CH642682A5 - Peptide substance obtained from a trematode and its use as a medicinal product - Google Patents

Description

La présente invention a pour objet un nouveau peptide obtenu à partir d'incubats de schistosome.

Elle a spécifiquement pour objet un peptide provenant de Schistosoma monsoni, de poids moléculaire compris entre 500 et 1000, soluble dans l'eau, thermostable, non précipitable par les réactifs des protéines, dialysant à travers une membrane de dextrane réticulé du type Amicon X-100.

Selon l'invention, ce peptide est obtenu par un procédé caractérisé en ce qu'on fait incuber des Schistosoma monsoni adultes dans l'eau, sépare les corps des nématodes et les débris particulaires du milieu liquide, soumet le milieu liquide à une dialyse vis-à-vis d'eau, recueille la fraction dialysée et lyophilise ladite fraction.

Suivant un mode d'exécution avantageux du procédé, le peptide est obtenu par incubation de Schistosoma monsoni dans l'eau bidis-tillée, décantation puis centrifugation, puis le surnageant est filtré sur filtre Millipore et mis en dialyse dans une cellule de dialyse équipée d'un filtre Amicon X-100; finalement, le liquide de dialyse est lyophilisé, puis concentré 10 fois.

Cette protéine possède des propriétés pharmacologiques très intéressantes qui se manifestent en inhibant la dégranulation des mas-tocytes de rats. Cette inhibition de la dégranulation laisse prévoir que cette substance biologique pourra inhiber la mise en liberté de l'histamine et des catécholamines contenues dans les mastocytes et évitera ainsi les phénomènes de bronchospasme, les manifestations d'anaphylaxie ou les risques de syncope dans les états d'allergie ou de choc, les urticaires et les allergies digestives.

L'activation des mastocytes par des facteurs allergisants, comme des anticorps ou des substances chimiques, conduit à la mise en liberté des aminés biologiques vaso-actives et peut de ce fait être rendue responsable de l'hypersensibilité immédiate ou des phénomènes de bronchoconstriction propres à l'allergie. La substance pepti-dique selon l'invention permet d'envisager le traitement des manifestations d'allergies par dépression des réactions d'immunité des substances vasomotrices associées à l'apparition des phénomènes d'allergie.

La substance peptidique selon l'invention peut être administrée à l'homme sous forme de compositions pharmaceutiques en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable. La substance peptidique peut être administrée par voie parentérale, perlinguale, permuqueuse ou rectale.

Produits d'incubation du schistosome

Dix mille vers adultes obtenus par perfusion de hamsters infectés depuis 40 d sont incubés dans 10 ml d'eau bidistillée à 30° C pendant 3 h. Après décantation, le surnageant obtenu constitue l'incubât. Celui-ci est centrifugé 10 min à 1000 g pour éliminer les débris particulaires, filtré sur filtre Millipore 0,45 jim et mis en dialyse 24 h à 4° C. Le liquide de dialyse ainsi que la fraction non dialysable sont lyophilisés et concentrés 10 fois lors de leur utilisation.

Etude pharmacologique du nouveau peptide Techniques d'anaphylaxie cutanée passive (PCA)

A — Principe

Cette technique consiste à sensibiliser passivement l'animal par injection intradermique du sérum. L'injection simultanée d'Ag et de colorant (après un délai variable tenant compte de la demi-vie tissu-laire des IgG et IgE) permet d'apprécier au niveau du point d'injection intradermique l'importance de la réaction anaphylactique par l'apparition d'une tache colorée, de surface proportionnelle à la dose d'Ag injectée [Ovary, «Progr. Allergy», (1958), 459]. Le titre PCA d'un sérum correspond à la plus grande dilution donnant une tache bleue d'au moins 5 mm. Nous avons utilisé cette technique, d'une part, pour évaluer le titre en réagines des sérums antiovalbumine, d'autre part, pour étudier l'effet inhibiteur des produits d'incubation du schistosome sur cette réaction.

B — Titration des sérums

Ces réactions ont été effectuées chez les rats Wistar mâles (180-200 g). On injecte par voie intradermique, dans le dos rasé du rat receveur, 0,1 ml des différentes dilutions du sérum à doser. Après une période de latence de 48 à 72 h, on injecte dans la veine caudale 5 mg d'ovalbumine additionnée de 4 mg de bleu d'Evans en solution dans 0,5 ml d'eau physiologique. 30 min plus tard, les rats sont sacrifiés et les réactions sont examinées du côté interne de la peau. C — Inhibition de la réaction d'anaphylaxie cutanée passive

La fraction dialysable des produits d'incubation du schistosome (100 |il) est injectée par voie intradermique 15 min avant l'injection intraveineuse de bleu d'Evans. Les témoins sont constitués par une injection d'eau physiologique.

1. Action de composés chimiques

Les substances ayant une action de dégranulation sur les mastocytes in vitro peuvent également induire une réaction positive in vivo. Deux substances ont été utilisées: le composé 48/80 (produit de condensation de la p-méthoxyphényléthylméthylamine avec le formal-déhyde) à une concentration de 1 et 0,1 Hg/ml, et la polymyxine-B-sulfate à une concentration de 10 |ig/ml. Ces substances (100 ni) ayant une action immédiate doivent être injectées par voie intradermique en même temps que l'injection intraveineuse de 4 mg de bleu d'Evans en solution dans 0,5 ml d'eau physiologique.

2. Inhibition de la dégranulation induite par un système anticorps-antigène

100 ni de sérum réaginique (antiovalbumine ou sérum de rat infecté par S. monsoni) sont injectés par voie intradermique et les points d'injection sont soigneusement repérés. 48 h plus tard, 100 ni de dialysat ou d'eau physiologique sont injectés aux mêmes points de sensibilisation. Puis, 15 min plus tard, on injecte le bleu d'Evans (4 mg) et l'ovalbumine (5 mg) ou l'Ag hydrosoluble de 5. monsoni 1 % (2 mg) en solution dans 5001*1 d'eau physiologique. (Ag: antigène hydrosoluble de Schistosoma.)

