CH658001A5

CH658001A5 - LIPOSOM.

Info

Publication number: CH658001A5
Application number: CH1532/83A
Authority: CH
Inventors: Masanobu Kawamata; Koichi Ushimaru; Shuji Yamane
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1981-10-29
Filing date: 1983-03-21
Publication date: 1986-10-15
Also published as: KR840001278A; BE896217A; DE3309076A1; JPS5874619A; FR2542999A1; GB2135878B; DE3309076C2; FR2542999B1; GB2135878A; GB8306237D0

Description

20 Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Liposom aus Sterylglucosid und/oder Sterylglucosidmonopalmitat sowie auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Liposoms. Ebenfalls bezieht sich die Erfindung auf ein ein Liposom als Wirkstoffkomponente enthaltendes Arzneimittel. 25 Sterylglucoside und Sterylglucosidmonopalmitate sind in Pflanzen enthalten und sie können aus diesen extrahiert und abgetrennt werden. Sie liegen meistens in Form einer Mischung aus beta-Sitosteryl-beta-D-glucosid, Stigmasteryl-beta-D-glucosid und Campesteryl-glucosid sowie als Fett-30 säureester dieser Verbindungen vor, und sie stammen von den verschiedensten, natürlichen Materialien ab, z.B. Sojabohnen, Baumwollsamen, Hülsenfrüchte, Kichererbsen, Grapefruit-Pressrückstände und ähnliche und sie können z.B. nach dem Verfahren von T. Kiribuchi et al, beschrieben 35 in Agricultural Biological Chemistry, Band 30, Nummer 8, Seite 770 bis 778 (1966), erhalten werden. Um Sterylglucoside aus Pflanzenmaterialien zu erhalten, kann man eine Mischung, die nach der weiter oben beschriebenen Methode erhalten wurden, mit Alkali hydrolisieren. Um Sterylglucosid-40 monopalmitate herzustellen, können die Sterylglucoside, die nach der weiter oben genannten Hydrolysemethode erhalten wurden, einer chemischen, synthetischen Reaktion unterworfen werden. The present invention relates to a liposome made from steryl glucoside and / or steryl glucoside monopalmitate and to a method for producing this liposome. The invention also relates to a medicament containing a liposome as active ingredient. 25 Sterylglucoside and Sterylglucosidmonopalmitate are contained in plants and they can be extracted from these and separated. They are usually in the form of a mixture of beta-sitosteryl-beta-D-glucoside, stigmasteryl-beta-D-glucoside and campesteryl-glucoside and as a fatty acid ester of these compounds, and they are derived from a wide variety of natural materials, e.g. Soybeans, cotton seeds, legumes, chickpeas, grapefruit pressed residues and the like and they can e.g. by the method of T. Kiribuchi et al, described 35 in Agricultural Biological Chemistry, volume 30, number 8, pages 770 to 778 (1966). In order to obtain steryl glucosides from plant materials, a mixture obtained by the method described above can be hydrolyzed with alkali. In order to produce sterylglucoside-40 monopalmitates, the sterylglucosides obtained by the hydrolysis method mentioned above can be subjected to a chemical, synthetic reaction.

Die Mengen an Konstituenten von Sterylglucosiden, die 45 aus Pflanzen extrahiert und abgetrennt wurde, sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt. The amounts of constituents of steryl glucosides that were extracted from 45 plants and separated are summarized in Table I below.

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beta-Sitosteryl- Stigmasteryl- Campesteryl- beta-sitosteryl-stigmasteryl-campesteryl-

beta-D-Glucosid beta-D-glucosid beta-D-glucosid beta-D-glucoside beta-D-glucoside beta-D-glucoside

Sojabohnen 56% 23% 21% Soybeans 56% 23% 21%

Baumwollsamen 96% 4% 0% Cotton seeds 96% 4% 0%

Hülsenfrüchte 87% 0% 3% Legumes 87% 0% 3%

oder Kichererbsen or chickpeas

Grapefruit-Trester 84% 9% 7% Grapefruit pomace 84% 9% 7%

Sterylglucoside kann man aus Pflanzen-Sterinen, die in Form von beta-Sitosterin, Stigmasterin, Campesterin oder Mischungen davon erhalten wurden, nach einem bekannten Verfahren synthetisieren, wie es z.B. in Chemische Berichte, Band 105, Seite 1097 bis 1121 beschrieben ist. Ausgehend von den erhaltenen Sterylglucosiden kann man ihre entsprechenden Monopalmitate herstellen. Steryl glucosides can be synthesized from plant sterols obtained in the form of beta-sitosterol, stigmasterol, campesterol or mixtures thereof, according to a known method, e.g. in Chemical Reports, Volume 105, pages 1097 to 1121. The corresponding monopalmitates can be prepared starting from the steryl glucosides obtained.

Sterylglucoside sind in Pyridin löslich, etwas löslich in Dioxan, schwach löslich in Alkoholen und Ketonen und fast unlöslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Kohlenwasserstoffe und halogenhaltige Lösungsmittel; 60 ebenfalls sind die Verbindungen in Wasser fast unlöslich. Steryl glucosides are soluble in pyridine, somewhat soluble in dioxane, slightly soluble in alcohols and ketones and almost insoluble in the usual organic solvents, such as. B. hydrocarbons and halogen-containing solvents; 60 the compounds are also almost insoluble in water.

