CH655801A5

CH655801A5 - PROCEDURE FOR THE ANALYSIS OF ANTI-STREPTOLYSINIC ANTIBODIES AND MEANS SUITABLE FOR THE PURPOSE.

Info

Publication number: CH655801A5
Application number: CH7224/81A
Authority: CH
Inventors: Paolo Tarli; Paolo Neri
Original assignee: Sclavo Spa
Priority date: 1981-05-07
Filing date: 1981-11-10
Publication date: 1986-05-15
Also published as: GB2098322A; CA1179258A; IT1218273B; NO813772L; SE8106638L; ES8302310A1; PT73958B; FR2505502A1; BE891075A; AU7704581A; IT8121549A0; FI813512L; DK470581A; PT73958A; AU551120B2; BR8107026A; GB2098322B; ES507495A0; AR229167A1; GR76695B

Description

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici allo scopo di determinare la presenza e/o la quantità di anticorpi antistreptolisinici nel sangue; essa si riferisce inoltre ai mezzi adatti allo scopo. The present invention relates to a process for the analysis of antistreptolysinic antibodies for the purpose of determining the presence and / or the quantity of antistreptolysinic antibodies in the blood; it also refers to means suitable for the purpose.

Come noto, la O-streptolisina è una tossina di natura proteica, secreta da certi streptococchi del gruppo A. Questa tossina è letale per gli animali da laboratorio, distrugge le colture cellulari, lisa i globuli rossi ed i globuli bianchi di molte specie animali. As known, O-streptolysin is a protein toxin, secreted by certain group A streptococci. This toxin is lethal to laboratory animals, destroys cell cultures, lyses red and white blood cells of many animal species.

È anche noto che alcuni ossidanti riescono ad inibire il potere litico di questa tossina e, se l'ossidazione è stata blanda, la reazione è reversibile, il che significa che, sotto l'azione di un opportuno riducente, la tossina riacquista il suo potere emolitico. It is also known that some oxidants are able to inhibit the lytic power of this toxin and, if the oxidation has been mild, the reaction is reversible, which means that, under the action of a suitable reducing agent, the toxin regains its power haemolytic.

La determinazione degli anticorpi antistreptolisinici è stata da tempo indicata come una strada valida per conoscere lo stato e la gravità di una situazione patologica legata alla presenza di microorganismi produttori di streptolisina-O. The determination of antistreptolysin antibodies has long been indicated as a valid way to know the state and severity of a pathological situation linked to the presence of microorganisms producing streptolysin-O.

Il primo metodo utilizzato allo scopo fu quello realizzato da Todd [J. Exp. Med. 55: 267-280 (1932)], il quale verificò e dimostrò la presenza di anticorpi antistreptolisinici nei sieri di pazienti colpiti da infezioni da streptococchi: il test diagnostico relativo veniva effettuato neutralizzando O-streptolisina per mezzo di quantitativi diversi del siero in esame, preventivamente inattivato, l'eccesso di O-streptolisina non neutralizzata essendo rivelato dalla emolisi di eritrociti aggiunti al sistema. The first method used for the purpose was that made by Todd [J. Exp. Med. 55: 267-280 (1932)], who verified and demonstrated the presence of anti-streptolysin antibodies in the sera of patients affected by streptococcal infections: the relative diagnostic test was carried out by neutralizing O-streptolysin by means of different quantities of the serum under examination, previously inactivated, the excess of non-neutralized O-streptolysin being revealed by the hemolysis of erythrocytes added to the system.

Rantz e Randall [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 59: 22-25 (1945)] suggerivano, a loro volta, di utilizzare, per la determinazione del titolo antistreptolisinico del siero, soluzioni concentrate di O-streptolisina totalmente ridotta prima della effettuazione del test diagnostico. Rantz and Randall [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 59: 22-25 (1945)] suggested, in turn, to use totally reduced concentrated solutions of O-streptolysin for the determination of the antistreptolysin titre of the serum before carrying out the diagnostic test.