Techniques de culture cellulaire A — Culture de lymphocytes

1. Récupération des cellules

L'action inhibitrice du dialysat a été testée vis-à-vis de lymphocy5

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tes spléniques de souris CBA femelles (CNRS, Orléans). Les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale. La rate est prélevée stérilement et dilacérée au moyen de pinces courbes dans du milieu RPMI additionné extemporanément de glutamine (2 nmol) et de tripeptide Gly-His-Lys acétate (Eurobio) (20 |ig/ml) [Pickart et al., «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 54 (1973), 562], Afin d'obtenir une meilleure stimulation, on élimine les cellules adhérentes. Les cellules sont placées dans des boîtes de Pétri à 37° C pendant 2 h de façon à séparer les cellules adhérentes. Le surnageant est prélevé et centrifugé. Les cellules sont comptées dans un hémocytomètre de Thomas par un test d'exclusion du bleu Trypan en solution à 0,02% en tampon Véronal pH 8,7. La suspension est ajustée à une concentration de 107 lymphocytes/ml.

2. Mitogènes

Les mitogènes utilisés pour induire une stimulation lymphocy-taire sont la concanavaline A extraite de Concanavalia ensiformis aux doses de 0,5 et 1 p.g/100 ni et la phytohémaglutinine extraite de Phaseolus vulgaris (Wellcome) diluée au 1:100.

3. Culture

La culture est réalisée en plaques de microtitration (Nunclon, Danemark). Les cellules sont réparties dans chaque puits à raison de 0,5-106 cellules/puits. La fraction dialysable de l'incubât de vers adultes est ajoutée sous un volume de 10 ni. On ajoute également les mitogènes, le volume final étant dans chaque puits de 200 ni.

48 h plus tard, 1 nCi de 3H Thymidine tritiée est ajouté dans chaque puits. On mesure l'incorporation de la thymidine après une nuit de contact. Les cellules sont lavées, puis lysées par de la soude IN pendant 10 min à 56°C. Le matériel acidoprécipitable est obtenu après addition de 2 ml d'acide trichloracétique froid. Après incubation de 15 min à 4°C et centrifugation, le précipité est dissous dans la soude IN et les échantillons sont placés dans des fioles de comptage. Le liquide scintillant utilisé est du Picofluor15 (Hewlett-Packard). Les échantillons sont comptés dans un spectomètre à scintillation Nuclear Chicago (Isocap 300).

B — Cultures de cellules en lignée continue

Les lignées utilisées pour les tests de cytotoxicité sont: une lignée monocytaire humaine J111 (American culture type collection) (CCL 24) et une lignée Hela. Les cellules sont cultivées en boîtes de Pétri dans du MEM (Minimum essential medium) additionné de 15% de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage. Après 24 h de culture en présence de dialysat, les cellules sont remises en suspension par action de versene-trypsine et centrifugées. Le culot est repris dans du MEM et compté. On mesure aussi la viabilité cellulaire par test d'exclusion du bleu Trypan (0,02%).

L'incorporation de thymidine est mesurée de la même façon que pour les cultures de lymphocytes.

Cytotoxicité mastocyte-éosinophile dépendante

A — Préparation des schistosomules

Les schistosomules sont récoltés in vitro après passage des cercai-res à travers la peau abdominale isolée de souris Swiss.

B — Milieu de culture

Le milieu de culture utilisé est le MEM : Eagle's minimum essential medium (production Institut Pasteur, Paris) auquel on rajoute 1 % de sérum de veau inactivé par chauffage et 20 ng/ml de tripeptide glycyl/histidyl/lysine (Calbiochem., San Diego, Ca.).

C — Préparation des cellules

10 ml d'eau physiologique sont injectés par voie intrapéritonéale à des rats Fischer mâles (Iffa Credo, l'Arbresle, France). 48 à 72 h plus tard, les cellules sont prélevées par lavage de la cavité périto-néale avec 20 ml de milieu de culture contenant 25 UI/ml d'hépari-nate de calcium. Les cellules péritonéales sont centrifugées à

1800 tr/min et lavées deux fois dans le milieu de culture. On enrichit cette population en éosinophiles en laissant adhérer les cellules dans des boîtes de Pétri (7-106 cellules/ml dans des boîtes de 3 cm de diamètre). Après 2 h, les cellules non adhérentes sont prélevées et comptées. La population obtenue contient environ 45% d'éosino-philes et 10% de mastocytes.

D — Purification des cellules

Pour éliminer la contamination due aux mastocytes, la population cellulaire obtenue est déposée sur une solution de Ficoll 35% (Pharmacia, Uppsala, Suède). Après centrifugation à 1000 g pendant 15 min, les cellules de l'interface sont prélevées et lavées dans le milieu. Cette population contient environ 50% d'éosinophi-les et moins de 1% de mastocytes.

La technique de purification des mastocytes sera décrite ultérieurement.

E — Test de cytotoxicité

50 schistosomules en suspension dans 100 ni de milieu de culture sont déposés dans les alvéoles d'une plaque de microtitration (Nunclon) et sont incubés une nuit avec 100 ni de sérum de rat infecté par Schistosoma monsoni, inactivé par chauffage, à une dilution finale de 1:16. Les schistosomules sont ensuite lavés avec le milieu de culture et remis en suspension dans 100 ni de milieu. On ajoute 100 ni de la suspension cellulaire effectrice de façon à obtenir un rapport de 4000-6000 cellules effectrices pour un schistosomule. Le pourcentage de cytotoxicité est déterminé par observation microscopique après une incubation de 48 h.