In bezug auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Sterylglucoside besteht kein wesentlicher Unterschied, sogar dann, wenn die Sterin-Ringsysteme verschieden sind oder wenn aus Pflanzen Mischungen der genannten 65 Verbindungen extrahiert werden. Andererseits sind Sterylglucosidmonopalmitate in nicht polaren Lösungsmitteln löslich, etwas löslich in Alkoholen und fast unlöslich in Wasser. In bezug auf die physikalischen und chemischen Eigenschaf There is no significant difference with regard to the physical and chemical properties of the steryl glucosides, even if the sterol ring systems are different or if mixtures of the above-mentioned 65 compounds are extracted from plants. On the other hand, steryl glucoside monopalmitates are soluble in non-polar solvents, somewhat soluble in alcohols and almost insoluble in water. In terms of physical and chemical properties

ten der Sterylglucosidmonopalmitate besteht kein Unterschied, sogar dann, wenn sie verschiedene Sterin-Ringsyste-me enthalten oder wenn man Mischungen der angeführten Verbindungen aus Pflanzen extrahiert. There is no difference between the sterylglucoside monopalmitates, even if they contain different sterol ring systems or if mixtures of the compounds mentioned are extracted from plants.

Sterylglucoside und Sterylglucosidmonopalmitate weisen eine hämostatische Wirkung auf, eine die kleinen Gefässen verstärkende Aktivität, eine Antischockwirkung und ähnliche Wirkungen, wie es in der japanischen vorgeprüften Patentveröffentlichung Sho-54-11369 sowie in der nicht vorgeprüften Patentveröffentlichung Sho-53-109954 beschrieben ist; die genannten Verbindungen sind nützliche Pharmazeuti-ka. Steryl glucosides and steryl glucoside monopalmitates have hemostatic activity, vasodilatory activity, anti-shock activity and similar effects as described in Japanese Patent Examined Publication Sho-54-11369 and Unexamined Patent Publication Sho-53-109954; the compounds mentioned are useful pharmaceuticals.

Es ist wünschenswert, dass die genannten Verbindungen als Injektionslösungen wegen ihrer pharmakologischen Wirkungen verwendet werden sollen, aber wegen ihrer Unlöslichkeit in Wasser war es bis jetzt unmöglich, sie in wässrigen Lösungsmitteln aufzulösen, um injizierbare Lösungen bereitzustellen. Es wurden daher Versuche durchgeführt, diese Verbindungen in injizierbare Lösungen zu überführen, sie in nicht-wässrigen Lösungsmitteln aufzulösen oder aus ihnen Suspensionen herzustellen. Die genannten Verbindungen sind jedoch in Propylenglycol, «Macrogol» sowie pflanzlichen Ölen, die häufig als Lösungsmittel für Injektionslösungen dienen, sehr wenig löslich und es war nicht möglich, die gewünschten Konzentrationen zu erzielen. Bei den zuletzt durchgeführten Versuchen war es möglich, Injektionslösun-gegi herzustellen, aber wenn sie in vivo injiziert wurden, so fand in demjenigen Teil des Körpers, wo die Injektion stattfand, eine so langsame Auflösung statt, dass man die gewünschte pharmazeutische Wirkung nicht erreichen konnte. Auf jeden Fall kann festgestellt werden, dass alle Versuche zur Herstellung injizierbarer Injektionslösungen keinen Erfolg hatten. It is desirable that the above compounds be used as injection solutions because of their pharmacological effects, but because of their insolubility in water, it has heretofore been impossible to dissolve them in aqueous solvents to provide injectable solutions. Attempts have therefore been made to convert these compounds into injectable solutions, to dissolve them in non-aqueous solvents or to prepare suspensions from them. However, the compounds mentioned are very slightly soluble in propylene glycol, “macrogol” and vegetable oils, which often serve as solvents for injection solutions, and it was not possible to achieve the desired concentrations. In the last experiments carried out, it was possible to prepare solutions for injection, but when they were injected in vivo, the dissolution in the part of the body where the injection took place was so slow that the desired pharmaceutical effect could not be achieved . In any case, it can be said that all attempts to produce injectable solutions for injection have been unsuccessful.

Durch Anwendung üblicher bekannter Methoden zur Herstellung injizierbarer Lösungen aus fast unlöslichen Verbindungen war es nicht möglich, injizierbare Lösungen von Sterylglucosiden und Sterylglucosidmonopalmitaten bereitzustellen und aus diesem Grund ist es notwendig, spezielle Methoden zu verwenden. Bisher gelang es bereits, durch Verwendung von hydrophilen Lösungsmitteln und löslich machenden Substanzen, wie sie z.B. in den japanischen vorgeprüften Patentveröffentlichungen Sho-53-31210 und Sho-53-20567 offenbart sind, eine wässrige Lösung der genannten Verbindungen zu erhalten. Diese Methoden weisen jedoch immer noch einige Mängel auf, die verbessert werden müssen. By using common known methods for producing injectable solutions from almost insoluble compounds, it has not been possible to provide injectable solutions of sterylglucosides and sterylglucoside monopalmitates, and for this reason it is necessary to use special methods. So far, it has been possible to use hydrophilic solvents and solubilizing substances, such as those e.g. Japanese Patent Examined Publications Sho-53-31210 and Sho-53-20567 disclose to obtain an aqueous solution of the above compounds. However, these methods still have some shortcomings that need to be improved.

Diese Mängel sind nachstehend beschrieben: These shortcomings are described below:

1) Da die Affinität von Sterylglucosiden und Sterylglucosidmonopalmitaten zu Wasser sehr gering ist, ist es notwendig, verhältnismässig grosse Mengen an Lösungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln zur Löslichmachung bestimmter Mengen derartiger Verbindungen in Wasser bereitzustellen. 1) Since the affinity of steryl glucosides and steryl glucoside monopalmitates for water is very low, it is necessary to provide relatively large amounts of solvents or surface-active agents for solubilizing certain amounts of such compounds in water.

2) Beim Sterilisieren durch Anwendung von Wärme trennen sich die oberflächenaktiven Mittel ab und setzen sich an den Wänden der Ampulle fest. 2) When sterilizing by applying heat, the surface-active agents separate and attach themselves to the walls of the ampoule.

