CH655801A5

CH655801A5 - Procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici e mezzi adatti allo scopo.

Info

Publication number: CH655801A5
Application number: CH7224/81A
Authority: CH
Inventors: Paolo Tarli; Paolo Neri
Original assignee: Sclavo Spa
Priority date: 1981-05-07
Filing date: 1981-11-10
Publication date: 1986-05-15
Also published as: AU551120B2; FR2505502B1; SE8106638L; ES8302310A1; FR2505502A1; GB2098322A; FI813512L; AR229167A1; BR8107026A; ES507495A0; BE891075A; DE3144042A1; GR76695B; NZ198700A; AU7704581A; PT73958B; NO813772L; IT8121549A0; CA1179258A; DK470581A

Description

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici allo scopo di determinare la presenza e/o la quantità di anticorpi antistreptolisinici nel sangue; essa si riferisce inoltre ai mezzi adatti allo scopo.

Come noto, la O-streptolisina è una tossina di natura proteica, secreta da certi streptococchi del gruppo A. Questa tossina è letale per gli animali da laboratorio, distrugge le colture cellulari, lisa i globuli rossi ed i globuli bianchi di molte specie animali.

È anche noto che alcuni ossidanti riescono ad inibire il potere litico di questa tossina e, se l'ossidazione è stata blanda, la reazione è reversibile, il che significa che, sotto l'azione di un opportuno riducente, la tossina riacquista il suo potere emolitico.

La determinazione degli anticorpi antistreptolisinici è stata da tempo indicata come una strada valida per conoscere lo stato e la gravità di una situazione patologica legata alla presenza di microorganismi produttori di streptolisina-O.

Il primo metodo utilizzato allo scopo fu quello realizzato da Todd [J. Exp. Med. 55: 267-280 (1932)], il quale verificò e dimostrò la presenza di anticorpi antistreptolisinici nei sieri di pazienti colpiti da infezioni da streptococchi: il test diagnostico relativo veniva effettuato neutralizzando O-streptolisina per mezzo di quantitativi diversi del siero in esame, preventivamente inattivato, l'eccesso di O-streptolisina non neutralizzata essendo rivelato dalla emolisi di eritrociti aggiunti al sistema.

Rantz e Randall [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 59: 22-25 (1945)] suggerivano, a loro volta, di utilizzare, per la determinazione del titolo antistreptolisinico del siero, soluzioni concentrate di O-streptolisina totalmente ridotta prima della effettuazione del test diagnostico.

La stessa Richiedente è titolare di brevetto Svizzero N° 624 772 depositato il 17 dicembre 1976 che si riferisce ad un particolare metodo per la determinazione del titolo antistreptolisinico, metodo che prevede, fra l'altro, di eseguire una serie di operazioni, la prima delle quali comporta talvolta la preparazione di una pluralità di soluzioni a concentrazioni precostituite di O-streptolisina ossidata, alle quali vengono aggiunti campioni di sangue intero diluito in un opportuno mezzo; nel prose-guio il metodo prevede l'impiego di riducenti che vengono aggiunti alle miscele ottenute nel modo ora indicato, al fine di ripristinare le capacità emolitiche della O-streptolisina.

Nessuno dei metodi finora indicati, o anche fra altri altrettanto conosciuti, ha tuttavia indicato di realizzare contemporaneamente, o in tempi successivi secondo i desideri o le necessità dell'utilizzatore, una valutazione qualitativa della presenza o meno degli anticorpi antistreptolisinici e/o una precisa determinazione del titolo antistreptolisinico.

Il metodo descritto nel Brevetto della Richiedente prima ricordata, pur legato agli indubbi vantaggi derivanti dall'impiego di O-streptolisina ossidata direttamente nella fase di analisi e di sangue intero, offre tuttavia il fianco ad inevitabili critiche quando, dalla determinazione accurata del titolo antistreptolisinico, si desideri passare direttamente ad una valutazione puramente qualitativa della sola presenza di anticorpi o del valore della soglia anticorpale di un certo campione. Il ricorso infatti ad una molteplicità di soluzioni a differenti concentrazioni note di O-streptolisina ossidata, indubbiamente pieno di vantaggiosi effetti quando tradotto nella determinazione del titolo, perde parte della sua utilità operativa quando traslato ad una singola determinazione della soglia anticorpale.