Test de dégranulation

A — Obtention des cellules péritonéales de rat

Les cellules utilisées pour le test sont obtenues par lavage de la cavité péritonéale de rats Wistar mâles (180-200 g) (Janvier, Le Genest, 200 g) avec 20 ml de milieu de Eagle (MEM) (production Institut Pasteur, Paris). A ce milieu ont été ajoutés préalablement de la glutamine (2 mmol), de l'héparinate de calcium 50 U/ml et le tripeptide Gly-His-Lys acétate 20 ng/ml- L'exsudat péritonéal contient en moyenne 10e mastocytes, ce qui représente 2 à 5% des cellules totales. Les cellules sont centrifugées 5 min à 1000 g. Les mastocytes sont colorés au bleu de toluidine et comptés dans un hémocytomètre de Fuchs Rosenthal.

B — Incorporation de 3H sérotonine

Une solution de 5-hydroxy-[3H]-tryptaminecréatininesulfate (10 Ci/mmol) (Amersham) a été utilisée pour le marquage des cellules. L'exsudat péritonéal est incubé 30 min à 37° C avec 2 nCi de 3H sérotonine pour 106 mastocytes. La suspension cellulaire est ensuite lavée 4 fois dans 5 ml de milieu pour éliminer l'excès de sérotonine marquée.

C — Mesure de la libération de sérotonine

La réaction est réalisée en plaques de microtitration à fond plat (Linbro, Flow Lab.). Les différentes substances testées activatrices ou inhibitrices sont mises en contact avec 50 ni de la suspension cellulaire à 106 mastocytes/ml. Après un temps d'incubation variable suivant le cas étudié, la plaque est centrifugée 5 min à 1000 g. 50 ni de surnageant sont transférés dans une fiole de comptage. Le traitement des cellules par 50 ni de digestine (Merck) permet de mesurer la quantité totale de radioactivité incorporée dans les cellules.

D — Mesure de la radioactivité

10 ml de liquide scintillant (toluène Triton 1:1 (v/v) butyle PBD 7 g/1) sont ajoutés dans chaque fiole de comptage. La radioactivité est mesurée dans un spectromètre à scintillation (Isocap 300,

Nuclear Chicago, Illinois) avec une efficacité de 50,1 % pour le 3H. L'extinction de fluorescence (quenching) est corrigée par la méthode

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des rapports de canaux, à partir de courbes étalons obtenues avec des échantillons d'activité constante.

E — Produits utilisés

Le composé 48/80, la polymyxine-B-sulfate, l'ATP, l'a-chymo-trypsine, la L-a-lysophosphatidylcholine, le dicoumarol et la papa-vérine, le cromoglycate de sodium et l'ovalbumine sont des produits commerciaux.

F — Contrôle morphologique de la dégranulation

50 jj.1 de bleu de toluidine 0,1% (I.C.N. Laboratories, Cleveland) sont ajoutés aux cellules activées. Le pourcentage de mastocytes dégranulés est déterminé par observation microscopique avec un grossissement de 40 x 10 (modèle Reichert, Autriche). Pour chaque détermination, trois cents cellules au moins ont été observées.

G — Etude ultrastructurale

Les cellules sont fixées par une solution de glutaraldéhyde 2,5% en tampon cacodylate de sodium 0,1 M, pH 7,2 à 4°C, puis lavées en tampon cacodylate. On postfixe les cellules par le tétroxyde d'osmium à 1 % dans l'eau distillée pendant 1 h. Une déshydratation à l'acétone suivie d'une inclusion en Araldite est ensuite réalisée. L'observation est faite avec un microscope électronique Hitachi HU 12.

H — Purification des mastocytes

La technique utilisée a été décrite par Sullivan et al. dans «J. Immunol.», 114 (1975), 1480. Les cellules sont déposées sur une solution de sérumalbumine bovine (SAB) 38% (poids/volume).

Après 30 min à température ambiante, les cellules sont centrifugées 20 min à 450 g. Les mastocytes se trouvent alors dans la couche de SAB. Le surnageant et l'interface sont éliminés et la couche inférieure est lavée plusieurs fois avec le milieu de culture. La préparation de mastocytes obtenue est pure à 99% avec un rendement d'environ 75%. L'observation microscopique confirme l'intégrité structurale des mastocytes purifiés.

Résultats et discussion

I— Mise au point du test de dégranulation A — Incorporation de sérotonine par la suspension cellulaire

1. Localisation de la sérotonine marquée au niveau des mastocytes

Seuls les mastocytes et les plaquettes ont la propriété d'incorporer la sérotonine exogène. Les plaquettes en faible proportion dans l'exsudat péritonéal sont éliminées par le premier lavage des cellules, cela étant confirmé lors de l'observation microscopique. Cependant, pour démontrer la localisation de la sérotonine marquée au niveau des mastocytes, une préparation de mastocytes purifiés a été comparée à la population péritonéale totale. L'exsudat péritonéal est marqué par la sérotonine tritiée, puis un aliquot est prélevé en vue de la purification. A concentration égale en mastocytes, la quantité totale de radioactivité incorporée est la même dans la préparation contenant 5% de mastocytes et dans celle contenant 95% de mastocytes. La courbe de libération de sérotonine sous l'action du composé 48/80 est rigoureusement identique pour les deux préparations (fig. 1). Ces faits expérimentaux démontrent l'incorporation sélective de la sérotonine au niveau des mastocytes. Cela renforce l'intérêt de la méthode en permettant l'utilisation de populations non purifiées.

2. Intégrité structurale après marquage

L'observation microscopique ainsi que l'étude en microscopie électronique montrent que le marquage par la sérotonine tritiée n'affecte pas l'intégrité structurale des membranes et des granules mastocytaires.

B — Action du composé 48/80

Ce composé a été choisi pour son aptitude à faire dégranuler les mastocytes avec une amplitude importante, ce qui facilite l'observation morphologique et la détermination optique du pourcentage de mastocytes dégranulés.

Les cellules sont incubées 15 min à 37° C avec des concentrations de composé 48/80 allant de 1 mg à 0,1 (ig/ml. On mesure, d'une part, la libération de sérotonine tritiée, d'autre part, le pourcentage de mastocytes dégranulés obtenu par observation microscopique.