La stessa Richiedente è titolare di brevetto Svizzero N° 624 772 depositato il 17 dicembre 1976 che si riferisce ad un particolare metodo per la determinazione del titolo antistreptolisinico, metodo che prevede, fra l'altro, di eseguire una serie di operazioni, la prima delle quali comporta talvolta la preparazione di una pluralità di soluzioni a concentrazioni precostituite di O-streptolisina ossidata, alle quali vengono aggiunti campioni di sangue intero diluito in un opportuno mezzo; nel prose-guio il metodo prevede l'impiego di riducenti che vengono aggiunti alle miscele ottenute nel modo ora indicato, al fine di ripristinare le capacità emolitiche della O-streptolisina. The same Applicant is the holder of a Swiss patent No. 624 772 filed on December 17, 1976 which refers to a particular method for the determination of the antistreptolysinic title, a method which provides, among other things, for carrying out a series of operations, the first of which which sometimes involves the preparation of a plurality of solutions at preconstituted concentrations of oxidized O-streptolysin, to which samples of whole blood diluted in a suitable medium are added; in the preamble the method provides for the use of reducing agents which are added to the mixtures obtained in the manner indicated above, in order to restore the hemolytic capacity of O-streptolysin.

Nessuno dei metodi finora indicati, o anche fra altri altrettanto conosciuti, ha tuttavia indicato di realizzare contemporaneamente, o in tempi successivi secondo i desideri o le necessità dell'utilizzatore, una valutazione qualitativa della presenza o meno degli anticorpi antistreptolisinici e/o una precisa determinazione del titolo antistreptolisinico. None of the methods indicated so far, or even among others equally known, has however indicated that a qualitative assessment of the presence or absence of antistreptolysin antibodies and / or a precise determination is carried out at the same time, or at a later time according to the user's wishes or needs. of the antistreptolysinic title.

Il metodo descritto nel Brevetto della Richiedente prima ricordata, pur legato agli indubbi vantaggi derivanti dall'impiego di O-streptolisina ossidata direttamente nella fase di analisi e di sangue intero, offre tuttavia il fianco ad inevitabili critiche quando, dalla determinazione accurata del titolo antistreptolisinico, si desideri passare direttamente ad una valutazione puramente qualitativa della sola presenza di anticorpi o del valore della soglia anticorpale di un certo campione. Il ricorso infatti ad una molteplicità di soluzioni a differenti concentrazioni note di O-streptolisina ossidata, indubbiamente pieno di vantaggiosi effetti quando tradotto nella determinazione del titolo, perde parte della sua utilità operativa quando traslato ad una singola determinazione della soglia anticorpale. The method described in the Patent of the Applicant mentioned above, although linked to the undoubted advantages deriving from the use of oxidized O-streptolysin directly in the analysis phase and of whole blood, nevertheless offers the inevitable criticism when, from the accurate determination of the antistreptolysinic title, you want to go directly to a purely qualitative evaluation of the presence of antibodies only or of the value of the antibody threshold of a certain sample. The use of a multiplicity of solutions at different known concentrations of oxidized O-streptolysin, undoubtedly full of advantageous effects when translated into the determination of the titer, loses part of its operational usefulness when transferred to a single determination of the antibody threshold.

La Richiedente ha ora trovato, ciò che costituisce oggetto della presente invenzione, una soluzione che permette di sfruttare i vantaggi dell'impiego di O-streptolisina ossidata sia nel caso della determinazione dell'esatto titolo anticorpale sia nel caso si desideri determinare solo la soglia di detto titolo. The Applicant has now found, what constitutes the subject of the present invention, a solution which allows to exploit the advantages of the use of oxidized O-streptolysin both in the case of determining the exact antibody titer and in case only the threshold of called title.

Un oggetto della presente invenzione viene fornito dal procedimento per la analisi degli anticorpi antistreptolisinici che prevede, nella sua formulazione base, la messa in presenza di O-streptolisina ossidata con il campione cui si è interessati, il successivo trattamento con un agente riducente per ripristinare le capacità emolitiche della O-streptolisina e il confronto con un bianco di controllo. An object of the present invention is provided by the process for the analysis of antistreptolysin antibodies which provides, in its basic formulation, the presence in the presence of oxidized O-streptolysin with the sample in question, the subsequent treatment with a reducing agent to restore the hemolytic capacity of O-streptolysin and comparison with a control blank.