3) Bei intravenöser Injektion wird die pharmakologische Wirkung der genannten Verbindung durch das verwendete löslich machende Mittel beeinflusst. Es ist nicht möglich, unter Verwendung von löslich machenden Mitteln, ausser einigen, wie z.B. «HCO-60» (Handelsname) (Polyoxyethylen 3) In the case of intravenous injection, the pharmacological action of the compound mentioned is influenced by the solubilizing agent used. It is not possible to use solubilizing agents, except some, e.g. "HCO-60" (trade name) (polyoxyethylene

60 Mol und gehärtetes Castoröl), die gewünschte Wirkung zu erzielen. 60 moles and hardened castor oil) to achieve the desired effect.

Es wurden ausführliche Studien unternommen, um eine Injektionslösung zu finden, die man leicht unter Anwendung von Wärme sterilisieren kann, die hohe Konzentrationen des aktiven Bestandteiles enthält, welcher sich zur Stärkung von Blutgefässen eignet, sowie als Antischockmittel, wo hohe Extensive studies have been undertaken to find a solution for injection that can be easily sterilized using heat that contains high concentrations of the active ingredient that is useful for strengthening blood vessels, and as an anti-shock agent where high

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Dosen notwendig sind, eingesetzt werden kann und wobei die genannten injizierbaren Lösungen, sogar bei intravenöser Verabreichung, eine sichere pharmazeutische Wirkung erzielen. Als Resultat dieser Untersuchungen wurde festgestellt, s dass die gewünschten Ziele erreicht werden können, wenn man die genannten aktiven Verbindungen in Liposom ein-schliesst. Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein Liposom, das eine neue Zusammensetzung aus Sterylgluco- . siden und/oder Sterylglucosidmonopalmitaten darstellt, io Ebenfalls bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zu Herstellung des Liposoms sowie auf Arzneimittel, die das erfindungsgemässe Liposom enthalten. Doses are necessary, can be used and wherein the injectable solutions mentioned, even with intravenous administration, achieve a safe pharmaceutical effect. As a result of these investigations it was found that the desired goals can be achieved if the active compounds mentioned are included in liposome. The present invention thus relates to a liposome which is a new composition of sterylgluco-. represents siden and / or Sterylglucosidmonopalmitaten, io The present invention also relates to a method for the production of the liposome and to medicinal products which contain the liposome according to the invention.

Beispiele für die Verwendung von Liposom als Träger für Pharmazeutika wurden kürzlich in der Literatur gefun-i5 den und ebenfalls konnte man verschiedene Herstellungsverfahren dafür in verschiedenen Veröffentlichungen feststellen. Zum Beispiel in Tyrell, D.H., et al: Biochimica et Biophysica Acta MR 457, Seiten 259 bis 302 (1976); Flender, J.H., et al: Life Science, 20(7), Seiten 1109 -1020 (1977). 20 Im allgemeinen werden Liposome in den nachfolgenden Formen erhalten: Examples of the use of liposome as a carrier for pharmaceuticals have recently been found in the literature and various manufacturing processes for it have also been found in various publications. For example, in Tyrell, D.H., et al: Biochimica et Biophysica Acta MR 457, pages 259 to 302 (1976); Flender, J.H., et al: Life Science, 20 (7), pages 1109-1020 (1977). 20 In general, liposomes are obtained in the following forms:

Man gibt eine Lösung des Lipids in Chloroform in ein oval geformtes Gefäss, das Chloroform wird von der Lösung abgedampft, so dass sich eine dünne Membran des Lipids an 25 den Wänden des Gefässes bildet, dann gibt man einen Puffer und eine wässrige Lösung des Pharmazeutikums hinzu und die Lipidmembran wird von den Wänden durch Rühren entfernt. Auf diese Weise wird eine wässrige Lösung des pharmazeutischen Mittels in die entstandenen kleinen Kugeln 30 oder Träger eingeschlossen. Es war daher notwendig, die pharmazeutischen Mittel, die nicht in dem Liposom eingeschlossen waren, durch Gelfiltration oder durch Ultrazentri-fugation zu entfernen. Ausserdem, für den Fall, dass das Liposom in der weiter oben beschriebenen Form vorliegt, de-35 fundiert die wässrige Lösung des pharmazeutischen Mittels innerhalb kurzer Zeit aus dem Liposom in die wässrige Schicht hinein, sogar dann, wenn man das Liposom von freien pharmazeutischen Mitteln befreite. Es besteht der Nachteil, dass das Liposom kaum als praktisches pharmazeuti-40 sches Präparat Verwendung finden kann. Nach Durchführung intensiver Untersuchungen konnte jedoch unerwarteterweise festgestellt werden, dass Sterylglucoside bzw. Sterylglucosidmonopalmitate eine starke Affinität zu dem Lipid, aus welchem das Liposom gebildet ist, aufweisen und unter 45 Anwendung dieser Eigenschaften können die genannten Verbindungen in ein Liposom-Lipid eingeschlossen werden. A solution of the lipid in chloroform is placed in an oval-shaped vessel, the chloroform is evaporated from the solution so that a thin membrane of the lipid forms on the walls of the vessel, then a buffer and an aqueous solution of the pharmaceutical are added and the lipid membrane is removed from the walls by stirring. In this way, an aqueous solution of the pharmaceutical agent is enclosed in the resulting small balls 30 or carriers. It was therefore necessary to remove the pharmaceutical agents that were not included in the liposome by gel filtration or by ultracentrifugation. In addition, in the event that the liposome is in the form described above, the aqueous solution of the pharmaceutical agent will de-found within a short time from the liposome into the aqueous layer, even if the liposome is released from free pharmaceutical agents liberated. There is the disadvantage that the liposome can hardly be used as a practical pharmaceutical preparation. After intensive investigations, however, it was unexpectedly found that sterylglucosides or sterylglucoside monopalmitates have a strong affinity for the lipid from which the liposome is formed, and using these properties, the compounds mentioned can be included in a liposome lipid.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein Liposom, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es als aktiven Bestandteil ein oder mehrere Sterylglucoside und/oder Steryl-50 glucosidmonopalmitate enthält. The present invention thus relates to a liposome which is characterized in that it contains one or more sterylglucosides and / or steryl-50 glucoside monopalmitates as the active ingredient.