La libération spontanée de sérotonine tritiée représente 1 à 5% de la radioactivité totale incorporée dans les mastocytes. Chaque concentration est testée en triple exemplaire et le pourcentage de libération de sérotonine est calculée d'après la formule suivante:

%=^5|xl00

X: radioactivité totale de l'échantillon S : radioactivité libérée spontanément

T : radioactivité totale incorporée (libérée après action de la digestine)

Le composé 48/80 présente une activité à partir d'une concentration de 1 |ig/ml. La courbe dose-réponse présente une allure sigmoide. L'activité maximale correspondant à 75-86% de sérotonine libérée est obtenue pour une concentration de 100 ng/ml de composé 48/80.

Un parallélisme étroit s'établit entre les résultats obtenus par la méthode isotopique et l'observation microscopique. L'étude de corrélation donne un coefficient r = 0,9935 (p < 0,001).

C — Action d'autres activateurs chimiques

Plusieurs composés ayant la propriété d'induire une dégranulation mastocytaire ont été testés dans les mêmes conditions que le composé 48/80. La polymyxine-B-sulfate, l'a-chymotrypsine, la L-a-lysophosphatidylcholine et l'ATP induisent une libération de sérotonine. Les courbes doses-réponses sont concordantes avec celles observées par les méthodes classiques. Les doses nécessaires pour induire une dégranulation sont plus importantes qu'avec le composé 48/80. La polymyxine-B-sulfate induit une libération de sérotonine à partir de 10 Hg/ml, la chymotrypsine 100 ng/ml et l'ATP 500 |ig/ml. Avec l'ATP, le pourcentage de sérotonine libérée reste limitée à 20% dans la gamme de concentrations étudiées.

D — Inhibition de la dégranulation par des agents chimiques

Deux types d'inhibiteurs de la dégranulation ont été décrits. Le premier type d'inhibiteur inhibe l'étape d'activation membranaire. Ce sont des substances qui interviennent au niveau des nucléotides cycliques en provoquant une augmentation de l'AMPc intracellulaire par inhibition de la phosphodiestérase. C'est par ce mécanisme qu'agissent par exemple le dicoumarol ou le cromoglycate de sodium.

Le second type d'inhibiteur agit directement au niveau du métabolisme intracellulaire. C'est le cas par exemple de la papavérine.

On a testé l'effet du dicoumarol et de la papavérine sur une dé-granulation induite par la polymyxine-B. Les cellules sont d'abord incubées 30 min à 37°C avec les inhibiteurs; la dégranulation est induite par action de polymyxine-B-sulfate (100 (ig/ml) 15 min à 37° C. Avec une dose de 100 |imol/l de papavérine, l'inhibition est de 75% ; avec 10 p.mol/1 de dicoumarol, elle est de 89%. Ces composés sont donc actifs sur la dégranulation mastocytaire et la libération de sérotonine tritiée.

E — Dégranulation induite par une réaction antigène-anticorps

L'interaction des mastocytes avec un allergène et l'Ac réaginique correspondant induit une dégranulation, mais les altérations cellulaires sont beaucoup moins importantes que sous l'action de composés chimiques, ce qui renforce l'intérêt d'une méthode plus précise que l'observation microscopique. Nous avons donc recherché les conditions optimales de dégranulation induite par un sérum réaginique antiovalbumine et l'antigène correspondant.

1. Recherche du temps optimal de sensibilisation

La fixation des IgE à la surface du mastocyte nécessite un temps de contact avant que la dégranulation puisse être induite par addi-

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tion de l'antigène. Nous avons donc recherché le temps optimal nécessaire pour obtenir la sensibilisation des mastocytes.

Les mastocytes marqués sont incubés avec l'antisérum antiovalbumine pendant des périodes variables de 15 min à 2 h, puis mis en contact avec l'antigène pendant 15 min. Ni l'antigène ni l'antisérum n'induisent de libération de sérotonine supérieure au témoin. Quand l'antigène est ajouté simultanément à l'antisérum, aucune dégranulation n'est induite même si l'on prolonge les temps d'incubation, ce qui rend l'étape de sensibilisation absolument nécessaire. Elle peut être cependant de courte durée puisqu'on obtient le maximum de libération de sérotonine avec un temps de contact de 15 min.

2. Influence de la concentration en antigène

Nous avons étudié une gamme de concentrations de 1 à 1000 (xg/ml, soit en concentrations finales de 0,05 à 50 |ig. Les cellules sont mises en contact 15 min avec les différentes concentrations d'antigène. Dans la gamme de concentrations testées, la libération de sérotonine s'accroît avec la concentration en antigène. Pour l'ensemble des expériences, nous avons donc utilisé la concentration la plus forte, soit 50 \ig par puits.

3. Sensibilité de la méthode

Les sérums des rats Hooded-Lister immunisés contre l'ovalbu-mine présentent des titres en PCA variant de 64 à 512. On a testé un sérum de titre 128 à différentes dilutions. On peut induire une libération de sérotonine avec ce sérum jusqu'à une dilution de 54, mais dans ce cas seulement 5% de la sérotonine incorporée se retrouve dans le surnageant. Le sérum pur induit la libération de 20% de la sérotonine, ce qui reste faible et nécessite l'utilisation du sérum non dilué pour toutes les expériences. Les sérums utilisés pour la sensibilisation passive devront avoir un titre PCA supérieur à 128. Cette limite n'est pas imputable au test lui-même, mais à la difficulté de sensibiliser passivement des mastocytes in vitro.

4. Caractéristiques de la dégranulation anaphylactique

Deux propriétés des IgE ont été utilisées pour vérifier que la libération de sérotonine fait suite à l'interaction des IgE avec les récepteurs mastocytaires: ce sont la thermolabilité des IgE et la forte affinité de l'IgE pour le récepteur mastocytaire.

Thermolabilité: le sérum antiovalbumine de titre PCA 128 est chauffé 3 h à 56° C. Ce sérum pur est incubé 15 min à 37° C avec des mastocytes marqués dans les conditions de sensibilisation passive. Après addition d'antigène, il n'y a aucune libération de sérotonine alors que le même sérum non chauffé induit une libération de 21,9% de sérotonine tritiée.