La Richiedente ha ora trovato, ciò che costituisce oggetto della presente invenzione, una soluzione che permette di sfruttare i vantaggi dell'impiego di O-streptolisina ossidata sia nel caso della determinazione dell'esatto titolo anticorpale sia nel caso si desideri determinare solo la soglia di detto titolo.

Un oggetto della presente invenzione viene fornito dal procedimento per la analisi degli anticorpi antistreptolisinici che prevede, nella sua formulazione base, la messa in presenza di O-streptolisina ossidata con il campione cui si è interessati, il successivo trattamento con un agente riducente per ripristinare le capacità emolitiche della O-streptolisina e il confronto con un bianco di controllo.

Più particolarmente l'oggetto della presente invenzione è costituito da un procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici, comprendente una preliminare determinazione della soglia del valore anticorpale e, se il valore preliminare non dovesse risultare aldi sotto del limite di soglia, la successiva accurata misura del titolo degli anticorpi antistreptolisinici.

Uno dei vantaggi del procedimento viene dato dalla possibilità di impiegare indifferentemente sangue intero o siero come tale e non inattivato.

Scendendo nel dettaglio delle varie operazioni, il procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici secondo la presente invenzione comprende la preparazione di almeno una soluzione di O-streptolisina ossidata a concentrazioni note, la preparazione di almeno una soluzione di un adatto agente riducente, la diluizione del campione in esame con una soluzione

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non emolitica, l'unione della O-streptolisina ossidata con una quantità precostituita del campione, la stasi della miscela così ottenuta ad una temperatura compresa fra 15 e 75 °C, l'aggiunta del riducente, l'attesa della sedimentazione dei globuli rossi, il controllo dell'avvenuta emolisi o meno, la verifica dello stato del bianco di controllo.

La successione delle varie operazioni testé indicate trova naturalmente la sua traduzione ideale nella determinazione del titolo antistreptolosinico, che sarà determinato dalla ultima prova nel corso della quale non si sia verificata emolisi eritrocita-ria. Un tale risultato può essere raggiunto partendo da soluzioni di O-streptolisina ossidata a concentrazione costante e aggiungendo a questa quantità diverse del campione sotto esame, ovvero utilizzando una serie di soluzioni di O-streptolisina ossidata a concentrazioni note, via via crescenti, e aggiungendo a tutte il campione in esame nella stessa quantità.

A sua volta, una singola prova effettuata aggiungendo una soluzione del campione sotto esame ad una soluzione a concentrazione nota di O-streptolisina ossidata ed introducendo successivamente il riducente permette, dopo confronto con il bianco di controllo, di verificare la presenza o meno, nel campione, di anticorpi antistreptolisinici e, data la conoscenza della concentrazione della O-streptolisina, il dato quantitativo corrispondente a questa concentrazione: se la concentrazione è scelta in maniera opportuna, questa singola prova fornisce chiaramente il dettaglio della soglia anticorpale.

Queste realizzazioni alternative sono rese possibili dalla natura stessa della composizione base che, prevedendo la presenza di più costituenti, comprende questi separati l'uno dagli altri, tutti inseriti in uno stesso Kit diagnostico ovvero ognuno contenuto in una singola confezione.

Riducenti adatti allo scopo sono mercaptoetanolo, ditiotrei-tolo, cisteina, N-acetil-cisteina, metabisolfito di sodio, solfito di sodio, tanto per citare alcuni nomi.

Come detto, è possibile l'impiego, accanto al sangue intero, di siero, nel qual caso si dovrà prevedere una fase di aggiunta di eritrociti, dopo la addizione dell'agente riducente, per la verifica dell'avvenuta emolisi, o meno.

Tutto questo, ed altre caratteristiche appariranno evidenti dall'esame del seguente esempio operativo con il quale si vuole illustrare l'invenzione che, tuttavia, non deve essere considerata come limitata agli stessi.

Esempio

Allo scopo di eseguire l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici su una serie di 80 campioni di sangue (oppure di siero, nel qual caso occorrerà effettuare, al momento opportuno, una ag-5 giunta di globuli rossi ai singoli campióni), vengono preparati 80 contenitori in ciascuno dei quali viene posta O-streptolisina ossidata in quantità tale da corrispondere al valore della soglia anticorpale («contenitori per il test a soglia»).