Das erfindungsgemässe Liposom wird erhalten, indem man ein oder mehrere Sterylglucoside und/oder Sterylglucosidmonopalmitate in einer Lösung eines Lipids in Chloroform auflöst, dann das Chloroform abdampft, um die Lipid-55 Membran an die Wand des Behälters zu binden und schliesslich, nach Zugabe eines Mediums, rührt oder einer Ultraschallwellen-Bestrahlung unterwirft. The liposome of the invention is obtained by dissolving one or more sterylglucosides and / or sterylglucoside monopalmitates in a solution of a lipid in chloroform, then evaporating the chloroform to bind the Lipid-55 membrane to the wall of the container and finally, after adding a medium , stirred or subjected to ultrasonic wave radiation.

In der Chloroformlösung des Lipids und des Sterylgluco-sides und/oder Sterylglucosidmonopalmitates ist vorzugs-60 weise ebenfalls ein Sterin zur Stabilisierung der Membran enthalten und es kann ebenfalls in der Lösung ein Aufla-dungsmittel enthalten sein. The chloroform solution of the lipid and the sterylglucoside and / or sterylglucoside monopalmitate preferably also contains a sterol to stabilize the membrane and a charging agent can also be present in the solution.

Im erfindungsgemässen Liposom sind also die Sterylglucoside und/oder Sterylglucosidpalmitate in ein Lipid einge-65 schlössen. In the liposome according to the invention, the sterylglucosides and / or sterylglucoside palmitates are therefore included in a lipid.

Als Sterin kann Cholesterin verwendet werden. Nach Abdampfung des Chloroforms gibt man als Medium bevorzugt physiologische Kochsalzlösung und eine Pufferlösung Cholesterol can be used as sterol. After the chloroform has been evaporated off, the medium used is preferably physiological saline and a buffer solution

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hinzu und rührt und/oder unterwirft einer Ultraschallwellenbehandlung. Beispiele für Lipide, die für hier verwendet werden können, sind natürlich vorkommende Lipide, wie z.B. Lecithin, Sphingolipid-phosphoglyceride, Ganglioside usw. oder synthetische Lipide, wie z.B. Dimyristoyl-, Dipalmit-oyl-, Distearyl- und Dioleylphosphatidylcholin usw. Natürliches oder synthetisch hergestelltes Lecithin ist bevorzugt. Beispiele für Stabilisatoren für die Liposom-Membran sind Cholesterin, beta-Sitosterin, Stigmasterin und Campesterin oder gemischte Sterine, die aus pflanzlichem Material extrahiert wurden. Beispiele für Aufladungsmittel sind Stearyl-amin, welches eine positive elektrische Ladung verleiht und Phosphatidsäure sowie Dicetylphosphorsäure, die eine negative elektrische Ladung verleihen. added and stirred and / or subjected to ultrasonic wave treatment. Examples of lipids that can be used for here are naturally occurring lipids such as e.g. Lecithin, sphingolipid phosphoglycerides, gangliosides etc. or synthetic lipids such as e.g. Dimyristoyl, dipalmit-oyl, distearyl and dioleyl phosphatidylcholine, etc. Natural or synthetically produced lecithin is preferred. Examples of stabilizers for the liposome membrane are cholesterol, beta-sitosterol, stigmasterol and campesterol or mixed sterols extracted from plant material. Examples of charging agents are stearylamine, which imparts a positive electrical charge, and phosphatidic acid and dicetylphosphoric acid, which imparts a negative electrical charge.

Beispiel für Sterylglucoside für die vorliegende Erfindung sind beta-Sitosteryl-beta-D-glucosid, Stigmasteryl-beta-D-glucosid, Campesteryl-beta-D-glucosid, ChoIesteryl-beta-D-glucosid und Sterylglucosidmischungen sowie Mischungen, die sich aus den weiter oben erwähnten Sterylglucosiden zusammensetzen und aus pflanzlichen Materialien extrahiert wurden. Beispiele für Sterylglucosidmonopalmitate, die gemäss der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind 6-Monopalmitate der weiter oben genannten Sterylglucoside. Examples of sterylglucosides for the present invention are beta-sitosteryl-beta-D-glucoside, stigmasteryl-beta-D-glucoside, campesteryl-beta-D-glucoside, choesteryl-beta-D-glucoside and sterylglucoside mixtures and mixtures which result from the Assemble steryl glucosides mentioned above and have been extracted from plant materials. Examples of sterylglucoside monopalmitates which can be used according to the present invention are 6-monopalmitates of the sterylglucosides mentioned above.

Das bevorzugte Verhältnis des Hauptbestandteils und der Lipidkomponente ist folgendermassen: bis ein Gewichtsprozent des Hauptbestandteils, ein bis zehn Teile, vorzugsweise drei bis fünf Teile des Lipids, 0,5 bis 5 Teile, vorzugsweise 0,3 bis 2 Teile des Sterins und 0,05 bis 0,5 Teile des Aufladungsmittels. Abhängig von der Stärke und der Dauer des Rührens sowie der Bestrahlung mit Ultraschallwellen erhält man ein Liposom, das eine einzige oder mehrere Lamellen aufweist. The preferred ratio of the main component and the lipid component is as follows: up to one percent by weight of the main component, one to ten parts, preferably three to five parts of the lipid, 0.5 to 5 parts, preferably 0.3 to 2 parts of the sterol and 0.05 up to 0.5 parts of the charging agent. Depending on the strength and duration of the stirring and the irradiation with ultrasound waves, a liposome is obtained which has a single or several lamellae.