Tableau 1 :

Influence de la concentration en antigène sur la libération de sérotonine

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2 Moyenne de trois expériences.

3 Non significativement différent de la libération spontanée.

La destruction des IgE par chauffage inhibe totalement la dégranulation ultérieure, ce qui confirme que c'est un phénomène dépendant des IgE fixées à la surface du mastocyte.

Affinité de l'IgE: les IgE présentent pour le récepteur mastocytaire une forte affinité. La fixation de l'IgE est irréversible par lavage des cellules. On peut donc, après la sensibilisation passive, laver les cellules et induire une dégranulation avec l'antigène.

Les cellules marquées sont incubées avec un sérum antiovalbumine de titre PCA 128 15 min à 37° C puis sont lavées 3 fois dans le milieu de culture. 50 |ig d'antigène sont ensuite ajoutés. On mesure la libération de sérotonine après 15 min d'incubation (tableau 3). Sans étape de lavages, ce sérum induit une libération de 23,7%. Après 3 lavages entre la sensiblisation par l'IgE et l'addition de l'antigène, 20,2% de la sérotonine est libérée; on préserve donc la sensibilisation des mastocytes par lavage, ce qui confirme l'interaction d'IgE avec le mastocyte.

F — Discussion

Cette méthode permet d'apprécier d'une manière quantitative l'importance de la dégranulation induite, d'une part, par des activa-teurs chimiques, d'autre part, par un système anaphylactique.

La rapidité d'incorporation de la sérotonine marquée permet d'éviter des altérations de la structure cellulaire. L'étude en micros-copie électronique nous a permis de confirmer l'intégrité structurale des cellules.

Après 3 lavages, tous l'excès de sérotonine est éliminé. La libération spontanée de sérotonine par les mastocytes correspond à environ 1-5% de la sérotonine incorporée [Bach et al., «J. exp. Med.», 133 (1971A), 752, obtiennent, par dosage d'histamine, une libération spontanée de 0 à 5%]. Le bruit de fond mesuré est donc tout à fait normal et confirme que les conditions expérimentales utilisées pour marquer les cellules respectent leur intégrité et ne perturbent pas leur activation ultérieure.

L'incorporation sélective du marqueur au niveau des mastocytes permet d'éviter la purification des cellules, tout au moins dans le cas où les interactions avec les autres types cellulaires n'interfèrent pas dans la libération des médiateurs. Cette possibilité d'éviter l'étape de purification des cellules représente à la fois un gain de temps et une garantie de meilleur état des cellules. La mesure de la libération de sérotonine semble être une bonne technique de mesure de la dégranulation.

La destruction des IgE par chauffage abolit complètement la libération de sérotonine. Par contre, elle est maintenue si les cellules sont lavées après la sensibilisation passive par le sérum réaginique. Ces deux faits expérimentaux confirment qu'il s'agit d'une dégranu-lation anaphylactique dont le signal est l'interaction de l'IgE avec son récepteur sur le mastocyte. L'inhibition de la dégranulation par le cromoglycate de sodium confirme que la mesure de la libération de sérotonine est dans nos conditions une bonne méthode d'évaluation de la dégranulation, aussi bien en anaphylaxie active qu'après sensibilisation passive.

II— Production par Schistosoma mansoni d'un facteur inhibiteur de la dégranulation mastocytaire

A — Inhibition de la dégranulation in vitro

1. Inhibition de la dégranulation induite par un système anaphylactique

Des mastocytes péritonéaux de rat marqués à la sérotonine sont incubés avec la fraction dialysable et non dialysable de l'incubât à différentes concentrations. Après 45 min de contact, on induit une dégranulation par action d'un sérum réaginique antiovalbumine et ovalbumine dans les conditions habituelles. Des doses de dialysat de 10-50 (il sont testées. On mesure, d'une part, la libération de sérotonine en présence de dialysat seul de façon à contrôler l'effet cytotoxi-que de cette substance, d'autre part, la libération de sérotonine après activation par le système anaphylactique. A de faibles concentrations (10-30 (il), la fraction dialysable de l'incubât inhibe de façon significative la dégranulation mastocytaire. Cette inhibition est fonction de la dose puisqu'on obtient 54% avec 10 (il et 70% avec 20 (il. Avec 30 |il l'inhibition est de 49%, mais une libération spontanée de sérotonine commence à apparaître à cette dose, ce qui peut expliquer la plus faible inhibition obtenue avec cette concentration. Aux plus fortes concentrations (40 et 50 jj.1), la libération spontanée de sérotonine augmente de façon considérable. Elle est presque totale avec s

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50 (il de dialysat (87%), ce qui correspond non pas à un processus actif, mais très certainement à une cytotoxicité du dialysat à ces concentrations. La fraction non dialysable ne présente pas d'action inhi-bitrice.

2. Inhibition de la dégranulation induite par des agents chimiques

Il était intéressant de voir si cette substance a la propriété d'inhiber de façon très générale le processus de dégranulation, ou si cette inhibition est spécifique d'une dégranulation induite par des réactions antigène-anticorps. Pour cela, nous avons mis en contact des mastocytes marqués avec l'incubât, puis nous avons induit une dégranulation par action de composé 48/80 ou de polymyxine-B-sulfate.

Les doses de ces composés utilisées pour faire dégranuler les mastocytes sont des doses infra-optimales, de façon à limiter la lyse cellulaire qui résulte d'une dégranulation explosive. Avec le composé 48/80 (5 (ig/ml), le pourcentage de libération de sérotonine est de 17,1 %. La préincubation avec 10 |il de fraction dialysable réduit ce pourcentage à 15,1%; avec 20 ni, on obtient 10,4%. L'inhibition obtenue avec 20 |il est de 39%. Bien que statistiquement significative (p < 0,05), elle reste cependant limitée.

