Reaktoren erzeugt wurde, war dieselbe. The general procedure of Example IB was carried out to compare acetic acid with sulfuric acid. The amount of L-phenylalanine that was generated in the reactors was the same.

Beispiel 4 Example 4

15 Nach dem allgemeinen Verfahren gemäss Präparation 6 wurden Zellen erzeugt. Diese Zellen wurden verwendet, um die Wiederverwendbarkeit (Stabilität) der ganzen Zellen zu untersuchen. Drei Substrate wurden zubereitet, 60 mM t-Zimtsäure, 7,5 M Ammoniumhydroxid, pH mit Schwefel-20 säure auf 10,0 bzw. 9,0 bzw. 8,0 eingestellt. Die Zellen (4,5 g Zellpaste) wurden in jedes Substrat (45 cm3) verbracht und während 16 Stunden bei 30 C gehalten. Die L-Phenylalanin-Konzentration wurde nach der L-Aminosäureoxidase-Me-thode und durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. 25 Die Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und während 16 Stunden in frisches Substrat verbracht. Die Resultate sind unten zusammengestellt. 15 Cells were generated according to the general procedure according to preparation 6. These cells were used to investigate the reusability (stability) of the whole cells. Three substrates were prepared, 60 mM t-cinnamic acid, 7.5 M ammonium hydroxide, pH adjusted to 10.0, 9.0 and 8.0 with sulfuric acid. The cells (4.5 g cell paste) were placed in each substrate (45 cm3) and kept at 30 C for 16 hours. The L-phenylalanine concentration was determined by the L-amino acid oxidase method and by thin layer chromatography. 25 The cells were centrifuged, washed and placed in fresh substrate for 16 hours. The results are summarized below.

Ansatz I Ansatz II % Aktivitäts-30 pH mg/ml L-PHE mg/ml L-PHE rétention Approach I Approach II% activity-30 pH mg / ml L-PHE mg / ml L-PHE rétention

9 9

10 10th

0,22 0,95 2,02 0.22 0.95 2.02

0,12 0,78 0,43 0.12 0.78 0.43

55 82 21 55 82 21

35 35

Die obigen Resultate zeigen, dass, obwohl pH 10,0 die doppelte anfängliche Aktivität von pH 9,0 ergibt, nach einem Ansatz die pH 9,0 -Zellen eine 163% höhere Aktivität als diejenigen von pH 10,0 aufweisen. The above results show that although pH 10.0 gives twice the initial activity of pH 9.0, after one approach the pH 9.0 cells have 163% higher activity than those of pH 10.0.

40 40

Beispiel 5 Example 5

Eine Untersuchung der Stabilität über 2 Wochen wurde wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die pH-Werte im Reaktor betrugen jedoch 8,75, bzw. 9,00 bzw. 9,25, und die Ammonium-45 hydroxid-Konzentration betrug 5,5 M. Der 14-tägigeTest wurde mit 6 aufeinanderfolgenden Beschickungsversuchen von freien R. rubra -Zellen durchgeführt. An examination of the stability over 2 weeks was carried out as in Example 4. However, the pH values in the reactor were 8.75, 9.00 and 9.25, respectively, and the ammonium 45 hydroxide concentration was 5.5 M. The 14-day test was carried out with 6 successive loading attempts of free R. rubra cells.

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. The results are summarized in the following table.

50 50

Tabelle I Table I

55 55

mg L-Phenylalanin erzeugt / Stunde / Gramm Trockengewicht an Zellen (% der noch vorhandenen anfänglichen Aktivität) mg L-phenylalanine produced / hour / gram dry weight of cells (% of initial activity still present)

pH der Reaktion pH of the reaction

60 60

Tage beim angegebenen pH Days at the specified pH

1 1

7 7

14 14

65 65

8,75 8.75

9,00 9.00

9,25 9.25

5,9 5.9

5,7 5.7

3,6 3.6

3,8 3.8

7,2 7.2

(61) (61)

(67) (67)

(74) (74)

3,5 3.5

4,0 4.0

(59) (59)

(61) (61)

(70) (70)

Diese Resultate zeigen, dass die richtigen Bedingungen die Wiederverwendung von PAL zur Erzeugung von L-Phenyl- These results show that the right conditions are right to reuse PAL to produce L-phenyl

alanin erlauben, und dass die Retentionsaktivität für freie Zellen hoch ist. allow alanine and that the retention activity for free cells is high.