Die erfindungsgemässen Liposome, die Sterylglucoside und/oder Sterylglucosidmonopalmitate enthalten, können parenteral verabreicht werden und sie weisen die folgenden Vorteile auf: The liposomes according to the invention, which contain sterylglucosides and / or sterylglucoside monopalmitates, can be administered parenterally and they have the following advantages:

1) Da die Menge des eingesetzten Lipids gewöhnlich drei bis fünf Gewichtsteile pro ein Gewichtsteil des Hauptbestandteils ausmacht, ist es möglich, Injektionslösungen herzustellen, die sich für intravenöse Injektionen eignen. 1) Since the amount of the lipid used is usually three to five parts by weight per one part by weight of the main component, it is possible to prepare injection solutions which are suitable for intravenous injections.

2) Es besteht die Möglichkeit, eine Injektionslösung herzustellen, die sogar fünf oder etwa fünf Prozent des Hauptbestandteils enthält, und daher ist es möglich, Injektionslösungen bereitzustellen, die nicht nur für hämostatische Zwecke dienen, aber auch zur Verstärkung von Blutgefässen sowie als Antischockmittel verwendet werden können, wo man höhere Dosen verabreichen muss. 2) There is a possibility of preparing a solution for injection that even contains five or about five percent of the main ingredient, and therefore it is possible to provide solutions for injection that are not only used for hemostatic purposes, but are also used to strengthen blood vessels and as an anti-shock agent where you have to give higher doses.

3) Die vorliegende erfindungsgemässe pharmazeutische Zusammensetzung ermöglicht, bestimmte pharmakologische Wirkungen zu erzielen, sogar dann, wenn sie durch intravenöse Injektion verabreicht wird. 3) The present pharmaceutical composition according to the invention enables certain pharmacological effects to be achieved, even when it is administered by intravenous injection.

4) Die Sterilisation kann durch Erhitzen leicht durchgeführt werden. 4) The sterilization can be easily carried out by heating.

Neben den weiter oben genannten Vorteilen weist das erfindungsgemässe Liposom markierende Eigenschaften auf, und zwar dann, wenn es in einer Ampulle zusammen mit Stickstoff gehalten wird und man sie im Dunkeln aufbewahrt. Die auf diese Weise vorbereitete Zusammensetzung ist mindestens zwei Jahre lang bei Zimmertemperatur stabil und man kann weder im Aussehen noch bei den Konzentrationen Veränderungen beobachten. In addition to the advantages mentioned above, the liposome according to the invention has labeling properties, namely when it is kept in an ampoule together with nitrogen and it is kept in the dark. The composition prepared in this way is stable for at least two years at room temperature and no changes in the appearance or in the concentrations can be observed.

In den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Preferred embodiments of the invention are described in the examples below.

Beispiel 1 example 1

Man gab 20 mg Wollschweiss-Lecithin in ein ovales Ge-fass von 50 ml Inhalt. Man löste in 2 ml Chloroform auf und 20 mg of wool sweat lecithin were placed in an oval 50 ml container. It was dissolved in 2 ml of chloroform and

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gab dann 5 mgbeta-Sitosteryl-beta-D-glucosid und 2 mg Cholesterin hinzu und löste auf. Das Chloroform wurde auf einem Dampfbad bei einer Temperatur von 30 °C unter Verwendung eines Drehverdampfers abgedampft. Dann blies s man zehn Minuten lang Stickstoff auf den Rest, trocknete sechs Stunden lang in einem Vakuum-Trockengefass, gab 5 ml einer physiologischen Natriumchloridlösung hinzu und homogenisierte drei Minuten lang unter Stickstoff unter Verwendung eines Ultraschallwellen-Homogenisators io (Choompa Kogyo Co.; 25KHz, 150 W). Man erhielt eine fast durchsichtige, hellgelbe Flüssigkeit. Diese Flüssigkeit wurde steril filtriert unter Verwendung eines GS-Filters mit kleinen Poren und man erhielt ein Filtrat, in welchem 99,6% beta-Sitosteryl-beta-D-glucosid, verglichen mit der Menge 15 bevor der Filtration, identifiziert werden konnten. Man füllt das Filtrat zusammen mit Stickstoff in eine Ampulle von 5 ml Inhalt und unterwirft diese Ampulle einer Sterilisation im Autoklaven während zwanzig Minuten bei einer Temperatur von 120 °C. Während der Sterilisation konnte man we-20 der eine Abtrennung des Hauptbestandteils noch des Lipids beobachten. Wenn die Injektionslösung im Dunkeln aufbewahrt wird, findet weder die Abtrennung von Fremdstoffen noch eine Herabsetzung der Konzentration des Hauptbestandteils statt, und zwar in einem Zeitraum von mehr als 25 zwei Jahren bei Zimmertemperatur. Einer Gruppe von zehn Mäusen wurde diese Injektionslösung sowie eine Blindprobe intravenös injiziert. Man stellte die Blindprobe her, indem man den Hauptbestandteil aus der Injektionslösung entfernte. Die Schwänze der Mäuse wurden ein Zentimeter entfernt 30 von dem Ende mit einem chirurgischen Messer abgeschnitten, in Wasser eingeweicht und man mass die Zeit, bei welcher die Blutung aufhörte (siehe Motohashi, et al.: Tokyo Ji-keikai Medicai Journal, 75(5), 1008, 1959), um die pharmakologische Aktivität der vorliegenden erfindungsgemässen 35 Injektionslösungen bei intravenöser Injektion zu bestimmen. Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt, aus welcher hervorgeht, dass der Mittelwert der hämostatischen Zeit in der Blindgruppe 14,7 ± 0,082 Minuten beträgt, während diejenige Gruppe, 40 welcher man 0,2 mg pro Kilogramm der Injektionslösung verabreichte, eine hämostatische Zeit von 12,3 + 0,27 Minuten besass. Es besteht ein bedeutender Unterschied in bezug auf das Niveau des P < 0,01, und die Wirksamkeit der erfindungsgemässen Injektionslösung bei der intravenösen Ver-45 abreichung wurde mit Sicherheit nachgewiesen. then added 5 mgbeta-sitosteryl-beta-D-glucoside and 2 mg cholesterol and dissolved. The chloroform was evaporated on a steam bath at a temperature of 30 ° C using a rotary evaporator. Then nitrogen was blown on the rest for ten minutes, dried in a vacuum drier for six hours, added 5 ml of a physiological sodium chloride solution and homogenized for three minutes under nitrogen using an ultrasonic wave homogenizer io (Choompa Kogyo Co .; 25KHz , 150 W). An almost transparent, light yellow liquid was obtained. This liquid was sterile filtered using a small pore GS filter and a filtrate was obtained in which 99.6% beta-sitosteryl-beta-D-glucoside could be identified compared to the amount before the filtration. The filtrate is filled with nitrogen into an ampoule of 5 ml content and this ampoule is subjected to sterilization in an autoclave for 20 minutes at a temperature of 120 ° C. During the sterilization, we could see a separation of the main constituent and the lipid. If the solution for injection is kept in the dark, there will be no removal of foreign substances or a decrease in the concentration of the main component in a period of more than 25 two years at room temperature. A group of ten mice were injected with this solution for injection and a blank sample intravenously. The blank was prepared by removing the major component from the solution for injection. The mice 's tails were cut a centimeter from the end with a surgical knife, soaked in water and the time at which the bleeding stopped was measured (see Motohashi, et al .: Tokyo Ji-keikai Medicai Journal, 75 (5 ), 1008, 1959) in order to determine the pharmacological activity of the present 35 injection solutions according to the invention with intravenous injection. The results obtained are summarized in Table II below, from which it can be seen that the mean value of the hemostatic time in the blind group is 14.7 ± 0.082 minutes, whereas the group to which 40 mg 0.2 kg per kg of the solution for injection was administered possessed hemostatic time of 12.3 + 0.27 minutes. There is a significant difference in the level of P <0.01, and the effectiveness of the solution for injection in intravenous administration according to the present invention has been demonstrated with certainty.