Avec la polymyxine-B-sulfate (5 (ig/ml), on obtient 29,8%. En préincubant avec 10 (il de dialysat, on a 19,5%, avec 20 (il 13,5%, ce qui correspond respectivement à 35 et 55% d'inhibition. On peut donc inhiber plus facilement une dégranulation induite par de la po-lymyxine-B- que par le composé 48/80.

3. Caractéristiques du facteur inhibiteur a) Thermostabilité

La fraction dialysable de l'incubât de vers adultes est chauffée • 1 h à 100° C puis mise en contact avec les mastocytes marqués. On compare l'inhibition de la dégranulation anaphylactique obtenue avec les fractions chauffée et non chauffée. On obtient, avec 10 jj.1 de dialysat, respectivement 54 et 56% d'inhibition. Il s'agit donc d'un composé thermostable.

b) Caractère irréversible de l'inhibition par lavage

On a recherché si l'inhibition de la dégranulation pouvait être levée par lavage des cellules après leur mise en contact avec la fraction inhibitrice.

Les cellules marquées sont incubées 45 min avec 10 jxl de dialysat puis lavées 3 fois dans le milieu de culture. On induit une dégranulation soit par action de polymyxine-B-sulfate, soit par action d'un sérum antiovalbumine et d'ovalbumine.

Avec le système anaphylactique, on obtient 30,3% de libération de sérotonine. Avec 10 (il de dialysat, on obtient 13,3% s'il n'y a pas d'étape de lavages et 19,5% lorsque les cellules sont lavées entre l'incubation avec le dialysat et la sensibilisation passive avec le sérum réaginique. On ne peut donc pas restaurer la réponse normale par ces lavages.

Avec la polymyxine-B-sulfate (10 |ig/ml), la dégranulation est de 23,9%. En prêincubant avec le dialysat, on obtient sans lavage 19,9% ; avec l'étape de lavages, on obtient 22,0% pour le témoin et 12,7% avec le dialysat, ce qui correspond à 34 et 42% d'inhibition. On obtient le même résultat que précédemment avec la réaction anaphylactique. Il semble que le dialysat induise un signal inhibiteur irréversible même lorsqu'il est ensuite éliminé par lavages.

c) Non-cytotoxicité de la substance protidique selon l'invention

L'action de la fraction dialysable de l'incubât de vers a été

étudiée vis-à-vis de lymphocytes stimulés par des mitogènes. Cette fraction s'est montrée inhibitrice de la prolifération lymphocytaire. Bien que les tests de cytotoxicité réalisés sur les cultures de lymphocytes aient été négatifs, il était nécessaire de voir si cette fraction possède un caractère de toxine cellulaire, c'est-à-dire si elle induit une cytotoxicité ou cytostaticité des cellules, quelle que soit la lignée choisie.

On a étudié deux lignées de cellules en culture continue. La première est la lignée Hela. Ce sont des cellules tumorales du col utérin n'ayant pas de compétence immunologique particulière. La seconde est la lignée monocytaire humaine J111. On a étudié l'action du dialysat sur des lymphocytes stimulés par des mitogènes ainsi que sur ces deux lignées cellulaires. La cytotoxicité est mesurée par test d'exclusion au bleu Trypan accompagnée d'une numération en hémocytomètre de Thomas. L'inhibition de croissance est évaluée par la mesure de l'incorporation de 3H thymidine (Thy).

Les lymphocytes spléniques de souris CBA sont mis en culture conformément à la technique décrite précédemment en présence de 10 (il de dialysat et de mitogènes PHA (dilution 1/100) et Con A (1 (ig). On mesure l'incorporation de 3H Thy au bout de 72 h de culture. La dose de 10 (il de dialysat se révèle extrêmement efficace vis-à-vis de lymphocytes stimulés par des mitogènes. L'inhibition est de 96%, c'est-à-dire que la stimulation mitogénique est totalement abolie. L'incorporation de base de la thymidine en présence ou en absence de dialysat est la même, ce qui suggère qu'il ne s'agit pas d'une action cytotoxique.

Les cellules Hela et les monocytes sont mis en culture conformément à la technique décrite précédemment. Le test au bleu Trypan permet d'évaluer le pourcentage de cellules mortes lorsque celles-ci ne sont pas lysées. Un effet toxique pourrait entraîner une lyse cellulaire, c'est pourquoi il est nécessaire de faire également une numération de façon à conaître le nombre de cellules viables. Avec les cellules Hela, aucune différence de comportement n'est observée entre les cellules témoins et les cellules cultivées en présence de dialysat. Après 72 h de culture, les cellules se sont multipliées et forment un tapis confluent; l'inhibition de contact limite la prolifération cellulaire, ce qui explique la plus faible incorporation de thymidine en fin de culture (tableau 2).

Tableau 2:

Incorporation de thymidine par des lymphocytes stimulés en présence de dialysat

Stimulation

Incorporation de 3H Thy par les lymphocytes de souris

Témoin cpm+ET1

Dialysat 10 (il cpm1 ± ET

—

15848+4463

15850 ± 2421

Con A 1 (ig

237643 + 8632 (IT2 = 15)

24896 ±9235 (IT =16)

PHA Yioo

206224+58231 (IT =13)

22469 ±3656 (IT =14)

1 Nombre de coups par minute (cpm)± écart type (ET).

2 IT : index de transformation.

(Tableau en tête de la page suivante)

Le même résultat a été obtenu avec la lignée monocytaire J111. La multiplication cellulaire est plus lente mais, en 48 h, on observe cependant une augmentation du nombre de cellules, cette augmentation étant identique avec et sans dialysat.

Aux doses couramment utilisées pour mettre en évidence des effets inhibiteurs, la fraction dialysable de l'incubât ne présente pas d'action toxique sur les cellules, quelle que soit leur origine.