Beispiel 6 Example 6

Die Zellpaste aus Präparation 7 wurde immobilisiert nach dem allgemeinen Verfahren, welches in der US-Patentanmel-dung Serial No. 400 141 beschrieben ist. Das Substrat (80 mM; 4,8 M NH3; pH 9,23) wurde von unten nach oben durch eine Säule gepumpt, welche mit immobilisierten R. rubra -Zellen gefüllt war. Die Fliessgeschwindigkeiten variierten zwischen 0,10,0,25 und 0,50 SVh_1 bei 22 °C und zwischen 0,25 und 0,50 SVh 1 bei 28 °C. Die ausfliessende Flüssigkeit wurde auf L-Phenylalanin untersucht. Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. The cell paste from preparation 7 was immobilized according to the general method described in the US patent application Serial No. 400 141 is described. The substrate (80 mM; 4.8 M NH3; pH 9.23) was pumped from bottom to top through a column which was filled with immobilized R. rubra cells. The flow velocities varied between 0.10.0.25 and 0.50 SVh_1 at 22 ° C and between 0.25 and 0.50 SVh 1 at 28 ° C. The outflowing liquid was examined for L-phenylalanine. The results are shown in the table below.

Tabelle II Table II

Temperatur temperature

Fluss erzeugtes River generated

Produktivität productivity

(°C) (° C)

(SVhl) (SVhl)

L-PHE L-PHE

(g/l/h) (g / l / h)

0,10 0.10

5,4 5.4

0,54 0.54

22 22

0,25 0.25

2,7 2.7

0,68 0.68

0,50 0.50

2,1 2.1

1,05 1.05

0,25 0.25

3,8 3.8

0,95 0.95

28 28

0,50 0.50

2,8 2.8

1,40 1.40

Bei 0,1 SVh 1 wurde eine 40%ige Umwandlung des Substrates beobachtet, wobei 5,4 g L-Phenylalanin/Liter bei 22 "C erzeugt wurden. A 40% conversion of the substrate was observed at 0.1 SVh 1, 5.4 g of L-phenylalanine / liter being produced at 22 ° C.

10 10th

20 20th

25 25th

30 30th

Beispiel 7 Example 7

Die Kultur- und Immobilisierungsbedingungen aus Beispiel 6 wurden wiederholt. Eine Säule aus immobolisierten R. rubra -Zellen, welche PAL enthielt wurde verwendet, um die Produktivität Halblebenszeit der Säule unter gewissen Bedin- 35 gungen zu bestimmen. Das Substrat war 75 mM CA; 4,5 M NH3; pH 9,25, und wurde bei 23 °C mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,25 SVh 1 kontinuierlich betrieben. Die Produk-tivitäts-Halblebenszeit erwies sich als 41 Tage dauernd (siehe Figur 1). Diese Untersuchung zeigt, dass immobilisiertes PAL40 über eine lange Zeil verwendet werden kann und kontinuierlich L-Phenylalanin erzeugt. The culture and immobilization conditions from Example 6 were repeated. A column of immobilized R. rubra cells containing PAL was used to determine the productivity half-life of the column under certain conditions. The substrate was 75 mM CA; 4.5 M NH3; pH 9.25, and was operated continuously at 23 ° C. with a flow rate of 0.25 SVh 1. The productivity half-life was 41 days (see Figure 1). This study shows that immobilized PAL40 can be used over a long line and continuously produces L-phenylalanine.

Beispiel 8 Example 8

A) Ein Fermentationsmedium wurde zubereitet wie in Präparation 5 beschrieben und verwendet, um R. rubra in einem 10 Liter -Fermentor zu züchten. Die Beimpfung des Fer-mentors erfolgte wie in Präparation 3. Proben der Zellen wurden periodisch aus dem Fermentor entnommen. Die Zellen A) A fermentation medium was prepared as described in Preparation 5 and used to grow R. rubra in a 10 liter fermentor. The fermenter was inoculated as in preparation 3. Samples of the cells were taken periodically from the fermentor. The cells

658 670 658 670

wurden auf ihre PAL-Aktivität untersucht, um die optimale Erntezeit zu bestimmen. Es wurde gefunden, dass innerhalb 6 Stunden nach Auftreten der Spitzenaktivität weniger als 50% der Spitzenaktivität verblieben. were examined for their PAL activity in order to determine the optimal harvest time. It was found that less than 50% of the peak activity remained within 6 hours of peak activity.

Es wurde ferner festgestellt, dass das ganze D,L-Phenylalanin vor Erreichung der Spitzenaktivität aus dem Medium verbraucht worden war. It was also found that all of the D, L-phenylalanine had been consumed from the medium prior to peak activity.

B) Eine Wiederholung des Beispiels 8 A wurde durchgeführt. Jedoch wurde unmittelbar nachdem die Spitzenaktivität aufgetreten war, D,L-Phenylalanin in den Fermentor zugeführt (5 g /10 Liter). In der ersten Stunde erfolgte ein Abfall der PAL-Aktivität wie in 16 A. Die PAL-Aktivität stabilisierte sich jedoch für die nächsten 3 Stunden, bevor die Ernte erfolgte (siehe Figur 2). B) A repetition of Example 8 A was carried out. However, immediately after peak activity occurred, D, L-phenylalanine was added to the fermentor (5 g / 10 liters). In the first hour, the PAL activity decreased as in 16 A. However, the PAL activity stabilized for the next 3 hours before the harvest (see FIG. 2).