Beispiel 2 Example 2

20 mg Dipalmitoyl-Lecithin, 10 mg beta-Sitosteryl-beta-D-glucosidmonopalmitat und 5 mg Cholesterin wurden in so 3 ml Chloroform aufgelöst. Man verdampfte die Mischung bei einer Temperatur von 30 °C im Vakuum auf einem Wasserbad unter Verwendung eines Dreh-Verdampfers. In den erhaltenen Rest wurde zehn Minuten lang Stickstoffgas geblasen und man trocknete noch weitere sechs Stunden lang 55 in einem Vakuum-Trockengefass. Dann gab man 5 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,2 hinzu (hergestellt, indem man 1,8 Gramm Trinatriumphosphat, 6,4 Na-triumdihydrogenphosphat und 5,1 Gramm Natriumchlorid in destilliertem Wasser für Injektionszwecke bis zu einem Li-60 ter auflöste). Man homogenisierte die Mischung drei Minuten lang unter Verwendung eines Ultraschallwellen-Homogenisators, wobei man eine leicht trübe Liposomlösung erhielt. Diese wurde auf einem HA-Filter mit sehr kleinen Poren filtriert und man erhielt ein Filtrat, in welchem 99,2% 65 beta-Sitosteryl-beta-D-glucosidmonopalmitat enthalten sind. Das Filtrat wird zusammen mit Stickstoffgas in Ampullen gefüllt und mit Dampf bei hoher Temperatur und einer Temperatur von 120 °C zwanzig Minuten lang in einem 20 mg of dipalmitoyl lecithin, 10 mg of beta-sitosteryl-beta-D-glucoside monopalmitate and 5 mg of cholesterol were dissolved in 3 ml of chloroform. The mixture was evaporated at a temperature of 30 ° C in vacuo on a water bath using a rotary evaporator. Nitrogen gas was blown into the resulting residue for ten minutes, and drying was continued in a vacuum drier for a further six hours. Then 5 ml of a pH 6.2 phosphate buffer (added by making 1.8 grams trisodium phosphate, 6.4 sodium dihydrogenphosphate and 5.1 grams sodium chloride in distilled water for injections up to a li 60th resolved). The mixture was homogenized for three minutes using an ultrasonic wave homogenizer to obtain a slightly cloudy liposome solution. This was filtered on a HA filter with very small pores and a filtrate was obtained in which 99.2% 65 beta-sitosteryl-beta-D-glucoside monopalmitate are contained. The filtrate is filled with ampoules together with nitrogen gas and with steam at high temperature and a temperature of 120 ° C for 20 minutes in one

5 5

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Autoklaven sterilisiert. Die pharmakologische Wirkung der erhaltenen Injektionslösung, wobei diese intravenös verabreicht wurde, ist in Tabelle II, Nr. 2, dargestellt. Sterilized autoclaves. The pharmacological effect of the injection solution obtained, which was administered intravenously, is shown in Table II, No. 2.

Beispiel 3 Example 3

In ein ovales Gefäss von 50 ml Inhalt gab man 4 mg Dioleylphosphatidylcholin und 4 mg Dipalmitoylphosphatidyl-cholin. Man löste die Mischung in 2 ml Chloroform auf und löste Cholesteryl-beta-D-glucoside und 1 mg Cholesterin darin auf. Das Chloroform wurde auf einem Wasserbad bei einer Temperatur von 30 °C unter Verwendung eines Dreh-Verdampfers abgedampft. Die Weiterverarbeitung fand auf solche Weise statt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und man erhielt 5 ml der Liposomlösung, die 3 mg Cholesteryl-beta-D-glucosid enthielt. Die pharmakologische Aktivität dieser Lösung ist in Tabelle II, Nr. 3, beschrieben. 4 mg of dioleylphosphatidylcholine and 4 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine were placed in an oval vessel of 50 ml content. The mixture was dissolved in 2 ml of chloroform and cholesteryl-beta-D-glucoside and 1 mg of cholesterol were dissolved therein. The chloroform was evaporated on a water bath at a temperature of 30 ° C using a rotary evaporator. The further processing took place as described in Example 1, and 5 ml of the liposome solution containing 3 mg of cholesteryl-beta-D-glucoside was obtained. The pharmacological activity of this solution is described in Table II, No. 3.