B — Inhibition de la dëgranulation in vivo

I. PCA induite par des agents chimiques

Le composé 48/80 et la polymyxine sont capables d'induire in vivo une réaction positive lorsqu'ils sont injectés par voie intradermique. La réaction est instantanée, c'est pourquoi l'injection intraveineuse de bleu d'Evans doit être faite simultanément. La dilution limite donnant une réaction positive est déterminée pour chacun de ces composés sur une série de rats témoins. Pour le composé 48/80, il s'agit de 0,1 |ig/ml pour la polymyxine de 10 |ig/ml.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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7

Tableau 3:

Action du dialysat sur la viabilité et la croissance de cellules Hela

Temps

Témoin

Dialysat 10 |il

3H

Numération1 3 H Thy (cpm + ET)

4,6- 10s ± 0,5 • 10s 23114+9477

4,9-105 + 0,9-105 30040± 11177

8H

Numération 3 H Thy (cpm ± ET)

4,1 • 105± 1,0-105 17847 + 1675

3,0-105 + 0,4-105 19629+977

24H

Numération 3H Thy (cpm + ET)

7,7-105 + 0,4-105 22719 + 651

5,6-105 + 0,5- 10s 21873 + 1550

72H

Numération 3H Thy (cpm ± ET)

21,6- 10s ±3,8-105 5726 + 386

22,0 -105± 3,0 -105 6015 + 1764

1 Numération en hémocytomètre de Thomas après test d'exclusion du bleu Trypan.

2 Incorporation de 3 H Thy exprimée en coups par minute (cpm)± écart type (ET).

Le dialysat est injecté 10 min avant l'induction de la dégranulation à raison de 100 |il par injection, par voie intradermique. Simultanément, on injecte le bleu d'Evans par voie intraveineuse et le 48/80 ou la polymyxine par voie intradermique. Les témoins positifs sont constitués par une première injection d'eau physiologique puis une seconde de 48/80 ou de polymyxine. On observe après injection du dialysat une nette diminution de l'intensité de la réaction, que ce soit avec le composé 48/80 ou avec la polymyxine.

2. PCA induite par une réaction anaphylactique a) Sérum antiovalbumine et ovalbumine

On a induit une réaction d'anaphylaxie cutanée passive en utilisant un sérum antiovalbumine de titre PCA 1:128. Les animaux sont sensibilisés par le sérum réaginique dilué au 1:64. Après 48 h de sensibilisation, le dialysat est injecté au même point, une injection d'eau physiologique constituant le témoin positif. L'ovalbumine est injectée par voie intraveineuse avec le bleu d'Evans. Une forte réaction positive est obtenue avec le sérum réaginique. Cette réaction est pratiquement totalement abolie si le dialysat a été injecté au préalable.

b) Sérum de rat infecté et antigène hydrosoluble de S. monsoni

Un deuxième système anaphylactique a été choisi: contrairement aux expériences in vitro, il est possible d'obtenir une réaction positive avec un sérum de rat infecté par S. monsoni lorsqu'on utilise la technique de PCA. Le sérum de rat infecté est pris au 45e d de l'infection, c'est-à-dire à la période la plus favorable pour l'obtention d'IgE spécifiques anti-S. monsoni. Le sérum (titre PCA 1:8) est injecté pur par voie intradermique 48 h avant l'injection de dialysat. L'injection intraveineuse d'Ag hydrosoluble S. monsoni et de bleu d'Evans amène une forte réaction positive pour le témoin. Celle-ci est totalement abolie avec le dialysat. On confirme les résultats obtenus avec les composés chimiques, l'inhibition étant même plus marquée dans le cas de la réaction anaphylactique.

C — Inhibition du système de cytotoxicité mastocyte/éosinophile dépendant

Le mécanisme de cette réaction de cytotoxicité a été décrit par Capron et al. Les éosinophiles mis en contact avec des schistosomules sensibilisés par des Ac IgGa sont capables d'enrober et de tuer ceux-ci. La présence de mastocytes ou de surnageants de mastocytes dégranulés est indispensable pour qu'il y ait cytotoxicité. Il est probable que les mastocytes activés par des complexes à IgE ou IgGa libèrent des produits d'activation des éosinophiles. Ceux-ci sont alors capables de détruire les schistosomules. Il était donc intéressant de voir si la fraction dialysable de l'incubât de vers adultes était capable en bloquant les mastocytes d'inhiber cette réaction de cytotoxicité.

10 |il de fraction dialysable sont déposés au contact des schistosomules sensibilisés en même temps que les cellules obtenues après adhérence de 2 h. Le pourcentage de schistosomules morts après 25 48 h de culture est déterminé. La présence de la fraction dialysable de l'incubât fait tomber le pourcentage de cytotoxicité de 63 à 17%, soit une inhibition de 74%. La fraction dialysable agit très probablement au niveau des mastocytes, mais il est également possible qu'elle agisse sur les éosinophiles. C'est pourquoi une deuxième expérience 30 a consisté à incuber préalablement des mastocytes purifiés avec la fraction dialysable puis à ajouter ces mastocytes à des éosinophiles purifiés et des schistosomules sensibilisés. Le pourcentage de cytotoxicité qui était de 14% tombe à 3% lorsque les mastocytes ont été préincubés avec la fraction dialysable. On retrouve le même pour-35 centage d'inhibition, bien que le témoin positif soit beaucoup plus faible. Cela suggère que l'action de la fraction dialysable se situe au niveau des mastocytes.