Più particolarmente l'oggetto della presente invenzione è costituito da un procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici, comprendente una preliminare determinazione della soglia del valore anticorpale e, se il valore preliminare non dovesse risultare aldi sotto del limite di soglia, la successiva accurata misura del titolo degli anticorpi antistreptolisinici. More particularly, the object of the present invention is constituted by a process for the analysis of antistreptolysin antibodies, comprising a preliminary determination of the threshold of the antibody value and, if the preliminary value should not be below the threshold limit, the subsequent accurate measurement the titer of antistreptolysin antibodies.

Uno dei vantaggi del procedimento viene dato dalla possibilità di impiegare indifferentemente sangue intero o siero come tale e non inattivato. One of the advantages of the process is given by the possibility of using whole blood or serum as such and not inactivated indifferently.

Scendendo nel dettaglio delle varie operazioni, il procedimento per l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici secondo la presente invenzione comprende la preparazione di almeno una soluzione di O-streptolisina ossidata a concentrazioni note, la preparazione di almeno una soluzione di un adatto agente riducente, la diluizione del campione in esame con una soluzione Going into detail of the various operations, the process for the analysis of antistreptolysin antibodies according to the present invention comprises the preparation of at least one oxidized O-streptolysin solution at known concentrations, the preparation of at least one solution of a suitable reducing agent, the dilution of the sample under examination with a solution

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non emolitica, l'unione della O-streptolisina ossidata con una quantità precostituita del campione, la stasi della miscela così ottenuta ad una temperatura compresa fra 15 e 75 °C, l'aggiunta del riducente, l'attesa della sedimentazione dei globuli rossi, il controllo dell'avvenuta emolisi o meno, la verifica dello stato del bianco di controllo. non-haemolytic, the union of oxidized O-streptolysin with a pre-constituted quantity of the sample, the stasis of the mixture thus obtained at a temperature between 15 and 75 ° C, the addition of the reducing agent, the wait for the sedimentation of the red blood cells, checking whether haemolysis has occurred or not, checking the status of the blank check.

La successione delle varie operazioni testé indicate trova naturalmente la sua traduzione ideale nella determinazione del titolo antistreptolosinico, che sarà determinato dalla ultima prova nel corso della quale non si sia verificata emolisi eritrocita-ria. Un tale risultato può essere raggiunto partendo da soluzioni di O-streptolisina ossidata a concentrazione costante e aggiungendo a questa quantità diverse del campione sotto esame, ovvero utilizzando una serie di soluzioni di O-streptolisina ossidata a concentrazioni note, via via crescenti, e aggiungendo a tutte il campione in esame nella stessa quantità. The sequence of the various operations just indicated naturally finds its ideal translation in the determination of the antistreptolosinic titer, which will be determined by the last test in which no erythrocytic hemolysis occurred. Such a result can be achieved starting from solutions of oxidized O-streptolysin at constant concentration and adding to this quantity different of the sample under examination, that is by using a series of solutions of oxidized O-streptolysin at known concentrations, gradually increasing, and adding to all the test sample in the same quantity.

A sua volta, una singola prova effettuata aggiungendo una soluzione del campione sotto esame ad una soluzione a concentrazione nota di O-streptolisina ossidata ed introducendo successivamente il riducente permette, dopo confronto con il bianco di controllo, di verificare la presenza o meno, nel campione, di anticorpi antistreptolisinici e, data la conoscenza della concentrazione della O-streptolisina, il dato quantitativo corrispondente a questa concentrazione: se la concentrazione è scelta in maniera opportuna, questa singola prova fornisce chiaramente il dettaglio della soglia anticorpale. In turn, a single test carried out by adding a solution of the sample under examination to a solution with a known concentration of oxidized O-streptolysin and subsequently introducing the reducing agent allows, after comparison with the control blank, to verify the presence or absence, in the sample. , antistreptolysin antibodies and, given the knowledge of the concentration of O-streptolysin, the quantitative data corresponding to this concentration: if the concentration is chosen appropriately, this single test clearly provides the detail of the antibody threshold.