Beispiel 4 Example 4

In ein ovales Gefäss von 50 ml Inhalt gab man 15 mg Di-palmitoyllecithin, aufgelöst in 2 ml Chloroform. Dann wurden 5 mg Stigmasteryl-beta-D-glucosid, 5 mg Stigmasterin und 1 mg Stearylamin darin aufgelöst und man dampfte das Chloroform auf einem Wasserbad bei einer Temperatur von 30 °C unter Verwendung eines Verdampfers ab. Der erhaltene Rückstand wurde auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben, behandelt und man erhielt 5 ml einer Liposomlösung, die eine positive Ladung aufwies und 5 mg Stig-masteryl-beta-D-glucosid enthielt. Die pharmakologische Aktivität der erhaltenen Injektionslösung ist in Tabelle II, Nr. 4, beschrieben. 15 mg of di-palmitoyl lecithin, dissolved in 2 ml of chloroform, were placed in an oval vessel of 50 ml. Then 5 mg of stigmasteryl-beta-D-glucoside, 5 mg of stigmasterol and 1 mg of stearylamine were dissolved therein and the chloroform was evaporated on a water bath at a temperature of 30 ° C using an evaporator. The residue obtained was treated in the same manner as described in Example 2 and 5 ml of a liposome solution which had a positive charge and contained 5 mg of stig-masteryl-beta-D-glucoside were obtained. The pharmacological activity of the solution for injection obtained is described in Table II, No. 4.

Beispiel 5 Example 5

Anstelle von 1 mg Stearylamin, wie es in Beispiel 4 eingesetzt wurde, fügte man 1 mg Dicetylphosphorsäure hinzu und behandelte anschliessend auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4. Man erhielt 5 ml einer Liposomlösung mit einer negativen Ladung, die 5 mg Stigmasteryl-beta-D-glucosid enthielt. Die pharmakologische Aktivität dieser Injektionslösung ist in Tabelle II, Nr. 5, dargestellt. Instead of 1 mg of stearylamine, as used in Example 4, 1 mg of dicetylphosphoric acid was added and the treatment was then carried out in the same manner as in Example 4. 5 ml of a liposome solution with a negative charge containing 5 mg of stigmasteryl beta D-glucoside contained. The pharmacological activity of this solution for injection is shown in Table II, No. 5.

Beispiel 6 Example 6

Wollschweiss-Lecithin (200 mg) wird in ein ovales Gefäss von 100 ml Inhalt gegeben und in 5 ml Chloroform aufgelöst. Dann gab man 50 mg Sterylglucosid und 25 mg Chole-5 Sterin, das aus Sojabohnen extrahiert wurde, hinzu. Das Chloroform wurde aus der Lösung im Vakuum auf einem Wasserbad bei einer Temperatur von 30 °C unter Verwendung eines Dreh-Verdampfers abgedampft. Man blies Stickstoffgas zehn Minuten lang auf den Rest und trocknete sechs 10 Stunden lang in einem Vakuum-Trocknungsgefäss. Zu dem erhaltenen Produkt gab man 5 ml eines Phosphatpuffers, der in Beispiel 2 verwendet wurde, man homogenisierte fünf Minuten lang in einem Stickstoffstrom und wendete einen Ul-traschallwellen-Homogenisator an, wobei man eine leicht 15 trübe Liposomlösung erhielt. Diese wurde durch einen HA-Filter mit sehr kleinen Poren filtriert und das Filtrat enthielt 98,2% Sterylglucosid. Dann behandelte man auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, und man erhielt 5 ml der Liposomlösung, die 50 mg Sterylglucosid ent-20 hielt. Die pharmakologische Aktivität dieser Injektionslösung ist in Tabelle II, Nr. 6, dargestellt. Wool sweat lecithin (200 mg) is placed in an oval vessel of 100 ml content and dissolved in 5 ml of chloroform. Then 50 mg of steryl glucoside and 25 mg of Chole-5 sterol extracted from soybeans were added. The chloroform was evaporated from the solution in vacuo on a water bath at a temperature of 30 ° C using a rotary evaporator. Nitrogen gas was blown on the remainder for ten minutes and dried in a vacuum drying vessel for six 10 hours. To the obtained product was added 5 ml of a phosphate buffer used in Example 2, homogenized for 5 minutes in a nitrogen stream, and an ultrasonic wave homogenizer was used to obtain a slightly cloudy turbid liposome solution. This was filtered through an HA filter with very small pores and the filtrate contained 98.2% steryl glucoside. The treatment was then carried out in the same manner as that described in Example 1, and 5 ml of the liposome solution containing 50 mg of sterylglucoside were obtained. The pharmacological activity of this solution for injection is shown in Table II, No. 6.

25 Beispiel 7 25 Example 7

In ein ovales Gefäss von 100 ml Inhalt gab man 200 mg Wollschweiss-Lecithin und löste durch die Zugabe von 5 ml Chloroform auf. Dann wurden 50 mg Cholesterin und 50 mg 30 Sterylglucosidmonopalmitate hinzugefügt, die man aus Baumwollsamen extrahierte. Es fand eine Lösung statt und dann behandelte man, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist, und erhielt 5 ml der Liposomlösung, die 50 mg Sterylglucosidmonopalmitate enthielt, welche aus Baumwollsamen ex-35 trahiert waren. Die pharmakologische Aktivität dieser Injektionslösung ist in Tabelle II, Nr. 7, dargestellt. 200 mg of wool sweat lecithin were added to an oval vessel with a volume of 100 ml and dissolved by adding 5 ml of chloroform. Then 50 mg of cholesterol and 50 mg of 30 sterylglucoside monopalmitates were added, which were extracted from cottonseed. A solution took place and then treated as described in Example 6 to obtain 5 ml of the liposome solution containing 50 mg of sterylglucoside monopalmitates extracted from cottonseeds ex-35. The pharmacological activity of this solution for injection is shown in Table II, No. 7.