Beispiel 9 Example 9

Zellen wurden gezüchtet und immobilisiert nach dem Verfahren von Beispiel 6. Das verwendete Substrat enthielt jedoch 75 mM CA und 4,5 M NH3 und wies ein pH von 9,43 bei 23 °C und eine Fliessgeschwindigkeit von SVh 1 = 0,50 auf. Es wurde gefunden, dass die Säule 1,9 g L-Phenylalanin / Liter Bettvolumenträger / Stunde erzeugte. Die Konzentration an L-Phenylalanin in der ausfliessenden Flüssigkeit betrug 3,8 g/Liter. Cells were grown and immobilized according to the procedure of Example 6. However, the substrate used contained 75 mM CA and 4.5 M NH3 and had a pH of 9.43 at 23 ° C and a flow rate of SVh 1 = 0.50. The column was found to produce 1.9 g L-phenylalanine / liter bed volume / hour. The concentration of L-phenylalanine in the outflowing liquid was 3.8 g / liter.

Beispiel 10 Example 10

Zellen wurden nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 6 gezüchtet und immobilisiert. Die immobilisierten Zellen wurden in eine Säule eingefüllt und 352 cm3 Substrat (75 mM CA; 4,5 M NH3; pH 9,4) wurden mit 1,0 SVh 1 durch die Säule umlaufen gelassen. Proben des Substrates wurden in Zeitabständen entnommen und die L-Phenylalaninkonzen-tration durch L-Amino-oxidas-Enzymversuch und durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die Resultate sind in der untenstehenden Tabelle zusammengestellt. Cells were grown and immobilized according to the general procedure of Example 6. The immobilized cells were filled into a column and 352 cm3 of substrate (75 mM CA; 4.5 M NH3; pH 9.4) were circulated through the column with 1.0 SVh 1. Samples of the substrate were taken at intervals and the L-phenylalanine concentration was determined by L-amino-oxidas enzyme experiment and by thin layer chromatography. The results are summarized in the table below.

Tabelle III Umlaufzeit (Stunden) Table III Orbital Period (Hours)

7 7

21,5 21.5

24 24th

44,5 44.5

L-Phenylalanin (Gramm/Liter) L-phenylalanine (grams / liter)

2,8 4,6 5,0 6,8 2.8 4.6 5.0 6.8

% Umwandlung % Conversion

23 37 40 55 23 37 40 55

45 45

Dieses Beispiel zeigt, dass unter den Bedingungen der Reaktion L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen und in hohem Konversionsmass hergestellt werden kann unter Verwendung immobilisierter Zellen, welche PAL enthalten. This example shows that under the conditions of the reaction, L-phenylalanine can be produced in high concentrations and in a high degree of conversion using immobilized cells which contain PAL.

C C.

1 Blatt Zeichnungen 1 sheet of drawings

Claims

658 670

1. A process for the preparation of L-phenylalanine, in which

(a) reacting trans-cinnamic acid with an ammonium ion source to form a substrate solution,

(b) adjusting the pH of this substrate solution, and

(c) this substrate solution is brought into contact with phenylalanine ammonium hydroxide lyase under conditions producing L-phenylalanine to form L-phenylalanine, characterized in that

(A) uses a halogen-free ammonium salt as the ammonium ion source, and

(B) adjusts the pH of the substrate solution by adding a halogen-free acid.

2. The method according to claim 1, characterized in that the pH of the substrate solution is adjusted such that it is in the range from 8 to 10, in particular from 8.5 to 9.5.

2nd

PATENT CLAIMS

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the ammonium ion source is selected from the group consisting of ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrite, ammonium citrate and ammonium acetate, and is preferably ammonium sulfate.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the pH of the substrate solution is adjusted with an acid selected from the group consisting of sulfuric acid, phosphoric acid and acetic acid, preferably with sulfuric acid.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the concentration of ammonium ions is in the range from 0.1 M to 7.5 M, preferably in the range from 1 M to 5 M.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the concentration of t-cinnamic acid in the solution is in the range of 30 mM to 200 mM, preferably between 60 mM and 150 mM.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the Phenylalaninammoniumhydroxide lyase can be used again.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that intact cells containing phenylalanine ammonium hydroxide lyase are added to the substrate in a feed reactor.

9. The method according to claim 8, characterized in that the charging system is a simple charging system.

10. The method according to claim 8, characterized in that the feed system is a continuous feeder.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the phenylalanine ammonium hydroxide lyase is immobilized on or in a reusable carrier.

12. The method according to claim 11, characterized in that the phenylalanine ammonium hydroxide lyase is immobilized in a column, which is preferably kept at a temperature of 10 to 40 "C, in particular 18 to 30 nC, when the substrate solution through the column is pumped.