D — Conclusion

40 La fraction dialysable de l'incubât de vers adultes S. monsoni présente vis-à-vis de la dégranulation mastocytaire une action inhibitrice. Les expériences effectuées in vitro ont montré que cette fraction est capable d'inhiber la dégranulation, qu'elle soit induite par un système anaphylactique ou par des agents chimiques. L'utilisation 45 de la méthode isotopique de mesure de la dégranulation permet d'apprécier très exactement l'inhibition. Lorsque la dégranulation est induite par l'action d'un sérum antiovalbumine et de l'antigène correspondant, des doses de 10 à 30 jj.1 sont responsables d'une inhibition croissante de la libération de sérotonine. Avec de plus fortes 50 concentrations, un effet cytotoxique apparaît. La lyse cellulaire ou tout au moins l'altération de la membrane cellulaire entraîne une libération spontanée de sérotonine. Cette mesure de la libération spontanée de sérotonine constitue ainsi un bon indicateur de la cytotoxicité éventuelle du dialysat. Il est à noter que cette cytotoxicité 55 aux fortes concentrations n'est pas surprenante et correspond aux caractéristiques d'un grand nombre de substances biologiques. Le même effet inhibiteur est observé lorsque la dégranulation est induite par la polymyxine-B. Cet effet est beaucoup plus difficile à mettre en évidence lorsqu'il s'agit du composé 48/80. Cela peut s'expliquer par 60 le fait que la dégranulation induite par le composé 48/80 serait la conséquence d'un mécanisme différent de celui de l'activation classique. Par exemple, la dépendance de la dégranulation vis-à-vis du taux de nucléotides cycliques intracellulaires n'a pu être démontrée lorsqu'elle est induite par le composé 48/80 [Johnson et al., 65 «J. Immunol.», 112 (1974), 511 ; Diamant, «Acta Physiol. Scand.», 71 (1967), 283], alors qu'elle a été clairement démontrée dans le mécanisme général de la dégranulation [Kaliner et Austen, «J. Immunol.», 112 (1974), 664]. La possibilité d'inhiber une dégra

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nulation induite par un agent chimique tel que la polymyxine-B suggère que le dialysat agit par inhibition d'un signal d'activation intracellulaire plutôt que par des phénomènes de compétition au niveau des récepteurs pour l'IgE.

Une caractéristique de la substance inhibitrice est d'être thermostable (1 h-100°C), ce qui est propre aux substances de poids moléculaire < 10000. L'inhibition est irréversible par lavage des cellules. Ce résultat suggère que le dialysat induit au niveau de la cellule un signal intracellulaire qui empêche l'activation ultérieure, par exemple en bloquant une étape du métabolisme nécessaire au processus de la dégranulation. On ne peut toutefois exclure pour expliquer ce phénomène irréversible la possibilité d'une liaison de forte affinité entre le mastocyte et le facteur inhibiteur.

Les tests effectués sur des cellules Hela et les monocytes humains en culture continue ont montré que le dialysat ne présente aucune activité cytotoxique ou cytostatique sur ces cellules, aux doses utilisées pour mettre en évidence un effet inhibiteur sur les lymphocytes ou les mastocytes. Le dialysat dans les conditions utilisées n'est pas une toxine cellulaire, mais possède une action spécifique vis-à-vis de certains types cellulaires dont les lymphocytes et les mastocytes.

L'utilisation de la technique de PCA a permis de confirmer in vivo le rôle inhibiteur joué par le dialysat. Les composés chimiques 48/80 et polymyxine-B présentent l'avantage d'induire une réaction positive immédiate sans période de sensibilisation, ce qui a facilité les expériences dans un premier temps. Le même nombre d'injections est effectué pour chaque point (eau physiologique ou dialysat), ce qui permet d'éliminer l'hypothèse d'une inhibition due au traumatisme de l'injection intradermique. Le dialysat seul n'induit pas de réaction positive. Si l'action du dialysat consistait en une lésion tis-

sulaire au point d'injection, il est probable qu'il en résulterait une lyse des mastocytes avec libération de médiateurs et vasodilatation, donc une réaction positive avec le dialysat seul. L'absence de réaction avec le dialysat permet de dire qu'il ne s'agit pas d'une simple s réaction cytotoxique. La présence du dialysat entraîne une forte atténuation de la réaction provoquée par le 48/80 ou la polymyxine. Une inhibition presque totale est observée dans le système anaphylactique, qu'il s'agisse d'un sérum antiovalbumine ou d'un sérum de rat infecté par S. monsoni. Le fait que le dialysat soit injecté après ou io par des agents chimiques suggère une intervention au niveau du métabolisme cellulaire dans l'une des étapes de l'activation conduisant à la dégranulation. On pourrait penser que l'action du dialysat se situe non pas au niveau du mastocyte, mais agit par destruction des médiateurs libérés. L'utilisation de la mesure de la sérotonine tritiée 15 libérée écarte cette hypothèse, car la radioactivité est de toute façon mesurée, même si la sérotonine libérée a été ultérieurement dégradée.

La purification de cette substance apporte des renseignements importants sur sa nature, son mécanisme d'action et son identification in vivo. D'autre part, elle permet de déterminer l'intérêt phar-macologique du produit de l'invention dans le traitement des phénomènes allergiques.

On signalera, pour terminer, que la schistosomiase sévit dans les régions de la vallée du Yang Tse qui sont un très important siège d'endémie hépatitique cirrhogène aboutissant à l'un des foyers mondiaux du cancer du foie. Il y a une relative protection des populations infestées par Schistosoma. On peut donc en inférer à l'existence dans les extraits de Schistosoma d'un facteur chimique de protection de l'hôte vis-à-vis du virus responsable.

20

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r

Claims (4)

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1. Peptide provenant de Schistosoma monsoni, de poids moléculaire compris entre 500 et 1000, soluble dans l'eau, thermostable, non précipitable par les réactifs des protéines, dialysant à travers une membrane de dextrane réticulé du type Amicon X-100.

2. Procédé d'obtention du peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on fait incuber des Schistosoma monsoni adultes dans l'eau, sépare les corps des nématodes et les débris particulaires du milieu liquide, soumet le milieu liquide à une dialyse vis-à-vis d'eau, recueille la fraction dialysée et lyophilise ladite fraction.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on fait incuber des Schistosoma monsoni adultes dans l'eau pendant 3 h, sépare les corps des nématodes, soumet le filtrat à une centrifuga-tion, sépare le surnageant, le filtre sur un filtre Millipore, soumet le filtrat à une dialyse vis-à-vis d'eau distillée dans une cellule à dialyse équipée d'un filtre Amicon X-100 pendant 24 h, recueille la fraction dialysée que l'on lyophilise.

4. Compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif le peptide de la revendication 1 en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte non toxique pharmaceuti-quement acceptable.