Aus der Tabelle II geht ganz klar hervor, dass die erfindungsgemässen Zusammensetzungen eine pharmakologische Aktivität aufweisen, wenn sie intravenös verabreicht werden. It is very clear from Table II that the compositions according to the invention have pharmacological activity when administered intravenously.

40 40

Tabelle 2 Table 2

Pharmakologische Aktivitäten von Liposom-Injektionslösungen Pharmacological activities of liposome injection solutions

Nr. No.

Zusammen Together

Verabrei benötigte Zeit zur Dispensing time needed to

Stillung der Blutung (Minuten) Bleeding stop (minutes)

setzung gemäss chungsweg settlement according to the route

0,4 mg/kg3' 0.4 mg / kg3 '

0,2 mg/kg*' 0.2 mg / kg * '

01 mg/kg3' 01 mg / kg3 '

Blindprobe Blank test

1 1

Beispiel 1 example 1

intravenös intravenously

11,1 + 1,55** 11.1 + 1.55 **

11,7 + 0,87** 11.7 + 0.87 **

14,0+1,13 14.0 + 1.13

14,7 + 0,82 14.7 + 0.82

2 2nd

Beispiel 2 Example 2

intravenös intravenously

9,5 + 0,91** 9.5 + 0.91 **

11,1 + 1,12** 11.1 + 1.12 **

13,8 + 1,02 13.8 + 1.02

14,7 + 0,82 14.7 + 0.82

3 3rd

Beispiel 3 Example 3

intravenös intravenously

11,3 + 1,20** 11.3 + 1.20 **

11,4 + 0,78** 11.4 + 0.78 **

12,0 + 0,96 12.0 + 0.96

14,7 + 0,82 14.7 + 0.82

4 4th

Beispiel 4 Example 4

intravenös intravenously

10,8 + 0,91** 10.8 + 0.91 **

11,6 + 0,80** 11.6 + 0.80 **

13,3 + 1,12 13.3 + 1.12

14,7 + 0,82 14.7 + 0.82

5 5

Beispiel 5 Example 5

intravenös intravenously

11,2 + 0,81** 11.2 + 0.81 **

12,2+0,75* 12.2 + 0.75 *

12,8+1,00 12.8 + 1.00

14,7+0,82 14.7 + 0.82

6 6

Beispiel 6 Example 6

intravenös intravenously

9,7+0,88** 9.7 + 0.88 **

10,9 + 1,15** 10.9 + 1.15 **

12,1 + 0,80 12.1 + 0.80

14,2 + 0,95 14.2 + 0.95

7 7

Beispiel 7 Example 7

intravenös intravenously

11,6+0,73** 11.6 + 0.73 **

11,2+0,82** 11.2 + 0.82 **

12,5 + 0,96 12.5 + 0.96

14,2 + 0,95 14.2 + 0.95

a) verabreichte Dose *p < 0,05 **p<0,01 a) administered dose * p <0.05 ** p <0.01

60 60

65 65

Claims

658 001

PATENT CLAIMS

1. Liposome, characterized in that it contains one or more steryl glucosides and / or steryl glucoside monopalmitates as active ingredient.

2. Liposome according to claim 1, characterized in that it is in the form of a simple lamella.

3. Liposome according to claim 1, characterized in that it is in the form of a multilayer lamella.

4. Liposome according to one of claims 1 to 3, characterized in that the active ingredient is contained in the lipid.

5. Liposome according to one of claims 1 to 4, characterized in that the lipid is natural or synthetic phosphatidylcholine.

6. Liposome according to claim 5, characterized in that the natural phosphatidylcholine is Wollschweiss-Leci- • thin.

7. Liposome according to claim 5, characterized in that the synthetic phosphatidylcholine is at least one of the group dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearylphosphatidylcholine and di-oleylphosphatidylcholine.

8. Liposome according to one of claims 1 to 7, characterized in that a sterol is contained as a stabilizer for the liposome.

9. Liposome according to claim 8, characterized in that the sterol is at least one of the group cholesterol, be-ta-sitosterol, stigmasterol and campes | erin.

10. Liposome according to one of claims 1 to 9, characterized in that the liposome contains a substance which imparts a positive charge.

11. Liposome according to claim 10, characterized in that the substance which imparts the positive charge is stearylamine.

12. Liposome according to one of claims 1 to 9, characterized in that the liposome contains a substance which imparts a negative charge.

13. Liposome according to claim 12, characterized in that the substance which confers the negative charge is phosphatidic acid or dicetylphosphoric acid.

14. Liposome according to one of claims 1 to 13, characterized in that the steryl glucoside beta-sitostere-ryl-beta-D-glucoside, stigmasteryl-beta-D-glucoside, campe-steryl-beta-D-glucoside or cholesteryl-beta -D-glucoside and the sterylglucoside monopalmitate is a monopalmitate of the sterylglucosides mentioned above.

15. A method for producing a liposome according to any one of claims 1 to 14, characterized in that one or more sterylglucosides and / or sterylglucosidmonopalmitate in a solution of a lipid in chloro-

Form dissolves, then evaporates the chloroform to bind the lipid membrane to the wall of the container and finally, after adding a medium, stirring or subjected to an ultrasonic wave radiation.

16. The method according to claim 15, characterized in that in the chloroform solution of the lipid a sterol and /

or a charging agent is included.

17. Pharmaceutical composition, characterized in that it contains the liposome according to one of claims 1 to 14 as active ingredient.