Queste realizzazioni alternative sono rese possibili dalla natura stessa della composizione base che, prevedendo la presenza di più costituenti, comprende questi separati l'uno dagli altri, tutti inseriti in uno stesso Kit diagnostico ovvero ognuno contenuto in una singola confezione. These alternative embodiments are made possible by the very nature of the basic composition which, by providing for the presence of several constituents, comprises these separated from each other, all inserted in the same diagnostic kit or each contained in a single package.

Riducenti adatti allo scopo sono mercaptoetanolo, ditiotrei-tolo, cisteina, N-acetil-cisteina, metabisolfito di sodio, solfito di sodio, tanto per citare alcuni nomi. Suitable reductants for the purpose are mercaptoethanol, dithiothrei-tol, cysteine, N-acetyl-cysteine, sodium metabisulfite, sodium sulphite, to name a few.

Come detto, è possibile l'impiego, accanto al sangue intero, di siero, nel qual caso si dovrà prevedere una fase di aggiunta di eritrociti, dopo la addizione dell'agente riducente, per la verifica dell'avvenuta emolisi, o meno. As mentioned, the use of serum alongside whole blood is possible, in which case a phase of addition of erythrocytes must be provided, after the addition of the reducing agent, for the verification of the occurrence of hemolysis, or not.

Tutto questo, ed altre caratteristiche appariranno evidenti dall'esame del seguente esempio operativo con il quale si vuole illustrare l'invenzione che, tuttavia, non deve essere considerata come limitata agli stessi. All this and other features will become evident from the examination of the following operating example with which it is intended to illustrate the invention which, however, must not be considered as limited to them.

Esempio Example

Allo scopo di eseguire l'analisi degli anticorpi antistreptolisinici su una serie di 80 campioni di sangue (oppure di siero, nel qual caso occorrerà effettuare, al momento opportuno, una ag-5 giunta di globuli rossi ai singoli campióni), vengono preparati 80 contenitori in ciascuno dei quali viene posta O-streptolisina ossidata in quantità tale da corrispondere al valore della soglia anticorpale («contenitori per il test a soglia»). In order to carry out the analysis of antistreptolysin antibodies on a series of 80 blood samples (or serum, in which case it will be necessary to carry out, at the appropriate time, an addition of red blood cells to the individual fields), 80 containers are prepared in each of which oxidized O-streptolysin is placed in quantities such as to correspond to the antibody threshold value («threshold test containers»).

Il valore della soglia anticorpale è stato fissato in 200 Ul/ml io (al di sotto di tale valore il risultato del saggio è considerato negativo; la presenza di anticorpi anti-streptolisina O in quantità superiori a tale valore è invece considerata tale da fare considerare positivo il risultato del saggio). The antibody threshold value was set at 200 Ul / ml io (below this value the test result is considered negative; the presence of anti-streptolysin O antibodies in quantities greater than this value is instead considered such as to be considered positive the test result).

Gli 80 campioni di sangue vengono diluiti con un opportuno 15 diluente ed analizzati (secondo la tecnica precedentemente descritta) utilizzando i contenitori per il test a soglia. Al termine della analisi (dopo avere effettuato il confronto con i rispettivi bianchi di controllo), i campioni vengono suddivisi in due gruppi: The 80 blood samples are diluted with a suitable 15 diluent and analyzed (according to the previously described technique) using the threshold test containers. At the end of the analysis (after comparing with the respective control blanks), the samples are divided into two groups:

20 — campioni che hanno provocato emolisi nel proprio contenitore: la quantità di anticorpi anti-streptolisina O presente è inferiore a quella considerata come soglia anticorpale e quindi su questi campioni il procedimento analitico può considerarsi concluso; il risultato finale viene espresso come «titolo anti-25 streptolisinico inferiore a 200 Ul/ml»; 20 - samples that provoked hemolysis in its container: the amount of anti-streptolysin O antibodies present is less than that considered as the antibody threshold and therefore on these samples the analytical procedure can be considered completed; the final result is expressed as "anti-25 streptolysinic content lower than 200 Ul / ml";