Il valore della soglia anticorpale è stato fissato in 200 Ul/ml io (al di sotto di tale valore il risultato del saggio è considerato negativo; la presenza di anticorpi anti-streptolisina O in quantità superiori a tale valore è invece considerata tale da fare considerare positivo il risultato del saggio).

Gli 80 campioni di sangue vengono diluiti con un opportuno 15 diluente ed analizzati (secondo la tecnica precedentemente descritta) utilizzando i contenitori per il test a soglia. Al termine della analisi (dopo avere effettuato il confronto con i rispettivi bianchi di controllo), i campioni vengono suddivisi in due gruppi:

20 — campioni che hanno provocato emolisi nel proprio contenitore: la quantità di anticorpi anti-streptolisina O presente è inferiore a quella considerata come soglia anticorpale e quindi su questi campioni il procedimento analitico può considerarsi concluso; il risultato finale viene espresso come «titolo anti-25 streptolisinico inferiore a 200 Ul/ml»;

— campioni che non hanno provocato emolisi nel proprio contenitore: la quantità di anticorpi anti-streptolisina O presente è uguale o superiore a quella considerata come soglia anticorpale; su questi campioni il procedimento analitico non può con-30 siderarsi concluso in quanto viene ritenuto necessario conoscere l'esatto titolo antistreptolisinico.

Proseguendo nell'esempio della analisi di 80 campioni, i campioni di questo secondo gruppo sono, per esempio, nel numero di 10. Si preparano quindi 10 serie di contenitori conte-35 nenti quantità scalari e predeterminate di O-streptolisina ossidata (il numero dei contenitori di ogni serie e le quantità di O-streptolisina ossidata vengono scelte in funzione del campo di titoli antistreptolisinici che si vuole saggiare).

I campioni in oggetto vengono quindi analizzati (secondo la 40 tecnica precedentemente descritta), ciascuno con una serie di contenitori. Il risultato finale viene determinato dalla quantità di O-streptolisina presente nel contenitore non mostrante emolisi eritrocitaria e immediatamente precedente al primo dei contenitori mostranti emolisi eritrocitaria.

Claims

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1. Procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisi-nici comprendente una preliminare determinazione.della soglia del valore anticorpale e, se il valore preliminare non dovesse risultare al di sotto del limite di soglia, la successiva accurata misura del titolo degli anticorpi antistreptolisinici, nel quale la prima operazione viene effettuata mettendo in contatto O-strepto-lisina ossidata in quantità nota con il campione cui si è interessati, trattando successivamente quanto ottenuto con un agente riducente, attendendo la sedimentazione dei globuli rossi, controllando l'eventuale emolisi eritrocitaria, e verificando lo stato del bianco di controllo.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 comprendente la preparazione di almeno una soluzione di O-streptolisina ossidata a concentrazioni note, la preparazione di almeno una soluzione di un adatto agente riducente, la diluizione del campione in esame con una soluzione non emolitica, l'unione della O-streptolisina ossidata con una quantità precostituita del campione in esame, la stasi della miscela così ottenuta ad una temperatura compresa fra 15 e 75°C, l'aggiunta di un agente riducente, l'attesa della sedimentazione dei globuli rossi, il controllo dell'emolisi e la verifica dello stato del bianco di controllo.

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RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 1 a 2 nel quale il campione in esame è costituito da sangue intero o siero come tale.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 3 nel quale il campione in esame è costituito da siero tal quale e il ripristino delle capacità emolitiche della O-streptolisina è preceduto da un'opportuna addizione di globuli rossi.

5. Kit diagnostico per l'esecuzione del procedimento secondo la rivendicazione 1, comprendente, in contenitori separati, O-streptolisina ossidata in quantità nota, un riducente per il ripristino delle capacità emolitiche della O-streptolisina e un diluente per il campione da esaminare.

6. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 5 nel quale la O-streptolisina ossidata in quantità nota è presente in una serie di contenitori separati ognuno contenente una frazione a concentrazione precostituita.

7. Kit diagnostico secondo le rivendicazioni 5 e 6 nel quale la O-streptolisina ossidata è presente allo stato solido, in soluzione a concentrazione nota o, ancora, allo stato liofilo.

8. Kit diagnostico secondo le rivendicazioni 5 e 6 nel quale l'agente riducente è scelto tra mercaptoetanolo, ditiotreitolo, cisteina, N-acetil-cisteina, metabisolfito di sodio e solfito di sodio.