— campioni che non hanno provocato emolisi nel proprio contenitore: la quantità di anticorpi anti-streptolisina O presente è uguale o superiore a quella considerata come soglia anticorpale; su questi campioni il procedimento analitico non può con-30 siderarsi concluso in quanto viene ritenuto necessario conoscere l'esatto titolo antistreptolisinico. - samples that have not provoked hemolysis in their container: the quantity of anti-streptolysin O antibodies present is equal to or greater than that considered as the antibody threshold; on these samples the analytical procedure cannot be considered concluded since it is deemed necessary to know the exact antistreptolysinic title.

Proseguendo nell'esempio della analisi di 80 campioni, i campioni di questo secondo gruppo sono, per esempio, nel numero di 10. Si preparano quindi 10 serie di contenitori conte-35 nenti quantità scalari e predeterminate di O-streptolisina ossidata (il numero dei contenitori di ogni serie e le quantità di O-streptolisina ossidata vengono scelte in funzione del campo di titoli antistreptolisinici che si vuole saggiare). Continuing in the example of the analysis of 80 samples, the samples of this second group are, for example, in the number of 10. Then 10 sets of containers are prepared containing 35 scalar and predetermined quantities of oxidized O-streptolysin (the number of containers of each series and the quantities of oxidized O-streptolysin are chosen according to the field of antistreptolysinic titers to be tested).

I campioni in oggetto vengono quindi analizzati (secondo la 40 tecnica precedentemente descritta), ciascuno con una serie di contenitori. Il risultato finale viene determinato dalla quantità di O-streptolisina presente nel contenitore non mostrante emolisi eritrocitaria e immediatamente precedente al primo dei contenitori mostranti emolisi eritrocitaria. The samples in question are then analyzed (according to the technique previously described), each with a series of containers. The final result is determined by the amount of O-streptolysin present in the container not showing erythrocyte hemolysis and immediately preceding the first of the containers showing erythrocyte hemolysis.

Claims

655 801

1. Procedure for the analysis of antistreptolysis-antibodies comprising a preliminary determination of the antibody value threshold and, if the preliminary value should not be below the threshold limit, the subsequent accurate measurement of the titre of the antistreptolysin antibodies, in the which the first operation is carried out by bringing oxidized O-strepto-lysine in known quantity into contact with the sample in question, subsequently treating what has been obtained with a reducing agent, waiting for the sedimentation of the red blood cells, checking for any red blood cell hemolysis, and checking the status of the control blank.

2. Process according to claim 1 comprising the preparation of at least one oxidized O-streptolysin solution at known concentrations, the preparation of at least one solution of a suitable reducing agent, the dilution of the test sample with a non-hemolytic solution, the union of oxidized O-streptolysin with a pre-constituted quantity of the sample under examination, the stasis of the mixture thus obtained at a temperature between 15 and 75 ° C, the addition of a reducing agent, the wait for the sedimentation of the red blood cells, the control of hemolysis and verification of the state of the control blank.

2

Method according to one of claims 1 to 2, in which the test sample consists of whole blood or serum as such.

4. Process according to claim 3 in which the sample under examination is made up of serum as it is and the restoration of the hemolytic capacity of O-streptolysin is preceded by an appropriate addition of red blood cells.

5. Diagnostic kit for carrying out the process according to claim 1, comprising, in separate containers, oxidized O-streptolysin in a known quantity, a reducing agent to restore the hemolytic capacity of O-streptolysin and a diluent for the sample to be tested.

6. Diagnostic kit according to claim 5 in which oxidized O-streptolysin in known quantity is present in a series of separate containers each containing a fraction of preconstituted concentration.

7. Diagnostic kit according to claims 5 and 6 in which oxidized O-streptolysin is present in the solid state, in a solution of known concentration or, again, in the freeze-dried state.

Diagnostic kit according to claims 5 and 6 in which the reducing agent is selected from mercaptoethanol, dithiothreitol, cysteine, N-acetyl-cysteine, sodium metabisulfite and sodium sulphite.